Summary
Transimmünizasyon (TI) cihaz veya plaka ve ilgili protokoller, deneysel bir ortamda, ekstrorporeal fotokemoterapi (ECP) temel özelliklerini çoğaltmak için geliştirilmiştir, fizyolojik olarak aktif, ayarlanabilir dendritik üretimi için izin kanser immünoterapi için hücreler (DCs).
Abstract
Ekstrorporeal fotokemoterapi (ECP), deri T hücreli lenfoma (CTCL) için yaygın olarak kullanılan bir kanser immünoterapi olduğunu, dünya çapında 350 üzerinde üniversite merkezlerinde operatif. ECP 'nin klinik etkinliği ve örnek güvenlik profili, yaygın kullanımını tahrik ederken, altta yatan mekanizmaların elucidasyonu kısmen laboratuvar ECP modelinin eksikliği nedeniyle bir zorluk olarak kalmıştır. Bu engeli aşmak ve ECP araştırması için basit, Kullanıcı dostu bir platform oluşturmak için, hem fare modelleri hem de küçük insan kanı örnekleri ile çalışmak için uygun olan klinik ECP lökosit işleme cihazının ölçekli bir sürümünü geliştirdik. Bu cihaz Transimmünizasyon (TI) odası veya plaka olarak adlandırılır. Landmark deneyler bir dizi, minyatür cihaz düzenli olarak çeşitli syngeneic fare tümörü modellerinde Terapötik anti-kanser dokunulmazlık başlatılan bir hücresel aşı üretmek için kullanıldı. Deneysel sistemden bireysel faktörleri kaldırarak ve In vivo anti-tümör tepkisini ascertaining, daha sonra ECP immünizing potansiyelinin anahtar mekanik sürücüleri aydınlatılamamıştır. Topluca, sonuçlarımız ECP 'nin anti-tümör etkilerinin dendritik hücreler (DC) tarafından başlatıldığını, kan monoksit etkileşimi ile fizyolojik olarak TI plakasında trombositlerle oluşturulduğunu ve apoptotik hücre olan tümör hücrelerinden antijenlerle birlikte yüklendiğini ortaya koydu. Ölüm ince photoactivatable DNA çapraz bağlama Ajan 8-Methoxypsoralen ve UVA ışık (8-MOPA) maruz tarafından titoy edilir. Fare döndüğünde, bu hücresel aşı belirli ve devredilebilir anti-tümör T hücre bağışıklık yol açar. TI odasının, insan kan işleme için de uygun olduğunu doğruladıktan sonra, insan DCs 'yi, aktivasyon durumu ve profilinde klinik ECP odasından elde edilen tamamen karşılaştırılabilir bir şekilde üretmektedir. Burada sunulan protokoller, fare ve adam içinde ECP çalışmaları, 8-MOPaile apoptotik tümör hücrelerinin kontrollü üretimi ve çeşitli uygulamalar için fizyolojik insan ve fare monoksit türevi DCS üretimi için tasarlanmıştır.
Introduction
Ekstrorporeal fotokemoterapi (ECP), dünya çapında üniversite merkezlerinde yaygın olarak ameliyat edilen, kurulan bir immünoterapi yöntemidir. Kullanımı, benzersiz seçicilik, güvenlik ve ECP tedavisinin iki yönlü etkinliğini, ECP 'nin fiziksel bağışıklık sistemi ile paylaştığı özellikleri ile ortak göründüğü şekilde tahrik edilmiştir. ECP, kutanöz T hücreli lenfoma (CTCL)1,2' deki malign hücrelere karşı seçici bir şekilde immünize edilir ve nakil, otoimmünite ve Graft-versus-Host hastalığı (GVHD) ayarlarında hedeflenen antijenler için seçici olarak tolerans göstermesidir 3 ' ü , 4. ECP 'nin IMMÜNOGENISITE CTCL5' te sağlam bir CD8 T hücre bölmesine bağımlılığı ile vurgulanırken, özgüllük ECP 'nin çok uygun yan reaksiyon profiline yansıtıldığı halde, nakil esnasında hiçbir off-Target immün bastırma veya GvHD ayarları ve CTCL 'de patojenik olmayan T hücresi klonların potansiyel olarak malign T hücreleriyle birlikte kaybolabilen fırsatçı enfeksiyon duyarlılığını arttırmaz.
ECP 'nin klinik önemini göz önüne alındığında, mekanizmalarının daha iyi anlaşılması, ECP 'nin terapötik ulaşmalarını daha geniş bir kanser spektrumuna ve immünolojik bozukluklara kadar genişletebileceğini umut etmek Uluslararası çıkarları uyarmıştır. Ulusal Sağlık Enstitüleri (NıH) devlet-of-the-bilim Sempozyumu6 ve Amerikan Apheresis Uzlaşma Konferansı7' ye ait iki yurt içi onaylı atölye çalışmaları, yapılan ve raporlanan, ECP anti-kanser ve tolerogenic etkileri asıl hücresel katkıda bulunanların tanımlaması.
Bugüne kadar, ECP 'nin mekanizmasına hitap etmeye çalışan çok sayıda yayınlanmış rapor olmasına rağmen, iki birincil engel bilimsel gelişmeleri engellemişlerdir. Öncelikle, deneysel laboratuar ortamında ECP mekanizmalarının incelenmesi, ECP 'nin hücresel ve in vivo efektlerini tamamen yansıtan ve hayvan modelleri için uygulanabilir olan minyatür ECP cihazının eksikliği ile sınırlıdır. İkincisi, klinik ortamda ECP örneklerinin derinlemesine laboratuar analizi, tedavi merkezlerine erişim gerektiren ECP-işlenmiş hasta bağışıklık hücrelerinin sınırlı mevcudiyeti ile kısıtlanmıştır ve ayrıca hastanın infüzyon ve hasta-reinfkullanılan lökositlerin ödün olmayan setleri için etik ihtiyaç.
ECP araştırmalarının ilerlemesini engelleyen engelleri çözmek için, tedavinin temel unsurlarını en yakından taklit eden minyatür bir ECP aparatı geliştirmek için dışarı çıkıyoruz. Standart ECP tedavisi, 1 mm kalınlığında, ultraviyole bir ışık (UVA)-şeffaf, plastik plaka6,8ile bir hastanın lökootezi zenginleştirilmiş löokaytlardan geçişini içerir. Plakada, lökositler 8-Methoxypsoralen (8-MOP), UVA pozlama üzerine bir fotoğraf-activatable Ajan maruz geçici bir reaktif forma dönüştürülür (8-MOPa), DNA çapraz-pirimidin üsleri onun iki bivalent bağlama yoluyla bağlama yeteneğine kardeş DNA ipleri9,10. İşlenmiş, 8-MOPA-tedavi lökositler toplanır ve Hastaya intravenöz olarak döndürülür.
ECP kendisi iki yönlü bir tedavi olduğundan, kanserde immünizing ve nakli, otoimmünite ve GvHD ayarlarında toleranasyon, açıklama için biz model ECP 's bağışıklığı modu "transimmünizasyon" ve tolerogenic modu "transtolerization" adlı var. İlk önce transimmünizasyon modalitesi üzerine odaklandık. Son zamanlarda bildirilen minyatür ölçeklenebilir fare-to-man ECP cihaz, transimmünizasyon (TI) odası veya plaka, ve karşılık gelen protokol, bir kanser ayarında insan ECP cihazın hem hücresel ve in vivo etkilerini çoğaltmak11.
