Summary
We presenteren een hoge doorvoer tractiekracht assay gefabriceerd met silicone rubber (PDMS). Deze nieuwe assay is geschikt voor het bestuderen van fysieke veranderingen in cel contractiliteit tijdens verschillende biologische en biomedische processen en ziekten. We demonstreren het nut van deze methode door het meten van een TGF-β afhankelijke toename van de contractiliteit tijdens de epitheel-naar-mesenchymale overgang.
Abstract
Cellulaire contractiliteit is essentieel in diverse aspecten van de biologie, rijprocessen die variëren van beweeglijkheid en verdeling tot weefsel contractie en mechanische stabiliteit, en vertegenwoordigt een kernelement van multi-cellulaire dier leven. In aanhandige cellen wordt acto-myosine contractie gezien in tractie krachten die cellen op hun substraat uitoefenen. Disregulatie van cellulaire contractiliteit verschijnt in een groot aantal pathologieën, het maken van contractiliteit een veelbelovend doelwit in diverse diagnostische benaderingen met behulp van biofysica als een metriek. Bovendien kunnen nieuwe therapeutische strategieën worden gebaseerd op het corrigeren van de schijnbare storing van de celcontractiliteit. Deze toepassingen vereisen echter een directe kwantificering van deze krachten.
We hebben op siliconen elastomeer gebaseerde tractiekracht microscopie (TFM) ontwikkeld in een geparallelliseerd multi-well formaat. Ons gebruik van een Silicone rubber, specifiek Polydimethylsiloxaan (PDM'S), in plaats van de vaak gebruikte hydrogel Polyacrylamide (PAA) stelt ons in staat om robuuste en inerte ondergronden te maken met een onbepaalde houdbaarheid-levens waarvoor geen gespecialiseerde bewaarcondities nodig zijn. In tegenstelling tot pijler-PDMS gebaseerde benaderingen die een modulus in het GPa-bereik hebben, zijn de PDM'S die hier worden gebruikt zeer compliant, variërend van ongeveer 0,4 kPa tot 100 kPa. We creëren een platform voor hoge doorvoer voor TFM door deze grote monolithische substraten ruimtelijk te partitioneren in biochemisch onafhankelijke putten, waardoor een multi-well platform ontstaat voor het screenen van tractiekracht dat compatibel is met bestaande multi-well systemen.
In dit manuscript gebruiken we dit multi-well Traction Force-systeem om de epitheel naar mesenchymale transitie (EMT) te onderzoeken; we induceren EMT in NMuMG cellen door ze bloot te stellen aan TGF-β, en om de biofysische veranderingen te kwantificeren tijdens EMT. We meten de contractiliteit als een functie van concentratie en duur van TGF-β-blootstelling. Onze bevindingen hier tonen het nut van geparallelliseerde TFM in de context van ziekte Biophysics.
Introduction
Acto-myosin contractiliteit is een essentieel element van actieve celmechanica, invloed op het gedrag van de cellen van beweeglijkheid en proliferatie tot stamcel differentiatie. In weefsels drijft contractiliteit activiteit van polaire scheiding in embryogenese, tot vernauwing van de luchtwegen en cardiale activiteit. Kritisch, om spanning te genereren, cellen moeten eerst zich houden aan hun extracellulaire omgeving. Daarbij genereert deze contractiliteit tractie krachten op hun omgeving. Traction Force microscopie (TFM) is ontstaan in een veelheid van vormen als een manier om deze krachten te kwantificeren uit verschillende cellen onder verschillende omstandigheden.
Het veld van TFM heeft een uitzonderlijke breedte van innovatie en toepassing gezien en de resultaten hebben de weg vrijgemaakt voor nieuwe perspectieven in de biologie, die mechanica en fysieke krachten omvatten. Beginnend met rimpel siliconen substraten1, onderzoekers hebben verschillende technieken toegepast om de tractie krachten van cellen te meten. Deze benaderingen zijn voortdurend verbeterd en hebben nu een niveau van resolutie bereikt over de volgorde van verschillende micron2. Er is echter één hoofdprobleem ontstaan, namelijk de moeilijkheid om substraten met voldoende lage moduli te maken met behulp van de beschikbare siliconen. Om dit probleem te omzeilen, werd Polyacrylamide als vervanging gekozen door het gemak van het maken van substraten op de orde van 1-20 kPa3. We hebben onlangs zeer conforme siliconen in TFM4geïmplementeerd, waardoor we hetzelfde bereik van moduli kunnen fabriceren als Polyacrylamide, maar met de voordelen van inerte en robuuste siliconen.
TFM-benaderingen hebben waardevolle mechano-biologische ontdekkingen mogelijk gemaakt, maar een hardnekkige tekortkoming is hun complexiteit, waardoor ze vaak hun gebruik beperken tot onderzoekers in de engineering-of fysische wetenschappen disciplines. Dit is grotendeels te wijten aan de gedetailleerde kalibraties en uitdagende berekeningen die nodig zijn om de contractiliteit te kwantificeren. Een andere belangrijke uitdaging is dat TFM-methoden grotendeels lage doorvoer zijn en daarom niet geschikt zijn om veel verschillende omstandigheden of populaties tegelijkertijd te bestuderen5. Dit heeft een knelpunt gepresenteerd, dat de overdracht van TFM van een gespecialiseerde biofysica-instelling in bredere biologische en farmacologische toepassingen heeft belemmerd.
