Summary
Мы представляем высокую пропускную силу силы ассеис изготовлены с силиконовой резины (PDMS). Этот новый ассси подходит для изучения физических изменений в сотрудничности клеток во время различных биологических и биомедицинских процессов и заболеваний. Мы демонстрируем полезность этого метода, измеряя tGF-я зависимое увеличение контрактности во время эпителиального перехода к мезенхимальному.
Abstract
Сотовая контрактность имеет важное значение в различных аспектах биологии, движущих процессов, которые варьируются от подвижности и деления, для сокращения тканей и механической стабильности, и представляет собой основной элемент многоклеточной жизни животных. В клетках атто-миозина, акто-миосин сокращения наблюдается в тяговых сил, которые клетки оказывают на их субстрат. Дисрегуляция клеточной контрактильности появляется в множестве патологий, что делает контрактность перспективной мишенью в различных диагностических подходах с использованием биофизики в качестве метрики. Кроме того, новые терапевтические стратегии могут быть основаны на исправлении очевидной неисправности клеточной контрактности. Однако эти приложения требуют прямой количественной оценки этих сил.
Мы разработали силиконовую эластомерную масляную силовую микроскопию (TFM) в параллельном формате мультиколодца. Наше использование силиконовой резины, в частности полидиметилсилоксана (PDMS), а не широко используемых гидрогель полиакриламид (PAA) позволяет нам сделать надежные и инертные субстраты с неопределенным исполидных сроков хранения, не требующих специализированных условий хранения. В отличие от подходов на основе столба-PDMS, которые имеют модуль в диапазоне GPa, PDMS, используемый здесь, очень совместим, от примерно 0,4 кПа до 100 кПа. Мы создаем платформу высокой пропускной силы для TFM путем раздела этих больших монолитных субстратов, пространственно в биохимически независимых скважин, создавая многоскважинную платформу для скрининга силы тяги, совместимую с существующими многоскважинными системами.
В этой рукописи мы используем эту многостороннюю систему силы тяги для изучения Эпителия к мезенхимальному переходу (EMT); мы индуцируем EMT в клетках NMuMG путем подвергать их к TGF-я, и для того чтобы количественно биофизические изменения во время EMT. Мы измеряем сородичность как функцию концентрации и продолжительности воздействия TGF-я. Наши выводы здесь демонстрируют полезность параллелизированного TFM в контексте биофизики болезней.
Introduction
Контрактность акто-миозина является важным элементом активной клеточной механики, влияющим на поведение клеток от подвижности и пролиферации до дифференциации стволовых клеток. В тканях контрактность приводит к активности от полярного разделения при эмбриогенезе, к сужению дыхательных путей и сердечной деятельности. Критически, для того чтобы произвести напряжение, клетки должны сперва придерживаться к их внеклеточной окружающей среде. При этом эта договорность генерирует силы тяги на их окрестностях. Микроскопия силы тяги (TFM) вытекла в множество форм как путь к количественной оценке этих усилий от различных клеток на по-разному условиях.
Область TFM стала свидетелем исключительной широты инноваций и применения, и результаты проложили путь к новым перспективам в биологии, которые включают механику и физические силы. Начиная с морщинсиликоновых силиконовых субстратов1, исследователи применили различные методы для измерения сил тяги клеток. Эти подходы постоянно совершенствуются и в настоящее время достиглиуровня разрешения порядка нескольких микрон 2. Тем не менее, одна основная проблема возникла, которая является трудность в создании субстратов соответствующим низким модули с использованием имеющихся силиконов. Чтобы обойти эту проблему, полиакриламид был принят в качестве замены в связи с легкостью создания субстратов по заказу 1-20 кПа3. Недавно мы внедрили оченьсовместимые силиконы в TFM 4, что позволяет нам изготовить тот же диапазон модули, что и полиакриламид, но с преимуществами инертного и надежного силикона.
Подходы ТФМ позволили провести ценные механо-биологические открытия, однако постоянным недостатком является их сложность, часто ограничивающая их использование исследователями в инженерных или физических дисциплинах. Это в значительной степени объясняется подробными калибровками и сложными расчетами, которые необходимы для количественной оценки контрактности. Еще одной важной проблемой является то, что методы TFM в основном низкой пропускной способ и, следовательно, плохо подходит для изучения многих различных условий или популяций одновременно5. Это создало узкое место, которое препятствует переносу ТФМ из специализированной биофизики в более широкие биологические и фармакологические приложения.
