Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

מבנים ברמת הפנים המולקולריים של פולימרים וBiomacromolecules מתגלים דרך תדר סיכום הדור ספקטרוסקופיה ויברtional

Published: August 13, 2019 doi: 10.3791/59380
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Bioelectronics, School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University

Summary

להיות מנוצל באופן מקיף, הדור תדר הסיכום (SFG) ספקטרוסקופיית התנודה יכול לעזור לחשוף את הסדר שרשרת ההזמנה ושינוי מבניים משני קורה בממשקים פולימרים וביוקלאכליים.

Abstract

בתור ספקטרוסקופיית אופטי לא לינארית, הפקת תדר הסיכום (SFG) התנודה בספקטרוסקופיה היתה בשימוש נרחב בחקירת משטחים וממשקים שונים. טכניקה אופטית לא פולשנית זו יכולה לספק את המידע המקומי ברמה מולקולרית עם רגישות מונאולייר או מונמונאולייר. אנחנו כאן מספקים מתודולוגיה ניסיונית על איך באופן סלקטיבי לזהות את הממשק הקבור הן קרו ו biomacromolecules. עם זאת בראש, מבנים משניים משני הפנים של המשי ומבני המים ברחבי מודל שרשרת קצר הדו הדו הדו הם דנו. הראשון מראה חפיפה שרשרת שרשרת או השפעה הכליאה המרחבית והשני מראה פונקציה הגנה נגד Ca2 + יונים הנובע מבנה השדרה של שדרת השיקל של מים.

Introduction

התפתחות של הדור תדר sum (sfg) ספקטרוסקופית ספקטרוסקופיה ניתן לחזור לעבודה שנעשתה על ידי שן ואח '. לפני שלושים שנה1,2 ייחודו של הסלקטיביות הבין-לפנים והרגישות התת-מונאולייר הופכת את הספקטרוסקופיית התנודה הגדולה ביותר של חוקרים בתחומי הפיסיקה, הכימיה, הביולוגיה והחומרים המדעיים, וכו '3,4 ,5. כיום, מגוון רחב של סוגיות מדעיות הקשורות למשטחים ולממשקים נחקרים באמצעות sfg, במיוחד עבור ממשקים מורכבים ביחס לפולימרים ולbiomacromolecules, כגון מבני שרשרת והרפיה מבנית ב ממשקי פולימר קבורים, המבנים המשניים של החלבון, ומבני המים הבינפנים9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25,26.

עבור משטחים פולימריים וממשקים, דגימות סרט דק מוכנות בדרך כלל על ידי ציפוי ספין כדי להשיג את המשטחים או הממשקים הרצויים. הבעיה מתעוררת בשל הפרעה האות משני הממשקים של הסרטים כפי שהוכנו, אשר מוביל אי נוחות לניתוח sfg ספקטרום שנאסף27,28,29. ברוב המקרים, האות הרטט רק מממשק יחיד אחד, או סרט/מצע או סרט/המדיום השני, הוא רצוי. למעשה, הפתרון לבעיה זו הוא די קל, כלומר, כדי ניסויים למקסם את שדות האור בממשק הרצוי ולמזער את שדות האור בממשק השני. מכאן, מקדמי פרנל או מקדמי השדה המקומי צריך להיות מחושב באמצעות מודל הסרט דק ולהיות מאומת ביחס התוצאות הנסיוניות3,9,10,11, . 12,13,14,15,30

עם הרקע המוצג לעיל, ניתן לחקור כמה ממשקים פולימריים וביולוגיים כדי להבין את המדע הבסיסי מהרמה המולקולרית. בעקבות זאת, לקיחת שלושה בעיות הפנים כדוגמאות: בודק פולי (2-הידרוקסיל מתיונין) (פמה) משטח וממשק קבור עם סובסטרט9, היווצרות של מבנה המשי (SF) מבנים משניים על הפוליסטירן (PS) משטח ו מבני המים המקיפים את המודל שרשרת קצר מודל דופלקס16,21, אנו מראים כיצד הספקטרוסקופיית התנודה של sfg מסייע לחשוף את המבנים המולקולריים ברמה המולקולרית הקשורים למדע הבסיסי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הניסוי של SFG