We hebben onlangs ontwikkeld een multi-well formaat tfm plaat, waarmee onderzoekers parallel hun tfm metingen voor het sneller kwantificeren van contractiliteit metrische gegevens, terwijl het verkennen van de impact van verschillende verbindingen en ook met behulp van minder reagentia4 . Deze methodologie heeft een breed nut in diverse mechanobiologie studies, van het evalueren van de effecten van verbindingen op cellulaire activiteit, voor het kwantificeren van de contractiele veranderingen in differentiatie of ziekte.
Een gebied van biomedisch onderzoek dat sterk zal profiteren van TFM is de studie van de invloed van fysieke signalen op de kwaadaardige fenotypes van kankercellen. Metastase, verantwoordelijk voor 90% van de kanker-gerelateerde sterfgevallen, wordt gekenmerkt door tumorcellen verlaten hun oorspronkelijke tumor site en koloniseren van een secundaire site. Voor cellen om te migreren via weefsel en doorgeven in en uit het vasculaire systeem, ze moeten radicaal veranderen hun vormen te persen door deze fysieke barrières terwijl het genereren van aanzienlijke krachten om te trekken hun weg langs extracellulaire matrix of verplaatsen tussen andere Cellen. Deze krachten worden overgebracht naar het substraat door middel van focale adhesie interacties2,3, en kunnen worden gekwantificeerd met behulp van tfm. Hoewel kankers biologisch chemisch uitzonderlijk divers zijn, met een groeiend repertoire van bekende mutaties en eiwit veranderingen, zijn enkele veelvoorkomende fysieke veranderingen waargenomen; in verschillende vormen van kanker, waaronder borst-, prostaat-en longkanker, is gebleken dat gemetastaseerde cellen 2-3 keer de tractie krachten van niet-metastatische cellen6,7,8moeten uitoefenen. Deze resultaten suggereren dat er een sterke correlatie kan zijn tussen metastatische progressie en de tractie krachten die door cellen worden uitgeoefend; de gedetailleerde tijdsafhankelijke veranderingen in contractiliteit zijn echter moeilijk te onderzoeken.
De epitheel-to-mesenchymale transitie (EMT) is een proces waarbij cellen de hechting van de cel en de nauw verbonden celceladhesie verminderen, en steeds meer migratie en invasief worden. Naast fysiologische functies die wondgenezing en ontwikkelingsprocessen omvatten, EMT is ook een proces dat wordt uitgebuit tijdens metastasen, waardoor het een nuttig modelsysteem om dit proces te bestuderen. Met behulp van TGF-β, we kunnen induceren de EMT in Murine borstklier epitheelcellen (NMuMG)9 direct kwantificeren van de fysieke veranderingen tijdens deze transformatie, en karakteriseren de tijd en de dosis-afhankelijke effecten van TGF-β op EMT en cel contractility. In dit artikel, we demonstreren het nut van deze aanpak door het meten van de veranderingen in contractiliteit tijdens een geïnduceerde EMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: het volgende protocol zal onderzoekers begeleiden in het vervaardigen en gebruiken van de multi-well TFM schotel getoond in Figuur 1.
1. bereiding van de PDMS siliconen substraten
- Bereiding van het silicone rubbermengsel van PDMS op basis van een samengesteld mengsel van twee in de handel verkrijgbare Kits.
- Voeg deel A en deel B van de PDMS Kit toe (bv. GEL-8100, zie de tabel met materialen) in een 1:1 gewichtsverhouding in de 50 ml buis.
Opmerking: het mengsel wordt gemengd op een rotator met een snelheid die langzaam genoeg is om het mengsel heen en weer te stromen tijdens de revolutie om een volledige menging te garanderen. - Voeg de benodigde hoeveelheid Uithardings middel toe voor de gewenste modulus van het substraat.
Opmerking: de hoeveelheid Uithardings middel die aan het mengsel moet worden toegevoegd, hangt af van de gewenste modulus van het substraat en kan meestal variëren van 0,1% tot 1,8%. Raadpleeg tabel 1 en Figuur 3 voor een gids voor specifieke als concentraties en resulterende moduli. - Meng de formulering op de Rotator voor 30-45 min; Zorg ervoor dat de rotatie langzaam genoeg is voor een grondige menging.
- Voeg deel A en deel B van de PDMS Kit toe (bv. GEL-8100, zie de tabel met materialen) in een 1:1 gewichtsverhouding in de 50 ml buis.
- Onderste laag: deklaag PDMS substraten op de glazen glijbaan
- Plaats de op maat gemaakte Chuck afgebeeld in Figuur 2 op de spin-coater. Reinig het glas met ethanol of isopropanol en droog met een pluisvrij doekje. Plaats de glazen schuif in de boorkop en schakel het vacuüm in om de dia op zijn plaats te houden.
- Pas onuitgeharde PDM'S ongeveer 1 cm van de randen toe en werk in de richting van het centrum. Breng voldoende (3-4 mL) PDM'S aan om ervoor te zorgen dat het hele oppervlak bedekt wordt.
Opmerking: om ervoor te zorgen dat de PDM'S gelijkmatig worden verspreid op het oppervlak van het glas, kan een pipetpunt nuttig zijn om het mengsel van de PDMS van het midden naar de randen te spreiden. - Draai het glas met het PDMS mengsel op een spin-coater met het volgende protocol.