Недавно мы разработали многоскважинную пластину TFM, которая позволяет исследователям параллелизировать свои измерения TFM для более быстрой количественной оценки показателей контрактности, исследуя влияние различных соединений, а также используя меньше реагентов4 . Эта методология имеет широкую полезность в различных исследованиях механобиологии, от оценки влияния соединений на клеточную активность до количественной оценки сократительных изменений в дифференциации или заболеваниях.
Одной из областей биомедицинских исследований, которые принесут большую пользу от TFM является изучение того, как физические сигналы воздействия злокачественных фенотипов раковых клеток. Метастаз, ответственный за 90% смертей, связанных с раком, характеризуется раковыми клетками, покидающих исходный участок опухоли и колонизирующих вторичном месте. Для клеток мигрировать через ткани и пройти в и из сосудистой системы, они должны радикально изменить свою форму, чтобы протиснуться через эти физические барьеры, генерируя значительные силы, чтобы тянуть свой путь вдоль внеклеточной матрицы или двигаться между другими Клетки. Эти силы передаются в субстрат через фокусные взаимодействия2,3и могут быть количественно с помощью TFM. В то время как раковые заболевания биохимически исключительно разнообразны, с расширяющимся репертуаром известных мутаций и белковых изменений, наблюдались некоторые общие физические изменения; в различных раковых заболеваний, в том числе молочной железы, простаты и рака легких, метастатические клетки были показаны оказывать 2-3 раза тяговые силы неметастатических клеток6,7,8. Эти результаты показывают, что может быть сильная корреляция между метастатическим прогрессированием и тяговые силы, оказываемые клетками; однако трудно изучить подробные временные изменения в контрактности.
Эпителиальный переход к мезенхимальному переходу (ЭМТ) представляет собой процесс, при котором клетки уменьшают адепты и плотное соединение опосредованное сливки клеток, становясь более мигрирующим и инвазивным. В дополнение к физиологическим функциям, которые включают заживление ран и процессы развития, EMT также процесс, используемый во время метастазирования, что делает его полезной модельной системой для изучения этого процесса. Используя TGF-я, мы можем побудить EMT в murine молочной эпителиальных клеток (NMuMG)9 непосредственно количественно физических изменений во время этой трансформации, и характеризуют время и дозо-зависимые эффекты TGF-я на ЭМТ и сократительность клеток. В этой статье мы демонстрируем полезность этого подхода, измеряя изменения в контрактности во время индуцированной EMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол будет направлять исследователей в изготовлении и использовании многоскважины TFM блюдо показано на рисунке 1.
1. Приготовление силиконовых субстратов PDMS
- Приготовление силиконовой резиновой смеси PDMS на основе композитной смеси из двух коммерчески доступных комплектов.
- Добавьте часть А и часть B комплекта PDMS (например, GEL-8100, см. таблицуматериалов) в соотношении веса 1:1 в трубку 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь смешивается на ротаторе со скоростью достаточно медленно для смеси течь вперед и назад во время революции, чтобы обеспечить полное смешивание. - Добавьте необходимое количество лечебного средства для желаемого модуля субстрата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество лечебного агента, которое будет добавлено в смесь, зависит от желаемого модуля субстрата и обычно может варьироваться от 0,1% до 1,8%. Обратитесь к таблице 1 и рисунку 3 для руководства по конкретным концентрациям кросслинкера и, как следствие, модули. - Смешайте рецептуру на ротаторе 30-45 мин; обеспечить вращение достаточно медленно для тщательного смешивания.
- Добавьте часть А и часть B комплекта PDMS (например, GEL-8100, см. таблицуматериалов) в соотношении веса 1:1 в трубку 50 мл.
- Нижний слой: покрытие субстратов PDMS на стеклянной горке
- Поместите специально построенный патрон, иллюстрированный на рисунке 2, на спин-пальто. Очистите стекло этанолом или изопропанолом и высушите салфеткой без ворса. Поместите стеклянную горку в патрон и включите вакуум, чтобы удерживать горку на месте.
- Нанесите неизлечимый PDMS примерно на 1 см от краев и работать в направлении центра. Применить достаточно (3-4 мл) PDMS для обеспечения всей поверхности будут покрыты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения равномерного распределения PDMS на поверхности стекла, наконечник пипетки может быть полезным для распространения смеси PDMS от центра до краев. - Закрутите стекло смесью PDMS на спин-пальто со следующим протоколом.
- Для распространения неизлечимых PDMS на слайде, ускорить на 50 об/мин / с от 0 до 200 об/мин; удерживайте при 200 об/мин в течение 1 мин.
- Для достижения 100 мкм толщиной слой PDMS, ускорить на 50 об/с до 300 об/мин и продержаться 1 мин при 300 об/мин. Различные желаемые толщины, кроме 100 мкм потребует конкретных значений скорости.