  1. השתמש במערכת SFG המסחרית השנייה (טבלת חומרים), אשר מספקת קרן בסיסית 1064 ננומטר עם רוחב הדופק של ~ 20 ps ותדר של 50 Hz, מבוסס על ND: YAG לייזר.
  2. המר את קרן היסוד 1064 ננומטר לתוך קרן מ532 בעלת קרן כנגד ובין 355 מודולים הרמוניים שנייה ושלישית. ישירות להנחות את הקרן 532 ננומטר כמו קרן אור קלט וליצור קלט אחר באמצע אינפרא אדום (IR) קרן המכסה את טווח התדר מ 1000 אל 4000 ס מ-1 דרך הדור פרמטרית אופטי (opg)/אופטי הגברה (OPA)/ תהליך של יצירת תדר שונה (DFG).
  3. הגדר את זוויות האירוע של שתי קורות קלט להיות 53 ° (IR) ו 64 ° (גלוי), בהתאמה, לעומת פני השטח נורמלי.
  4. כדי לזהות את המבנים הבינפנים פולימרים (ממשק הסרט/המצע או הסרט/ממשק בינוני אחר), השתמש ב-ssp (קרן מקוטב סכום תדר, קרן מקוטב לעין מקוטלת וקרן האינפרא אדום מקוטב) ושילובים הקיטוב ppp.
  5. כדי לזהות את המבנים הבינפנים חלבון משני ומבני מים סביב ה-DNA, מלבד ssp ו-ppp, השתמש שילובים spp ו psp קיטוב שימשו.
  6. כדי להבטיח את הדגימות לא ניזוקו, לשלוט על האנרגיה אינפרא אדום ונראה לעין להיות ~ 70 ו ~ 30 mJ, בהתאמה. תרשים של תהליך ה-SFG עם הדיאגרמה ברמת האנרגיה הוצג באיור 1. איור 2 מציג את מערכת sfg בחדר הנקי שלנו.

2. מקדמי פרנל

  1. השתמש בפריזמות מימין כמו מצעים עבור כל הניסויים שנדונו כאן. קיימים שני ממשקים עבור סרט פולימרי על מצע מוצק, כלומר, משטח פולימרי באוויר, פולימר/מצע ממשק. שניהם יכולים ליצור אותות SFG מאז סימטריה היפוך הוא שבור בשני הממשקים. לכן, ספקטרום SFG שנאסף הוא אחד התערב. עם זאת, מקדמי השדה המקומי או מקדמי פרנל בשני הממשקים יכולים להיות מתכווננים על ידי שינוי זוויות האירוע או עובי הסרט אחד בכל פעם או בו31,32. זה מספק לנו את ההזדמנות כדי לחקור את האות SFG ויברtional מממשק אחד בלבד. כאן, הסרט "פמה" בפריזמה הקפה2 נלקח כדוגמה9.
  2. כפי שמוצג באיור 3, מעסיקים את הגיאומטריה הימנית של מנסרה כדי לזהות את אותות sfg שנוצרו מהסרט התחתון של ה-פמה ma. עוצמת הפלט sfg במצב משתקף מבוטאת כ
    Equation 11
    בו Equation 2 מציין את הסדר השני האפקטיבית הרגישות לינארית הטנסור.
    Equation 2מורכב משלושה חלקים, כלומר, ממשק מנסרה/פולימר, הממשק הבינוני פולימר/תחתון (המדיום התחתון כולל גז, נוזל או מוצק.) ואת הרקע הלא מהדהד, כפי שמוצג במשוואה הבאה.
    Equation 32
    כאן המדיום התחתון יכול להיות אוויר, מים או משהו אחר. F מייצג את מקדם פרנל המתאים האחראי לתיקון השדה המקומי.
  3. החל מודל סרט דק לחישוב מקדמי פרנל במקרה זה. להלן מוצגים רק הליכי חישוב קצרים.
    1. לממשק מנסרה/פולימר, השתמש ב
      Equation 43
      Equation 54
      Equation 6(5)
      המשמעות של כל פרמטר המוצג מוצגת להלן.
      1. ωאני מציין את תדר הקרן.
      2. tp ו - t מציינות את מקדמי השידור הכולל וניתן להתבטא כ
        Equation 76
        Equation 87
      3. tp12 ו- ts12 לציין את מקדמי השידור הליניארי של קרן האור בממשק מנסרה/פולימר.
      4. rp23 ו- rs23 מציינות את מקדמי ההשתקפות הליניארית של קרן האור בממשק הפולימר/בינוני.
      5. α מייצגת את ההבדל הפאזה בין קרן רפלקטיבית לבין קרן הרפלקטיבית המשנית שלה לאחר שהיא מפיצה על פני הסרט הפולימר דק ולאחר מכן משקפת לאחור, אשר ניתן להתבטא כ
        Equation 98
      6. λ מייצג את אורך הגל של קרן אור d הוא עובי הסרט פולימר.
      7. Φ1 ו- Φ2 מייצגים את זוויות האירוע בממשק מנסרה/פולימר ואת ממשק פולימר/בינוני בהתאמה.
      8. n1 ו- n2 מייצגים את מדדי השבירה של הסרט פריזמה ופולימר בהתאמה.
      9. בן 12 מייצגת את מדדי השבירה של הרבדים הבינפנים של הפולימר לפריזמה/פולימר.
    2. עבור ממשק פולימרי/בינוני, השתמש ב
      Equation 109
      Equation 1110
      Equation 1211
      1. Δ מייצג את הבדלי הפאזה של שדות החשמל הקלים בשני ממשקים.
      2. מכיוון שרוחב הפולס עבור קורות הקלט שלנו הוא ~ 20 ps, השגיאה מעיכוב הזמן המשויך לאפקט הפיזור יכולה להיות מוזנחת.
      3. הביטוי של הפרש שלב כזה עבור הפלט sfg, הקלט גלוי ואת קורות הקלט אינפרא אדום ניתן לכתוב בנפרד כ
        Equation 1312
        Equation 1413
        Equation 1514
         
