Summary
シリコーンゴム(PDMS)で製造された高スループットトラクション力アッセイを提示する。この新しいアッセイは、様々な生物学的および生物医学的プロセスおよび疾患における細胞収縮性の物理的変化を研究するのに適している。上皮間葉転移中の収縮性のTGF-β依存性の増加を測定することにより、この方法の有用性を実証する。
Abstract
細胞の収縮性は、生物学の多様な側面において不可欠であり、運動性と分裂から組織収縮および機械的安定性に至るまで、多細胞動物生活の中核的な要素を表すプロセスを駆動する。付着細胞では、アクトミオシン収縮は、細胞がその基板に作用する牽引力で見られる。細胞収縮の調節不定は無数の病理に現れ、生物物理学をメトリックとして用いた多様な診断アプローチにおいて、収縮性が有望な標的となる。さらに、新しい治療戦略は、細胞収縮の明らかな誤動作を修正することに基づいていることができます。しかし、これらのアプリケーションは、これらの力の直接定量化を必要とします。
シリコーンエラストマーベースのトラクション力顕微鏡(TFM)を並列マルチウェルフォーマットで開発しました。シリコーンゴム、特にポリジメチルシロキサン(PDMS)を使用することで、一般的に使用されるヒドロゲルポリアクリルアミド(PAA)ではなく、特殊な貯蔵条件を必要としない無期限の棚寿命を持つ堅牢で不活性な基板を作ることができます。GPa範囲に係数を持つピラーPDMSベースのアプローチとは異なり、ここで使用されるPDMSは、約0.4 kPaから100 kPaに至るまで、非常に準拠しています。これらの大きなモノリシック基板を生化学的に独立したウェルに空間的に分割することにより、TFMのハイスループットプラットフォームを作成し、既存のマルチウェルシステムと互換性のある牽引力スクリーニングのためのマルチウェルプラットフォームを作成します。
この原稿では、このマルチウェル牽引力システムを使用して、上皮から間質遷移(EMT)を調べます。NMuMG細胞にEMTを誘導し、TGF-βにさらすことで、EMT中の生物物理学的変化を定量化します。TGF-β暴露の濃度と持続時間の関数として収縮性を測定する。我々の知見は、疾患生物物理学の文脈における並列化されたTFMの有用性を示す。
Introduction
アクトミオシン収縮は、運動性および増殖から幹細胞分化に細胞行動に影響を与える活性細胞力学の不可欠な要素である。組織では、収縮性は胚形成における極性分離から気道収縮および心臓活動に活動を駆動する。批判的に、緊張を生成するために、細胞は最初に細胞外環境に付着しなければなりません。そうすることで、この収縮性は周囲に牽引力を生み出す。トラクションフォース顕微鏡(TFM)は、異なる条件下で多様な細胞からこれらの力を定量化する方法として、多数の形態で出現した。
TFMの分野は、革新と応用の例外的な幅を見てきました, そして、結果は、力学と物理的な力を組み込んだ生物学の新しい視点のための道を開きました.シリコーン基板1のしわから始まり、研究者は細胞牽引力を測定するために様々な技術を適用してきました。これらのアプローチは継続的に改善され、現在は数ミクロン2の順序で解像度のレベルに達しています。しかし、1つの主な問題が浮上しており、これは利用可能なシリコーンを用いて適切に低いモジュリの基板を作成する難しさである。この問題を回避するために、ポリアクリルアミドは、1-20 kPa3の順序で基板を作成する容易さのために代替として採用されました。我々は最近、TFM4に非常に準拠したシリコーンを実装し、ポリアクリルアミドと同じ範囲のモジュリを製造することができますが、不活性で堅牢なシリコーンの利点を持ちます。
TFMのアプローチは貴重なメカノ生物学的発見を可能にしましたが、持続的な欠点は、その複雑さであり、多くの場合、工学や物理科学の分野の研究者にその使用を制限します。これは、収縮性を定量化するために必要な詳細なキャリブレーションと挑戦的な計算に大部分が起因します。もう一つの重要な課題は、TFM法が主に低スループットであり、したがって、同時に多くの異なる条件や集団を研究するのに適していないことです 5.これは、より広範な生物学的および薬理学的応用への専門的な生物物理学からのTFMの移転を妨げているボトルネックを提示している。
我々は最近、研究者が異なる化合物の影響を探求し、またより少ない試薬を使用しながら、収縮性メトリックのより速い定量のために彼らのTFM測定値を並列化することを可能にするマルチウェルフォーマットTFMプレートを開発しました4.この方法論は、細胞活動に対する化合物の影響の評価から、分化または疾患の収縮変化の定量化にまで、多様なメカノバイオロジー研究において広範な有用性を有する。