- Om de niet-uitgeharde PDM'S op de glijbaan te verspreiden, accelereren bij 50 rpm/s van 0 tot 200 rpm; Houd bij 200 rpm gedurende 1 min.
- Om een PDMS-laag van 100 μm te bereiken, versnelt u bij 50 rpm/s tot 300 rpm en houdt u 1 minuut vast bij 300 rpm. Voor andere gewenste diktes dan 100 μm zijn specifieke snelheidswaarden vereist.
- Om te verwijderen, vertraagt bij 50 rpm/s tot 0 rpm. Schakel vacuüm uit en verwijder de gecoate glijbaan, zorg dat u het gecoate oppervlak niet aanraakt.
Opmerking: het is belangrijk om de versnellings-en vertragings stappen op te nemen om een soepel continu oppervlak te garanderen.
Let op: om ervoor te zorgen dat het monster niet van de klauwplaat vliegt, moet de op maat gemaakte houder worden gebruikt om de glijbaan vast te houden, en niet alleen vertrouwen op vacuüm en de bestaande platte boorkop. De gegevens en specificaties van deze houder zijn vermeld in Figuur 2.
- Plaats het spin-Coated monster in de oven bij de fabrikant aanbevolen temperatuur (100 °C) gedurende 2 uur.
Opmerking: het oppervlak van de oven waar het monster wordt geplaatst, moet stevig zijn (d.w.z. niet een draadrek) en een niveau oppervlak om de uniforme verwarming en dikte van het monster te garanderen. Een keramische of stalen plaat maakt een ideaal oppervlak.
- Top kraal laag
- Voeg kraal oplossing in de juiste verhouding toe aan het resterende PDMS-mengsel.
Opmerking: deze verhouding is afhankelijk van de concentratie van de Bouillon kraal oplossing en de gewenste dichtheid van de kraal op het monster. Typische eindwaarden zijn 9,2 x 1011 kralen/ml en 0,05-0.2 kralen/μm2, en een overmaat aan kralen is over het algemeen beter dan een ontoereikende hoeveelheid. - Meng de kraal oplossing met de niet-uitgeharde PDM'S. Dit kan worden bereikt door de buis op een rotator te plaatsen voor ongeveer 30 minuten, grondig gedurende 1-2 min, of sonicatie gedurende 30 minuten. Deze methoden kunnen worden gecombineerd.
Let op: in onze applicatie vinden we dat sonicatie effectief is in het breken van kraal aggregaten, en rotatie is effectief bij het mengen. Gesynthetiseerde fiduciaire kralen kunnen samenvoegen in opslag. Voorafgaand aan het gebruik, kunnen ze worden geresuspendeerd in hexaan en gesoniceerd. Als er significante grote aggregaten zijn, kan men de kraal suspensie filteren door middel van een 5 μm spuit filter. Deze filtratie stap is optioneel; het helpt om het monster met monoverspreide kralen te kapen, maar een significante fractie van kralen kan verloren gaan in het filter. - Haal de glijbaan uit de oven, laat afkoelen tot kamertemperatuur en plaats hem op de spin-coater.
- Voeg aan het oppervlak van het gecoate monster 3-4 mL van de kraal en ongehard PDMS-mengsel toe.
Opmerking: het mengsel met toegevoegde kralen is minder visceus vanwege de hexaan. Zorg ervoor dat u het oppervlak van het substraat niet aanraakt omdat het de reeds gecoate PDMS substraat kan beschadigen. Bovendien mag het kraal mengsel in eerste instantie niet het oppervlak NAT; Zorg dat het mengsel niet onmiddellijk het uitgeharde PDMS-oppervlak afstroomt. - Draai het voorbeeld met het volgende protocol.
- Om de kraal en niet-uitgeharde PDMS mengsel te verspreiden, accelereren bij 100 RPM/s van 0 tot 500 rpm; Houd bij 500 rpm gedurende 1 min.
- Om een dun laagje kraal-ingesloten PDMS (~ 1 μm) te bereiken, accelereren bij 200 rpm/s van 500 tot 5000 rpm; vasthouden bij 5000 rpm gedurende 10 sec.
- Om te verwijderen, vertraagt bij 100 RPM/s tot 0 rpm. Schakel vacuüm uit en verwijder gecoate glijbaan, zorg dat u het gecoate oppervlak niet aanraakt.
- Plaats het spin-Coated monster in de oven bij 100 °C gedurende 1 uur.
Opmerking: temperaturen boven 100 °C of duur langer dan 1 uur kunnen de kraal fluorescentie verminderen. Zorg ervoor dat de oventemperatuur is ingesteld op 100 °C en niet hoger. - Het protocol kan hier worden onderbroken. Om het monster op te slaan, bedek het oppervlak om stof-en licht blootstelling te voorkomen. Zorg ervoor dat er niets aan de oppervlakte raakt. Het monster is bij kamertemperatuur voor onbepaalde tijd houdbaar.
- Voeg kraal oplossing in de juiste verhouding toe aan het resterende PDMS-mengsel.
- Montage van de plaat
- Voeg deel A (basis) en deel B (Uithardings middel, bv. Sylgard) van een PDMS elastomeer Kit toe in een gewichtsverhouding van 10:1 in de buis van 50 mL.
- Meng het mengsel op de Rotator voor 30-45 min.
