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Immunology and Infection

Nuevo protocolo para la generación de células dendríticas inmunogénicas fisiológicas

Published: May 17, 2019 doi: 10.3791/59370
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,3, 1
1Department of Dermatology, Yale University School of Medicine, 2Dermatology Department, University of Rome Tor Vergata, 3Department of Pathology, Yale University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

El dispositivo o placa de transimmunización (TI) y los protocolos relacionados se han desarrollado para replicar las características clave de la fotoquimioterapia extracorpórea (ECP), en un entorno experimental, lo que permite la producción de células (DCs) para la inmunoterapia oncológica.

Abstract

La fotoquimioterapia extracorpórea (ECP) es una inmunoterapia de cáncer ampliamente utilizada para el linfoma cutáneo de células T (CTCL), operativa en más de 350 centros universitarios en todo el mundo. Si bien la eficacia clínica y el perfil de seguridad ejemplares de la ECP han impulsado su uso generalizado, la elucidación de los mecanismos subyacentes ha seguido siendo un desafío, en parte debido a la falta de un modelo de laboratorio de ECP. Para superar este obstáculo y crear una plataforma sencilla y fácil de usar para la investigación de ECP, desarrollamos una versión reducida del dispositivo de procesamiento de leucocitos clínico ECP, adecuado para trabajar con modelos de ratón y muestras de sangre humana pequeñas. Este dispositivo se denomina cámara de Transimmunización (TI) o placa. En una serie de experimentos históricos, el dispositivo miniaturizado se usó para producir una vacuna celular que inició regularmente la inmunidad terapéutica contra el cáncer en varios modelos de tumores de ratones singénicos. Al eliminar los factores individuales del sistema experimental y determinar su contribución a la respuesta antitumoral in vivo , se aclararon los impulsores mecánicos clave del potencial de inmunización del ECP. Colectivamente, nuestros resultados revelaron que los efectos antitumorales del ECP son iniciados por las células dendríticas (DC), generadas fisiológicamente a través de la interacción de los monocitos sanguíneos con las plaquetas en la placa TI, y cargadas con antígenos de células tumorales cuya célula apopóntica la muerte se valora finamente por la exposición al agente de reticulación de ADN fotoactivable 8-methoxypsoralen y la luz UVA (8-MOPA). Cuando se devuelve al ratón, esta vacuna celular conduce a la inmunidad de linfocitos T antitumoral específica y transferible. Hemos comprobado que la cámara de TI también es adecuada para el procesamiento de sangre humana, produciendo DCs humano totalmente comparable en estado de activación y perfil a los derivados de la cámara clínica ECP. Los protocolos presentados aquí están destinados a estudios de ECP en ratones y hombres, generación controlada de células tumorales apopónticas con 8-MOPA, y producción rápida de DCS fisiológicos humanos y de ratón derivados de monocitos para una variedad de aplicaciones.

Introduction

La fotoquimioterapia extracorpórea (ECP) es una inmunoterapia establecida que es ampliamente operativa en centros universitarios de todo el mundo. Su uso ha sido impulsado por la selectividad única, la seguridad y la eficacia bidireccional de la terapia ECP, rasgos que el ECP comparte con el sistema inmunológico fisiológico en sí con el que parece asociarse. El ECP se inmuniza selectivamente contra las células malignas en el linfoma cutáneo de células T (CTCL)1,2y se toleriza selectivamente para los antígenos específicos en los ajustes de trasplante, autoinmunidad y enfermedad de injerto contra huésped (EICH) 3 , 4. la inmunogenicidad del ECP se destaca por su dependencia de un compartimento de células CD8 T intacto en CTCL5, mientras que la especificidad se refleja en el perfil de reacción adversa muy favorable de la ECP, sin supresión inmune fuera de la Diana en el trasplante o La configuración de la EICH, y ninguna susceptibilidad de infección oportunista aumentada en CTCL, donde los clones de linfocitos T no patógenos potencialmente podrían perderse junto con los linfocitos T malignos.

Dada la importancia clínica del ECP, la esperanza de que una mejor comprensión de sus mecanismos podría expandir el alcance terapéutico de la ECP a un espectro más amplio de cánceres y trastornos inmunológicos ha estimulado el interés internacional. Se realizaron y informaron dos talleres sancionados nacionalmente, un Simposio de estado de la ciencia de los institutos nacionales de salud (NIH)6 y una asociación americana para la aféresis, Conferencia de consenso7, con el objetivo de acelerar la identificación de los principales contribuyentes celulares a los efectos anticancerígenos y tolerogénicos de la ECP.

Hasta la fecha, a pesar de los numerosos informes publicados que intentan abordar el mecanismo de la ECP, dos obstáculos primarios han impedido avances científicos. En primer lugar, la investigación de los mecanismos del ECP en el entorno del laboratorio experimental se ha limitado por la falta de un dispositivo ECP en miniatura que refleje plenamente los efectos celulares e in vivo de ECP, y se aplique a los modelos animales. En segundo lugar, el análisis exhaustivo de las muestras de ECP en el entorno clínico ha sido restringido por la disponibilidad limitada de células inmunitarias procesadas por el ECP, que requieren acceso a los centros de tratamiento, y están sujetas además al momento de la infusiones del paciente, y la necesidad ética de conjuntos no comprometidos de leucocitos reinfundidos por el paciente.

Para resolver los obstáculos que impiden el avance de la investigación del ECP, nos hemos establecido para desarrollar un aparato de ECP en miniatura que imitaría más estrechamente los elementos clave de la terapia. El tratamiento estándar del ECP involucra el paso de leucocitos enriquecidos con leucoaféresis de un paciente a través de una lámina de plástico de 1 mm de espesor, ULTRAVIOLETA a luz (uva),6,8. En la placa, los leucocitos están expuestos a 8-methoxypsoralen (8-MOP), un agente fotoactivable que sobre la exposición a la UVA se convierte transientemente a una forma reactiva (8-MOP a), capaz de reticulación de ADN a través de su unión bivalente a bases de pirimidina en hermana DNA hebras9,10. Los leucocitos tratados con8 trapos procesados se recogen y se devuelven por vía intravenosa al paciente.

Dado que el ECP en sí es una terapia bidireccional, inmunizando en el cáncer y tolerizing en los ajustes de trasplante, autoinmunidad y Eich, para aclarar hemos nombrado el modo de inmunización del modelo ECP "transimmunization", y el modo tolerogénico "transtolerización". Primero nos centramos en la modalidad de transimmunización. Nuestro dispositivo de ratón a hombre escalable miniaturizado recientemente reportado, la cámara o placa de transimmunización (TI), y el protocolo correspondiente, reproducen los efectos celulares e in vivo del dispositivo ECP humano en un entorno de cáncer11.