- Чтобы удалить, замедляй при 50 об/мин/с до 0 об/мин. Отвадить вакуум и удалить покрытую горку, заботясь, чтобы не коснуться покрытой поверхности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно включить ускорение и замедление шаги для обеспечения гладкой непрерывной поверхности.
ВНИМАНИЕ: Чтобы образец не улетел от патрона, пользовательский держатель должен использоваться для удержания слайда, а не полагаться просто на вакуум и существующий плоский патрон. Подробности и технические характеристики этого держателя приведены на рисунке 2.
- Поместите образец со спинным покрытием в духовку при рекомендованной производителем температуре (100 градусов по Цельсию) в течение 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхность печи, где находится образец, должна быть твердой (т.е. не проволочной стойкой) и ровная поверхность для обеспечения равномерного нагрева и толщины образца. Керамическая или стальная пластина является идеальной поверхностью.
- Верхний слой биса
- Добавьте раствор бисины в соответствующее соотношение к оставшейся смеси PDMS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это соотношение зависит от концентрации раствора бульонного биса и желаемой плотности биса на образце. Типичные конечные значения 9,2 х 1011 бусин/мл и 0,05-0,2 бусы/мкм2,и избыток бисера, как правило, предпочтительнее неадекватного количества. - Смешайте раствор биса с неизлечимым PDMS. Это может быть достигнуто путем размещения трубки на ротаторе в течение примерно 30 мин, вихрь в течение 1-2 мин, или sonication в течение 30 мин. Эти методы могут быть объединены.
ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем приложении, мы находим, что sonication является эффективным в нарушении биса агрегатов, и вращение является эффективным в смешивании. Синтезированные фидуциарные бусины могут агрегироваться в хранении. Перед использованием, они могут быть повторно приостановлены в гексан и sonicated. Если есть значительные крупные агрегаты, можно фильтровать подвеску биса через фильтр шприца 5 мкм. Этот этап фильтрации является необязательным; это помогает покрыть образец монодиспердидистом, но значительная часть бисера может быть потеряна в фильтре. - Выньте горку из духовки, дайте остыть до комнатной температуры и поместите ее на спин-пальто.
- Добавьте 3-4 мл смеси биса и неизлечимую смесь PDMS на поверхность образца с покрытием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь с добавлением бисера менее вязкая из-за гексана. Убедитесь в том, чтобы не касаться поверхности субстрата, поскольку он может повредить уже покрытием PDMS субстрата. Кроме того, смесь биса может изначально не промокнуть поверхность; заботиться о том, чтобы смесь не сразу вытекала с вылеченной поверхности PDMS. - Закрутите образец следующим протоколом.
- Для распространения бисера и неизлечимой смеси PDMS, ускорить при 100 об/мин/с от 0 до 500 об/мин; удерживайте при 500 об/мин в течение 1 мин.
- Для достижения тонкого слоя бисера встроенных PDMS (1 мкм), ускорить на 200 об/мин / с от 500 до 5000 об/мин; удерживайте при 5000 об/мин на 10 с.
- Чтобы удалить, замедляй при 100 об/мин/с до 0 об/мин. Отвадить вакуум и удалить покрытую горку, позаботившись, чтобы не коснуться покрытой поверхности.
- Поместите образец со спинным покрытием в духовку при температуре 1 00 градусов по Цельсию на 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура выше 100 градусов или продолжительность более 1 ч может уменьшить бисфлооресценции. Убедитесь, что температура духовки установлена до 100 градусов по Цельсию и не выше. - Протокол можно приложить здесь. Для хранения образца, покрыть поверхность, чтобы избежать пыли и воздействия света. Убедитесь, что ничто не касается поверхности. Образец является шельфовым при комнатной температуре на неопределенный срок.
- Добавьте раствор бисины в соответствующее соотношение к оставшейся смеси PDMS.
- Сборка тарелки
- Добавьте часть A (база) и часть B (лечебное средство, например, Sylgard) комплекта elastomer PDMS в соотношении веса 10:1 в трубку 50 мл.
- Смешайте смесь на ротаторе в течение 30-45 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для одной тарелки, смешать 5 мл базы с 0,5 мл лечебного агента. До 1 мл гексана может быть добавлено, чтобы уменьшить вязкость смеси. - Нанесите смесь на дно разделителя и разложите смесь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разделитель должен быть помещен вверх ногами. - Положите субстрат на разделитель вверх дном.
- Поместите образец вверх дном в духовку при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 2 ч.