Opmerking: Meng voor één plaat 5 mL basis met 0,5 mL Uithardings middel. Tot 1 mL hexaan kan worden toegevoegd om de viscositeit van het mengsel te verminderen. - Breng het mengsel aan op de bodem van de verdeler en verdeel het mengsel.
Opmerking: de scheidingslijn moet ondersteboven worden geplaatst. - Leg het substraat ondersteboven op de scheidslijn.
- Plaats het monster ondersteboven in de oven bij 65 °C gedurende 2 uur.
- Neem monsters uit de oven en reinig de bodem van het glas met 70% ethanol of isopropanol om eventuele PDM'S resten te verwijderen.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. Om het monster op te slaan, plaats een deksel op het substraat en wikkel het apparaat in aluminiumfolie om blootstelling aan het licht te voorkomen. Het monster is bij kamertemperatuur voor onbepaalde tijd houdbaar. De scheidingslijn gebruikt in deze methode is in een 96-well formaat; echter, onderzoekers kunnen andere formaten in dienst (384-well, 2-well, 4-well, 8-well, etc.) afhankelijk van de gewenste experiment opstellingen en beschikbaarheid van het verdelen van structuren. Sommige verdere optimalisatie kan nodig zijn.
2. oppervlakte functionalisatie
- Los 80 μL van een sulfo-SANPAH aliquot op in 40 mL 0,1 M HEPES buffer (pH 7-9).
Opmerking: bereid sulfo-SANPAH aliquots voor door het oplossen van 100 mg sulfo-SANPAH poeder in 2 mL steriel dimethylsulfoxide (DMSO). Bereid de HEPES-buffer van 0,1 M door 50 mL HEPES in 450 mL steriel gedeïoniseerd water te verdunen en filtreer door een porie filter van 0,22 μm. - Voeg 200 μL verdunde sulfo-SANPAH oplossing toe aan elk goed van de 96-goed plaat.
- Stel de plaat bloot aan UV (300-460nm) licht op de juiste afstand en duur.
Opmerking: na blootstelling aan UV moet de kleur van de oplossing donkerder zijn. De afstand en duur van UV-belichting hangen af van het UV-Lampvermogen. In onze toepassing, we bloot voor 10-15 min op een afstand van 5 cm. - Verwijder de sulfo-SANPAH oplossing uit de putjes en voeg aan elk putje een fibronectin-oplossing van 200 μL van 5 μg/mL toe.
Opmerking: onderzoeker gespecificeerde eiwitten kunnen worden gebruikt voor oppervlaktecoating. Sommige algemeen gebruikte eiwitten zijn collageen, fibronectin, en laminine. We hebben vastgesteld dat sulfo-SANPAH de meest effectieve methode is, en plasma reiniging terwijl het soms in PDM'S werkzaam is, wordt afgeraden omdat het een siliciumdioxide-laag creëert en het oppervlak zichtbaar beschadigt. - Incuberen de plaat bij 4 °C 's nachts.
Opmerking: afhankelijk van het eiwit dat wordt gebruikt voor coating kunnen verschillende incubatie methoden worden toegepast. - Verwijder de fibronectin-oplossing en was tweemaal goed met fosfaat gebufferde Saline (PBS).
- Plaats een deksel op het monster.
- Voeg 200 μL PBS toe aan elke put.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. De monsters met fibronectin-coating kunnen maximaal 2 weken bij 4 °C worden bewaard.
3. UV-sterilisatie
- Steriliseer het monster onder UV-licht in een biologische veiligheidskast gedurende 30 minuten.
Opmerking: langere UV-blootstellings tijden kunnen een negatieve invloed hebben op de kraal fluorescentie. Alle volgende stappen moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd.
4. celcultuur
- Verwijder PBS van elke put en voeg 200 μL cellen die in cultuur media zijn opgehangen toe aan elk goed.
- Plaat de cellen op de gewenste celdichtheid. Celdichtheid is afhankelijk van het gewenste experiment. Voor eencellige onderzoeken moeten cellen minimaal 50 μm van elkaar zijn en moeten cellen in de buurt van de randen van het beeldvormings venster niet in de TFM-meting worden opgenomen. Voor monolaag-cellen moet het weergaveveld worden bedekt met een confluente laag cellen in het beeldvormings venster.
- Bereid de volledige groei cultuurmedia voor NMuMG-cellen voor door de DMEM aan te vullen met 5% FBS, 10 mM HEPES, 10 μg/mL insuline, 1% penicillaire-streptomycine, 1 mM L-glutamine en 0,5 μg/mL amfotericine B.
- Bereid de insuline voorraad in door te reconstitueren in aangezuurd water (2,5 mL ijsazijn in 130 mL gedeïoniseerd water) tot een concentratie van 10 mg/mL. Bewaar de stockoplossing bij 4 °C. Wacht tot de oplossing helder is en filtreer vervolgens door een porie filter van 0,22 μm.
- TGF-β-toevoeging
- Om het TGF-β-bestand voor te bereiden, los 2 μg TGF-β op in 100 μL van 10 mM citroenzuur (pH 3,0) en filter steriliseren met 0,22 μm poriën. Vortex de buis en ALIQUOT in de gewenste volumes. Bewaar de aliquots bij-80 °C.
- Voeg 1,5 μL TGF-β-stamoplossing toe aan 10 mL van de volledige celkweek media om de celkweek media te vormen met de uiteindelijke TGF-β-concentratie van 3 ng/mL.