Transimmünizasyon içinde vivo modelde mümkün olduğunca klinik olarak alakalı hale getirmek için, subkutan enjekte edilen syngeneik fare tümörü sonra immünoterapi başlatıldı, böylece kurulan kanserde protokolün etkinliğini test. Benzer şekilde CTCL 'de ECP 'ye, Yumm 1.7 Melanom modelinde prensip olarak transimmünizasyon protokolü, tümör taşıyan hayvanlardan periferik kan mononükleer hücreler (PBMC) kullanır. Hücreler akış altında TI plakası üzerinden geçirilir. Minyatür odada hücrelerin 8-MOPbir tedavisi mümkün iken, sadece istenilen hücre tipi 8-MOPAmaruz kalmasını sağlamak için, ayrı olarak yürütmek için tercih edilir. Önceki çalışmalar ECP 's tolerogenic etkisi 8-MOPa-yaralı antijen sunan hücre12tarafından aracılı olduğunu gösterir, bağışıklık etkisi 8-hedef tümör hücrelerininbir yaralanma MOP gerektirirken11. Transimmünizasyon protokolünde ya tümör hücreleri, ya da immün hücreler, seçmeli olarak 8-MOPA 'ya ihtiyaç duyulan şekilde maruz kalabilirler. 8-MOPA-yaralanan tümör hücreleri ve ECP kaynaklı dendritik hücreler (DC) arasındaki temas süresini maksimumdan çıkarmak, klinik ECP13' ün immünoterapötik kapasitesini önemli ölçüde geliştirecek şekilde gösterilmiştir, biz bir gecede ortak kuluçş protokolüne adım at. Gece kuluçvan sonra, tedavi hücreler tümör taşıyan hayvan döndürülür.
Bu sistem, tümör büyümesini güvenilir bir şekilde azalttı ve kurulan syngeneik tümörlerle fareler içinde spesifik anti-tümör bağışıklık başlattı11, ve bıze ECP 'nin klinik anti-tümör etkinliğini mekanizmasını incelemek için izin verdi. Birkaç çalışmada, ECP dokunulmazlığının TI plakası14,15' te ex vivo trombosit aktivasyonu yoluyla başlatıldığını göstermiştir. Aktif trombositler daha sonra monoksit-dendritik hücre maturasyonu14, fizyolojik DCS üretimine yol açan sinyal. Yeni kurulan monoksit-türetilmiş DCs, antijen spesifik T hücresi yanıtlarını16etkinleştirmek için 8-MOPA-hasarlı tümör hücrelerinden çapraz-mevcut talaşık antijenleri edebiliyoruz. Daha önce12,17, ancak tavsiye olarak, 8-MOPakaynaklı hasar doğmakta olan DCS kendileri karşı hareket veya hatta anti-tümör etkisi11ters olabilir, ECP tolerans için bir mekanik bağlantı sağlayarak.
TI plaka da insan PBMC fizyolojik aktif DCs üretmek için kullanılmıştır. Fare çalışmalarına benzer şekilde, insan TI-türeyen DCs, nesil için trombositlerin varlığında plaka geçişi üzerine bağımlıdır, klinik ECP plakasında üretilen bunlar ile fenotipically özdeş görünür ve verimli bir şekilde işleme ve insan T hücrelerinin aktivasyonu için insan tümörü antijenleri çapraz sunma11,16.
ECP immünoterapi mekanizmasının açığa çıkarılması, bu nedenle hızlı bir şekilde fizyolojik fare ve istenen antijen özgüllüğü insan dendritik hücreler oluşturmak için bir yöntem ortaya çıkardık, bu işlevsel olarak modüle edilebilir. Yenilikçi TI cihazı ve protokolü, ECP araştırma ve tedavi ve kanser immünoterapi alanlarında daha geniş ölçüde potansiyel öneme sahiptir ve fizyolojik, fonksiyonel dendritik hücrelere ilgi ile diğer herhangi bir alanda immünizasyon ya da tolerans modalitesi. Bu yayının, bu tür araştırma alanlarına ilgi duydukları araçlara gerekli araçları sunmasını umuyoruz.
Protocol
Burada tarif edilen tüm fare yöntemleri Yale Üniversitesi 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıeruc) tarafından, ulusal hayvan sağlığı kuralları enstitüleri ile ilgili olarak onaylanmıştır. Tüm insan çalışmaları, sağlıklı gönüllüler tarafından yazılı Onayla bağışlanan kan ile yapılmıştır. İnsan kanı çalışmaları, tanınan etik yönergelere (örn. Helsinki beyannamesi, CıOMS, Belmont raporu, ABD ortak kuralı) uygun olarak yapılmıştır ve 0301023636 protokol numarası altında Yale ınsan soruşturma Inceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır.
Not: Aşağıda fare syngeneic tümörlerin anti-tümör tedavisi için transimmünizasyon açıklayan protokoldür.
1. syngeneic YUMM 1.7 tümör Implantasyonu
- Syngeneik tümörlerin, tümör hücresi ilgi alanına uygun olarak fareler tarafları içine implantı için kurulan protokolleri takip edin.
Not: Aşağıdaki protokol Yumm 1.7 C57BL/6 fare Melanom tümör modelini açıklar. YUMM 1.7 Melanom hücreleri nazik Dr Bosenberg, Yale18tarafından sağlandı. -
Bir hücre geçişi sonra hücrelerin dondurulmuş bir kısım çözme ve hücreleri kullanın. Kültür taze çözülür YUMM 1.7 hücreler Dulbecco 'nun modifiye kartal besin karışımı F-12 orta (DMEM/F12), ile tamamlayıcı 10% ısı-inaktive fetal Sığır serum (FBS), 1% penisilin/streptomisin, ve 1% esansiyel olmayan amino asitler, standart altında doku kültürü koşulları (37 °C, 5% CO2).
- Toplamak YUMM 1.7 hücreleri 60 \ u201270% Confluence yeterli Trypsin-EDTA kullanarak hücre kültürü plaka veya Flask alt kapsayacak şekilde (örneğin, 4 mL bir T75 Flask).
- 3 \ u20124 dk için oda sıcaklığında hücre kültürü gemiler Rest, hafifçe hücrelerin ayırmak yardımcı olmak için bazen geminin alt veya tarafına dokunarak.
- 1 mL fetal Sığır serum ekleyin (FBS) başına 4 mL tripsin-ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) hücrelerin çoğu ayrılmış bir kez reaksiyon durdurmak için. 15 mL konik tüpüne pipetleme yaparak hücreleri toplayın. Fosfat-tamponlu tuz (PBS) ile Flask durulayın ve aynı toplama tüpüne durulama ekleyin. PBS ile tüpü 15 mL 'ye doldurun.
- Küçük bir kısım çıkarın ve hücreleri saymak.
- Tümör hücrelerini toplamak için standart doku kültürü santrifüjünde 250 x g 'de 10 dakika aşağı spin.
- 1 x 106 hücreli/ml yoğunlukta PBS 'de resuspend Yumm 1.7 hücreler.
- 1 x 105 Yumm 1.7 tümör hücrelerini subkutan içinde 100 μL PBS alıcı 4 ila 6 haftalık vahşi tip erkek C57BL/6J fareler, kurumsal yönergelere göre anestezize (örneğin, 3 \ u20125% Isoflurane uçucu madde gaz, anestezi arka pençe tutam refleks eksikliği ile teyit).
- Bir Kaliper kullanarak dik tümör çapları ve yüksekliği iki haftalık ölçümler yoluyla tümör hacmini izleyin. Hesaplama YUMM 1.7 (tümör uzunluğu x Genişlik x yükseklik olarak tümör hacmi)/2.
- Tümör sadece palpe edildiğinde transimmünizasyon terapisi başlatın; YUMM 1.7 tümörler için, bu genellikle gün 7 \ u201210 sonrası tümör implantasyonu.
2. Transimmünizasyon için periferik kan mononükleer hücrelerin toplanması
- Her tümör taşıyan fareyle yanak kanama yoluyla 100 \ u2012150 μL kan toplayın.
- Kan toplanan gibi, her fare tedavi grubundan havuz kanı (her 5 deneysel fareler + 5 kontrol fareler) tek bir 15 mL tüp içeren 5.000 U/mL heparin. 100 μL kan toplanan başına 10 μL% 10 heparin kullanın.
Not: Kan pıhtılaşma önlemek için toplama sırasında sıklıkla tüp karıştırın. Kontrol tümör taşıyan fareler deneysel fareler aynı zamanda, tedavi grubu ile eşit koşullar sağlamak için, "kontrol" kan ya atılır olabilir veya ek sağlamak için tedavi grubunun kanı ile birlikte Bled olabilir tedavi grubu için deneysel PBMC, müfettişlerin takdirine. - Set up 1 15 mL tüp 4 mL lenfosit yalıtım Orta ( malzeme tablosunabakın) başına 5 \ u201210 fare Bled. Yavaş tabaka kan (tümör taşıyan fareler toplanan) orta üstünde. PBMC kırmızı kan hücrelerinden ayırmak için 1000 \ u20121, 500 x g 20 dakika için hücreleri döndürün.