Con el fin de hacer que el modelo in vivo de transimmunización sea lo más clínicamente relevante posible, iniciamos la inmunoterapia después de que los tumores singénicos inyectados por vía subcutánea se hicieran palpables, probando así la eficacia del protocolo en el cáncer establecido. Del mismo modo que el ECP en CTCL, el protocolo de transsimmunización de prueba de principio en el modelo YUMM 1.7 de melanoma utiliza células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de animales portadores de tumores. Las células se pasan a través de la placa de TI bajo flujo. Mientras que 8-MOPun tratamiento de las células en la cámara en miniatura es posible, es preferible conducirse por separado, para asegurarse de que sólo el tipo de célula deseada se exponea 8-MOP a. Estudios anteriores indican que el efecto tolerogénico de la ECP está mediado por las células de 8-MOP-que presentanunantígeno lesionado12, mientras que el efecto de inmunización requiere 8-MOPuna lesión de las células del tumor objetivo11. En el protocolo de transimmunización, las células tumorales, o las células inmunitarias, pueden exponerse selectivamente a 8-MOP a según sea necesario. Ya que la maximización del tiempo de contacto entrelas células tumorales de 8-MOP y las células dendríticas inducidas por ECP (DC) ha demostrado mejorar significativamente la capacidad inmunotherapéutica de la clínica ECP13, incorporamos una noche paso de la coincubación a nuestro protocolo. Después de la incubación durante la noche, las células tratadas se devuelven al animal que lleva el tumor.

Este sistema redujo de forma fiable el crecimiento tumoral e inició una inmunidad antitumoral específica en ratones con tumores singénicos establecidos11, y nos permitió diseccionar el mecanismo de la eficacia antitumoral clínica de la ECP. En varios estudios hemos demostrado que la inmunidad a ECP se inicia a través de la activación plaquetaria ex vivo en la placa ti14,15. Las plaquetas activadas posteriormente señalan la maduración14de células monocitos a dendríticas, lo que lleva a la producción de DCS fisiológicas. Los controladores de dominio derivados de monocitos recién formados son capaces de interpresentar antígenos internalizados de células tumorales dañadas por 8-MOP para activar las respuestas de células T de antígeno específicas16. Como se sugirió anteriormente12,17, sin embargo, 8-MOPA-inducida por daño de los propios DCS naciente pueden contrarrestar o incluso revertir el efecto antitumoral11, proporcionando un enlace mecanicista a la tolerancia de la ECP.

La placa TI también se ha utilizado para producir controladores de dominio fisiológicamente activados de PBMC humano. De manera similar a los estudios de ratón, los DCs humanos derivados de TI dependen de la placa-pasaje en presencia de plaquetas para su generación, aparecen fenotípicamente idénticos a estos producidos en la placa clínica ECP, y son capaces de procesar eficientemente y antígenos del tumor humano de presentación cruzada para la activación de células T humanas11,16.

Al descubrir el mecanismo de la inmunoterapia de ECP, por lo tanto hemos descubierto un método para la generación rápida de ratones fisiológicos y células dendríticas humanas de especificidad de antígeno deseada, que pueden ser funcionalmente modulada. El innovador dispositivo y Protocolo de TI tiene una importante importancia potencial en los campos de la investigación y la terapia de ECP y la inmunoterapia del cáncer de manera más amplia, y en cualquier otro campo con interés en las células dendríticas funcionales y fisiológicas, ya sea en la inmunización o la modalidad de tolerizing. Esperamos que esta publicación proporcione las herramientas necesarias a quienes tengan interés en dichas áreas de investigación.

Protocol

Todos los métodos de ratón descritos aquí han sido aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad de Yale, de acuerdo con los institutos nacionales de pautas de sanidad animal. Todos los estudios en humanos se realizaron con sangre donada por voluntarios sanos, con consentimiento informado por escrito. Los estudios de sangre humana se realizaron de acuerdo con las pautas éticas reconocidas (por ejemplo, declaración de Helsinki, CIOMS, Informe Belmont, regla común de los Estados Unidos), y fueron aprobadas por la Junta de revisión de investigación humana de Yale bajo el protocolo número 0301023636.

Nota: El siguiente es el protocolo que describe la transimmunización para la terapia antitumoral de los tumores singénicos del ratón.

1. implante tumoral singénico YUMM 1.7

  1. Siga los protocolos establecidos para implantar tumores singénicos en los flancos de los ratones según corresponda a la línea de células del tumor de interés.
    Nota: El siguiente protocolo describe el modelo de tumor de melanoma del ratón YUMM 1.7 C57BL/6. Las células de melanoma YUMM 1.7 fueron proporcionadas amablemente por el Dr. Bosenberg, Yale18.
  2. Descongelar una alícuota congelada de las células y utilizar las células después de un pasaje de la célula. Cultivo de células YUMM 1.7 recién descongeladas en la mezcla de nutrientes del águila modificada de Dulbecco, el medio F-12 (DMEM/F12), complementado con un 10% de suero bovino inactivado por calor (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de aminoácidos no esenciales, bajo estándar condiciones de cultivo de tejidos (37 ° c, 5% CO2).
    1. Recoger YUMM 1.7 células en 60 \ u201270% confluencia añadiendo suficiente tripsina-EDTA para cubrir la parte inferior de la placa de cultivo celular o matraz (por ejemplo, 4 mL para un frasco de T75).
    2. Descanse los vasos de cultivo celular a temperatura ambiente durante 3 \ u20124 min, tocando suavemente en la parte inferior o los lados del recipiente ocasionalmente para ayudar a separar las células.
    3. Añadir 1 mL de suero bovino fetal (FBS) por 4 mL de ácido tripsina-ethylenediaminetetraacético (EDTA) para detener la reacción una vez que la mayoría de las células se hayan desprendido. Recoja las células pipeteando en un tubo cónico de 15 mL. Enjuagar el matraz con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y añadir el enjuague al mismo tubo de recogida. Llene el tubo a 15 mL con PBS.
    4. Saca una pequeña alícuota y cuenta las células.
    5. Gire hacia abajo durante 10 min a 250 x g en una centrífuga de cultivo de tejido estándar para recolectar las células tumorales.
  3. Resuspend YUMM 1.7 células en PBS a una densidad de 1 x 106 células/ml.
  4. Inyectar 1 x 105 yumm 1.7 células tumorales por vía subcutánea en 100 ΜL de PBS en los flancos derecho de los ratones de 4 a 6 semanas de edad silvestres de tipo salvaje C57BL/6J, anestesiados según las pautas institucionales (p. ej., 3 \ u20125% gas inhalante isoflurano, anestesia confirmado por la falta de reflejo de pellizco de pata trasera).
  5. Monitorear el volumen del tumor a través de mediciones quincenales de diámetros y altura del tumor perpendicular usando un calibrador. Calcule YUMM 1.7 (volumen del tumor como longitud del tumor x ancho x alto)/2.
  6. Iniciar la terapia de transimmunización cuando los tumores se vuelven simplemente palpable; para tumores YUMM 1.7, esto es generalmente día 7 \ u201210 implantación tumoral post.