Opmerking: om 10 mM pH 3,0 citroenzuur te maken, Verdun het zuur in water en stel de pH in op 3,0 door toevoeging van HCl.
5. gegevensverzameling
- Verkrijg voor elke positie ten minste één afbeelding van fiduciaire deeltjes en cellen. Focus op de laag van de kraal.
Opmerking: de pixel grootte moet worden geoptimaliseerd op basis van de grootte van de fiduciaire deeltjes en de beeldverwerkings methode die wordt gebruikt. In deze applicatie gebruiken de auteurs een 10x 0,4 NA objectief, en beelden worden verworven met 1024 x 1024 resolutie, met 455 nm/pixel. In het algemeen is het nuttig om een resolutie van ten minste ongeveer 1-5 pixels per kraal te behouden; Hier zijn kralen polydis en hebben ze een individuele afmeting van 300-500 nm. Het is van cruciaal belang dat de fluorescerende fiduciaire kralen scherp zijn voor afbeeldingen die voor TFM-berekeningen worden gebruikt. De focus en imaging kwaliteit van de kralen moet worden geprioriteerde over de beeldvorming van de cellen zelf. Er mag geen kruis gesprek zijn tussen verschillende kanalen, met name een fluorescentie die niet afkomstig is van de fiduciaire kralen die in de beeldvormings spectra van de kralen voorkomen. - Zodra alle posities van belang zijn geregistreerd, voeg je een Detacherings oplossing toe aan elke put om Force-Free referentiebeelden van de fiduciaire deeltjes te verkrijgen.
- Meng een waterige oplossing met 2% TritonX-100, 50 mM natrium azide en 500 mM kaliumhydroxide om de oplossing voor het loslating van cellen te bereiden.
Opmerking: het bovenstaande is bedoeld als een voorbeeld van een effectieve Detacherings oplossing. Verschillende Detacherings oplossingen naar goeddunken van onderzoekers kunnen worden gebruikt om de cellen van het substraat oppervlak los te maken.
- Meng een waterige oplossing met 2% TritonX-100, 50 mM natrium azide en 500 mM kaliumhydroxide om de oplossing voor het loslating van cellen te bereiden.
6. beeldanalyse
- Voer de juiste beeldanalyse uit naar wens.
Opmerking: de analyse software is in eigen huis ontwikkeld. Beeldanalyse kan worden gedaan met op maat gemaakte software of software online beschikbaar.
7. kraal synthese
Opmerking: het volgende protocol is gebaseerd op de synthesemethode beschreven door klein et al.10.
- Bereid onder een rook afzuigkap de drie-nekkolf met een watergekoelde terugvloeikoeler.
Let op: zet een synthese op in een goed geventileerde chemische rook afzuigkap. - Voeg 0,5 ml PDMS stabilisator en de toe aan de kolf.
- Rust één nek uit met een rubberen septum met een stikstof inlaat naald en een uitlaat naald en rust de andere nek uit met een rubberen septum voor het toevoegen van reagens met een spuit.
- Voeg 100 mL watervrij hexaan in 250 mL toe aan de kolf en voeg een kleine magnetische roerstaaf toe.
- Plaats de kolf in het mineraaloliebad bij 75 °C en spoel het met stikstofgas gedurende 1 uur.
- Voeg 6 mL methylmethacrylaat toe aan een ronde bodem kolf van 25 mL.
- Voeg 0,100 g 2, 2 '-Azobisisobutyronitril (AIBN) toe aan de ronde bodem kolf en spoel het mengsel met stikstofgas gedurende 1 uur.
Opmerking: flush methylamethacrylaat door voorverpakte kolom om remmers vóór gebruik te verwijderen. Voeg methylamethacrylaat en AIBN mengsel toe aan de drie-nekkolf. - De oplossing wordt in eerste instantie troebel en verandert melkachtig. Laat de reactie 3 uur lopen nadat de oplossing troebel wordt.
- Plaats de kolf na 3 uur in een ijswaterbad.
- Vacuüm-filter de oplossing met grof filtreerpapier.
- Centrifugeer het filtraat en resuspendeer de deeltjes in hexaan.
Opmerking: het volume van de hexaan moet worden toegevoegd, hangt af van de gewenste concentratie van de kraal oplossing. Sonicatie vergemakkelijkt herdispersie van de kraal deeltjes in hexaan oplossing. Door de auteurs geproduceerde kralen hebben polydis diameters van ongeveer 300-500nm. Vanwege het gebruik van cross-correlatie patroon tracking om verplaatsingen te bepalen, zijn deeltjes kralen niet vereist.
8. reologie meetprotocol
Opmerking: reologie is niet vereist voor elke onderzoeker of experiment, maar is noodzakelijk om de moduli te kwantificeren voor nieuwe formuleringen van PDM'S. In dit protocol, gebruiken we een shear rheometer voor het meten van de effecten van Crosslinker, frequentie, en spanning op moduli van PDMS monsters. Afhankelijk van de beschikbare gereedschappen en expertise, kan moduli ook worden gemeten met behulp van vele andere mechanische analyse benaderingen. Bovendien kunnen onderzoekers die dit protocol gebruiken, ervoor kiezen om onze gepubliceerde moduli in tabel 1, Figuur 3 en Figuur 4weer te gegeven.