- Santrifüjleme sonunda, üst plazma tabakası toplamak, bırakarak ~ 0,5 mL Buffy Coat yukarıda kalan, ve 4 °C daha sonra kullanım için saklamak (adım 7,1).
- Temiz bir 15 mL tüp içine Buffy Coat tabakası toplamak, 15 mL PBS ile doldurun ve PBMC toplamak için standart bir doku kültürü santrifüjte 250 x g 10 dk için spin.
- Dikkatle supernatant kapalı pipet, ve tüp Flicking Pelet pelletini. Pelet yumuşak ve kaybolabilir gibi, deplülmez etmeyin. 2 mL ACK kırmızı kan hücresi liziz tampon ekleyin ( malzeme tablosunaBAKıN) PBMC kalan kırmızı kan hücrelerini kaldırmak için tüp. 10 dakika boyunca buzun üzerinde inküyün.
- PBS ile tüpü 15 mL 'ye doldurun ve PBMC 'yi toplamak için standart doku kültürü santrifüjünde 250 x g 'de 10 dakika aşağı döndürün.
- Dikkatle supernatant kapalı pipet, ve Flicking tarafından Pelet pelletini. Pelet yumuşak ve kaybolabilir gibi, deplülmez etmeyin.
Not: Bu adımda, arıtılmış PBMC, denemeye en uygun şekilde değiştirilebilir. Çeşitli PBMC bileşenleri (trombositler, monosit, diğer immün hücre türleri) gerektikçe PBMC 'den tükenmiş veya izole edilebilir. Ayrıca, PBMC kendilerini 8-MOPA, önce ya da Bölüm 4 sonra (önce veya plaka geçişi sonra-Bölüm 2 veya bölüm 5 önce), protokol adımlarını izleyerek, 3.3 \ u 20123.8 ve Yumm 1.7 hücreler için PBMC yerine maruz olabilir. Bu, tedavinin immünojenik kapasitesini keser ve bunun yerine bağışıklık toleransını teşvik eder. - Her tedavi grubu için (her 5 deneysel fareler + 5 kontrol faresi), 300 μL FBS içinde PBMC Pelet pelletini.
3. tümör hücrelerinin 8-MOP/UVA tedavisi
- Kültür ve toplama YUMM 1.7 tümör hücreleri adımları açıklandığı gibi 1.2 – 1.3 bir 8-MOPA-maruz tümör hücresi antijen kaynağı hazırlamak için.
- Hazırlamak 2,5 x 106 Yumm 1.7 tümör hücreleri tedavi grubu başına 5 fareler. Her tedavi grubu için, 2,5 x 106 hücreli/300 μL (~ 8,33 x 106 hücreler/ml) de FBS tümör hücresi Pelet pelletini.
- Doku kültürü kaput ışıkları kapalı, eklemek 8-MOP ( malzeme tablosunabakın) IÇIN Yumm 1.7 tümör hücre süspansiyonu son 8-mop konsantrasyon 100 ng/ml.
Dikkat: 8-MOP bir photoactivatable DNA-zararlı Ajan ve kanserojen olduğunu. Kullanım ve dağıtma, maruz deri ile temas önlemek ve uygun atmak dikkatli olun. - Hücreleri iyi karıştırın, hücre konteynerini teneke folyoyla sarın ve 37 °C 'de 20 dakika boyunca inküye yapın.
- 1 mL FBS ile 5 fareler (2,5 x 106 Yumm 1.7 tümör hücreleri) her tedavi grubu için bir kuyu doldurarak bir 12-Well doku kültürü plaka ön kat, ve 4 °C 'de 20 dakika için doldurulmuş plaka soğutmak.
- Önceden ısıtmak için UVA ışık kaynağını açın.
Dikkat: UVA ışığı kanserojen. UVA ışık kaynakları ile çalışırken hızlı ve dikkatli bir şekilde çalışır, cilt pozlama korumak ve yüz ve gözler korumak için yüz kalkanları veya gözlükleri kullanın. - 20 dakika sonra, soğutulmuş 12-kuyu plakası (adım 3,5) doku kültürü kaputu taşıyın, FBS kuyudan kaldırmak ve 300 μL (2,5 x 106 hücreler/ıyı) MOP-Exposed tümör hücreleri (adım 3,4) iyi başına ekleyin.
- 4 J/cm2toplam ışınlama için ön ıSıTıLMıŞ UVA ışık kaynağına hücre içeren plaka açığa.
Not: Burada açıklanan 8-MOP konsantrasyonu ve UVA dozu, YUMM 1.7 tümör hücresi hattı için kalibre edilmiştir. 8-MOP/UVA dozu bir Titrasyon, neden yeterli 100% tümör hücre ölümü içinde 1 pozlama hafta, her deneysel tümör hücre hattı için yapılmalıdır, etkili öldürme dozu belirlemek için. Hücrelerin Retro-orbitally (adım 6,1) ve böylece herhangi bir hasarlı tümör hücreleri başka türlü tedavi hayvan göz tümörlerini oluşturabilir çünkü bu kritik fare in vivo TI deneyler için önemlidir. Bir kılavuz olarak, 4 \ u20128 J/cm2 UVA, 100 \ u2012200 ng/ml 8-MOP, çoğu tümör hücre hatları için tipik etkili bir aralığıdır. - Her iyi 8-MOPA-tedavi tümör hücreleri toplayın, plaka dönen ve dikkatle tam hücre kurtarma sağlamak için pipetleme.
4. TI plakası hücrelerin geçişi
- 5 fareler her tedavi grubu için, bir 1,5 mL konik tüp 300 μL uygun PBMC (adım 2,11) ve 300 μL 8-MOPA-tedavi tümör hücrelerinin (adım 3,9) birleştirir. Hücreleri karıştırın.
- Bir 10 mL şırınga kullanın "giriş" ve "çıkış" tı boru setleri doldurmak için (bkz.
Malzeme tablosu) FBS ile. Tüpleri doldurmak için boru kelepçelerini açın ve tüpleri şırınga bağlantısını kesmeden önce doldurduktan sonra FBS 'i tüpün içinde tutmak için kelepçeleri kapatın. - PBMC ve tümör hücre karışımı eklemek için bir P1000 pipet kullanın (adım 4,1) TI plaka ( malzeme tablosunabakın). Plakayı 45° açıyla tutun, Pipet ucunu TI plaka alımına güvenli bir şekilde yerleştirin ve plakayı yavaşça doldurun ve kabarcıkları kaçının.
- Pipet pistonu bırakmadan önce Pipet ucunu alından çıkarın. Plaka 450 μL tutar; kalan hücreleri 1,5 mL konik tüpüne geri döndürür.
- FBS dolu boru, hücre dolu TI plaka ve 1,5 mL konik tüp doku kültürü kuluçka içinde kalan hücreler içeren 37 °C için 1 h. Kuluçka sonra, kelepçeleri serbest, yerçekimi ile TI tüp boş.
- Bir P1000 pipet kullanarak TI plakasının hücreleri kaldırmak için Pipet ucunu piston ile plaka portuna yerleştirerek takın. Plakayı 45° açı olarak tutun ve P1000 Pipet ucunu doldurun. Hücreleri orijinal 1,5 mL konik tüpüne geri yerleştirin.
- TI plakasını çalıştırmak için, çıkış tüpünü plakaya bağlayın ve TI plakasını plaka çalışan sisteme sabitleyin.
- 1 mL şırıngayı kullanarak, 600 μL 'yi 1,5 mL konik tüpten PBMC ve tümör hücre karışımından çekin, şırıngadaki herhangi bir baloncuğu çıkarın, şırıngayı açık kelepçe ile giriş tüpüne takın ve sıvı borunun sonuna ulaşıncaya kadar yavaşça doldurun.
- Giriş tüpünün ücretsiz ucunu TI plakasına takın ve kalan hacmi yavaşça yüklemeye devam edin. Giriş kelepçesini kapatın.
- 1 mL şırıngayı ayırın ve giriş tüpünü şırınga pompasına bağlayın. Çıkış tüpünü, hücre toplama için temiz 1,5 mL konik tüpüne sabitleyin.