- Возьмите образцы из духовки и очистить дно стекла с 70% этанола или изопропанола, чтобы удалить любые остатки PDMS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Для хранения образца поместите крышку на субстрат и заверните устройство в алюминиевую фольгу, чтобы избежать воздействия света. Образец является шельфовым при комнатной температуре на неопределенный срок. Разделитель, используемый в этом методе, находится в 96-хорошем формате; однако, исследователи могут использовать другие форматы (384-ну, 2-ну, 4-ну, 8-ну и т.д.) в зависимости от желаемых экспериментов и наличия разделительных структур. Возможно, потребуется некоторая дальнейшая оптимизация.
2. Функционализация поверхности
- Растворите 80 зл сульфо-SANPAH aliquot в 40 мл 0,1 M HEPES буфера (pH 7-9).
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка Сульфо-SANPAH aliquots путем растворения 100 мг порошка Сульфо-САНПАХ в 2 мл стерильного диметилсульфида (DMSO). Приготовьте буфер 0.1 M HEPES, разбавив 50 мл HEPES в 450 мл стерильной деионизированной воды и процедите через фильтр поры 0,22 мкм. - Добавьте 200 л разбавленного раствора Sulfo-SANPAH к каждой скважине из 96-хорошой пластины.
- Выставь пластину на ультрафиолетовый (300-460нс) свет на нужное расстояние и продолжительность.
ПРИМЕЧАНИЕ: После уф-облучения цвет раствора должен быть темнее. Расстояние и продолжительность УФ-облучения зависят от мощности УФ-лампы. В нашем приложении мы выставляем на расстоянии 10-15 мин на расстоянии 5 см. - Снимите раствор Sulfo-SANPAH из скважин и добавьте 200 л из 5 мкг/мл фибронектина к каждой скважине.
ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователь-определенный протеин можно использовать для поверхностного покрытия. Некоторые широко используемые белки коллагена, фибронектина и ламинина. Мы обнаружили, Sulfo-SANPAH быть наиболее эффективным методом, и плазменной очистки в то время как иногда используется в PDMS не рекомендуется, как он создает слой диоксида кремния и заметно повреждения поверхности. - Инкубировать тарелку при 4 градусах Цельсия на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные методы инкубации могут быть применены в зависимости от белка, используемого для покрытия. - Удалите раствор фибронектина и промойте каждый колодец фосфатным сольником (PBS) дважды.
- Поместите крышку на образец.
- Добавьте 200 л PBS к каждой скважине.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Образцы с покрытием фибронектина могут храниться при 4 градусах Цельсия в течение 2 недель.
3. УФ-стерилизация
- Стерилизовать образец под ультрафиолетовым светом в шкафе биологической безопасности в течение 30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительное время воздействия УФ-излучения может негативно повлиять на флуоресценцию биса. Все последующие шаги должны выполняться в стерильных условиях.
4. Клеточная культура
- Удалить PBS из каждой скважины и добавить 200 Л клеток приостановлено в культуре средств массовой информации для каждого колодца.
- Плита клетки при нужной плотности клеток. Плотность клеток зависит от желаемого эксперимента. Для одноклеточных исследований, клетки должны быть не менее 50 мкм друг от друга и клетки вблизи краев окна изображения не должны быть включены в измерение TFM. Для монослойных ячеек окно изображения должно иметь поле обзора, покрытое совмещенным слоем ячеек.
- Подготовьте средства культуры роста для клеток НМУМ, дополняя DMEM 5% FBS, 10 мМ HEPES, 10 мкг/мл инсулина, 1% пенициллина-стрептомицина, 1 мМ L-глутамамин, и 0,5 мкг/мл амфотерицин B.
- Приготовьте запас инсулина путем восстановления в подкисленной воде (2,5 мл ледниковой уксусной кислоты в 130 мл деионированной воды) до концентрации 10 мг/мл. Храните складраствор при 4 градусах По Цельсию. Подождите, пока решение ясно, а затем фильтр через фильтр пор0,22 мкм.
- Добавление TGF-я
- Для приготовления запаса TGF-я растворите 2 мкг TGF-я в 100 мл лимонной кислоты 10 мм (pH 3.0) и фильтр стерилизовать с 0,22 мкм поры. Vortex трубки и aliquot в желаемых объемах. Храните аликвоты при -80 градусах по Цельсию.
- Добавьте 1,5 зл и л акций TGF-я в 10 мл полной среды культуры клеток, чтобы составить среду клеточной культуры с конечной концентрацией TGF-я 3 нг/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сделать 10 мМ pH 3.0 лимонной кислоты, разбавить кислоту в воде и настроить рН до 3,0, добавив HCl.