- Gebruik een rheometer met een 25 mm diameter parallelle plaat geometrie. Andere geometrieën kunnen worden gebruikt.
- Initialiseer het systeem en Kalibreer het toestel en meetsysteem (parallelle plaat, d = 25 mm). Na het meten van de nulopening begint u het voorbeeld van de PDMS te laden.
- Zodra het PDMS elastomeer en het crosslinking-middel zijn gemengd, moet het mengsel op de bodemplaat van de reometer worden gepipet.
- Verplaats de spil naar beneden om de bovenkant van het PDMS-voorbeeld volledig te contacteren.
- Trim voorzichtig het geladen monster overtollige van de bodemplaat.
- In een stam sweep test, toepassen van toenemende stammen voor elke samenstelling met verschillende crosslinking dichtheid om ervoor te zorgen dat de polymeerstructuur blijft in de lineaire visco-elastisch regime tijdens alle shear metingen.
Opmerking: stam waarden die relevant zijn voor celstudies zijn meestal in het bereik van 0,1-10%. We hebben gevonden dat PDMS lineair is tot ongeveer 100% stam. - Meet de Dynamic shear Storage modulus (G ') en Loss modulus (G ′ ′) van het PDMS-netwerk in een tijd sweep-test met een frequentie van 1 Hz en een oscillerende afschuif spanning van 0,5% bij 100 °C.
- Om de viscoelasticiteit en de tijds afhankelijkheid van het uiteindelijke PDMS-netwerk te bepalen, past u een frequentie sweep test toe met frequentie variërend 0,1-100 Hz en oscillatoire afschuif spanning van 0,5%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor toevoeging van TGF-β, een confluente monolaag van cellen heeft een kasseien achtige vorm en is strak verpakt. Bij de behandeling met TGF-β worden cellen meer langwerpig in de morfologie, waarbij het celgebied wordt vergroot en een mesenchymale fenotype wordt verworven. Gebruikmakend van de multi-Well apparaat gefabriceerd met zachte PDMS elastomeren, werden de fysische eigenschappen van cellen in een totaal 17 verschillende omstandigheden bestudeerd. De cellen werden behandeld met vier verschillende TGF-β-concentraties (0,5, 1, 2 en 4 ng/mL) en vier verschillende incubatie tijden (12, 24, 48, 96 h), en deze resultaten worden samengevat in Figuur 5. De cellen behandeld met TGF-β toegepaste grotere tractie spanningen en stam energieën dan de cellen gekweekt zonder TGF-β. Cellen geïnincubeerd met TGF-β voor 96 h toonde de grootste tractie spanningen en stam energieën. De cellen toegepast grotere spanningen en stam energieën wanneer behandeld met een hogere concentratie van TGF-β. Het verschil in tractie-en stam energieën was meer uitgesproken bij een langere incubatietijd.
Het oppervlak van het substraat moet glad en gelijkmatig bedekt zijn met liganden, zoals fibronectin of collageen. Bekrast oppervlak en/of niet-uniforme coating van liganden kan leiden tot onjuiste celbevestiging, wat resulteert in onnauwkeurige tractie meting. Figuur 6 toont de gelokaliseerde tractie spanningen door het niet-uniforme substraat oppervlak.
Figuur 1 : Overzicht van multi-well plaat fabricage. A) een op maat gesneden glazen glijbaan is het uitgangspunt. B) de glasplaat is bekleed met een dikke (~ 100 μm-laag van pdm's). C) een laag fiduciaire parels (weergegeven in het groen) worden vervolgens met een laag van ~ 1 μm dik bovenop de vorige laag gespin. D) de multi-well Divider wordt zorgvuldig bovenop de fiduciaire kraal laag geplaatst. E) de complete multi-well plaat is geassembleerd en klaar voor gebruik of opslag. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Aangepaste Chuck voor spin-coater. Om te voorkomen dat het onderste glas (waarbij PDMS is gecoat) van de standaard spin-coater Chuck vliegt, wordt een op maat gemaakte houder op de boorkop geplaatst. A) een op maat gemaakte houder voor de spin-coater Chuck. B) technische tekening van de houder met alle afmetingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Substraat stijfheid met veranderende als concentratie (WT%). PDMS-mengsels worden bereid zoals beschreven, met het extra als-percentage dat de elastische modulus verhoogt tot een maximum van 100 kPa bij 1,8 gewichtsprocent (WT%) Als. Als een gids, de modulus als een functie van als fit lineair, die kan worden gebruikt door onderzoekers om hun eigen mengsel te formuleren op een bepaalde gewenste modulus binnen dit bereik. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Reologie van PDMS elastomeer met 0, 0,15, 0,36 en 1 GEW% van de cross link-middelen bij een temperatuur van 100 °c. Driehoekige symbolen duiden op verlies modulus (G ' ') en vierkante symbolen geven opslagmodulus (G ') aan. (A) oscillatoire tijd sweep met een frequentie van 1 Hz en afschuif stam van 0,5% tijdens de gelatie. B) oscillatoire frequentie sweep van het PDMS-netwerk bij afschuif spanning van 0,5%. C) Trek sweep van het PDMS-netwerk met een frequentie van 1 Hz. Alle gegevenspunten werden verworven in drievat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Representatieve resultaten met behulp van tractie stress-apparaat met multi-well-formaat. Monolayer van cellen in verschillende omstandigheden werden gekweekt in een multi-Well apparaat om contractiliteit en stam energie te