- Şırınga pompası akış hızını 0,09 mL/dak olarak ayarlayın, ancak pompayı henüz başlatmayın. TI plakasını ~ 30° şırınga pompası tarafına doğru EĞIN, TI plakası çalışan bir platform veya başka bir araç kullanarak (örn., plakanın bir ucunda küçük bir düz nesne).
- Giriş tüpünün üzerindeki kelepçeyi dikkatlice bırakın. Enjektör pompayı başlatın, TI plakasının nasıl doldurduğunu dikkatle gözlemlemek ve gerekli olduğu gibi tüp veya plakayı herhangi bir hava kabarcığı akışını engel olmalıdır.
- TI plaka tamamen doldurulduktan sonra, onu boşaltır gibi ters yönde ~ 30° eğim. Tüm hücreler ve sıvı 1,5 mL konik toplama tüpünde olduğunda, pompası durdurun.
- TI plakasını yıkamak için, giriş tüpünü şırınga pompasından çıkarın, 600 μL FBS ile dolu 1 mL şırıngaya bağlayın ve 4.8 \ u 20124.9 adımlar için prosedürü izleyin.
- Şırınga pompası akış hızını 0,49 mL/dak olarak ayarlayın, giriş kelepçesini bırakın ve TI plakasını adımda açıklandığı gibi çalıştırın 4.12 \ u 20124.13, aynı 1,5 mL konik tüpte yıkama toplama. Herhangi bir yapışkan hücreleri ayırma ve salınımlı yardımcı olmak için hafifçe tüm zaman, TAP veya TI plaka dokunun.
- Spin koleksiyonu 1,5 mL konik tüp 8 dk. için 250 x g at tezgah mikrofuge içinde supernatant atmak.
5. gece kültürü orta için otolog fare serum hazırlanması
- Herhangi bir antikoagülan olmadan 10 \ u201212 hafta eski C57BL/6J fareler herhangi bir kurum tarafından onaylanmış yöntemi (örneğin, göz kanama, kuyruk ven kanama, yanak kanama veya Terminal Bleed-Out kalp delinme) tarafından kan toplamak. Tahmin edilen her 300 μL serum için 1 mL kan toplanması gerekir.
Not: Denemede 5 farenin her bir tedavi grubu için 300 μL serum gerekir. - 4 °C ' de kan pıhtıya izin verir.
- 3.000 x g 'de koagüle kan aşağı spin 15 dk. dikkatle üst serum içeren tabaka toplamak
Not: Serum hemen gece hücre inkübasyon orta yapmak için kullanılabilir (adım 6,1), ya da gelecekteki deneyler için korunmuş. Serum korumak için,-20 °c ' de plakaya dondurmak.
6. antijen ile PBMC gecelik Co-inkübasyon
- Resuspend PBMC ve tümör hücresi Pelet (adım 4,5) içinde 2 ml net rpmi ile 15% otolog fare serum (adım 5 hazırlanmış). 35 mm 'lik doku dışı kültüre sahip steril bir çanak içinde plaka ve standart doku kültürü koşullarında (37 °C, 5% CO2) bir gecede inkübe edilir.
Not: PBMC olmayan bir hücresel antijen (peptid, Nanoparticle, protein, vb) ile kullanıldığında, protokol 3 bölüm atlamak ve Bölüm 2 doğrudan Bölüm 4 devam, TI plaka için istenen antijeni ekleyerek-burada gece Co-kuluçka için PBMC geçti Adım 6,1. - Ertesi gün, dikkatle bir doku kültürü sıyırıcı ile çanak altındaki herhangi bir yapışan hücreleri ayırın, hatta hücre toplama sağlamak için kazımayı sırasında çanak döndürüyor. 15 mL 'Lik bir tüpte hücreleri toplayın.
- Yemek için 2 mL PBS ekleyin ve aynı tüp içine hücreleri toplama, kazımlama adımını tekrarlayın. 35 mm tabak 1 mL PBS ile durulayın ve aynı tüp için durulama ekleyin.
- Hücre toplamak için standart bir doku kültürü santrifüjte 250 x g 'de 10 dk için spin. Dikkatle süpernatant kapalı pipet ve tüp Flicking Pelet pelletini. Pelet yumuşak ve kaybolabilir gibi, deplülmez etmeyin.
7. TI-tedavi hücrelerin tümör taşıyan fareler yeniden enjeksiyon
- Geri spin otolog plazma (adım 2,4 hazırlanmış) içinde 750 x g 15 dakika için herhangi bir partikül tortu. Cell Pelet 'i (adım 6,4), 600 μL otolog plazma veya PBS 'de resuspend.
- Uygun anestezik Retro orbital Pleksi içine fare başına 100 μL hücreleri enjekte (örneğin, 3 \ u20125% Isoflurane uçucu madde gaz, anestezi arka pençe tutam refleks eksikliği ile teyit) tümör taşıyan deneysel fareler. Eğer o kadar istenirse, kontrol tümörü taşıyan fareler ile yeniden enjekte 100 μL otolog plazma tek başına, ya da PBS.
- YUMM 1.7 tümör taşıyan fareler için, 3 hafta boyunca haftada iki kez, toplam 6 tedavi için tedaviyi (2-7.2 basamakları) tekrarlayın. Topla ve PBMC tümörün taşıyan fareler haftalık (protokol bölümleri 2 \ u20124) Pazartesi ve Perşembe günleri, ve yeniden-gece kuluçkaya (protokol bölümleri 5 \ u20127) Salı ve Cuma günleri sonra infkullanım işlemek.
Not: Bu tedavi rejimi farelerde YUMM 1.7 tümörlerin spesifik büyüme kinetiği için geliştirilmiştir. Daha yavaş veya daha hızlı tümör büyüme oranları ile diğer tümör sistemleri için titoy olması gerekebilir-sırasıyla artan veya tedavi sayısını azaltarak. - Tümör hacmini iki haftalık ölçüm yoluyla izleyin — tercihen tedavi yönetimi (Salı ve Cuma)-dik tümör çapları ve yüksekliği bir Kaliper kullanılarak. Kontrol tümörü hacimleri kurumsal yönergeler ve protokoller tarafından izin verilen maksimal boyuta ulaştığında deneyi sonlandırın.
8. Insan kanı Ssmall hacimleri tedavi için protokol adaptasyon
- İlk insan kanından PBMC izole ederek insan hücreleri ile kullanım için protokol adapte. Herhangi bir tercih edilen PBMC yalıtım protokolüyle heparin 'i bir anti-koagulant olarak kullanın.
- Yalıtılmış PBMC fraksiyonu en iyi protokol sonuçları için, fizyolojik bir trombosit sayısı içerdiğinden emin olun. Monitör trombosit herhangi bir standart Hematoloji sayacı kullanarak ön ve post-PBMC yalıtım sayar.
- İnsan hücresel antijen kaynağı kullanıyorsanız, YUMM 1.7 hücreleri için Bölüm 3 ' te açıklanan adımları izleyerek insan antijenik hücrelerini tedavi edin. Titrat 8-MOP ve UVA dozlarda buna göre.
- 3 x 107 PBMC Per TI plakasını kullanarak bölüm 4 ' te açıklanan plaka geçişi adımlarını gerçekleştirin.
- Kültür PBMC bir gecede hücresel/diğer antijen ile seçim, Bölüm 6 ' da açıklandığı gibi, ama yerine 15% insan AB serum otolog fare plazma için gece kültürü orta adım 6,1.
- İstenen herhangi bir tahlil elde edilen hücreleri kullanın. Örneğin, antijen-reaktif T hücreleri ile ortak kültür TI-tedavi hücreler tarafından başlatılan antijen özgü T hücre yanıtlarını gözlemlemek için.
Representative Results
Son zamanlarda bir fare-to-man ölçeklenebilir minyatür ECP cihazı, TI plaka (Şekil 1a), geliştirilen ve ilgili tedavi protokolleri tasarlanmıştır. Cihaz ve protokol anahtar hücresel ve in vivo özellikleri immünizing ECP, "transimmünization" olarak adlandırılan yeniden.