5. Приобретение данных
- Для каждой позиции приобрести по крайней мере одно изображение фидуциарных частиц и клеток. Сосредоточьтесь на слое биса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пикселей должен быть оптимизирован на основе размера фидуциарных частиц и используемого метода обработки изображений. В этом приложении авторы используют цель 10x 0.4 NA, а изображения приобретаются с разрешением 1024 x 1024 с разрешением 455 нм/пиксель. В целом, полезно сохранить разрешение не менее 1-5 пикселей на бисен; здесь бусы полидисперсируют и имеют индивидуальный размер 300-500 нм. Очень важно, чтобы флуоресцентные фидуциарные бусы были в центре внимания для изображений, которые будут использоваться для расчетов TFM. Качество фокусировки и визуализации бисера должно быть приоритетом над визуализацией самих клеток. Не должно быть перекрестного разговора между различными каналами, особенно любой флуоресценции не от фидуциарных бусин, который появляется в спектре изображений бисера. - После того, как все позиции, представляющие интерес были записаны, добавить отряд решение каждой скважины для получения силы свободной ссылки изображения фидуциарных частиц.
- Для подготовки раствора отслоения клеток смешайте водный раствор, содержащий 2% TritonX-100, 50 мМ азида натрия и гидроксид калия 500 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеупомянутое приводится в качестве примера эффективного решения отряда. Различные решения отряда на усмотрение исследователей могут быть использованы для отсоединения клеток от поверхности субстрата.
- Для подготовки раствора отслоения клеток смешайте водный раствор, содержащий 2% TritonX-100, 50 мМ азида натрия и гидроксид калия 500 мм.
6. Анализ изображений
- Выполняйте соответствующий анализ изображений по желанию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ программного обеспечения был разработан в доме. Анализ изображений может быть сделан с помощью специального программного обеспечения или программного обеспечения, доступного в Интернете.
7. Синтез биса
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол основан на методе синтеза, описанном Klein et al.10.
- Под капотом дыма, подготовить три шеи колбу с водой охлажденный рефлюкс конденсатор.
ВНИМАНИЕ: Навлажь синтез в хорошо проветриваемом химическом капоте дыма. - Добавьте в колбу 0,5 мл стабилизатора PDMS и фторфора.
- Оборудуйте одну шею резиновой перегородкой с помощью иглы азота и иглы розетки и оборудуйте другую шею резиновой перегородкой для добавления реагента со шприцем.
- Добавьте 100 мл ангидного гексана в 250 мл в колбу и добавьте небольшую магнитную панель перемешивания.
- Поместите колбу в ванну с минеральным маслом при 75 градусах Цельсия и очистите ее азотным газом на 1 ч.
- Добавьте 6 мл метилметакрилата в круглую нижнюю колбу 25 мл.
- Добавьте 0,100 г 2,2'-azobisisobutitrile (AIBN) в круглую нижнюю колбу и очищайте смесь азотным газом на 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Промыть метиламетакрилат через расфасованную колонку, чтобы удалить ингибиторы перед использованием. Добавьте смесь метиламетакрилата и AIBN в трехшеедвую колбу. - Раствор сначала становится облачным и становится молочным. Пусть реакция работать в течение 3 ч после раствора становится облачным.
- После 3 ч поместите колбу в ледяную водяную баню.
- Вакуумно-фильтруем раствор с грубой фильтровальной бумагой.
- Центрифуги фильтрог и повторно приостановить частицы в гексане.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем гексана, который будет добавлен, зависит от желаемой концентрации раствора бисины. Соникация облегчает повторное рассеивание частиц биса в растворе гексана. Производимые авторами бусы имеют диаметрполидиспера примерно 300-500нм. Из-за использования кросс-корреляционного отслеживания шаблона для определения смещений, монодисперсные бусы не требуются.
8. Протокол измерения реологии
ПРИМЕЧАНИЕ: Реология не требуется для каждого исследователя или эксперимента, но необходимо количественно модули для новых формулировок PDMS. В этом протоколе мы используем реометр сдвига для измерения воздействия кросслинкера, частоты и нагрузки на модули образцов PDMS. В зависимости от имеющихся инструментов и опыта, модули также могут быть измерены с использованием многих других подходов механического анализа. Кроме того, исследователи, использующие этот протокол, могут избрать использовать наши опубликованные модули, представленные в таблице1, Рисунке 3 и рисунке4.
- Используйте реометр с параллельной геометрией пластины диаметром 25 мм. Другие геометрии могут быть использованы.
- Инициализируем систему и откалибруем устройство и измерительную систему (параллельная пластина, дежавю 25 мм). После измерения нулевого зазора начните загрузку образца PDMS.
- Как только elastomer PDMS и перекрестное вещество были смешаны, pipet смесь на нижнюю пластину реометра.