  4. מתוך הדיון לעיל, עבור הסרט פריזמה-פולימר-בינוני (1-2-3) מערכת, לבטא את מקדמי פרנל הכולל עבור ממשקים מנסרה/פולימר/בינוני כמשוואות הבאות, עבור ssp ו- ppp שילובים הקיטוב . כמובן, שני הממשקים נחשבים לאזימוט איזוטרופי.
    1. עבור ממשק מנסרה/פולימר, הביטויים של המקדמים הכולל של מקדמי פרנל הן של ssp והן של שילובים של ppp מוצגים כדלקמן.
      1. עבור ssp, המשוואה מ
        Equation 1615
      2. ועבור ppp, המשוואה היא
        Equation 516
        Equation 517
        Equation 518
        Equation 519
         
      3. t10 ו- t01 לציין את מקדמי השידור ליניארי באוויר/מנסרה, ממשקים מנסרה/אוויר בהתאמה.
    2. עבור ממשק הפולימר/בינוני, הביטויים של מקדמי פרנל הכולל הן של ssp והן של שילובי הקיטוב של ppp מתוארים כדלקמן.
      1. עבור ssp, המשוואה מ
        Equation 2120
      2. עבור ppp, המשוואות הן
        Equation 521
        Equation 522
        Equation 523
        Equation 524
           
         
  5. לאחר חישוב מקדמי פרנל באמצעות מודל דחוקה, להתוות אותם כפונקציה של עובי הסרט, כפי שמוצג באיור 4.
    הערה: במקרה זה, קיים טווח עובי לאיסוף האות SFG מממשק קפה2 פריזמה/פמה עם תרומה neglectable מהממשק השני, שהוא סביב 150 nm. באופן דומה, עובי מתאים ניתן לבחור לזיהוי של ממשק המדיום הפאמי/התחתון עם תרומה neglectable של בית קפה2 מנסרה/ממשק פמה.

3. ג.היראל sfg שילוב פולריזציה

  1. עבור ממשק achiral רגיל, בדרך כלל, להשתמש ב-C∞ v סימטריה במונחים של אנסמבל ממוצע33,34. עם הפעולה של היפוך סימטריה, הסדר השני לא לינארית הרגישות לקוי רכיבי טנסור ניתן להסיק, שהם cxxz, cxzx, czxx, cyyz, cyzy, czyy ו-czzz (ה תנאים קיימים ניתן לצמצם עוד יותר אם ממשק isotropic הוא הניח, כלומר x ו-y זהים). עם זאת, עבור ממשק שיראאל, המצב יהיה שונה. ממשק כיראאל יש את ה-∞ סימטריה, רק הפעולה הסימטריה הסיבוב מותרת. במקרה זה, מלבד מונחים achiral נורמלי, הסדר השני לינארית susceptibilities יהיה אפס, אשר ניתן לכנות כמו מונחים כיראליות, כלומר, czyx, czxy ו cyzx תחת התחשבות של לא אלקטרוני תהודה. לכן, באמצעות psp, pps ו spp שילובים הקיטוב, שיראאל sfg ספקטרום ניתן לאסוף33,34.