TFMから大きな利益を得る生物医学的研究の1つの領域は、物理的な手がかりが癌細胞の悪性発現型にどのように影響するかの研究です。転移は、癌関連死の90%を担う、癌細胞が元の腫瘍部位を離れ、二次部位を植民地化することを特徴とする。細胞が組織を通って移動し、血管系の中を出入りするためには、細胞外マトリックスに沿って自分の道を引っ張ったり、他の間を移動したりする実質的な力を生み出しながら、これらの物理的な障壁を圧迫するために形状を根本的に変更する必要があります。細胞。これらの力は、焦点接着相互作用2、3を介して基板に伝達され、TFMを用いて定量することができる。癌は非常に多様であるが、既知の突然変異およびタンパク質の変化の拡大するレパートリーと共に、いくつかの一般的な物理的変化が観察されている。乳癌、前立腺癌、肺癌を含む様々な癌において、転移細胞は非転移細胞6、7、8の牽引力の2〜3倍を発揮することが示されている。これらの結果は、転移性進行と細胞が働く牽引力との間に強い相関関係がある可能性があることを示唆している。しかし、収縮性の詳細な時間依存の変化を調べるのは困難です。
上皮間葉転移(EMT)は、細胞が付着性および接合接合性媒介細胞接着を減少させ、より渡り、侵襲的になるプロセスである。創傷治癒や発達過程を含む生理機能に加えて、EMTは転移時に利用されるプロセスであり、このプロセスを研究するのに有用なモデルシステムです。TGF-βを用いて、マウス乳液上皮細胞(NMuMG)9にEMTを誘導し、この形質転換中の物理的変化を直接定量し、EMTおよび細胞収縮性に対するTGF-βの時間および用量依存的効果を特徴付けることができる。この記事では、誘発EMT中の収縮性の変化を測定することによって、このアプローチの有用性を実証する。
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Protocol
注: 次のプロトコルは、図 1に示すマルチウェル TFM 皿の製造と使用に関する研究者を導きます。
1. PDMSシリコーン基板の調製
- 2つの市販キットの複合混合物に基づくPDMSシリコーンゴム混合物の調製。
- PDMSキットのパートAとパートB(例えば、GEL-8100、材料の表を参照)を50 mLチューブに1:1の重量比で追加します。
注:混合物は完全な混合を保障するために回転子の間に混合物が前後に流れるのに十分な遅い速度で混合される。 - 基板の所望の係数に必要な硬化剤を添加する。
注:混合物に添加される硬化剤の量は、基板の所望の係数に依存し、典型的には0.1%から1.8%の範囲であり得る。特定の架け出具濃度および結果のモジュリに関するガイドについては、表1および図3を参照してください。 - 30-45分間、回転子上の製剤を混合します。回転が完全に混合するのに十分遅くなることを確認してください。
- PDMSキットのパートAとパートB(例えば、GEL-8100、材料の表を参照)を50 mLチューブに1:1の重量比で追加します。
- 底層:ガラススライド上のコーティングPDMS基板
- 図 2に示すカスタム構築チャックをスピンコーターに配置します。エタノールまたはイソプロパノールでガラスをきれいにし、糸くずを入れない拭き取りで乾かします。ガラススライドをチャックに置き、真空をオンにしてスライドを所定の位置に保持します。
- 未硬化のPDMSをエッジから約1cm塗布し、中心に向かって作業します。表面全体が覆われるように十分な(3-4 mL)PDMSを適用します。
注: PDMS がガラスの表面に均等に広がるように、ピペット先端はPDMS混合物を中心から端に広げるのに役立ちます。 - 次のプロトコルでスピンコーター上のPDMS混合物でガラスを回転させます。
- 未硬化のPDMSをスライド上に広げるには、0から200 rpmまで50 rpm/秒で加速します。200 rpmで1分間保持します。
- 100 μm の厚い PDMS 層を実現するには、50 rpm/s ~ 300 rpm で加速し、300 rpm で 1 分間保持します。100 μm 以外の所望の厚さが異なる場合、特定の速度値が必要になります。
- 取り外すには、50 rpm/s で 0 rpm に減速します。真空を無効にし、コーティングされたスライドを取り外し、コーティングされた表面に触れないように注意してください。
注: 滑らかな連続サーフェスを確保するには、加減速ステップを含める必要があります。
注意:サンプルがチャックから飛び出さないようにするために、カスタムメイドのホルダーを使用してスライドを保持し、単に真空と既存のフラットチャックに依存しないようにする必要があります。このホルダーの詳細と仕様は図 2 に表示されます。
- スピンコーティングされたサンプルをオーブンに入れ、メーカー推奨温度(100°C)を2時間使用します。