2. recolección de células mononucleares de sangre periférica para la Transimmunización

  1. Recoger 100 \ u2012150 μL de sangre de cada ratón que lleva tumor a través de sangrado de la mejilla.
  2. A medida que se recolecta sangre, la sangre de la piscina de cada grupo de tratamiento del ratón (cada 5 ratones experimentales + 5 ratones de control) en un solo tubo de 15 mL que contiene 5.000 U/mL de Heparin. Utilizar 10 μL de heparina al 10% por cada 100 μL de sangre recolectada.
    Nota: Mezclar el tubo con frecuencia durante la recolección para evitar la coagulación sanguínea. Mientras que el control de ratones portadores de tumores puede ser sangrado al mismo tiempo que los ratones experimentales, para asegurar la igualdad de condiciones con el grupo de tratamiento, la sangre "control" puede ser desechada, o combinada con la sangre del grupo de tratamiento para proporcionar adicional PBMC experimental para el grupo de tratamiento, a discreción de los investigadores.
  3. Configurar el tubo de 1 15 mL con 4 mL de medio de aislamiento de linfocitos (ver la tabla de materiales) por 5 \ u201210 ratones sangrados. Lentamente capa de sangre (recolectada de ratones portadores de tumor) en la parte superior del medio. Gire las células durante 20 min a 1000 \ u20121, 500 x g para separar el PBMC de los glóbulos rojos.
  4. Al final de la centrifugación, recoger la capa de plasma superior, dejando ~ 0,5 mL restante por encima del abrigo de la Buffy, y almacenar a 4 °C para su uso posterior (paso 7,1).
  5. Recoja la capa de pelaje Buffy en un tubo limpio de 15 mL, llene con PBS a 15 mL, y gire durante 10 min a 250 x g en una centrífuga de cultivo de tejido estándar para recolectar el PBMC.
  6. Pipet cuidadosamente del sobrenadante, y resuspender el pellet moviendo el tubo. No decantarse, ya que el pellet es blando y se puede perder. Añadir 2 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos ACK (ver la tabla de materiales) al tubo para remover cualquier resto de glóbulos rojos del PBMC. Incubar sobre hielo durante 10 min.
  7. Llene el tubo con PBS a 15 mL, y gire hacia abajo durante 10 min a 250 x g en una centrífuga de cultivo de tejido estándar para recolectar el PBMC.
  8. Cuidadosamente Pipet del sobrenadante, y resuspender el pellet por parpadeo. No decantarse, ya que el pellet es blando y se puede perder.
    Nota: En este paso, el PBMC purificado se puede modificar como mejor se adapte al experimento. Los diversos componentes de PBMC (plaquetas, monocitos, otros tipos de células inmunitarias) pueden agotarse o aislarse del PBMC según sea necesario. Además, los mismos PBMC pueden exponerse a 8-MOPa, antes o después de la sección 4 (antes o después del pasaje de la placa — después de la sección 2 o antes de la sección 5), siguiendo los pasos del protocolo 3.3 \ u 20123.8 y sustituyendo PBMC por células yumm 1.7. Esto truncará la capacidad inmunogénica del tratamiento, y en su lugar promover la tolerancia inmune.
  9. Para cada grupo de tratamiento (cada 5 ratones experimentales + 5 ratones de control), Resuspender el pellet de PBMC en 300 μL de FBS.

3.8-MOP/UVA tratamiento de células tumorales

  1. Cultivo y recolectar células tumorales YUMM 1.7 como se describe en los pasos 1.2 – 1.3 para preparar unafuente de antígeno de células tumorales de 8-MOP a-expuesta.
  2. Prepare 2,5 x 106 yumm 1.7 células tumorales por grupo de tratamiento de 5 ratones. Para cada grupo de tratamiento, Resuspender el pellet de células tumorales en FBS a 2,5 x 106 células/300 μL (~ 8,33 x 106 células/ml).
  3. Con las luces de la campana de cultivo de tejido apagado, añadir 8-MOP (ver la tabla de materiales) a la yumm 1.7 suspensión de células tumorales para una concentración final 8-mop de 100 ng/ml.
    PRECAUCIÓN: 8-MOP es un agente que daña el ADN fotoactivable y carcinógeno. Tenga cuidado al manipular y dispensar, evite el contacto con la piel expuesta y Deseche apropiadamente.
  4. Mezclar bien las células, envolver el recipiente de la célula en papel de hojalata, e incubar durante 20 min a 37 °C.
  5. Precapa una placa de cultivo de tejido de 12 posi llenando un pozo para cada grupo de tratamiento de 5 ratones (2,5 x 106 yumm 1.7 células tumorales) con 1 ml de FBS, y refrigerar la placa rellena durante 20 min a 4 °C.
  6. Encienda la fuente de luz UVA para precalentarla.
    PRECAUCIÓN: La luz UVA es un carcinógeno. Cuando se trabaja con fuentes de luz UVA trabajar con rapidez y cuidado, proteger la piel de la exposición, y utilizar protectores de cara o gafas para proteger la cara y los ojos.
  7. Después de 20 min, mueva la placa refrigerada de 12 pocillos (paso 3,5) a la campana de cultivo de tejido, retire el FBS de los pozos y agregue 300 μL (2,5 x 106 células/pozo) células tumorales de la fregona (desde el paso 3,4) por pozo.
  8. Exponer la placa que contiene células a la fuente de luz pre-calentada UVA para la irradiación total de 4 J/cm2.
    Nota: La concentración de 8-MOP y la dosis UVA descritas aquí están calibradas para la línea de células tumorales YUMM 1.7. Se debe realizar una titulación de dosis de 8-MOP/UVA, suficiente para causar un 100% de muerte celular tumoral dentro de 1 semana de exposición, para cada línea celular tumoral experimental, con el fin de determinar la dosis efectiva de matanza. Esto es críticamente importante para los experimentos de TI del ratón in vivo, porque las células se reinyectan retro-orbitalmente (paso 6,1) y, por lo tanto, las células tumorales no dañadas pueden formar tumores oculares en el animal tratado. Como pauta, 4 \ u20128 J/cm2 de uva, 100 \ u2012200 ng/ml 8-MOP, es el rango efectivo típico para la mayoría de las líneas celulares del tumor.
  9. Recoja las células tumorales tratadas con 8 TRAPEADORES de cada pozo, girando la placa y pipeteando cuidadosamente para garantizar una recuperación completa de las células.