Kanıtı-of-prensip murine transimmünizasyon Protokolü11 (Şekil 1B) periferik kan mononükleer hücrelerin EKSTRORPOREAL TI plaka geçişi oluşur (PBMC) tümör taşıyan fareler birlikte APOPTOTIK 8-MOPA-Exposed tümör hücreleri. Özellikle, TI odası saydamdır ve standart mikroskopinin slayt biçimine uyacak şekilde boyutlandırılır ve protokolün herhangi bir noktasında TI plakası içinde hücre etkileşimlerini kolay şekilde görüntüleme olanağı sağlar (video 1). TI-Plate-aktif bağışıklık hücreleri, 8-MOP A-Exposed apoptotik tümör hücreleri ilebirgecede inkük, tümör hücre alımı kolaylaştırarak, işleme, ve DCS için tümör antijenlerin transferi. Ertesi gün, eş-kulkarlı hücre karışımı tümör taşıyan hayvanın kan akışına döndürülür. Kontrol hayvanları, tümör büyümesi üzerinde lenfotükenme herhangi bir etkisi için normalleştirmek için, aynı kan toplama prosedürleri geçmesi yerine PBS yeniden infüzyon almak. Tüm hayvanlarda tümör büyümesi deney boyunca izlenir.
Yumm 1.7 syngeneic murine Melanom model18' i kullanarak yapılan çalışmalarda, transimmünizasyon Protokolü üç hafta boyunca haftada iki kez tekrarlanıyordu, her hayvana toplam altı tedavi (Şekil 1B). Tedavi, (> 100) tedavi edilen tüm hayvanların iyi tolere edilmiş ve sürekli 2 yıl (Şekil 2a, B) üzerinde gerçekleştirilen 9 bağımsız deneyler gözlenen olarak, tedavi karşı kontrol hayvanlarda Yumm 1.7 tümör büyüme azalma gösterdi ortaya çıktı. Sonuçlar, bir deney içinde bireysel hayvanlar için temsil edilen tüm deneyler (Şekil 2a) üzerinde transimmünizasyon-tedavi ve kontrol hayvanların birikimli tümör büyüme verileri gösterir, bir anlam sağlamak için değişkenlik gösterebilir (Şekil 2B).
Biz protokol başarısı eleştirel tedavi PBMC içinde monosit varlığına bağlıdır bulundu, PBMC fraksiyonu trombositlerin varlığı, ve TI plaka geçiş adım. Plaka geçişi atlandığında ya da trombosit veya monosit PBMC fraksiyondan tükendiğinde, terapötik etki artık gözlemlenmez (Şekil 3A). Tedavi ayrıca apoptotik tümör hücrelerinin varlığını gerektirir. İmmün hücrelerin veya antijen kaynağının yokluğunda ya da uyumsuz antijen varlığını etkisiz olduğunu, örneğin fareler taşıyan YUMM 1.7 tümörler MC38 kolon karsinomu hücreleri kullanılarak tedavi edilir (Şekil 3B). Bir immünizing sonucu için de 8-MOPAPBMC pozlama önlemek için önemlidir. 8-MOPa-EXPOSED PBMC sadece abrogate, ya da muhtemelen ters, anti-tümör bağışıklık (Şekil 3c), ama aynı zamanda maruz kalmayan hücrelerin immünizing potansiyelini inhibe, deney olduğu gibi 8-MOPA-maruz ve 8-MOP eşit sayıda Akorumalı PBMC gözlemlenebilir anti-tümör etkisi (Şekil 3c) ile kullanıldı.
İnsan PBMC ile, TI odası ve transimmünizasyon protokolü, DC 'ye başarılı monoksit aktivasyonuna yol açar, hücre yüzeyi ve klinik ECP plakası tarafından elde edilen hücreler arası aktivasyon işaretçileri ile ayırt edilemez (Tablo 1). Fare çalışmalarında olduğu gibi, DC aktivasyonu (Şekil 4A) ve transimmünizasyon yeteneği-DCS işlemek ve mevcut antijen (Şekil 4b,C) kritik olarak PBMC trombositlerin varlığı ve TI plaka geçişi üzerinde bağlıdır. Transimmünizasyon-aktif insan DCS etkili bir şekilde işleyebilir ve çapraz-mevcut ya peptit antijenleri (Şekil 4b), ya da tüm 8-MOPA-Exposed insan tümörü hücrelerinden antijenler, in vitro insan antijeni özgü T hücre hatları etkinleştirmek için (Şekil 4c), TI ve trombosit bağımlı bir şekilde (Şekil 4b, C).
Şekil 1: Transimmünizasyon (TI) odası ve protokol şemaları. (A) transimmünizasyon tedavi odasının diyagramı ve ÖZELLIKLERI (TI plakası). (B) transimmünizasyon tedavisi deneysel iş akışının şematik açıklaması. Kısaca, hayvanların syngeneic tümör hücreleri ile subkutan (s.c.) aşı vardır; palpe tümörler ile hayvanlar iki kez kan beraberlik, kan PBMC yalıtım, 8-MOP/UVA tedavi tümör hücreleri, PBMC ve tümör hücre Co-kuluçka bir gecede otolog trombosit kaplı TI plaka yoluyla plik akış geçişi tarafından haftalık tedavi edilir ve aynı tümör taşıyan hayvanlara intravenöz olarak hücrelerin yeniden enjeksiyonu. Tümör hacmi deney boyunca ölçülür. Bu rakam11' den itibaren değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Yumm 1.7 Melanom syngeneic tümörlerin transimmünizasyon kontrolleri büyümesi. (A) zaman içinde Yumm 1.7 tümör hacmi 1 x 105 Yumm 1.7 tümör hücreleri ile aşı C57BL/6 fareler için çizilen ve altı transimmünizasyon tedavileri (siyah çizgi) veya altı kontrol tedavileri (gri çizgi) alma. Veriler iki yıl boyunca yürütülen dokuz bağımsız deneyden fazla birikimli. (B) tek bir temsilci Yumm 1.7 transimmunizaton deney, her satır için tek bir fare için tümör büyüme gösteren veri. (A ve B) Tüm deneylerde "PBS kontrol" fareler deneysel hayvanlar ile aynı programda Bled, ama altı steril PBS yeniden infüzyon aldı. Hata çubukları SEM 'i temsil eder, Sidak 'ın birden çok karşılaştırma testini kullanarak her zaman noktası için hesaplanan p değerleri; * *, p = 0,0013; , p < 0,0001. Bu rakam11' den itibaren değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: transimmünizasyon, TI plakasında monosit ve trombosit gerektirir-PBMC fraksiyonu geçti, yanı sıra 8-antijen eşleşen tümör hücrelerininbir tedavi MOP ve 8-MOPa koruyucu PBMC. (A) C57BL/6 fareler için çizilmiş zaman içinde Yumm 1.7 tümör hacmi 1 * 105 Yumm 1.7 tümör hücreleri ile aşı ve altı transimmünizasyon tedavileri (katı siyah çizgiler), altı kontrol tedavileri (katı gri çizgiler) veya altı TI tedaviler alma plaka geçişi adımından önce PBMC 'den (sırasıyla a-CD11b ve a-CD41 tükenme kitleri kullanılarak) monositler veya trombositlerin tükenmesi veya plaka geçişi atlanmışsa (noktalı çizgiler). (B) C57BL/6 fareler için çizilmiş zaman içinde tümör hacmi 1 x 105 Yumm 1.7 tümör hücreleri ile aşı ve altı transimmünizasyon tedavileri (katı siyah çizgiler), altı kontrol tedavileri (katı gri çizgiler), PBMC Alone (kesikli hat), 8- MOPa-TEDAVI Yumm 1.7 hücreler tek başına, veya TI kullanarak 8-MOPA-tedavi MC38 tümör hücreleri (noktalı çizgiler). (C) C57BL/6 fareler için çizilmiş zaman içinde tümör hacmi 1 x 105 Yumm 1.7 tümör hücreleri ile aşı ve altı transimmünizasyon tedavileri (katı siyah çizgiler), altı kontrol tedavileri (katı gri çizgiler), altı TI tedaviler alma nerede PBMC homojen 8-MOPa hemen önce plaka geçişi, altı TI tedaviler burada PBMC eşit 8-MOPbir hemen sonra plaka geçişi, ya da altı tedaviler maruz edildi maruz kaldıktan sonra plaka geçişi sonra tı hücreleri ile karışık 1:1 8-MOPA ışınlama (noktalı çizgiler) ' e maruz kalan eşit sayıda PBMC 'dir. (A, B ve C) Tüm deneylerde "PBS kontrol" fareler deneysel hayvanlar ile aynı programda Bled, ama altı steril PBS yeniden infüzyon aldı. Veri temsili deneyler için sağlanır. Çubuklar SEM, P-değerleri her zaman noktası için Sidak 's birden fazla karşılaştırmalar testi kullanarak hesaplanan temsil eder; *, p < 0,05; * *, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001; NS = farklar önemli değil. Bu rakam11' den itibaren değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: TI odası ile TI Protokolü hızla DC olgunlaşma, benzersiz aktivasyon profili ve insan PBMC, plaka geçişi ve trombositler bağlı olarak T hücresi etkinleştirme kapasitesini teşvik eder.