注:サンプルを配置するオーブンの表面は、サンプルの均一な加熱と厚さを確保するために固体(ワイヤラックではない)と水平面でなければなりません。セラミックまたは鋼板は理想的な表面を作る。
- トップビーズレイヤー
- 残りのPDMS混合物に適切な比率でビーズ溶液を添加します。
注:この比率は、ストックビーズ溶液の濃度とサンプル上の所望のビーズ密度に依存します。一般的な最終値は 9.2 x 1011ビーズ/mL および 0.05-0.2 ビーズ/μm2であり、一般にビーズの過剰は不十分な量よりも好ましいです。 - ビーズ溶液を未硬化PDMSと混ぜます。これは、約30分間、1-2分の渦、または30分間の超音波処理のために、回転子にチューブを置くことによって達成することができる。これらの方法は組み合わせてもよい。
注:我々のアプリケーションでは、超音波処理はビーズの凝集体を破壊するのに有効であり、回転は混合に有効であることがわかります。合成受託ビーズは、貯蔵中に凝集してもよい。使用前に、ヘキサンで再懸濁し、超音波処理を行うことができます。大きな凝集体が大きい場合は、5 μmのシリンジフィルターを通してビーズ懸濁液をろ過することができます。このろ過ステップはオプションです。これは、単分散ビーズでサンプルをコーティングするのに役立ちますが、ビーズのかなりの部分がフィルタで失われる可能性があります。 - オーブンからスライドを取り出し、室温まで冷却し、スピンコーターの上に置きます。
- ビーズと未硬化PDMS混合物の3-4 mLを被覆サンプルの表面に追加します。
注:ビーズを添加した混合物は、ヘキサンによる粘性が低いです。既にコーティングされたPDMS基板に損傷を与える可能性があるため、基板の表面に触れないようにしてください。さらに、ビーズ混合物は、最初は表面を濡らさない場合があります。混合物がすぐに硬化したPDMS表面から流れ出らないことに注意してください。 - サンプルを次のプロトコルでスピンします。
- ビーズと未硬化PDMS混合物を広げるには、0から500 rpmまで100 rpm/sで加速します。500 rpmで1分間保持します。
- ビーズ埋め込みPDMS(約1μm)の薄い層を達成するには、500から5000のrpmに200 rpm/sで加速します。5000 rpmで10sに保持します。
- 取り外すには、100 rpm/s で 0 rpm に減速します。真空を無効にし、コーティングされたスライドを取り外し、コーティングされた表面に触れないように注意してください。
- スピンコーティングされたサンプルをオーブンに100°Cで1時間置きます。
注:100°C以上の温度または1時間より長い持続時間は、ビーズの蛍光を減らすことができます。オーブンの温度が100°Cに設定され、それ以上ではないことを確認してください。 - プロトコルはここで一時停止できます。サンプルを保存するには、ほこりや光の露出を避けるために表面を覆います。表面に何も触れていないことを確認します。サンプルは室温で無期限に棚に安定している。
- 残りのPDMS混合物に適切な比率でビーズ溶液を添加します。
- プレートの組み立て
- PDMSエラストマーキットのパートA(ベース)とパートB(硬化剤、例えばシルガード)を50mLチューブに10:1の重量比で追加します。
- 30-45分間回転子の混合物を混ぜます。
注:1枚のプレートの場合、5 mLのベースと硬化剤の0.5 mLを混ぜます。最大1mLのヘキサンを添加して混合物の粘度を低下させることができる。 - 仕切りの底に混合物を適用し、混合物を広げます。
注: 仕切りは上下逆さまに配置する必要があります。 - 基板を仕切りに逆さまに置く。
- サンプルをオーブンで逆さまに65°Cの2時間置きます。
- オーブンからサンプルを取り出し、70%のエタノールまたはイソプロパノールでガラスの底をきれいにしてPDMS残渣を除去します。
注: プロトコルはここで一時停止できます。サンプルを保存するには、基板に蓋を置き、デバイスをアルミホイルで包み、光にさらされるのを避けます。サンプルは室温で無期限に棚に安定している。この方法で使用されるディバイダは 96 ウェル形式です。しかし、研究者は、所望の実験設定と分割構造の可用性に応じて、他のフォーマット(384ウェル、2ウェル、4ウェル、8ウェルなど)を採用することができます。さらに最適化が必要になる場合があります。
2. 表面の機能化
- スルフォ-SANPAHアリコートの80 μLを0.1M HEPESバッファー(pH 7-9)の40 mLで溶解します。