meten. A) grafiek van tractie spanningen met toenemende TGF-β incubatietijd voor verschillende TGF-β-concentraties. De tractie spanningen stegen met toenemende TGF-β-concentraties en incubatietijd. Alle gegevens zijn statistisch significant met betrekking tot de controle (d.w.z. geen TGF-β), met uitzondering van de volgende: 12 h-0,5 ng, 12 h-1 ng, 48 h-1 ng. B) grafiek van stam energie met toenemende TGF-β incubatietijd voor verschillende TGF-β-concentraties. Stam energieën stegen met toenemende TGF-β-concentraties en incubatietijd. Sample groottes variëren van n = 7 tot n = 15. Alle gegevens zijn statistisch significant met betrekking tot de controle (d.w.z. geen TGF-β) met uitzondering van de volgende: 12 h-0,5 ng, 12 h-1 ng, 24 h-0,5 ng, 24 h-1 ng, 48 h-1 ng. De statistische significantie werd bepaald aan de hand van de Kruskal Wallis-test, die geen normale verdeling op zich neemt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 : Representatieve resultaten van een suboptimaal (a, B) en een bevredigend (C, D) experiment. A) reflectie beeld van het substraat oppervlak. Ongewenste verontreinigingen, waaronder stof of vezels, of materiaaldefecten zoals krassen, zijn aanwezig op het substraat oppervlak. B Stress kaart van cel contractility: als gevolg van het niet-uniforme oppervlak, onregelmatige en onnauwkeurige tractie spanningen worden waargenomen rond de objecten. C Reflectie beeld van het substraat oppervlak. Er zijn geen zichtbare verontreinigingen zichtbaar. D Stress kaart van cel contractility: er zijn geen artefacten discontinuïteiten zichtbaar. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Crosslinker-concentratie (WT%) | G ' (PA) | Standaarddeviatie | E (kPa) | Standaarddeviatie |
| 0 | 0,135 | 0,014 | 0,405 | 0,043 |
| 0,15 | 1 | 0,1 | 3 | 0,35 |
| 0,36 | 4,027 | 0,245 | 12,081 | 0,73 |
| 0,75 | 16,01 | 0,49 | 48,03 | 1,2 |
| 1 | 18,44 | 0,989 | 55,32 | 1,94 |
| 1,5 | 27,638 | 0,93 | 82,91 | 1,64 |
| 1,8 | 33,986 | 0,88 | 101,94 | 1,088 |
| 2 | 33,36 | 0,67 | 100,08 | 1,1 |
Tabel 1: Substraat stijfheid met veranderende als concentratie (WT%). Door extra als concentraties te veranderen, worden PDMS substraten van de gewenste Young moduli gefabriceerd. PDMS shear moduli werden gemeten met een rheometer en Young 's moduli werden bepaald. Voor elk gegevenspunt werden 3 onafhankelijke preparaten uitgevoerd en de standaarddeviatie wordt gegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor het succes van deze methode is het van cruciaal belang om een gelijkmatig gecoat monster met een constante dikte van ongeveer 100 μm te hebben. De modulus moet zorgvuldig worden gekozen om de fysieke betekenis van het biologisch systeem van belang te onderzoeken. Bij het vervaardigen van een toplaag, moet de concentratie van de fiducial fluorescerende deeltjes worden geoptimaliseerd voor een nauwkeurige analyse van verplaatsing en tractie stress. Het analyseren van geïsoleerde enkelvoudige cellen vereist een dichtere fiduciaire laag dan het meten van confluente monolayers. Bovendien moet het oppervlak van het substraat een stabiele en uniforme coating hebben van adhesiemoleculen zoals collageen, fibronectin en laminine om de juiste hechting van de cellen aan het substraat oppervlak te garanderen. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan het bevestigen van de multi-well Divider; het moet worden geplaatst zonder te schuiven om te voorkomen dat de afdichting PDMS lijm wordt besmeurd op het cultuur oppervlak, en de buitenste rand moet zorgvuldig worden uitgelijnd met de glazen afmetingen om lekkages op de grens putten te voorkomen.
Om te voorkomen dat putten ledigen, moet een voldoende hoeveelheid PDMS lijm worden aangebracht op de goed scheidingslijn om het op zijn plaats te houden. Echter, gebruik van buitensporige hoeveelheden zal betrekking hebben op celcultuur oppervlak.
Er moet voldoende volume PDM'S worden toegevoegd tijdens de spin-coating procedure. Bij het uitharden moeten de oven en de rekken niveau zijn. Ontoereikende PDM'S of een ontketende oven kunnen leiden tot ongelijke PDMS-dikte.
De dichtheid van de kraal moet worden geoptimaliseerd voor een juiste analyse. Wanneer de dichtheid van de kraal niet voldoende is, moet de concentratie van de parels in fiduciair PDMS mengsel worden verhoogd. Bovendien moet een voldoende hoeveelheid van het mengsel worden toegevoegd voor spin coating. Om te zorgen voor de juiste fluorescerende signalen van de fiduciaire kraal deeltjes, moet de Uithardings toestand zorgvuldig worden gecontroleerd. Langere tijden en hogere temperaturen dan die welke in dit protocol zijn gespecificeerd, kunnen de fluorescentie verslechteren. Onjuiste eiwit coating op het oppervlak van het monster kan leiden tot een slechte celhechting. Om dit te voorkomen, moet het oppervlak worden gereinigd en moet het verstrijken van reagentia zoals sulfo-SANPAH en liganden worden gecontroleerd. UV-belichtingstijd en-sterkte moeten worden geoptimaliseerd. Immunofluorescentie of andere fluorescerende eiwit constructie kan worden getest om een uniforme ligand coating te garanderen.