Taze izole insan PBMC ("kontrol") arasında CD11c+ hücrelerde belirtilen Işaretçilerin A. FACS analizi, TI Protokolü ("tı") ile tedavi PBMC, ya da plaka geçişi atlanmışsa TI-tedavi PBMC, trombosit kullanarak tükenmiş edildi a-CD41 boncuk kiti önce plaka geçişi, ya da yukarıdakilerin her ikisi de yapılmıştır. Veriler üç kan bağış ile altı bağımsız deney özetlenmektedir. Çubuk hata çubukları SEM. P-değerleri eşleştirilmiş t-testi kullanılarak hesaplanan her karşılaştırma için temsil ederken, ortalama değerleri temsil eder; *, p < 0,05; * *, p < 0,01. Paneller11' den itibaren değiştirildi. B. trombosit içeren veya trombosit-tükenmiş TI-tedavi insan PBMC bir alakasız (sıinfekl) peptid ile bir gecede birlikte inkübe edildi, ya da baş-ve-boyun Skuam Hücre Karsinomu için uzun peptid ile ilişkili HPV E7 protein. PBMC daha sonra özellikle E7 peptid için reaktif bir insan CD8 T hücre hattı uyarmak için kullanıldı. T hücresi stimülasyon, 5 günlük kültürden sonra ıfng üretimi ile ölçülmüştür. (C) trombosit içeren veya trombosit-tükenmiş TI-tedavi insan PBMC 8-MOP A-tedavi baş-ve boyun skuayöz Hücre Karsinomu Hücre hattı SCC61 ilebirgecede birlikte inkübe edildi, ya ifade (SCC61 HPV E6/7) ya da ifade DEĞIL (SCC61 hiçbir HPV ) antijenik HPV E6 ve E7 proteinleri19. PBMC daha sonra özellikle E7 peptid için reaktif bir insan CD8 T hücre hattı uyarmak için kullanıldı. T hücresi stimülasyon, 5 günlük kültürden sonra ıfng üretimi ile ölçülmüştür. (B ve C) Veri her biri üç çoğaltır ile temsili deneyler gösterir. Çubuk hata çubukları SEM. P-değerleri Sidak 's çoklu karşılaştırmalar testi kullanılarak hesaplanan her karşılaştırma için temsil ederken, ortalama değerleri temsil eder; , p < 0,001; , p < 0,0001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Işaretleyici | Parametre | Işlenme -miş | TI protokollü ECP plakası | TI protokolü ile TI plakası | p-değer ECP vs TI |
| HLA-DR | Δ MFı | 100,1 ± 42,4 | 439,8 ± 152,5 | 417,7 ± 152,2 | Ns |
| CD80 | Δ | 3,9 ± 1,1 | 22,3 ± 7,2 | 24,5 ± 7,2 | Ns |
| CD83 | Δ MFı | 0,3 ± 0,2 | 53,3 ± 9,7 | 51,4 ± 17,4 | Ns |
| CD86 | Δ MFı | 10,8 ± 1,7 | 103,9 ± 23,4 | 87,1 ± 17,6 | Ns |
| PLAUR | Δ MFı | 54,5 ± 12 | 721,4 ± 183,6 | 528,7 ± 135,5 | Ns |
| ICAM1 | Δ MFı | 12,2 ± 1,6 | 179,6 ± 28,5 | 192,5 ± 25,4 | Ns |
| ITGB5 | Δ MFı | 53,6 ± 25,7 | 97,1 ± 31,6 | 103,8 ± 32,8 | Ns |
| CCL2 (MCP-1) | Δ | 0,6 ± 0,5 | 70,1 ± 6,7 | 55,2 ± 8,9 | Ns |
| CXCL5 | Δ | 0,7 ± 0,4 | 39,1 ± 7,2 | 41,5 ± 4,7 | Ns |
| CXCL16 | Δ | 0,3 ± 0,2 | 28,0 ± 8,8 | 35,3 ± 11,7 | Ns |
| CD105 (endoglin) | Δ MFı | 3,6 ± 0,3 | 124,3 ± 25,4 | 141,8 ± 33,2 | Ns |
| CD112 (nectin 2) | Δ MFı | 10,9 ± 1,8 | 47,3 ± 5,2 | 50,9 ± 9,2 | Ns |
| CD120a (TNFR-1) | Δ MFı | 10,1 ± 2,6 | 2,2 ± 1,4 | 1,8 ± 1,1 | Ns |
| CD137L (4-1BBL) | Δ MFı | 2,9 ± 1,5 | 1,0 ± 0,4 | 1,2 ± 0,6 | Ns |
Tablo 1: TI odası ile TI protokol hızla klinik ECP odası Ile TI protokolü tarafından Indüklenen DC olgunlaşma eşdeğer indükler. Yeni izole PBMC ("tedavi edilmemiş") arasında canlı insan CD11c + hücrelerinde karşılık gelen IgG denetimlerinden belirtilen işaretçilerin değişiklerinin FACS analizi, TI protokolünden sonra klinik ECP plakasını geçen PBMC ("tı protokolü ile ECP plakası") ve bir gecede kuluçka, veya TI protokolü ile tedavi PBMC analiz ("protokol ile TI plaka") ve gece kuluçka aşağıdaki analiz. Tüm hücre popülasyonunun değiştirildiği HLA-DR gibi işaretçiler için, veriler ortalama floresan yoğunlukta (MFı) değişiklik olarak ifade edilir. Yalnızca bir alt kümesinin işaretçinin CCL2 gibi ifade ettiği işaretler için, canlı CD11c + PBMC 'nin yüzde işaretleyici pozitif hücrelerinde fark yerine temsil edilir. Veriler üç kan bağış ile altı bağımsız deney özetlenmektedir. Her İşaretleyiciye ait veriler, ortalama (SEM) yaş ± standart hatası olarak ifade edilir. P-eşleştirilmiş t testi kullanılarak hesaplanan her karşılaştırma için değerler; NS = farklar önemli değil. Tablo11' den değiştirildi.
Video 1: TI plaka içinde trombosit ve immün hücre etkileşimlerini canlı hücre görüntüleme.
PBMC, yukarıdaki protokol bölümünde açıklandığı gibi hazırlanmış ve Bölüm 4 ' te açıklandığı gibi transimmünizasyon plakasına maruz kaldığında, 4.2.3 adımda statik inkübasyon süresi 1 saat ile 30 dakikaya düşürüldü. TI protokolü sırasında, standart bir mikroskop kaydırağına eşit boyutta olan TI plakası, bir floresan görüntüleme sisteminin slayt tutma aşamasına takılır ve içindeki hücreler 40X büyütmede ve 37 °C ' de plaka dolgusu sırasında görüntülenmiş (4.2.2 ), plaka inkübasyon (4.2.3) ve plaka akışı (4.3.5) aşamaları. Sürekli görüntüler elde edildi ve "otomatik tarama rutin" yazılımı kullanılarak üretilen filmler. Videonun altındaki başlıklar, hücrelerin çekilen protokolün aşamasını gösterir. Videoda oklar ve çevrelerde, ilişkili başlıklar ile, hücre ve ilgi alanları işaret. 10 μM ölçek çubuğu, video boyunca sağ alt köşedeki mevcut. Bu videoyu görüntülemek Için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)
Discussion
İlk kez yukarıda açıklanan minyatür cihaz ve protokol, fare deneysel sistemlerde ECP mekanizmaları ve küçük insan kanı örneklerinde verimli laboratuar araştırması için izin verir. Bu büyük bir avans; Örneğin, bize ilk kez bir fare modelinde katı tümörlere karşı transimmünizasyon etkinliğini göstermek için izin 11, insan Onkoloji benzer bir uygulama gelecekteki olasılığını açarak.