4. הכנה לדוגמא

  1. הכנת סרט פמה
    1. התמוססות אבקה של פמה (ראו טבלת חומרים) באתנול אנמים כדי להכין את הפתרון עם 2 wt% ו-4 wt% בהתאמה.
    2. לפני התצהיר של הסרטים של פמה, להשרות את הפריזמות ימין-זווית של קפה2 ב טולואן הממס הקודם ולאחר מכן לשטוף אותם עם אתנול ומים אולטרה טהור (18.2 MΩ · ס מ).
    3. לאחר מכן, לחשוף את מצעים (הפריכיות הימנית של קפה2 ) כדי פלזמה חמצן כדי להסיר מזהמים אורגניים אפשרי על ידי מנקה פלזמה (ראה לוח חומרים).
      1. ראשית, הפעל את מנקה הפלזמה. ושנה את הסובשים בתוכו
      2. לאחר מכן הפעל את משאבת ואקום כדי לכבות את המנקה. . הקלט את החמצן בתוכו
      3. לבסוף נקבע 4 דקות לניקוי. לאחר מכן, לשמור על מצעים נקיים עבור ההכנה הרציפה של הסרט פמה.
      4. לאחר מכן הכינו את סרטי ה-"פמה" עלהפריזבית הקפה-מסתובב (ראו לוח חומרים). כוונן את עוביים הסרט על-ידי ריכוז הפתרון ומהירות הסחרור.
        1. לשתק את הפריזמה הקפה2 על דיסק יניקה של ספין-מאטר.
        2. טיפה אחת טיפה של הפתרון פמה MA מוכן לפני על מצעים נקיים ב 1,500 rpm עבור 1 דקות (הסרט עובי 2 wt% עבור 100 nm ו 4 wt% עבור 200 nm).
      5. אל כל סרטי ה-פמה המוכנים בתנור ואקום ב-80 ° c בלילה.
  2. הכנת פיברומין (SF)
    הערה: הפרוטוקול שהוצע על ידי קפלן ואח '35 אומץ.
    1. מקום 7.5 g של הקוקונים משי של B. מורי בבית הנתרן קרבונט הרותח (Na2CO3, 0.02 M) פתרון מימית (3 L) עבור 30 דקות. הסר את SF הסיבי למיכל נקי.
    2. לשטוף את SF השיגה מושגת עם מים מוכי שלוש פעמים תחת ערבוב על מנת להסיר את מולקולות sericin ולהשאיר רק את מולקולות SF במדגם הסיבי.
    3. יבש את המדגם SF הסיבי בתנור ואקום ב 60 ° c בלילה.
    4. לאחר מכן, לפזר את המדגם SF שוליים סיבי ב ליתיום ברומיד (LiBr, 9.3 M) פתרון מימית (1 גרם של SF נפתרה ~ 4 מ ל של פתרון LiBr.) ו-דגירה אותו ב 60 ° צ' עבור 2 h תחת ערבוב.
    5. Dialyze הפתרון SF נגד מים מוהים (3,500 Da שקיות דיאליזה) במשך 3 ימים כדי להסיר LiBr מומס. מחליפים מים חדשים. שלוש פעמים בכל יום לבסוף לאחסן את הפתרון SF מעובד ב 4 ° צ' לניסויים SFG מאוחר יותר.
  3. הכנת מחלת שרשרת קצרה דופלקס
    1. להורות על המדגם החד והנטוש עם 3 '-end שונה על ידי כולסטרול-triethylene גליקול (חול-TEG) (5 '-GCTTCCGACGA-3 ') מתאגיד מסחרי (ראה טבלת חומרים), כמו גם את המשלים. עבור כל סטרנד בודד, לפזר 10 nmol של אבקת לדוגמה ב 0.5 ml באולטרטהור מים. לאחר מכן ערבבו אותם יחד כדי ליצור את הפתרון של הדופלקס הדו (10 nmol/mL).
    2. מערבבים 2 מ ג 1, 2-Dipalmitoyl-sn-גליקו-3-פוספולינולינה (DPPC) ו 2 מ ג של DPPC (d-DPPC) ו לפזר אותם 1 מ ל של כלורופורם להכין את הפתרון לשומנים.
    3. הכנת שוקת ל-DPPC & d-ליברות על ידי לאנגיור
      1. לחבר את הזכות-זווית קפה2 פריזמה לבעל מדגם תוצרת בית עם הפנים מנסרה אחת ניצב טבל לתוך הסביבה מימית של שוקת LB.
      2. לאחר מכן, הכנס את פתרון השומנים המעורב שהוכן לפני המים עד שהלחץ על פני השטח הגיע לערך מסוים מתחת 34 mN · m-1.
      3. לאחר רמות לחץ פני השטח, השתמש בשני מחסומי טפלון כדי לדחוס את המונאולייר השומנים ביחס של 5 מ"מ/מינימום עד ללחץ פני השטח של 34 mN · m-1 הגיע.
      4. הרם את הפריזמה עם מונאולייר השומנים מתוך המים בקצב של 1 מ"מ/דקה אנכית.
    4. הכנת מונאולייר השומנים האחר
      1. כדי להקל על ההרכבה של הדו הדו הדו ומולקולות השומנים באמצעות המגע ההידרופובי (כולסטרול ושרשרת אלדילייום), מערבבים את התמיסה הדופלקס לתמיסת שומנים ביחס מולרי של 1:100 שניות ל ליפיד).
      2. העלו את התמיסה המעורבת לשומנים ולתמיסת הדופלקס בתוך משטח המים במיכל טפלון תוצרת בית עד שלחץ פני השטח של 34 mN · m-1 הגיע.
    5. לבסוף, לשים את דופלקס השומנים בחלק התחתון של הפריזמה במגע עם דופלקס ליפיד עם מוסף דופלקס מוכנס על משטח המים כדי ליצור את המדגם הסופי עבור מדידה sfg.
  4. משוואת לורנץ
    1. השתמש במשוואה לורנץ כדי להתאים את ספקטרום ה-SFG כדי לחלץ את מידע הרטט למצב תנודה מסוים.
      Equation 2625
      כאשר Equation 27 מייצגת את עוצמת התנודה המגנטית Equation 28 , מייצגת את תדירות התהודה, Equation 29 מציינת את חצי הרוחב במחצית המרבית (hwhm) ומייצגת Equation 30 את תדירות הסריקה של קרן IR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בחלק מקדם פרנל של מקטע הפרוטוקול, הראינו כי, תיאורטית, זה אפשרי לזהות באופן סלקטיבי רק ממשק אחד בודד בבת אחת. כאן, בסקר, אישרו כי מתודולוגיה זו נכונה ביסודו, כפי שמוצג באיור 5 ובאיור 6.