4. placa de TI pasaje de las células

  1. Para cada grupo de tratamiento de 5 ratones, combine en un tubo cónico de 1,5 mL 300 μL del PBMC apropiado (del paso 2,11) y 300 μL de células tumorales tratadas con 8-MOP (a partir del paso 3,9). Mezclar las células.
  2. Utilice una jeringa de 10 mL para llenar los conjuntos de "entrada" y "salida" de la tubería de TI (consulte la
    Tabla de materiales) con FBS. Abra las abrazaderas del tubo para llenar los tubos, y cierre las abrazaderas una vez que los tubos se llenan antes de desconectar la jeringa, para retener el FBS dentro de la tubería.
  3. Utilice una Piera P1000 para añadir el PBMC y la mezcla de células tumorales (del paso 4,1) a la placa TI (consulte la tabla de materiales). Sostenga la placa en un ángulo de 45° , coloque la punta de la Piera firmemente en la toma de la placa de ti, y llene la placa lentamente, evitando burbujas.
  4. Retire la punta de la pildía de la toma antes de soltar el émbolo. La placa contiene 450 μL; devolver las células restantes al tubo cónico de 1,5 mL.
  5. Incubar los tubos rellenos de FBS, la placa de TI llena de células y el tubo cónico de 1,5 mL que contiene las células restantes en la incubadora de cultivos de tejidos a 37 °C durante 1 h. Después de la incubación, vacíe la tubería de TI por gravedad, liberando las abrazaderas.
  6. Utilice una pildera P1000 para extraer las células de la placa de TI insertando la punta de la Piera con el émbolo presionado en el puerto de la placa. Sujete la placa a un ángulo de 45° y llene la punta de la Piera P1000. Vuelva a colocar las células en su tubo cónico original de 1,5 mL.
  7. Para ejecutar la placa de TI, conecte el tubo de salida a la placa y asegure la placa de TI en el sistema de funcionamiento de la placa.
  8. Utilizando una jeringa de 1 mL, dibuje los 600 μL de PBMC y la mezcla de células tumorales del tubo cónico de 1,5 mL, deshágase de cualquier burbuja de la jeringa, fije la jeringa al tubo de entrada con la abrazadera abierta y llene lentamente hasta que el fluido llegue al final de la tubería.
  9. Fije el extremo libre del tubo de entrada a la placa TI y continúe cargando suavemente el volumen restante. Cierre la abrazadera de entrada.
  10. Separe la jeringa de 1 mL y conecte el tubo de entrada a la bomba de jeringa. Asegure la tubería de salida a un tubo cónico limpio de 1,5 mL para la recolección de células.
  11. Ajuste el caudal de la bomba de la jeringa a 0,09 mL/min, pero aún no arranque la bomba. Incline la placa de TI ~ 30° hacia el lado de la bomba de jeringa, utilizando una plataforma de funcionamiento de placa de ti o cualquier otro medio (por ejemplo, un pequeño objeto plano debajo de un extremo de la placa).
  12. Suelte con cuidado la abrazadera en el tubo de entrada. Iniciar la bomba de la jeringa, observando cuidadosamente cómo se llena la placa de TI, y el tubo de película o placa como sea necesario si las burbujas de aire impiden el flujo.
  13. Una vez que la placa de TI está completamente llena, inclínala ~ 30° en la dirección opuesta mientras se vacía. Cuando todas las células y el líquido estén en el tubo de recogida cónica de 1,5 mL, detenga la bomba.
  14. Para lavar la placa de TI, desconecte el tubo de entrada de la bomba de jeringa, conéctelo a una jeringa de 1 mL rellena con 600 μL de FBS y siga el procedimiento para los pasos 4.8 \ u 20124.9.
  15. Ajuste el caudal de la bomba de la jeringa a 0,49 mL/min, suelte la abrazadera de entrada y ejecute la placa de TI como se describe en los pasos 4.12 \ u 20124.13, recogiendo el lavado en el mismo tubo cónico de 1,5 mL. Deslice o toque la placa de TI suavemente todo el tiempo, para ayudar a separar y eluir las células adherentes.
  16. Gire la colección de 1,5 mL de tubo cónico en el microfuge de sobremesa a 250 x g durante 8 min para desechar el sobrenadante.

5. preparación del suero de ratón autólogo para el medio de cultivo nocturno

  1. Recoger la sangre de 10 \ u201212 semana viejos ratones C57BL/6J por cualquier método institucionalmente aprobado (por ejemplo, sangrado ocular, sangrado de la vena de la cola, sangrado de la mejilla, o sangrado terminal por punción cardíaca), sin ningún anticoagulante. Estimar la recolección de 1 mL de sangre por cada 300 μL de suero necesario.
    Nota: Uno necesitaría 300 μL de suero para cada grupo de tratamiento de 5 ratones en el experimento.
  2. Permitir que la sangre coagule durante la noche a 4 ° c.
  3. Gire hacia abajo la sangre coagulada a 3.000 x g durante 15 min, recoja cuidadosamente la capa que contiene suero superior
    Nota: El suero se puede utilizar inmediatamente para hacer el medio de incubación celular durante la noche (paso 6,1), o preservado para futuros experimentos. Para preservar el suero, congelar en alícuas a-20 ° c.

6. co-incubación durante la noche de PBMC con antígeno

  1. Resuspend el PBMC y el pellet de células tumorales (paso 4,5) en 2 mL de RPMI transparente con un 15% de suero de ratón autólogo (preparado en el paso 5). Placa en un plato estéril tratado con cultivo no tejido de 35 mm, e incubar durante la noche bajo condiciones de cultivo de tejido estándar (37 ° c, 5% CO2).
    Nota: Si se está utilizando PBMC con un antígeno no celular (péptido, nanopartícula, proteína, etc.), omita la sección 3 del protocolo y proceda de la sección 2 directamente a la sección 4, añadiendo el antígeno deseado a la placa de TI-PBMC aprobada para la coincubación durante la noche aquí en Paso 6,1.
  2. Al día siguiente, separe con cuidado las células adherentes de la parte inferior del plato con un raspador de cultivo de tejido, girando el plato mientras se raspa para asegurar incluso la recolección de células. Recoja las células en un tubo de 15 mL.
  3. Añadir 2 mL de PBS al plato y repetir el paso de raspado, recogiendo las células en el mismo tubo. Enjuagar el plato de 35 mm con 1 mL de PBS y añadir el enjuague al mismo tubo.
  4. Gire durante 10 min a 250 x g en una centrífuga de cultivo de tejido estándar para recolectar las células. Pipet cuidadosamente del sobrenadante y resuspender el pellet moviendo el tubo. No decantarse, ya que el pellet es blando y se puede perder.

7. re-inyección de células tratadas con TI en ratones portadores de tumor

  1. Centrifugación de plasma autólogo (preparado en el paso 2,4) a 750 x g durante 15 min para sedimento de cualquier particulados. Resuspend el pellet de células (del paso 6,4) en 600 μL de plasma autólogo o PBS.
  2. Inyecte células a 100 μL por ratón en el plexo retro-orbital de anestesiado apropiadamente (p. ej., 3 \ u20125% gas inhalante isoflurano, anestesia confirmada por falta de reflejo de pellizco trasero), portadores de tumores experimentales. Si lo desea, vuelva a inyectar el tumor de control que lleva ratones con 100 μL de plasma autólogo solo, o PBS.
  3. Para YUMM 1.7 ratones portadores de tumores, repita el tratamiento (pasos 2 – 7.2) dos veces a la semana durante 3 semanas, para un total de 6 tratamientos. Recoja y procese el PBMC de ratones portadores de tumores semanalmente (secciones de protocolo 2 \ u20124) los lunes y jueves, y vuelva a infundir después de la incubación durante la noche (secciones de protocolo 5 \ u20127) los martes y viernes.
    Nota: Este régimen de tratamiento se desarrolló para la cinética de crecimiento específica de tumores YUMM 1.7 en ratones. Es posible que deba valorarse para otros sistemas tumorales con tasas de crecimiento tumoral más lentas o más rápidas, aumentando o reduciendo respectivamente el número de tratamientos.
  4. Monitorear el volumen del tumor a través de la medición quincenal — preferiblemente en el momento de la administración de la terapia (martes y viernes) — de diámetros y altura del tumor perpendicular usando un calibrador. Finalice el experimento cuando controle que los volúmenes del tumor alcancen el tamaño máximo permitido por los lineamientos y protocolos institucionales.