Transimmünizasyon cihazı ve yöntemi burada açıklanan gelişmeden önce, tam olarak ECP tüm yönlerini araştırmak imkansızdı. Fare modellerinde ise 8-MOPa Aspect terapi bir petri çanak hücreleri tedavi ederek biraz çoğaltılabilir12,20, hiçbir kapasite yöntemi plaka geçiş, hangi gösterilmiştir entegre edildi ECP 'nin fizyolojik DC aktivasyonu14için kritik öneme sahip dinamik trombosit etkileşimleri sağlar. İnsan çalışmalarında, alternatif olarak, akış bileşeni tam olarak mevcut, ancak 8-MOPA, veya onları korumak için belirli hücresel bileşenleri seçici olarak açığa yeteneği,21,22eksik oldu. Bu ECP mekanizması tam anlayış ve bağışıklık veya tolerans için optimizasyon engelledi. Buna ek olarak, klinik ECP aparatı ile çalışmak için gerekli kan miktarı büyük, bilimsel soruşturma engellemektir. İlk kez burada açıklanan minyatür ECP cihaz ve protokol verimli, tam esnek ve ayarlanabilir laboratuvar ECP modelleme için izin verir. Ayrıca, TI plaka mikroskobik tarafından plaka içinde hücre etkileşimlerini gerçek zamanlı görselleştirme ve izlenmesi için izin verir.
Protokolün hem in vivo hem de ex vivo sistemlerini kullanarak başarısı için, tedavi edilen PBMC 'nin fonksiyonel DCs 'de aktive edilebilir monosit içermesi önemlidir. Bu aktivasyon devam etmek için, aynı zamanda PBMC kesir sağlıklı, activatable trombosit bir fizyolojik sayı içerir ve TI plaka geçiş protokolü yakından takip edilmesini sağlamak için gereklidir. Yeni etkinleştirilen DCs 'i belirli bir reaktivite yönünde yönlendirmek için antijen ile birlikte sağlanmalıdır. Biz anti-kanser bağışıklık için antijen teslim en verimli yöntem bir gecede Co-inkübasyon yeni aktif DCs ile antijen içeren 8-MOPA-maruz tümör hücreleri olduğunu bulduk. Bu tümör antijenleri önceden bilgi gerektirmeden bir immünojenik anti-kanser tepkisi oluşturmak mümkün olmanın ek avantajı vardır, DCS onları seçmek için izin vererek. Ancak, antijen bilindiği durumlarda, Co-inkübasyon antijenler olarak ücretsiz peptidler kullanırken ex vivo sistemlerde bazı başarı vardı. İmmünojenik uygulamalar için, DCS kendilerini 8-MOPA Exposure korunmalıdır. Son olarak, in vivo deneylerde, anti-tümör bağışıklık yeteneğine sahip bir hayvan modeli ile çalışmak önemlidir. Transimmünizasyon aktif, antijen özgü DCs oluşturarak çalışır, hangi doğuştan ve adaptif immün tepkiler başlatmak için vücutta çalışır. Tedavi edilen fare içinde NK, CD4 veya CD8 T hücrelerinin eksikliği etkinliği veya yetersizliği protokolün etkinliğini etkileyecek5,11.
Burada açıklanan protokol, bir fare katı syngeneic tümör modeli için optimize edilmiş bir kanıtı-of-prensip biridir, yine de birçok fırsat ortaya çıkarır. Onkoloji içinde ECP mekanizmaları sadece sadece elucidated ediliyor ve daha fazla anlayış için hala çok yer var. Daha geniş ölçüde, fizyolojik olarak aktif fare ve insan DCs oluşturmak ve seçici antijen özgü bağışıklık doğru yönlendirmek için yeteneği kanser ötesinde birçok potansiyel uygulamalar vardır. Aynı şeyi yapmak için yeteneği, ama bunun yerine antijen özgü tolerans doğru DCs doğrudan, ECP kendini tolerans etkinliği tarafından önerilen, aynı zamanda geniş kapsamlı tıbbi etkileri vardır. Bu yöntemle, fizyoloji DC terapilerine ilgi duyan herkes için araçları sunmayı ve verimli bir araştırma Caddesi açmasını umuyoruz.
Disclosures
Yale Üniversitesi, bir Yale başlangıç şirketi olan Transimmün AG lisansı olan Prof. Richard Edelson 'ın dendritik hücre araştırmasına ait patentlere sahiptir. Richard Edelson ve Michael Girardi Transimmün AG bilimsel danışmanlardır, Olga Sobolev ise Transimmün AG çalışanı. Transimmün AG herhangi bir mevcut ticari ürünler yok, ancak bu makalede kullanılan Transimmün plakaları üreten bir işbirlikçi olarak. Bu üç yazarın potansiyel olarak gelecekte bu keşifler ticarileştirilmesi yararlanabilir mümkündür.
Acknowledgments
Bu çalışma NıH-DCI Spore Grant 1 P50 CA121974 (R. Edelson, M. Girardi) tarafından desteklenmektedir; NIH Kanser Merkezi Destek Grant 3 P30 CA16359-28S1 (R. Edelson, M. Girardi); Howard Hughes Medical Institute eğitim bursu (A. Vassall); ve NY kardiyak Vakfı (R. Edelson, A. Ventura, A. Vassall, H. Ezaldein). Kısmi destek R01 CA196660-01 tarafından M. Bosenberg için sağlandı.