注:滅菌ジメチルスルホキシド(DMSO)の2 mLにスルフォ-SANPAH粉末の100mgを溶解することにより、スルフォ-SANPAHアリコートを調製します。無菌脱イオン水の450 mLでHEPESの50 mLを希釈することにより0.1 M HEPESバッファを準備し、0.22 μmの細孔フィルターを通して濾過します。 - 希釈されたスルフォ-SANPAH溶液を96ウェルプレートの各ウェルに200μL加えます。
- 適切な距離と持続時間で、プレートを UV (300~460nm) の光にさらします。
注: UV 露出後、溶液の色は暗くなります。UV 露出距離と持続時間は、UV ランプの電力によって異なります。我々のアプリケーションでは、我々は5センチメートルの距離で10〜15分を公開します。 - ウェルからSulfo-SANPAH溶液を取り出し、各ウェルに5 μg/mLフィブロネクチン溶液の200 μLを追加します。
注:研究者指定のタンパク質は、表面コーティングに使用することができます。一般的に使用されるタンパク質の中には、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンがあります。Sulfo-SANPAHが最も効果的な方法であることが判明し、PDMSで使用している間のプラズマ洗浄は、二酸化ケイ素層を作成し、表面を目に見えて損傷するので、お勧めしません。 - プレートを一晩4°Cでインキュベートします。
注:コーティングに使用されるタンパク質に応じて、異なるインキュベーション方法を適用することができます。 - フィブロネクチン溶液を取り出し、リン酸緩衝生理食べ物(PBS)で各をよく洗います。
- サンプルに蓋を付します。
- 各ウェルに200 μLのPBSを追加します。
注: プロトコルはここで一時停止できます。フィブロネクチンコーティングされたサンプルは、最大2週間4°Cで保存することができます。
3. 紫外線殺菌
- 生物学的安全キャビネットでUV光の下でサンプルを30分間殺菌します。
注:紫外線暴露時間が長いと、ビーズの蛍光に悪影響を及ぼす可能性があります。後続のすべてのステップは、無菌条件下で実行する必要があります。
4. 細胞培養
- 各ウェルからPBSを取り出し、培養培養培養物に懸濁した細胞を200μLずつ各ウェルに加えます。
- 目的の細胞密度で細胞をプレートします。細胞密度は、所望の実験に依存する。単一細胞研究では、細胞は最小50μm離れている必要があり、イメージングウィンドウのエッジ付近の細胞はTFM測定に含めるべきではありません。単層セルの場合、イメージング ウィンドウには、セルのコンフルエント層で覆われた表示フィールドが必要です。
- 5%FBS、10mM HEPES、10 μg/mLインスリン、1%ペニシリン連鎖マイシン、1mM L-グルタミン、および0.5 μg/mLアンホテリシンBでDMEMを補うことによってNMuMG細胞の完全な増殖培養培養培養剤を調製する。
- 酸性水(脱イオン水の130mLで氷河酢酸の2.5mL)を10mg/mLの濃度に再構成してインスリンストックを調剤する。ストック溶液を4°Cに保存します。溶液が明確になるまで待ってから、0.22 μmの細孔フィルターを通してフィルタリングします。
- TGF-β添加
- TGF-βストックを調製するには、10mMクエン酸(pH3.0)の100μLでTGF-βの2μgを溶解し、0.22 μmの細孔で濾過殺します。チューブとアリコートを所望のボリュームに渦巻きます。アリコートは-80°Cで保存します。
- 完全な細胞培養培養培養培養培養培養培養液の10mLにTGF-βストック溶液の1.5 μLを添加し、最終的なTGF-β濃度を3ng/mLで構成する。
注:10 mM pH 3.0クエン酸を作るために、水中で酸を希釈し、HClを添加してpHを3.0に調整します。
5. データ取得
- 各位置について、受託粒子および細胞の少なくとも1つの画像を取得する。ビーズ層に焦点を当てます。
注: ピクセルサイズは、使用する受託者粒子および画像処理方法のサイズに基づいて最適化する必要があります。このアプリケーションでは、著者は10x 0.4 NAの目的を使用し、画像は455 nm/ピクセルで1024 x 1024解像度で取得されます。一般に、ビードあたり少なくとも約 1 ~ 5 ピクセルの解像度を保持すると便利です。ここで、ビーズは多分散であり、300〜500 nmの個々のサイズを持っています。蛍光受託者ビーズは、TFM計算に使用される画像に焦点を当てることは重要です。ビーズの焦点とイメージング品質は、細胞自体のイメージングよりも優先されるべきである。異なるチャネル間のクロストーク、特にビーズのイメージングスペクトルに現れる受託ビーズからの蛍光は存在してはなりません。 - 対象となるすべての位置が記録されたら、各ウェルに剥離液を追加して、受託粒子の無力参照画像を取得します。