Het apparaat dat met deze methode en set van PDMS-formuleringen is gefabriceerd, is alleen toepasbaar op substraten met de jonge moduli variërend van 0,4 kPa tot 100 kPa. Andere moduli mogelijk met behulp van alternatieve formuleringen, echter, het huidige bereik omvat een groot aantal fysiologisch relevante waarden. Hoewel deze methode specifiek voor multi-well-fabricage is, kan deze ook worden gebruikt om afzonderlijke dia's of andere dia-geometrieën voor te bereiden, en in deze gevallen kan verdere probleemoplossing van de gebruiker nodig zijn. In deze uitvoeringsvorm wordt een relatief dikke (1 mm) glasplaat gebruikt, waarbij gemeenschappelijke hoge numerieke diafragma (NA)-doelstellingen op een omgekeerde Microscoop worden voorkomen. Hoewel het technisch haalbaar is om deze multi-well TFM-gerechten te construeren met dunner glas, kan de kwetsbaarheid van deze in verwerking en assemblage resulteren in een hoge mate van breuk en kan dit in tegenstelling tot de hogere doorvoer benadering worden gebruikt. Bovendien kan de oppervlaktecoating verder worden onderzocht op bredere toepassingen van het apparaat.
Met behulp van een multi-well-formaat, high-throughput experimenten zijn mogelijk. Multi-well formaat stelde ons in staat om de fysieke veranderingen van NMuMG cellen te onderzoeken tijdens EMT met TGF-β behandeling met combinaties van verschillende concentraties en verschillende incubatie tijden in één gerecht. Fabricage van tractie stress-apparaten met hydrogels zoals polyacrylamidegel hebben verschillende beperkingen. Met het dominante ingrediënt water zijn hydrogels gevoelig voor zoutconcentraties (osmolariteit), temperatuur, vochtigheid en pH-veranderingen. Veranderingen in een van deze eigenschappen kunnen leiden tot de verandering in de mechanische eigenschappen van het materiaal, waarbij extra zorg nodig is bij het gebruik van samples en het interpreteren van resultaten. Bovendien, met water, zijn hydrogels gevoeliger voor infecties, die extra zorg nodig. In tegenstelling tot watergedragen hydrogels is op siliconen gebaseerde PDM'S stabiel en inert. Eenmaal gefabriceerd, het kan worden opgeslagen op kamertemperatuur voor onbepaalde tijd zonder speciale handling of opslag voorwaarden.
Het ondoorlaat bare karakter van PDM'S stelt ons in staat om een monolithische ondergrond te fabriceren, zodat alle putjes echt identiek zijn in substraat dikte en-samenstelling, terwijl unieke biochemie in de media kan worden toegepast, of verschillende cellen die in elke Goed. Een oppervlak op basis van hydrogel maakt diffusieve factoren mogelijk om door te dringen en er doorheen te reizen, waardoor de hydrogel moet worden toegevoegd aan putten die anders zijn afgescheiden om kruisbesmetting te voorkomen.
Deze methode stelt onderzoekers in staat om cel-contractiliteit te bestuderen, een fundamenteel en alomtegenwoordig aspect van celbiologie, op een manier met hoge doorvoer, waardoor efficiëntere en reproduceerbare gegevensverzameling mogelijk is. Dit helpt bij het vertalen van tractiekracht microscopie in contractile Force screening, waardoor onderzoekers echt gebruik van contractiliteit als een metriek voor de celactiviteit, of de werkzaamheid van een compound. Als een methodologie, dit heeft brede toepassingen in de biofysische en Biomedische Wetenschappen, van het begrijpen van de fysica van cellen, te karakteriseren en testen van farmaceutische verbindingen tegen gestandaardiseerde celtypen, of misschien zeer gespecialiseerde individuele cellen voor gepersonaliseerde geneeskunde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AJE en RK hebben interesse in Live Cell-technologieën, een bedrijf dat in dit artikel beschreven materialen fabriceert.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Tom Kodger, Michael Landry, en Christopher J. Barrett voor hulp bij de kraal synthese. A.J.E. erkent de Raad natuurwetenschappen en ingenieurs onderzoek, verleent RGPIN/05843-2014 en EQPEQ/472339-2015, Canadian Institutes of Health Research Grant No. 143327, Canadian kanker Society Grant No. 703930 en Canadian Foundation for Innovation Project #32749. R. Krishnan erkent nationale instituten voor gezondheidszorg Grant No. R21HL123522 en R01HL136209. H.Y. werd gesteund door Fonds de Recherche Santé Québec en Fonds de Recherche Nature et Technologies Québec. De auteurs bedanken Johanan Idicula voor hulp bij de video en manuscript en Zixin he voor hulp bij het voorbereiden van de video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP |
References
- Harris, A., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K.
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Yoshie, H., Koushki, N., et al. Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers. Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).
- Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Agus, D. B., et al. Physical Sciences - Oncology Centers Network. A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells. Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).
- Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
- Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells. Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).
- Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer. Colloid & Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).