- Переместите шпиндель вниз, чтобы полностью связаться с верхней частью образца PDMS.
- Тщательно обрезать загруженный образец избыток из нижней пластины.
- В тесте развертки напряжения, применить увеличение штаммов для каждого состава с различной плотностью перекрестных для обеспечения полимерной структуры остается в линейном вязкоупругом режиме во время всех измерений сдвига.
ПРИМЕЧАНИЕ: Значение штамма, относящееся к клеточным исследованиям, обычно составляет 0,1-10%. Мы обнаружили, PDMS быть линейным до примерно 100% штамма. - Измерьте динамический модуль хранения сдвига (G'), и модуль потери (G') сети PDMS в тесте времени развертки с частотой 1 Гц и осцилляторный штамм сдвига 0,5% при 100 градусах Цельсия.
- Для определения вязкости и временной зависимости конечной сети PDMS нанесите тест частоты с частотой 0,1-100 Гц и осцилляторным штаммом сдвига 0,5%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Перед добавлением TGF-я, слияние монослой клеток имеет булыжник, как форма и плотно упакованы. После лечения TGF-я, клетки становятся более удлиненные в морфологии, увеличение области клеток и приобретения более мезенхимального фенотипа. Используя мульти-хорошо устройство, изготовленное с мягкими elastomers PDMS, были изучены физические свойства клеток в общей сложности 17 различных условиях. Клетки были обработаны с четырьмя различными концентрациями TGF-я (0,5, 1, 2 и 4 нг/мл) и четыре различных инкубационных раз (12, 24, 48, 96 ч), и эти результаты суммируются на рисунке 5. Клетки, обработанные TGF-я применяется большие тяги напряжений и деформации энергий, чем клетки культивируется без TGF-я. Клетки, инкубированные TGF-я для 96 ч показали самые большие тяговые напряжения и напряжения энергий. Клетки применяют большие напряжения и деформации энергий при лечении с более высокой концентрацией TGF-я. Разница в тяги и деформации энергий были более отчетливыми в более длительные периоды инкубации.
Поверхность субстрата должна быть гладкой и равномерно покрыта лигандов, таких как фибронектин или коллаген. Царапины поверхности и / или неравномерное покрытие лигандов может привести к неправильному вложению ячейки, что приводит к неточному измерению тяги. На рисунке 6 показаны локализованные тяговые напряжения из-за неравномерной поверхности субстрата.
Рисунок 1 : Обзор многоколодцного изготовления пластин. (A) Специально вырезанный стеклянный слайд является отправной точкой. (B) Стеклянная горка покрыта толстым слоем PDMS . (C) Слой фидуциарных бусин (показано зеленым цветом) затем спин-покрытие в 1 мкм толщиной слой в верхней части предыдущего слоя. (D) Многослойный разделитель аккуратно помещается поверх фидуциарного слоя бисера. (E) Полная многоскважинная пластина собрана и готова к использованию или хранению. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Пользовательский патрон для спин-пальто. Для предотвращения нижнего стекла (где PDMS покрыта) от отлета от стандартного спин-пальто патрон, на заказ держатель помещается на патрон. (A) Пользовательские держатель для спин-пальто патрон. (B) Инженерный рисунок держателя со всеми размерами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Субстрат жесткость с изменением концентрации кросслинкера (wt%). PdMS смеси готовятся, как описано, с дополнительным процентом crosslinker увеличения эластичного модуля до максимума 100 кПа на 1,8 процента веса (Wt%) crosslinker. В качестве руководства, модуля в качестве функции кросслинкера подходит линейно, которые могут быть использованы исследователями, чтобы сформулировать свою собственную смесь в определенном желаемом модуле в пределах этого диапазона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Реология ELMS эластомер, содержащий 0, 0,15, 0,36 и 1 wt% кросслинковых агентов при температуре 100 градусов по Цельсию. Символы треугольника указывают на модуль потери (G'') и квадратные символы указывают на модуль хранения (G'). (A) Осциллатория развертки времени с частотой 1 Гц и сдвига штамм 0,5% во время гелирования. (B) Осцилляторная частота развертки сети PDMS при штамме сдвига 0,5%. (C) Штамм развертки сети PDMS на частоте 1 Гц. Все точки данных были приобретены в тройном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 : Представитель результаты с использованием тяги стресс устройства с несколькими хорошо формата. Монослой клеток в разных условиях культивировался в мультискважинном устройстве для измерения контрактности и деформации энергии. (A) График тяги подчеркивается с увеличением времени инкубации TGF-я для различных концентраций TGF-я. Тяговая нагрузка увеличивается с увеличением концентраций TGF-я и время инкубации. Все данные являются статистически значимыми в отношении контроля (т.