- 細胞剥離溶液を調製するには、2%のTritonX-100、50mMのアジドナトリウム、および500mMの水酸化カリウムを含む水溶液を混合する。
注:上記は、効果的な剥離ソリューションの例として提供される。研究者の裁量で異なる剥離溶液を使用して、基板表面から細胞を切り離す場合があります。
- 細胞剥離溶液を調製するには、2%のTritonX-100、50mMのアジドナトリウム、および500mMの水酸化カリウムを含む水溶液を混合する。
6. 画像解析
- 必要に応じて適切な画像解析を実行します。
注:分析ソフトウェアは、社内で開発されました。画像解析は、オンラインで入手可能なカスタムメイドのソフトウェアまたはソフトウェアで行うことができます。
7. ビーズ合成
注: 次のプロトコルは、Klein et al.10によって記述された合成方法に基づいています。
- ヒュームフードの下で、水冷還流コンデンサーで3ネックフラスコを準備します。
注意:換気性の良い化学ヒュームフードに合成を設定します。 - フラスコにPDMS安定剤と蛍素を0.5mL加えます。
- 窒素入口針と出口針を持つゴム中隔で一方の首を装備し、注射器で試薬を追加するためのゴム中隔で他の首を装備します。
- フラスコに250mLの無水ヘキサンを100mL加え、小さな磁気攪拌棒を加えます。
- フラスコを75°Cのミネラルオイルバスに入れ、窒素ガスで1時間パージします。
- 25 mLの丸底フラスコに6mLのメチルメタクリレートを加えます。
- 丸底フラスコに2,2'-アゾビソブチリトリル(AIBN)の0.100gを加え、窒素ガスで1時間パージします。
注:使用前に阻害剤を除去するために、事前にパックされたカラムを通してメチルメタクリレートをフラッシュします。メチルメタクリレートとAIBN混合物を3ネックフラスコに加えます。 - 溶液は、最初は曇りになり、乳白色になります。溶液が曇った後、3時間反応を実行してみましょう。
- 3時間後、フラスコを氷水浴に入れます。
- 粗いフィルターペーパーで溶液を真空フィルターします。
- 濾液を遠心分離し、ヘキサン中の粒子を再中断する。
注:添加するヘキサンの体積は、ビーズ溶液の所望の濃度に依存する。超音波処理は、ヘキサン溶液中のビーズ粒子の再分散を容易にする。著者によって生成されたビーズは、約300〜500nmのポリ分散直径を持っています。変位を決定するために相互相関パターントラッキングを使用するため、単分散ビーズは必要ありません。
8. 生理学測定プロトコル
注:Rheologyは、すべての研究者や実験のために必要とされるわけではありませんが、PDMSの新しい製剤のためのモジュリを定量化する必要があります。このプロトコルでは、PDMSサンプルのモジュラーに対する架線、周波数、歪みの影響を測定するためにせん断レオメーターを採用しています。利用可能なツールと専門知識に応じて、モジュリは他の多くの機械的解析アプローチを使用して測定することもできます。さらに、このプロトコルを使用する研究者は、表1、図3および図4に示された公開されたモジュリを使用することを選択するかもしれません。
- 直径 25 mm の平行プレート ジオメトリを持つレオメーターを使用します。その他のジオメトリを使用できます。
- システムを初期化し、デバイスと測定システム(平行プレート、d = 25 mm)を校正します。ゼロギャップを測定した後、PDMSサンプルのロードを開始します。
- PDMSエラストマーと架橋剤が混合されるとすぐに、レオメーターの底板に混合物をピプテします。
- スピンドルを下に移動して、PDMS サンプルの上部に完全に接触します。
- ロードされたサンプルの過剰をボトムプレートから慎重にトリミングします。
- ひずみスイープテストでは、異なる架橋密度を持つ各組成物に対して増加する歪みを適用して、すべてのせん断測定中にポリマー構造が線形粘弾性政権に残ることを確認します。
注:細胞研究に関連するひずみ値は、通常、0.1〜10%の範囲です。PDMSは約100%のひずみまで直線的であることがわかった。 - 1Hzの周波数と100°Cで0.5%の振動せん断歪みを持つタイムスイープテストでPDMSネットワークの動的せん断貯蔵係数(G')および損失率(G'')を測定します。
- 最終的なPDMSネットワークの粘弾性と時間依存性を決定するには、0.1~100 Hzの周波数範囲と0.5%の振動せん断歪みを持つ周波数スイープテストを適用します。
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Representative Results