Yazarlar Dr Robert Tigelaar için onun mentorluk, rehberlik ve deneysel anlayış için minnettar. Biz Fraunhofer ıBMT, özellikle Dr Thorsten Knoll, geliştirmek ve ECP eşdeğer TI odası sağlamak için meslektaşlarımıza teşekkür ederiz. Nicholas Theodosakis, YUMM deneylerinin ilk aşamalarına nazik bir şekilde yardımcı oldu. Gönüllülük kan tedariği konusunda yardım için Yale ECP tedavi merkezi 'nde gönüllü kan bağışçılarımıza, Inger Christensen 'e ve profesyonel personeline teşekkür ediyoruz. Dr. Wendell Yarbrough ve Dr Natalia ıssaeva nazik bizimle SCC61 ve SCC61-E6/7 hücre hatları paylaştı. Projede teknik yardım için Dr. Julia Lewis 'e FACS protokol tavsiyesi için ve Yale FACS Core 'da E. Menet, G. Tokmoulina, C. Cote 'a teşekkür ederiz. TI plaka içindeki hücrelerin film görüntüleri Felix Rivera-Molina, doktora, hücre Biyoloji bölümü ve Yale sınema görüntüleme Merkezi, Yale Tıp Fakültesi yardımıyla satın alınmıştır. Film prodüksiyonu Andrew Osborne, kıdemli video yapımcısı, Iletişim ofisi, Yale Tıp Fakültesi tarafından denetlenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL) | Therakos, Inc | Rx only, NDC No. 64067-0216-01 | Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells |
| AB serum | Lonza BioWhittaker | 14-498E | Protocol step 8.5 - overnight culture of human PBMC |
| ACK red cell lysis buffer | Lonza BioWhittaker | 10-548E | Protocol step 2 - mouse PBMC preparation |
| Anesthesia Tabletop V1 system with active scavenging | VetEquip | 901820 | Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration |
| Autologous mouse plasma | prepare in lab | n/a | Prepare per protocol step 2.4, use in 7.1 - mouse TI treatment administration |
| Autologous mouse serum | prepare in lab | n/a | Prepare per protocol step 5, use in step 6.1 - overnight culture of mouse PBMC |
| C57Bl/6J mice | Jackson labs | 0000664 | Protocol steps 1, 2, 5 and 7 - mouse tumor injection, blood/serum collection, and therapy return |
| Cheek bleed GoldenRod lancet, 5 um | Medipoint | 9891620 | Protocol step 2 - mouse PBMC preparation |
| Clear RPMI | Gibco by LifeTech | 11835-030 | Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC |
| DMEM/F12 | Gibco by LifeTech | 11330-032 | Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture |
| EasyGrip Petri Dishes, 35mm | Falcon | 351008 | Protocol steps 5 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC |
| Eppendorf 1.5mL conical tubes | DOT scientific | 1700-GMT | Protocol steps 1-8 |
| FBS (fetal bovine serum, heat-inactivated) | SAFC Biosciences | 12306C-500mL | Protocol steps 1-4 - YUMM1.7 cell culture, 8-MOP/UVA treatment of cells, TI plate |
| Hemavet 950FS hematology counter | Drew Scientific | HV950FS | Protocol step 8.2 - monitoring human platelet numbers |
| Heparin 5,000U/mL | McKesson Packaging services | 949512 | Protocol steps 2 and 8 - mouse and human PBMC preparation |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 5260-04-05 | Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration |
| Lympholyte M lymphocyte isolation medium | Cedarlane Labs | CL5035 | Protocol step 2 - mouse PBMC preparation |
| Non-essential amino acids | Gibco by LifeTech | 11140-050 | Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture |
| PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2) | Gibco by LifeTech | 14190-144 | Protocol steps 1-7 |
| Pen/strep | Gibco by LifeTech | 15140-122 | Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture |
| Polypropylene 15mL conical tubes | Falcon | 352097 | Protocol steps 1-8 |
| Programmable 2-channel syringe pump | New Era Pump Systems Inc | model NE-4000 | Protocol steps 4 and 8 - running the TI plate |
| Retro-orbital injection needles, 27G x 1/2 | BD Biosciences | 305109 | Protocol step 7 - mouse TI treatment administration |
| Syringes, 10mL (LUER-LokTip) | BD Biosciences | 309604 | Protocol steps 4, 8 - running the TI plate |
| Syringes, 1mL (Slip tip) | BD Biosciences | 309659 | Protocol steps 1, 4, 7, 8 |
| TI plate and tubing set | Transimmune AG | not commercially available | Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis. |
| TI plate running platform | Transimmune AG | not commercially available | Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis. |
| Tissue culture flasks, T75 (75 cm2) | Falcon | 353136 | Protocol steps 1, 2, 6 and 8 - mouse and human cell culture |
| Tissue culture plates, 12-well | Falcon | 353043 | Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells |
| Tissue culture scrapers | Falcon | 353085 | Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC |
| Trypsin-EDTA 0.25% (1x) | Gibco by LifeTech | 25200-056 | Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture |
| Tumor injection needles, 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Protocol step 1 - mouse subcutaneous tumor introduction |
| UVA irradiator | Johnson and Johnson | not commercially available | The apparatus was specifically developed by J&J for Prof. R. Edelson's laboratory. Several machines are available in the laboratory on a collaborative basis; please contact Prof. R. Edelson for use of one. Alternative UVA irradiators are commercially available but have not been tested by us. |
| Invitrogen EVOS FL Auto 2 Imaging System | Invitrogen | fluorescence imaging instrument |
References
- Edelson, R., et al. Treatment of cutaneous T-cell lymphoma by extracorporeal photochemotherapy. Preliminary results. The New England Journal of Medicine. 316 (6), 297-303 (1987).
- Berger, C. L., Wang, N., Christensen, I., Longley, J., Heald, P., Edelson, R. L. The immune response to class I-associated tumor-specific cutaneous T-cell lymphoma antigens. The Journal of Investigative Dermatology. 107 (3), 392-397 (1996).
- Scarisbrick, J. J., et al. A multicentre UK study of GVHD following DLI: rates of GVHD are high but mortality from GVHD is infrequent. Bone Marrow Transplantation. 50 (1), 62-67 (2015).
- Barten, M. J., Dieterlen, M. -T. Extracorporeal photopheresis after heart transplantation. Immunotherapy. 6 (8), 927-944 (2014).
- Heald, P., et al. Treatment of erythrodermic cutaneous T-cell lymphoma with extracorporeal photochemotherapy. Journal of the American Academy of Dermatology. 27 (3), 427-433 (1992).
- Ratcliffe, N., et al. National Institutes of Health State of the Science Symposium in Therapeutic Apheresis: Scientific Opportunities in Extracorporeal Photopheresis. Transfusion Medicine Reviews. 29 (1), 62-70 (2015).
- Edelson, R., Wu, Y., Schneiderman, J. American council on ECP (ACE): Why now? Journal of Clinical Apheresis. , (2018).
- Edelson, R. L. Mechanistic insights into extracorporeal photochemotherapy: Efficient induction of monocyte-to-dendritic cell maturation. Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 322-329 (2014).
- Gasparro, F. P., Dall’Amico, R., Goldminz, D., Simmons, E., Weingold, D.
- Bevilacqua, P. M., Edelson, R. L., Gasparro, F. P. High-performance liquid chromotography analysis of 8-methoxypsoralen monoadducts and crosslinks in lymphocytes and keratinocytes. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (1), 151-155 (1991).
- Ventura, A., et al. Extracorporeal Photochemotherapy Drives Monocyte-to-Dendritic Cell Maturation to Induce Anticancer Immunity. Cancer Research. 78 (14), 4045-4058 (2018).
- Perez, M., Lobo, F. M., Yamane, Y., John, L., Berger, C. L., Edelson, R. L. Inhibition of antiskin allograft immunity induced by infusions with photoinactivated effector T lymphocytes (PET cells). Is in vivo cell transferrable? Annals of the New York Academy of Sciences. 636 (1), 95-112 (1991).
- Girardi, M., et al. Transimmunization for cutaneous T cell lymphoma: A phase I study. Leukemia & Lymphoma. 47 (8), 1495-1503 (2006).
- Durazzo, T. S., Tigelaar, R. E., Filler, R., Hayday, A., Girardi, M., Edelson, R. L. Induction of monocyte-to-dendritic cell maturation by extracorporeal photochemotherapy: Initiation via direct platelet signaling. Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 370-378 (2014).
- Gonzalez, A. L., Berger, C. L., Remington, J., Girardi, M., Tigelaar, R. E., Edelson, R. L. Integrin-driven monocyte to dendritic cell conversion in modified extracorporeal photochemotherapy: ECP activation of monocytes by fibronectin. Clinical & Experimental Immunology. 175 (3), 449-457 (2014).
- Kibbi, N., Sobolev, O., Girardi, M., Edelson, R. L. Induction of anti-tumor CD8 T cell responses by experimental ECP-induced human dendritic antigen presenting cells. Transfusion and Apheresis Science. 55 (1), 146-152 (2016).
- Maeda, A., Schwarz, A., Bullinger, A., Morita, A., Peritt, D., Schwarz, T. Experimental Extracorporeal Photopheresis Inhibits the Sensitization and Effector Phases of Contact Hypersensitivity via Two Mechanisms. Generation of IL-10 and Induction of Regulatory T Cells. The Journal of Immunology. 181 (9), 5956-5962 (2008).
- Meeth, K., Wang, J., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell & Melanoma Research. , (2016).
- Gubanova, E., et al. Downregulation of SMG-1 in HPV-Positive Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Due to Promoter Hypermethylation Correlates with Improved Survival. Clinical Cancer Research. 18 (5), 1257-1267 (2012).
- Berger, C. L., Perez, M., Laroche, L., Edelson, R. Inhibition of Autoimmune Disease in a Murine Model of Systemic Lupus Erythematosus Induced by Exposure to Syngeneic Photoinactivated Lymphocytes. Journal of Investigative Dermatology. 94 (1), 52-57 (1990).
- Spisek, R., Gasova, Z., Bartunkova, J. Maturation state of dendritic cells during the extracorporeal photopheresis and its relevance for the treatment of chronic graft-versus-host disease. Transfusion. 46 (1), 55-65 (2006).
- Berger, C., et al. Rapid generation of maturationally synchronized human dendritic cells: contribution to the clinical efficacy of extracorporeal photochemotherapy. Blood. 116 (23), 4838-4847 (2010).