איור 5 מראה את מבנה הפנים הפנימי שנקבר לאחר חדירה למים עם הסרט ~ 150 ננומטר הידרוג'ל ואיור 6 מראה את מבנה פני השטח במים עם ~ 430 ננומטר הסרט הידרוג'ל nm. חלוניות A ו-B מתאימות לטווחים CH ו-CO בהתאמה עבור שתי הדמויות. בממשק הקבור, כל פסגות הרטט שנצפו הן חדות וברורות. הסיבה היא כי המצע קפה2 הוא חלק ולא ניתן לחדר על ידי מולקולות פמה, המובילה לממשק קפה מחודד2/פמה. עם זאת, על פני השטח, כי מולקולות מים יכולים לקיים אינטראקציה עם פמה ולפזר לתוך הצובר, ממשק המים של מיכל/מיים לא יהיה חד כמו הקבר הקבור. לכן, פרופילים ספקטרליות שונים נצפו עבור שני ממשקים אלה.

Figure 1
איור 1 . התצוגה הסכמטית של התהליך SFG (הפאנל השמאלי) עם דיאגרמת מעבר אנרגיה (הלוח הימני). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 . . מערכת ה-SFG במעבדה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 . סכמטית מציג את נתיב הפצת האור בפריזמה עבור ניסוי SFG. המספרים 0, 1, 2 ו-3 מייצגים את האוויר, הפריזמה, פמה והמדיום התחתון (המדיום התחתון יכול להיות אוויר, מוצק או נוזלי.), בהתאמה. הועתק מ-Li, X; לי, ב. ג'אנג, איקס; לי, ג; גואו, ז; ז'או, ד'; לו, X. קרו 2016, 49, 3116-3125 (ref 9). זכויות יוצרים 2016 האגודה האמריקנית לכימיה. איור זה שונה מ-[9]. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 . מקדמי פרנל מחושב כפונקציה של עובי הסרט עבור הגיאומטריה הפריזמה במים עבור ssp ושילובים הקיטוב ppp . חלוניות A1 ל c1 תואמות לטווח ה-CH ולחלוניות A2 ל- c2 המתאימות לטווח המשותף. הועתק מ-Li, X; לי, ב. ג'אנג, איקס; לי, ג; גואו, ז; ז'או, ד'; לו, X. קרו 2016, 49, 3116-3125 (ref 9). זכויות יוצרים 2016 האגודה האמריקנית לכימיה. איור זה שונה מ-[9].