8. adaptación del protocolo para el tratamiento de pequeños volúmenes de sangre humana

  1. Adaptar el protocolo para su uso con las células humanas aislando primero PBMC de la sangre humana. Utilice heparina como un anticoagulante, con cualquier protocolo de aislamiento PBMC preferido.
  2. Asegúrese de que la fracción de PBMC aislada contenga un número fisiológico de plaquetas, para obtener los mejores resultados de protocolo. Monitorear el conteo de plaquetas pre y post-PBMC de aislamiento usando cualquier contador de Hematología estándar.
  3. Si utiliza una fuente de antígeno celular humano, trate las células antigénicas humanas siguiendo los pasos descritos en la sección 3 para las células YUMM 1.7. Valorar las dosis 8-MOP y UVA en consecuencia.
  4. Realice los pasos de pasaje de placa descritos en la sección 4, utilizando hasta 3 x 107 PBMC por placa de ti.
  5. Cultura PBMC durante la noche con el antígeno celular/otro de elección, como se describe en la sección 6, pero sustituir 15% suero AB humano para el plasma de ratón autólogo para el medio de cultivo nocturno en el paso 6,1.
  6. Utilice las celdas resultantes en cualquier ensayo deseado. Por ejemplo, la co-cultura con células T de antígeno reactiva para observar las respuestas de células T específicas de antígeno iniciadas por las células tratadas con TI.

Representative Results

Recientemente desarrollamos un dispositivo ECP en miniatura escalable de ratón a hombre, la placa TI (figura 1A), y diseñamos los protocolos de tratamiento correspondientes. El dispositivo y el protocolo reproducen las principales características celulares e in vivo del ECP inmunizante, denominado "transimmunización".

El protocolo de transimmunización de murina de prueba de principio11 (figura 1B) consiste en el pasaje de la placa de ti extracorpórea de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de ratones portadores de tumor junto con apopético 8-MOPa– expuesto células tumorales. En particular, la cámara de TI es transparente y de tamaño para que coincida con el formato de diapositiva de microscopía estándar, lo que permite una fácil visualización de las interacciones celulares dentro de la placa de TI en cualquier punto del Protocolo (video 1). Las células inmunes activadas por TI-Plate son incubadas durante la noche con las célulasdel tumor apopético de 8-MOP a-expuesta, facilitando la captación de células tumorales, el procesamiento y la transferencia de antígenos tumorales a los DCS. Al día siguiente, la mezcla celular coincubada se devuelve al torrente sanguíneo del animal que lleva el tumor. Los animales de control se someten a procedimientos de recolección de sangre idénticos, para normalizar los efectos de los linfocitos en el crecimiento tumoral, pero en su lugar reciben reperfusiones de PBS. El crecimiento tumoral en todos los animales se supervisa durante todo el experimento.

En estudios que utilizan el melanoma singénico murino YUMM 1.7 modelo18, el protocolo de transimmunización se repitió dos veces a la semana durante tres semanas, para un total de seis tratamientos en cada animal (figura 1B). La terapia pareció bien tolerada en todos los animales tratados (> 100), y mostró consistentemente reducción del crecimiento tumoral de YUMM 1.7 en animales tratados versus control, como se observó en 9 experimentos independientes realizados durante 2 años (figura 2A, B). Los resultados muestran datos acumulativos de crecimiento tumoral en animales tratados con transimmunización y control sobre todos los experimentos realizados (figura 2A), así como curvas de crecimiento tumoral representativas para animales individuales dentro de un experimento, para proporcionar un sentido de variabilidad en el sistema (figura 2B).

Descubrimos que el éxito del protocolo depende críticamente de la presencia de monocitos en el PBMC Tratado, la presencia de plaquetas en la fracción PBMC y el paso de pasaje de la placa TI. Cuando se omite el pasaje de la placa, o cuando las plaquetas o monocitos se agotan de la fracción PBMC, el efecto terapéutico ya no se observa (figura 3a). El tratamiento también requiere la presencia de células tumorales apopónticas. Es ineficaz en ausencia de las células inmunitarias o de una fuente de antígeno, o en presencia de antígeno no coincidente, por ejemplo cuando los ratones que tienen tumores YUMM 1.7 son tratados usando células de carcinoma de colon MC38 (figura 3B). Para un desenlace vacunal, también es fundamental evitar la exposición a la PBMC a 8-MOP a. 8-MOPA-expuesta PBMC no sólo abrogate, o posiblemente incluso inversa, inmunidad antitumoral (Figura 3C), pero también inhiben el potencial de inmunización de las células no expuestas, como en el experimento donde un número igual de 8-MOPA-expuesto y 8-MOP Se utilizaron PBMC protegidos con unefecto antitumoral observable (Figura 3C).

Con PBMC humano, la cámara de TI y el protocolo de transimmunización conducen a la activación exitosa de los monocitos en DC, indistinguibles por la superficie celular y los marcadores de activación intracelular de los logrados por la placa clínica ECP (tabla 1). Como en los estudios de ratón, la activación de CC (figura 4a) y la capacidad de los controladores de dominio generados por transimmunización para procesar y presentar antígeno (Figura 4B,C) dependen críticamente de la presencia de plaquetas en el PBMC, y en el pasaje de la placa ti. El DCs humano activado por Transimmunización puede procesar y presentar de manera eficaz los antígenos peptídicos (Figura 4B) o los antígenos de las célulastumorales humanas de 8-MOP a-expuestas, para activar las líneas celulares T-específicas del antígeno humano in vitro ensayos (figura 4C), en un ti y de manera dependiente de las plaquetas (Figura 4B, C).