TGF-βを添加する前に、細胞のコンフルエント単層は、形状のような石畳を有し、しっかりと詰め込まれる。TGF-β治療では、細胞は形態でより細長くなり、細胞領域を拡大し、より間葉性表現型を獲得する。ソフトPDMSエラストマーで製造されたマルチウェル装置を用いて、合計17種類の条件で細胞の物性を検討した。細胞を4つの異なるTGF-β濃度(0.5、1、2、および4 ng/mL)と4つの異なるインキュベーション時間(12、24、48、96時間)で処理し、これらの結果を図5に要約した。TGF-βで処理した細胞は、TGF-βを用いずに培養した細胞よりも大きな牽引応力およびひずみエネルギーを適用した。96時間TGF-βでインキュベートした細胞は、最大の牽引応力および歪みエネルギーを示した。細胞は、TGF-βのより高い濃度で処理した場合、より大きなストレスとひずみエネルギーを適用しました。トラクションとひずみエネルギーの違いは、より長いインキュベーション時間でより明確でした。
基板の表面は、フィブロネクチンやコラーゲンなどのリガンドで滑らかかつ均一にコーティングする必要があります。リガンドの傷面や不均一なコーティングは、不適切な細胞取り付けにつながり、トラクション測定が不正確になる可能性があります。図6は、不均一な基板表面による局所的な牽引応力を示す。
図 1:マルチウェルプレート製造の概要。(A) カスタムカットガラススライドが出発点です。(B) ガラススライドは厚さ(PDMSの約100μm層)でコーティングされています。(C) 受託ビーズの層(緑色で示す)は、前の層の上に約1μmの厚い層でスピンコーティングされます。(D) マルチウェルディバイダは、受託ビーズ層の上に慎重に配置されます。(E) 完全なマルチウェルプレートが組み立てられ、使用または貯蔵の準備ができている。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:スピンコーター用カスタムチャック。標準のスピンコーターチャックからボトムガラス(PDMSがコーティングされている)が飛び出ないように、カスタムメイドのホルダーをチャックの上に置きます。(A) スピンコーターチャック用のカスタムメイドホルダー。(B) すべての寸法を持つホルダーのエンジニアリング図面。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3:架架化機濃度の変化に伴う基板剛性(wt%)。PDMS混合物は、追加の架線部のパーセンテージが1.8重量パーセント(wt%)で100 kPaの最大まで弾性率を増加させるとともに調製される。クロスリンカー。ガイドとして、架リンカーの関数としてのモジュラスは直線的にフィットし、研究者がこの範囲内の特定の所望のモジュラスで独自の混合物を定式化するために使用することができる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 0、0.15、0.36および1重量%の架架剤を100°Cの温度で含有するPDMSエラストマーの回転数。三角形記号は損失係数(G'')を示し、正方形の記号はストレージモジュラス(G')を示します。(A) 振動時間は1Hzの周波数でスイープし、ゲル化中に0.5%のせん断歪み。(B) PDMSネットワークの振動周波数スイープは0.5%のせん断歪み。(C) 1 Hzの周波数でPDMSネットワークのひずみスイープ。すべてのデータ ポイントは三分の一で取得されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5:マルチウェルフォーマットのトラクションストレスデバイスを利用した代表的な結果。異なる条件下の細胞の単層をマルチウェル装置で培養し、収縮性および歪みエネルギーを測定した。(A) 異なるTGF-β濃度に対するTGF-βインキュベーション時間の増加に伴う牽引応力のグラフ。TGF-β濃度およびインキュベーション時間の増加に伴ってトラクション応力が増加した。すべてのデータは、次を除く制御に関して統計的に有意である(すなわち、TGF−βなし):12 h - 0.5 ng、12 h - 1 ng、48 h - 1 ng。(B) 異なるTGF-β濃度に対するTGF-βインキュベーション時間の増加に伴う歪みエネルギーのグラフ。TGF-β濃度およびインキュベーション時間の増加に伴って歪みエネルギーが増加した。サンプルサイズの範囲はn = 7からn =15です。すべてのデータは、次を除く制御に関して統計的に有意である(すなわち、TGF-βなし):12 h - 0.5 ng、12 h - 1 ng、24 h - 0.5 ng、24 h - 1 ng、 48 h - 1 ng。統計的有意性は、正規分布を想定しないクルスカル・ウォリス検定を用いて決定された。