е. нет TGF-я), за исключением следующих: 12 ч - 0,5 нг, 12 ч - 1 нг, 48 ч - 1 нг. (B) График деформации энергии с увеличением времени инкубации TGF-я для различных концентраций TGF-я. Напряжение энергий увеличивается с увеличением концентрации TGF-я и время инкубации. Размеры образцов варьируются от n no 7 до n и 15. Все данные статистически значимы по контролю (т.е. нет TGF- q), за исключением следующих: 12 ч - 0,5 нг, 12 ч - 1 нг, 24 ч - 0,5 нг, 24 ч - 1 нг, 48 ч - 1 нг. Статистическая значимость была определена с помощью теста Kruskal Wallis, который не предполагает нормального распределения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6 : Представитель результаты неоптимального (A, B) и удовлетворительного (C, D) эксперимента. (A) Отражение изображения поверхности субстрата. Нежелательные загрязняющие вещества, которые могут включать пыль или волокна, или материальные дефекты, такие как царапины присутствуют на поверхности субстрата. (B) Стрессовая карта сородиченности клеток: из-за неравномерной поверхности вокруг объектов наблюдаются нерегулярные и неточные тяговые напряжения. (C) Отражение изображения поверхности субстрата. Очевидных загрязняющих веществ не видно. (D) Стресс-карта сократимы клеток: разрывов артефакта не видно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Концентрация кросслинкера (wt%) | G' (Па) | Стандартное отклонение | E (kPa) | Стандартное отклонение |
| 0.00 | 0,135 | 0,014 | 0,405 | 0,043 |
| 0,15 | 1 | 0,1 | 3 | 0,35 |
| 0,36 | 4.027 | 0,245 | 12.081 | 0,73 |
| 0,75 | 16.01 (16.01) | 0,49 | 48.03 До 19.03 | 1,2 |
| 1 | 18.44 Для того, чтобы | 0,989 | 55.32 | 1,94 |
| 1,5 | 27.638 | 0,93 | 82.91 | 1.64 |
| 1,8 | 33.986 | 0,88 | 101.94 | 1.088 |
| 2 | 33.36 Для | 0,67 | 100.08 | 1.1 |
Таблица 1: Субстрат жесткость с изменением концентрации кросслинкера (wt%). Изменяя дополнительные концентрации перекрестного канала, сфабрикованные субстраты PDMS желаемого модули Янга. PDMS сдвига модули были измерены с реометром и модули Янг были определены. Для каждой точки данных было проведено 3 независимых подготовительных препарата и дается стандартное отклонение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для успеха этого метода, очень важно иметь равномерно покрытый образец с постоянной толщиной около 100 мкм. Модули должны быть тщательно отобраны для изучения физической значимости биологической системы интересов. При изготовлении верхнего слоя, концентрация фидуциальных флуоресцентных частиц должна быть оптимизирована для точного анализа смещения и тяги стресса. Анализ изолированных одиночных клеток требует более плотного фидуциарного слоя, чем измерение сольящих монослойных. Кроме того, поверхность субстрата должна иметь стабильное и равномерное покрытие молекул адгезии, таких как коллаген, фибронектин и ламинин, чтобы обеспечить правильное присоединение клеток к поверхности субстрата. Особое внимание следует проявлять при присоединении к разделителю с несколькими колодцами; он должен быть помещен без скольжения, чтобы предотвратить уплотнение клея PDMS от смазывания на поверхности культуры, и внешний край должен быть тщательно выровнен со стеклянными размерами, чтобы предотвратить любые утечки на пограничных скважинах.
Для предотвращения утечки скважин необходимо наносить достаточное количество клея PDMS к хорошо разделенному, чтобы удержать его на месте. Тем не менее, использование чрезмерных количеств будет охватывать поверхность клеточной культуры.
Достаточный объем PDMS необходимо добавить во время процедуры спин-покрытия. При лечении, печь и стеллажи должны быть ровными. Неадекватная PDMS или неровная печь может привести к неравномерной толщине PDMS.
Плотность биса должна быть оптимизирована для правильного анализа. Когда плотность бусины не является адекватной, концентрация бусин в фидуциарной смеси PDMS должна быть увеличена. Кроме того, необходимо добавить достаточное количество смеси для спинового покрытия. Для обеспечения надлежащих флуоресцентных сигналов фидуциарных частиц биса, лечебное состояние должно быть тщательно проверено. Более длительные и более высокие температуры, чем те, которые указаны в этом протоколе, могут ухудшить флуоресценцию. Неправильное белковое покрытие на поверхности образца может привести к плохой сцепрени клеток. Чтобы предотвратить это, поверхность должна быть очищена и срок годности реагентов, таких как Sulfo-SANPAH и лиганды должны быть проверены. Время и прочность УФ-облучения должны быть оптимизированы. Иммунофлуоресценция или другие флуоресцентные конструкции белка могут быть проверены для обеспечения равномерного лиганда покрытия.