Figure 1
Figura 1: esquemas de cámara y Protocolo de Transimmunización (TI). (A) diagrama y especificaciones de la cámara de tratamiento de transimmunización (placa ti). (B) Descripción esquemática del flujo de trabajo experimental de tratamiento de transimmunización. Brevemente, los animales son inoculados subcutáneamente (s.c.) con células tumorales singénicas; los animales con tumores palpables son tratados dos veces por semana por el sorteo de sangre, el aislamiento de PBMC de la sangre, el paso de flujo PBMC a través de la placa TI autóloga recubierta de plaquetas en presencia de células tumorales tratadas con 8-MOP/UVA, PBMC y co-incubación de células tumorales durante la noche, y la reinyección de las células por vía intravenosa en los mismos animales portadores de tumor. El volumen del tumor se mide a lo largo del experimento. Esta cifra ha sido modificada a partir de11. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: la Transimmunización controla el crecimiento de tumores singénicos YUMM 1.7 melanoma. (A) volumen tumoral yumm 1.7 con el tiempo trazado para ratones C57BL/6 inoculados con 1 x 105 yumm 1.7 células tumorales, y recibir seis tratamientos de transimmunización (línea negra), o seis tratamientos de control (línea gris). Los datos son acumulativos de nueve experimentos independientes realizados durante dos años. (B) datos de un experimento único representativo de yumm 1.7 transimmunizaton, con cada línea mostrando el crecimiento del tumor para un ratón individual. (A y B) Los ratones de "control de PBS" en todos los experimentos se sangraron en el mismo horario que los animales experimentales, pero recibieron seis reinfusiones estériles de PBS. Las barras de error representan SEM, los valores p calculados para cada punto de tiempo utilizando la prueba de comparaciones múltiples de Sidak; * *, p = 0,0013; , p < 0,0001. Esta cifra ha sido modificada a partir de11. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: la transimmunización requiere monocitos y plaquetas en la fracción de PBMC aprobada por placa de ti, así comoun tratamiento de 8-MOP a las células tumorales con antígeno y 8-MOPa ahorradores de PBMC. (A) volumen tumoral yumm 1.7 con el tiempo trazado para ratones C57BL/6 inoculados con células tumorales 1 * 105 yumm 1.7, y recibiendo seis tratamientos de transimmunización (líneas negras sólidas), seis tratamientos de control (líneas grises sólidas), o seis tratamientos de ti donde los monocitos o plaquetas se agotaron de PBMC antes del paso de pasaje de la placa (utilizando kits de depleción a-CD11b y a-CD41, respectivamente), o pasaje de placa fue omitido (líneas de puntos). (B) volumen del tumor con el tiempo trazado para ratones C57BL/6 inoculados con 1 x 105 yumm 1.7 células tumorales, y recibir seis tratamientos de transimmunización (líneas negras sólidas), seis tratamientos de control (líneas grises sólidas), PBMC solo (línea discontinua), 8- Solocélulas yumm 1.7 tratadas con MOP, o ti que utilizan células tumoralesMC38 tratadas con 8 MOP (líneas de puntos). (C) volumen del tumor con el tiempo trazado para ratones C57BL/6 inoculados con células tumorales de 1 x 105 yumm 1.7, y recibiendo seis tratamientos de transimmunización (líneas negras sólidas), seis tratamientos de control (líneas grises sólidas), seis tratamientos de ti donde PBMC fueron expuestos uniformemente a 8-MOP a inmediatamente antes del pasaje de la placa, seis tratamientos de ti donde PBMC estaban uniformemente expuestos a 8-MOP a inmediatamente después del pasaje de la placa, o seis tratamientos donde las células ti después del pasaje de la placa se mezclaron 1:1 con un número igual de PBMC que se han expuesto uniformemente a la irradiación de 8-MOP (líneas de puntos). (A, B y C) Los ratones de "control de PBS" en todos los experimentos se sangraron en el mismo horario que los animales experimentales, pero recibieron seis reinfusiones estériles de PBS. Se proporcionan datos para experimentos representativos. Las barras representan SEM, valores P calculados para cada punto de tiempo utilizando la prueba de comparaciones múltiples de Sidak; *, p < 0,05; * *, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001; NS = diferencias no significativas. Esta cifra ha sido modificada a partir de11. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: el protocolo de TI con cámara de TI induce rápidamente la maduración de CC, el perfil de activación único y la capacidad de activación de células T en PBMC humano, dependiente del pasaje de la placa y las plaquetas.
A. FACS análisis de los marcadores indicados en células CD11c+ entre el PBMC humano recién aislado ("control"), PBMC tratado con el protocolo de ti ("ti"), o PBMC tratado con ti donde se omitió el pasaje de la placa, las plaquetas se agotaron utilizando el a-CD41 kit de perlas antes del pasaje de la placa, o ambos de los anteriores se realizaron. Los datos Resumen seis experimentos independientes con tres donantes de sangre. Las barras representan valores medio, mientras que las barras de error representan SEM. valores P para cada comparación calculada mediante la prueba t emparejada; *, p < 0,05; * *, p < 0,01. Los paneles han sido modificados a partir de11. B. los PBMC humanos tratados con plaquetas o con plaquetas empobrecido se coincubaron durante la noche con un péptido irrelevante (SIINFEKL), o con péptido largo para la proteína de VPH E7 asociada al carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello. El PBMC se utilizaron entonces para estimular una línea humana CD8 T célula específicamente reactiva al péptido E7. La estimulación de células T se midió mediante la producción de IFNg después de 5 días de cultivo. (C) PBMC humano con tratamiento de plaquetas o de plaquetas empobrecido, fueron coincubados durante la noche con un carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello de 8-MOP tratado conunalínea de células SCC61, ya sea expresando (SCC61 VPH E6/7) o no expresando (SCC61 sin VPH ) las proteínas antigénicas VPH E6 y E719. El PBMC se utilizaron entonces para estimular una línea humana CD8 T célula específicamente reactiva al péptido E7. La estimulación de células T se midió mediante la producción de IFNg después de 5 días de cultivo. (B y C) Los datos muestran experimentos representativos con tres réplicas en cada uno. Las barras representan valores medio, mientras que las barras de error representan SEM. valores P para cada comparación calculada utilizando la prueba de comparaciones múltiples de Sidak; , p < 0,001; , p < 0,0001. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

marcador parámetro Untreated Placa ECP con protocolo de TI Placa de TI con protocolo de TI valor p ECP vs TI
HLA-DR Δ MFI 100,1 ± 42,4 439,8 ± 152,5 417,7 ± 152,2 Ns
CD80 Δ 3,9 ± 1,1 22,3 ± 7,2 24,5 ± 7,2 Ns
CD83 Δ MFI 0,3 ± 0,2 53,3 ± 9,7 51,4 ± 17,4 Ns
CD86 Δ MFI 10,8 ± 1,7 103,9 ± 23,4 87,1 ± 17,6 Ns
PLAUR Δ MFI 54,5 ± 12 721,4 ± 183,6 528,7 ± 135,5 Ns
ICAM1 Δ MFI 12,2 ± 1,6 179,6 ± 28,5 192,5 ± 25,4 Ns
ITGB5 Δ MFI 53,6 ± 25,7 97,1 ± 31,6 103,8 ± 32,8 Ns
CCL2 (MCP-1) Δ 0,6 ± 0,5 70,1 ± 6,7 55,2 ± 8,9 Ns
CXCL5 Δ 0,7 ± 0,4 39,1 ± 7,2 41,5 ± 4,7 Ns
CXCL16 Δ 0,3 ± 0,2 28,0 ± 8,8 35,3 ± 11,7 Ns
CD105 (endoglin) Δ MFI 3,6 ± 0,3 124,3 ± 25,4 141,8 ± 33,2 Ns
CD112 (nectina 2) Δ MFI 10,9 ± 1,8 47,3 ± 5,2 50,9 ± 9,2 Ns
CD120a (TNFR-1) Δ MFI 10,1 ± 2,6 2,2 ± 1,4 1,8 ± 1,1 Ns
CD137L (4-1BBL) Δ MFI 2,9 ± 1,5 1,0 ± 0,4 1,2 ± 0,6 Ns