Figure 5
איור 5 . ssp ו-ספקטרום של ppp של ממשק קפה2/פמה לאחר חשיפה למים. A: CH ו-OH טווח; ב: טווח CO. העקומות השחורות הן התוצאות המצוידות באמצעות משוואת לורנץ. הספקטרום היסט לבהירות. הועתק מ-Li, X; לי, ב. ג'אנג, איקס; לי, ג; גואו, ז; ז'או, ד'; לו, X. קרו 2016, 49, 3116-3125 (ref 9). זכויות יוצרים 2016 האגודה האמריקנית לכימיה. איור זה שונה מ-[9].

Figure 6
איור 6 . ssp ו-ספקטרום של ppp של משטח הפסמה על מנסרה2 . A: CH ו-OH טווח; ב: טווח CO. הדגימה הוצבה במגע עם מים. העקומות השחורות הן התוצאות המצוידות באמצעות משוואת לורנץ. הספקטרום היסט לבהירות. הועתק מ-Li, X; לי, ב. ג'אנג, איקס; לי, ג; גואו, ז; ז'או, ד'; לו, X. קרו 2016, 49, 3116-3125 (ref 9). זכויות יוצרים 2016 האגודה האמריקנית לכימיה. איור זה שונה מ-[9].

Figure 7
איור 7 . מנורמלת (psp) sfg ספקטרום ב-amide I (פאנל A) ו-N-H (פאנל B) טווחים עבור פתרון PS/SF (90 Mg/mL) ממשק לפני ואחרי הוספת מתנול. הנקודות הן נתונים ניסיוניים הקווים מוצק הם עקומות מצויד. ספקטרה היסט לבהירות. הועתק מ-Li, X; דנג, ג; אמא, ל'; לו, X; לאנגיור 2018, 34, 9453-9459 (ref 16). זכויות יוצרים 2018 האגודה האמריקנית לכימיה. איור זה שונה מ-[16].

Figure 8
איור 8 . מנורמלת (psp) sfg ספקטרום ב-(פאנל A) ו-N-H (פאנל B) טווחים עבור פתרון PS/SF (1 מ"ג/mL) ממשק לפני ואחרי הוספת מתנול. הנקודות הן נתונים ניסיוניים הקווים מוצק הם עקומות מצויד (כחול). ספקטרה היסט לבהירות. הועתק מ-Li, X; דנג, ג; אמא, ל'; לו, X; לאנגיור 2018, 34, 9453-9459 (ref 16). זכויות יוצרים 2018 האגודה האמריקנית לכימיה. איור זה שונה מ-[16].

Figure 9
איור 9 . Achiral (ssp, A) ו-צ'יראל (spp, B) sfg ספקטרום עבור הדופלקס הדו-מעוגן השומנים מעוגנת במגע עם Ca2 + פתרונות עם ריכוזים שונים (מ 0.6 מ"מ עד 6 מ"מ). נקודות הנתונים הותאמו בקירוב באמצעות משוואת לורנץ. השינוי של האזור המשולב עבור אותות הרטט מים כפונקציה של Ca2 + הריכוז הוצג (ssp, C; spp, D). כל הספקטרום היה מנורמל ומיסט לבהירות. הועתק מ-Li, X; אמא, ל'; לו, X; לאנגיור 2018, 34, 14774-14779 (ref 21). זכויות יוצרים 2018 האגודה האמריקנית לכימיה. איור זה שונה מ-[21].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי לחקור את המידע המבני מרמה מולקולרית, SFG יש את היתרונות הטבועים שלה (כלומר, מונאולייר או תת מונאולייר רגישות ובסלקטיביות הפנים), אשר ניתן להחיל על לימוד ממשקים שונים, כגון מוצק/מוצק, מוצק/ נוזלי, מוצק/גז, נוזלי/גז, נוזלי/נוזל ממשקים. למרות שתחזוקת הציוד והיישור האופטי עדיין גוזלת זמן, התשלום משמעותי בכך שניתן להשיג את המידע המפורט ברמה המולקולרית במשטחים ובממשקים.