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6:最適でない(A、B)および満足のいく(C、D)実験による代表的な結果。(A) 基板表面の反射画像。ほこりや繊維を含むことができる望ましくない汚染物質、またはスクラッチなどの材料欠陥が基板表面に存在する。(B)セル収縮性の応力マップ: 不均一なサーフェスのため、オブジェクトの周囲に不規則で不正確な牽引応力が観察されます。(C)基板表面の反射画像。見かけの汚染物質は見えません。(D)セル収縮性の応力マップ: アーティファクトの不連続性は表示されません。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 架リンカー濃度(wt%) | G' (Pa) | 標準偏差 | E (kPa) | 標準偏差 |
| 0 | 0.135年 | 0.014 | 0.405 | 0.043 |
| 0.15 | 1 | 0.1年 | 3 | 0.35 |
| 0.36分 | 4.027 | 0.245 | 12.081円 | 0.73年 |
| 0.75年 | 16.01の | 0.49件 | 48.03円 | 1.2年 |
| 1 | 18.44円 | 0.989円 | 55.32年 | 1.94件 |
| 1.5年 | 27.638円 | 0.93件 | 82.91円 | 1.64の |
| 1.8年 | 33.986円 | 0.88円 | 101.94年 | 1.088 |
| 2 | 33.36 | 0.67 | 100.08円 | 1.1年 |
表 1:架架化機濃度の変化に伴う基板剛性(wt%)。追加の架リンカー濃度を変化することにより、所望のヤングモジュラーのPDMS基板が製造される。PDMSせん断モジュリをレオメーターで測定し、ヤングのモジュリを決定した。データポイントごとに、3つの独立した準備が行われ、標準偏差が与えられます。
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Discussion
この方法の成功のためには、約100μmの一定の厚さの均一にコーティングされたサンプルを持つことが重要です。モジュラスは、目的の生物学的システムの物理的な意義を調べるために慎重に選択する必要があります。最上層を製造する場合、フィデューシャル蛍光粒子の濃度は、変位と牽引応力の正確な分析のために最適化する必要があります。単一細胞を分析するには、コンフルエント単層を測定するよりも密度の高い受託層が必要です。さらに、基板の表面は、基板表面に細胞が適切に取り付けられることを保証するために、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどの接着分子の安定した均一なコーティングを有する必要があります。マルチウェルディバイダーを取り付ける場合は、特に注意が必要です。PDMS接着剤が培養面に塗りつぶされないようにスライドせずに配置し、外側のエッジをガラスの寸法に慎重に合わせて、国境の井戸に漏れないようにする必要があります。
井戸が漏れないようにするには、十分な量のPDMS接着剤を井戸の仕切り器に塗布して所定の位置に保持する必要があります。しかし、過剰な量の使用は、細胞培養表面をカバーします。
スピンコーティング手順中に十分な量のPDMSを追加する必要があります。硬化する場合、オーブンとラックは水平である必要があります。PDMS が不十分であったり、オーブンの平らでない場合は、PDMS の厚さが不均一になる可能性があります。
ビーズ密度は、適切な分析のために最適化する必要があります。ビーズ密度が十分でない場合、受託PDMS混合物中のビーズの濃度を増加させる必要があります。さらに、スピンコーティングのために十分な量の混合物を添加する必要があります。受託ビーズ粒子の適切な蛍光シグナルを確実に確保するために、硬化状態を注意深く監視する必要があります。このプロトコルで指定されたものよりも長い時間と高い温度は、蛍光を低下させる可能性があります。試料表面の不適切なタンパク質コーティングは、細胞の接着性の低下につながる可能性があります。これを防ぐためには、表面を洗浄する必要があり、Sulfo-SANPAHやリガンドなどの試薬の有効期限をチェックする必要があります。紫外線暴露時間と強度を最適化する必要があります。免疫蛍光または他の蛍光タンパク質構築物は、均一なリガンドコーティングを確保するために試験されてもよい。