Tabla 1: el protocolo de TI con cámara de ti induce rápidamente la maduración de CC equivalente a la inducida por el protocolo de TI con la cámara clínica ECP. Análisis FACS del cambio de los marcadores indicados de los correspondientes controles IgG en células CD11c + humanas vivas entre cualquier PBMC recién aislado ("sin tratar"), PBMC pasó a través de la placa clínica ECP siguiendo el protocolo de TI ("placa ECP con protocolo de TI") y analizado después de la incubación durante la noche, o PBMC tratado con el protocolo de TI ("placa de TI con protocolo") y analizado después de la incubación durante la noche. Para los marcadores, como HLA-DR, donde se modificó toda la población celular, los datos se expresan como cambios en la intensidad media de fluorescencia (IMF). Para los marcadores en los que solo un subconjunto de celdas expresan el marcador, como CCL2, la diferencia en las celdas de porcentaje positivo de marcador de CD11c en vivo + PBMC se representa en su lugar. Los datos Resumen seis experimentos independientes con tres donantes de sangre. Los datos de cada marcador se expresan como un error estándar de la media (SEM). Valores P para cada comparación calculada mediante la prueba t emparejada; NS = diferencias no significativas. La tabla ha sido modificada a partir de11.

Video 1
Video 1: imágenes de células vivas de las interacciones de plaquetas e inmunoglobulina dentro de la placa de TI.
El PBMC se preparó como se describe en la sección 2 del protocolo anterior y se expuso a la placa de transimmunización como se describe en la sección 4, excepto que el período de incubación estática en el paso 4.2.3 se redujo de 1 h a 30 min. Durante el protocolo de ti, la placa de ti, que es idéntica en tamaño a una diapositiva de microscopio estándar, se ha instalado en la etapa de retención deslizante de un sistema de imágenes de fluorescencia y las celdas dentro de ella se imágenes a 40 aumentos y a 37 ° c durante el llenado de la placa (4.2.2 ), de incubación de placas (4.2.3) y de caudal de placa (4.3.5). Se adquirieron imágenes continuas y se produjeron películas utilizando el software de "rutina de escaneo automatizado". Los subtítulos debajo del video indican la etapa del protocolo en el que se están filmando las celdas. Las flechas y los círculos del vídeo, con los subtítulos asociados, señalan las celdas y las áreas de interés. La barra de escala de 10 μM está presente en la esquina inferior derecha a lo largo del vídeo. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)

Discussion

El dispositivo miniaturizado y el protocolo descrito anteriormente por primera vez permiten una investigación de laboratorio eficiente de los mecanismos de ECP en sistemas experimentales de ratón, y en muestras de sangre humana pequeñas. Este es un gran avance; por ejemplo, nos permitió demostrar por primera vez la eficacia de la transimmunización contra tumores sólidos en un modelo de ratón 11, abriendo la posibilidad futura de una aplicación similar en oncología humana.

Antes del desarrollo del dispositivo de transimmunización y el método descrito aquí, era imposible investigar completamente todos los aspectos del ECP. En los modelos de ratón, aunque el 8-MOP un aspecto de la terapia podría ser replicadoun poco por el tratamiento de las células en una placa de Petri12,20, no había capacidad para integrar en el método el pasaje de la plancha, que se ha demostrado que proporcionar interacciones plaquetarias dinámicas que son críticamente importantes para la activación de DC fisiológica de ECP14. En estudios en humanos, alternativamente, el componente de flujo estaba completamente presente, pero la capacidad de exponer selectivamente componentes celulares específicos a 8-MOP a, o para protegerlos de él, faltaba21,22. Esto impidió la comprensión completa del mecanismo de ECP, y su optimización para la inmunidad o tolerancia. Además, la cantidad de sangre necesaria para trabajar con el aparato clínico del ECP es grande, dificultando la investigación científica. El dispositivo y el protocolo ECP miniaturizado descritos aquí por primera vez permiten un modelado ECP de laboratorio eficiente, totalmente flexible y ajustable. Además, la placa TI permite la visualización y monitorización en tiempo real de las interacciones celulares dentro de la placa mediante microscopía.

Para el éxito del protocolo utilizando tanto sistemas in vivo como ex vivo, es fundamental que el PBMC tratado contenga monocitos que puedan activarse en controladores de dominio funcionales. Para que esta activación continúe, también es necesario asegurarse de que la fracción PBMC contiene un número fisiológico de plaquetas sanas y activables, y que el protocolo de pasaje de la placa TI se sigue estrechamente. Con el fin de dirigir los controladores de dominio recién activados hacia una reactividad específica, deben proporcionarse con antígeno. Hemos encontrado que el método más eficiente de la entrega de antígeno para la inmunidad contra el cáncer es la coincubación durante la noche de los controladores de dominio recién activados concélulas tumorales de 8-MOP que contienen antígeno. Esto tiene la ventaja añadida de ser capaz de crear una respuesta contra el cáncer inmunogénica sin necesidad de conocimiento previo de los antígenos del tumor, permitiendo que los DCs seleccionarlos. Sin embargo, en los casos en que se conoce el antígeno, tuvimos cierto éxito en los sistemas ex vivo cuando se utilizan péptidos libres como antígenos en la co-incubación. Para aplicaciones inmunogénicas, los controladores de dominio propios deben protegerse de 8-MOPuna exposición. Por último, en experimentos in vivo, es importante trabajar con un modelo animal que sea capaz de inmunidad antitumoral. La transimmunización funciona mediante la creación de controladores de dominio activados, específicos del antígeno, que trabajan en el cuerpo para iniciar respuestas inmunes innatas y adaptativas. La alteración de la actividad o la falta de las células NK, CD4 o CD8 en el ratón tratado afectará la eficacia del protocolo5,11.

Si bien el protocolo descrito aquí es una prueba de principio que se ha optimizado para un modelo de tumor singénico sólido de ratón, sin embargo, revela muchas oportunidades. Los mecanismos de ECP en oncología sólo están siendo elucidados, y todavía hay mucho espacio para una mejor comprensión. En términos más generales, la capacidad de generar un ratón y un DCs humano activados fisiológicamente, y de dirigirlos selectivamente hacia la inmunidad específica de antígeno, tiene muchas aplicaciones potenciales más allá del cáncer. La capacidad de hacer lo mismo, pero en su lugar dirigir los controladores de dominio hacia la tolerancia antígeno-específica, como se sugiere por la eficacia tolerizante de la propia ECP, también tiene implicaciones médicas de amplio alcance. Con este método, esperamos proporcionar las herramientas y abrir una avenida productiva de la investigación para cualquier persona con un interés en las terapias fisiológicas de DC.