בודק פולי (2-הידרוקסיל מתיונין) משטח וממשק קבור בפתרון: כפי שהדגמנו לעיל, ניתן לכוונן את מקדמי השדה האור. . נוכל לאשר את הניסויים האלה בממשק הקבור עם המצע, כי משטח המצע קפה2 חלקה ולא ניתן לחדר על ידי מולקולות פמה, ממשק זה הוא חד. עם זאת, על פני השטח עם מים, מולקולות מים יכולים לתקשר עם מולקולות פמה ולפזר לתוך הצובר. מכאן ממשק זה הוא מטושטש, ולא חדה כמו אחד קבור. לכן, פרופילים שונים של SFG ספקטרלי להיות נצפתה עבור שני ממשקים אלה. הנתונים הניסיוניים שלנו SFG הוכיחו את זה, המציין את היכולת לחקור באופן סלקטיבי את הממשק הקבור עם המצע או המשטח בתמיסה.

אינטראקציה בין שרשרת או השפעת כליאה על היווצרות של מבנים משניים ממשי: גורם מפתח הוא הריכוז החופף הקריטי (C *). עבור SF, C * הוא ~ 1.8 mg/mL. ניסויים, עבור הפתרון SF של ~ 90 mg/mL (מעל C *), אין כיראאל (psp) sfg האותות ויברtional זוהו ב-SF פתרון/PS ממשק, אלא אם כן גורם ממריץ-מתנול נוספה, כפי שמוצג באיור 7. אבל, עבור הפתרון SF של ~ 1 מ"ג/mL (מתחת C *), שיראאל (psp) sfg האותות ויברנטו ניתן לזהות ישירות ללא הוספת מתנול, כפי שמוצג באיור 8, אשר מציין כי מבנים משניים הורה כבר הוקמה ב-SF פתרון/ממשק PS. מאז C * הוא ריכוז הסף עבור חפיפה שרשרת שרשרת, האינטראקציה שרשרת שרשרת או הכליאה המרחבית יש לנקוט כגורם ויסות כאן עבור היווצרות של מבנים משניים SF בממשק.

מים מבנים מולקולריים סביב שרשרת הקצר olig,מחלת הגאות והשפל: לקבלת שרשרת קצרה דופלקס בתמיסה המים, המים כיררים האותות הרטט תואמים את שכבת השלחות של עמוד השדרה של כיראאל בחריץ הקטין . המים achiral האותות ויברtional המתאימים בעיקר לשכבת המים המקיפים את שרשרת דופלקס olig, והביאייר (עמוד השדרה של צ'יראאל של שכבת המים תורמת גם)33. ב-Ca2 + טווח ריכוז מ 0.6 עד 6 מ"מ, כפי שמוצג באיור 9, מצאנו, לא היה שינוי ברור עבור המים כירבים אותות התנודה במונחים של Ca2 + ריכוז. עם זאת, המים achiral האותות מושפעים מאוד כאשר Ca2 + הריכוז השתנה. הדבר מצביע על כך שעמוד השדרה של שכבת המים מחייב היטב את הכריכה הצמודה לדופלקס האוגיונולי, והוא משמש להגנה על האוגיונואואליות מתוך הרשות הביולוגית של Ca2 + יונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. אין לנו מה לגלות