Устройство, изготовленное с помощью этого метода и набора формулировок PDMS, применимо только к субстратам с модули Янга в диапазоне от 0,4 кПа до 100 кПа. Другие модули могут быть возможны с помощью альтернативных формулировок, однако текущий диапазон охватывает большой набор физиологически значимых значений. Хотя этот метод предназначен специально для изготовления нескольких скважин, он также может быть использован для подготовки отдельных слайдов или других геометрий слайдов, и в этих случаях может потребоваться дальнейшее устранение неполадок пользователем. В этом воплощении используется относительно толстая (1 мм) стеклянная горка, исключающая общие цели высокочисленной диафрагмы (NA) на перевернутом микроскопе. Хотя технически возможно построить эти многофункциональные tFM блюда с использованием более тонкого стекла, хрупкость этих в обработке и сборке может привести к высокой скорости поломки, и может работать вразрез с более высокой пропускной способностью подход. Кроме того, поверхностное покрытие может быть исследовано далее для более широкого применения устройства.
Используя многофункциональный формат, возможны эксперименты с высокой пропускной вотуй. Мульти-колодец позволил нам изучить физические изменения клеток НМУМГ во время EMT с помощью tGF-я лечения с комбинациями различных концентраций и разное время инкубации в одном блюде. Изготовление тяговых стрессовых устройств с гидрогелями, такими как полиакриламидгель, имеет несколько ограничений. С доминирующим ингредиентом воды, гидрогели чувствительны к концентрации соли (осмоляритность), температура, влажность, и рН изменения. Изменения в любом из этих свойств могут привести к изменению механических свойств материала, требующих дополнительного ухода при использовании образцов и интерпретации результатов. Кроме того, имея воду, гидрогели более восприимчивы к инфекциям, требующих дополнительного ухода. В отличие от гидрогелей на водной основе, PDMS на основе силикона является стабильным и инертным. После изготовления, он может храниться при комнатной температуре на неопределенный срок, не требуя каких-либо специальных условий обработки или хранения.
Непроницаемая природа PDMS позволяет нам изготовить монолитный субстрат, гарантируя, что все скважины действительно идентичны по толщине и составу субстрата, позволяя при этом использовать уникальную биохимию в средствах массовой информации или использовать различные клетки в каждом Хорошо. Поверхность на основе гидрогеля позволяет диффузивным факторам проникать и перемещаться по ней, что требует добавления гидрогеля в скважины, которые в противном случае разделены для предотвращения перекрестного загрязнения.
Этот метод позволяет исследователям изучать сотруднительность клеток, основной и вездесущий аспект клеточной биологии, в высокой пропускной способностью образом, что позволяет более эффективно и воспроизводимое приобретение данных. Это помогает перевести тракцию силы микроскопии в сократительной силы скрининга, что позволяет исследователям по-настоящему использовать контрактильность в качестве метрики для клеточной активности, или эффективность соединения. Как методология, это имеет широкое применение через биофизические и биомедицинские науки, от понимания физики клеток, для характеристики и тестирования фармацевтических соединений против стандартизированных типов клеток, или, возможно, узкоспециализированные отдельных клеток для персонализированной медицины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AJE и RK заинтересованы в Компании Live Cell Technologies, которая изготавливает материалы, описанные в этой статье.
Acknowledgments
Авторы благодарят Тома Кодгера, Майкла Лэндри и Кристофера Барретта за помощь в синтезе биса. A.J.E. признает гранты Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям RGPIN/05843-2014 и E-PE/472339-2015, Канадские институты исследований в области здравоохранения No 143327, Грант Канадского онкологического общества No 703930 и Канадский фонд инноваций Проект #32749. Р. Кришнан признает, национальные институты здравоохранения грант нет. R21HL123522 и R01HL136209. H.Y. была поддержана Фондами де Рехерче Санте Квебеки и Fonds de recherche Nature et Technologies Квебека. Авторы благодарят Johanan Idicula за помощь в видео и рукописи и Зиксин Он за помощь в подготовке видео.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP |
References
- Harris, A., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K.
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Yoshie, H., Koushki, N., et al. Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers. Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).
- Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Agus, D. B., et al. Physical Sciences - Oncology Centers Network. A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells. Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).
- Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
- Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells. Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).
- Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer. Colloid & Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).