Disclosures

La Universidad de Yale posee patentes derivadas de la investigación de células dendríticas del Prof. Richard Edelson que han sido licenciadas a una empresa start-up de Yale, Transimmune AG. Richard Edelson y Michael Girardi son consultores científicos de Transimmune AG, mientras que Olga Sobolev es una empleada de Transimmune AG. Transimmune AG no tiene ningún producto comercial actual, sin embargo, de forma colaborativa, produce las placas Transimmune utilizadas en este artículo. Es posible que estos tres autores puedan beneficiarse potencialmente de la comercialización de estos descubrimientos en el futuro.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por NIH-NCI Spore Grant 1 P50 CA121974 (R. Edelson, M. Girardi); Centro Oncológico NIH support Grant 3 P30 CA16359-28S1 (R. Edelson, M. Girardi); la beca de capacitación del Howard Hughes Medical Institute (A. Vassall); y la Fundación del corazón de Nueva York (R. Edelson, A. Ventura, A. Vassall, H. Ezaldein). El apoyo parcial fue proporcionado por r01 CA196660-01 a M. Bosenberg.

Los autores están agradecidos al Dr. Robert Tigelaar por su tutoría, orientación y perspicacia experimental. Agradecemos a nuestros colegas de Fraunhofer IBMT, especialmente al Dr. Thorsten Knoll, por el desarrollo y la prestación de la cámara de TI equivalente al ECP. Nicholas Theodosakis amablemente ayudó con las etapas iniciales de los experimentos de YUMM. Agradecemos a nuestros donantes voluntarios de sangre, Inger Christensen y su personal profesional en el centro de tratamiento de la ECP de Yale por ayuda con la adquisición de sangre voluntaria. El Dr. Wendell Yarbrough y la Dra. Natalia Issaeva amablemente compartieron con nosotros las líneas celulares SCC61 y SCC61-E6/7. Para obtener asistencia técnica sobre el proyecto, agradecemos al Dr. Julia Lewis por el Consejo del protocolo FACS, y a E. Menet, G. Tokmoulina, C. Cote en Yale FACS Core. Las imágenes cinematográficas de las células dentro de la placa TI fueron adquiridas con la ayuda de Felix Rivera-Molina, PhD, Dept de biología celular y Yale CINEMA Imaging Center, escuela de medicina de Yale. La producción cinematográfica fue supervisada por Andrew Osborne, Senior video Producer, oficina de comunicaciones, escuela de medicina de Yale.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL) Therakos, Inc Rx only, NDC No. 64067-0216-01 Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells
AB serum Lonza BioWhittaker 14-498E Protocol step 8.5 - overnight culture of human PBMC
ACK red cell lysis buffer Lonza BioWhittaker 10-548E Protocol step 2 - mouse PBMC preparation
Anesthesia Tabletop V1 system with active scavenging VetEquip 901820 Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration
Autologous mouse plasma prepare in lab n/a Prepare per protocol step 2.4, use in  7.1 - mouse TI treatment administration
Autologous mouse serum prepare in lab n/a Prepare per protocol step 5, use in step 6.1 - overnight culture of mouse PBMC
C57Bl/6J mice Jackson labs 0000664 Protocol steps 1, 2, 5 and 7 - mouse tumor injection, blood/serum collection, and therapy return
Cheek bleed GoldenRod lancet, 5 um Medipoint 9891620 Protocol step 2 - mouse PBMC preparation
Clear RPMI Gibco by LifeTech 11835-030 Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC
DMEM/F12 Gibco by LifeTech 11330-032 Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture
EasyGrip Petri Dishes, 35mm Falcon 351008 Protocol steps 5 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC
Eppendorf 1.5mL conical tubes DOT scientific 1700-GMT Protocol steps 1-8
FBS (fetal bovine serum, heat-inactivated) SAFC Biosciences 12306C-500mL Protocol steps 1-4 - YUMM1.7 cell culture, 8-MOP/UVA treatment of cells, TI plate
Hemavet 950FS hematology counter Drew Scientific HV950FS Protocol step 8.2 - monitoring human platelet numbers
Heparin 5,000U/mL McKesson Packaging services 949512 Protocol steps 2 and 8 - mouse and human PBMC preparation
Isoflurane Abbott Laboratories 5260-04-05 Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration
Lympholyte M lymphocyte isolation medium Cedarlane Labs CL5035 Protocol step 2 - mouse PBMC preparation
Non-essential amino acids Gibco by LifeTech 11140-050 Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture
PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2) Gibco by LifeTech 14190-144 Protocol steps 1-7
Pen/strep Gibco by LifeTech 15140-122 Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture
Polypropylene 15mL conical tubes Falcon 352097 Protocol steps 1-8
Programmable 2-channel syringe pump New Era Pump Systems Inc model NE-4000 Protocol steps 4 and 8 - running the TI plate
Retro-orbital injection needles, 27G x 1/2 BD Biosciences 305109 Protocol step 7 - mouse TI treatment administration
Syringes, 10mL (LUER-LokTip) BD Biosciences 309604 Protocol steps 4, 8 - running the TI plate
Syringes, 1mL (Slip tip) BD Biosciences 309659 Protocol steps 1, 4, 7, 8
TI plate and tubing set Transimmune AG not commercially available  Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.
TI plate running platform Transimmune AG not commercially available  Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.
Tissue culture flasks, T75 (75 cm2) Falcon 353136 Protocol steps 1, 2, 6 and 8 - mouse and human cell culture
Tissue culture plates, 12-well Falcon 353043 Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells
Tissue culture scrapers Falcon 353085 Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC
Trypsin-EDTA 0.25% (1x) Gibco by LifeTech 25200-056 Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture
Tumor injection needles, 25G x 5/8 BD Biosciences 305122 Protocol step 1 - mouse subcutaneous tumor introduction
UVA irradiator Johnson and Johnson not commercially available  The apparatus was specifically developed by J&J for Prof. R. Edelson's laboratory. Several machines are available in the laboratory on a collaborative basis; please contact Prof. R. Edelson for use of one. Alternative UVA irradiators are commercially available but have not been tested by us.
Invitrogen EVOS FL Auto 2 Imaging System Invitrogen fluorescence imaging instrument

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References

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Inmunología e infección problema 147 Inmunología cáncer inmunoterapia fotoquimioterapia extracorpórea ECP células dendríticas DC
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Ventura, A., Vassall, A., Yurter, A., Robinson, E., Filler, R., Hanlon, D., Meeth, K., Ezaldein, H., Girardi, M., Sobolev, O., Bosenberg, M. W., Edelson, R. L. Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (147), e59370, doi:10.3791/59370 (2019).

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