この方法およびPDMS製剤のセットで製造された装置は0.4 kPaから100 kPaの範囲のヤングのモジュリとの基質にのみ適用可能である。他のモジュリは代替製剤を用いて可能であり、しかし、現在の範囲は生理学的に関連する値の大規模なセットに及ぶ。この方法は、マルチウェル製造専用ですが、個々のスライドやその他のスライド ジオメトリの準備にも使用できます。本実施形態では、比較的厚い(1mm)ガラススライドが採用され、反転顕微鏡上で一般的な高い数値開口(NA)の目的を排除する。より薄いガラスを使用してこれらのマルチウェルTFM皿を構築することは技術的に可能ですが、処理および組み立てにおいてこれらの脆弱性は、高い破損率をもたらす可能性があり、より高いスループットアプローチに反して実行することができます。さらに、表面コーティングは、装置のより広い適用のためにさらに調べてもよい。
マルチウェルフォーマットを利用して、ハイスループット実験が可能です。マルチウェルフォーマットにより、EMT中のNMuMG細胞の物理的変化を、1皿で異なる濃度と異なるインキュベーション時間の組み合わせでTGF-β処理で調べることを可能にしました。ポリアクリルアミドゲルなどのヒドロゲルを用いたトラクションストレスデバイスの製造には、いくつかの制限があります。主成分が水である場合、ヒドロゲルは塩濃度(浸透度)、温度、湿度、pH変化に敏感です。これらの特性のいずれかの変化は、材料の機械的特性の変化につながる可能性があり、サンプルの使用と結果の解釈に特別な注意が必要です。さらに、水を持つ、ヒドロゲルは感染症の影響を受けやすく、特別な注意を必要とします。水系ヒドロゲルとは対照的に、シリコーンベースのPDMSは安定しており、不活性です。一度製造されると、それは特別な取り扱いまたは貯蔵条件を要求しないで無期限に室温で貯えることができる。
PDMSの不透過性により、モノリシック基板を作製し、すべてのウェルが基板の厚さと組成において真に同一であることを保証する一方で、独自の生化学をメディアに適用したり、それぞれに異なる細胞を利用することができます。まぁ。ヒドロゲルベースの表面は、拡散因子が浸透し、それを通過することを可能にし、クロスコンタミネーションを防ぐために別部されている井戸にヒドロゲルを追加する必要があります。
この方法により、研究者は細胞生物学の基本的かつユビキタスな側面である細胞収縮性を高スループットの方法で研究することができ、より効率的で再現性の高いデータ取得が可能になります。これは、トラクションフォース顕微鏡を収縮力スクリーニングに変換するのに役立ち、研究者は細胞活性または化合物の有効性の指標として収縮性を真に使用することができます。方法論として、これは、細胞の物理学の理解から、標準化された細胞型に対する医薬品化合物の特徴付けと試験、またはおそらく高度に専門化された、生物物理学および生物医学分野に広い応用を持っています。個別化医療のための個々の細胞。
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Disclosures
AJEとRKは、この記事に記載されている材料を製造するライブセルテクノロジーに関心を持っています。
Acknowledgments
著者らは、トム・コジャー、マイケル・ランドリー、クリストファー・J・バレットにビーズ合成の支援に感謝しています。A.J.E.は、自然科学・工学研究評議会がRGPIN/05843-2014およびEQPEQ/472339-2015、カナダ保健研究所助成金第143327号、カナダ癌学会助成金第703930号、カナダイノベーション財団を承認プロジェクト #32749。R.クリシュナンは、国立衛生研究所の助成金を認めます。R21HL123522およびR01HL136209。H.Y.はフォンド・ド・レチェルシュ・サンテ・ケベック、フォンド・ド・レチェルシュ・ネイチャー・エ・テクノロジーズ・ケベックによってサポートされました。著者は、ビデオと原稿の支援のためにヨハナン・イディキュラに感謝し、ビデオの準備を支援するためにZixin He.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP |
References
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- Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K.
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Yoshie, H., Koushki, N., et al. Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers. Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).
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