Acknowledgments

מחקר זה היה נתמך על ידי תוכנית פיתוח מפתח המדינה עבור מחקר בסיסי של סין (2017YFA0700500) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (21574020). קרנות המחקר הבסיסי של האוניברסיטאות המרכזיות, פרויקט ממומן על ידי התוכנית האקדמית עדיפות פיתוח של ג'יאנגסו מוסדות להשכלה גבוהה (PAPD) והמרכז ההדגמה הלאומית להנדסה ביו-רפואית ניסויית השכלה (האוניברסיטה הדרום-מזרחית) הייתה גם מוערכת מאוד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)  Avanti Polar Lipids, Inc. 850355P-1g
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 100092680 ≥99.7%
CaF2 prism Chengdu YaSi Optoelectronics Co., Ltd.
Calcium chloride anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10005817 ≥96.0%
deuterated DPPC (d-DPPC) Avanti Polar Lipids, Inc. 860345P-100mg
Electromagnetic oven Zhejiang Supor Co., Ltd C21-SDHCB37
Langmuir-Blodgett (LB) trough KSV NIMA Co., Ltd. KN 2003
Lithium bromide anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 20056926
Milli-Q synthesis system Millipore Ultrapure water
Plasma cleaner Chengdu Mingheng Science&Technology Co., Ltd PDC-MG Oxygen plasma cleaning
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) Sigma-Aldrich Co., LLC. 192066 MSDS Mw = 300 000
Polystyrene Sigma-Aldrich Co., LLC. 330345 MSDS Mw = 48 kDa and Mn = 47 kDa
Silk cocoons From Bombyx mori
Single complementary strand of oligonucleotide Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. H03596 5'-CGAAGGCTTCCAGCT-3'
Single strand of oligonucleotide Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. H04936  3¢-end modified by cholesterol-triethylene glycol(Chol-TEG) (5¢-GCTTCCGAAGGTCGA-3¢)
Sodium carbonate anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10019260 ≥99.8%
Spin-coater Institute of Microelectronics of the Chinese Academy of Sciences KW-4A For the prepartion of ploymer films 
Step profiler Veeco DEKTAK 150 For the measurement of film thickness
Sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy system EKSPLA A commercial picosecond SFG system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shen, Y. R. Optical Second Harmonic Generation at Interfaces. Annual Review of Physical Chemistry. 40, 327-350 (1989).
  2. Shen, Y. R. Surface properties probed by second-harmonic and sum-frequency generation. Nature. 337, 519-525 (1989).
  3. Lu, X., et al. Studying Polymer Surfaces and Interfaces with Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (1), 466-489 (2017).
  4. Chen, X., Clarke, M. L., Wang, J., Chen, Z. Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy Studies on Molecular Conformation and Orientation of Biological Molecules at Interfaces. International Journal of Modern Physics B. 19 (4), 691-713 (2005).
  5. Eisenthal, K. B. Liquid Interfaces Probed by Second-Harmonic and Sum-Frequency Spectroscopy. Chemical Reviews. 96 (4), 1343-1360 (1996).
  6. Richmond, G. L. Molcular Bonding and Interactions at Aqueous Surfaces as Probed by Vibrational Sum Frequency Spectroscopy. Chemical Reviews. 102 (8), 2693-2724 (2002).
  7. Wang, H., Gan, W., Lu, R., Rao, Y., Wu, B. Quantitative spectral and orientational analysis in surface sum frequency generation vibrational spectroscopy(SFG-VS). International Reviews in Physical Chemistry. 24 (2), 191-256 (2007).
  8. Shultz, M. J., Schnitzer, C., Simonelli, D., Baldelli, S. Sum frequency generation spectroscopy of the aqueous interface: Ionic and soluble molecular solutions. International Reviews in Physical Chemistry. 19 (1), 123-153 (2010).
  9. Li, X., et al. Detecting Surface Hydration of Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) in Solution in situ. Macromolecules. 49, 3116-3125 (2016).
  10. Li, X., Lu, X. Evolution of Irreversibly Absorbed Layer Promotes Dewetting of Polystyrene Film on Sapphire. Macromolecules. 51, 6653-6660 (2018).
  11. Lu, X., Spanninga, S. A., Kristalyn, C. B., Chen, Z. Surface Orientation of Phenyl Groups in Poly(sodium 4-styrenesulfonate) and in Poly(sodium 4-styrenesulfonate): Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) Mixture Examined by Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Langmuir. 26 (17), 14231-14235 (2010).
  12. Lu, X., Clarke, M. L., Li, D., Wang, X., Chen, Z. A Sum Frequency Generation Vibrational Study of the Interference Effect in Poly(n-butyl methacrylate) Thin Films Sandwiched between Silica and Water. Journal of Physical Chemistry C. 115, 13759-13767 (2011).
  13. Lu, X., et al. Directly Probing Molecular Ordering at the Buried Polymer/Metal Interface 2: Using P-Polarized Input Beams. Macromolecules. 45, 6087-6094 (2012).
  14. Lu, X., Myers, J. N., Chen, Z. Molecular Ordering of Phenyl Groups at the Buried Polystyrene/Metal Interface. Langmuir. 30, 9418-9422 (2014).
  15. Li, B., Lu, X., Ma, Y., Han, X., Chen, Z. Method to Probe Glass Transition Temperatures of Polymer Thin Films. ACS Macro Letters. 4, 548-551 (2015).
  16. Li, X., Deng, G., Ma, L., Lu, X. Interchain Overlap Affects Formation of Silk Fibroin Secondary Structure on Hydrophobic Polystyrene Surface Detected via Achiral/Chiral Sum Frequency Generation. Langmuir. 34, 9453-9459 (2018).
  17. Kai, S., Li, X., Li, B., Han, X., Lu, X. Calcium-dependent hydrolysis of supported planar lipids was triggered by honey bee venom phospholipase A2 with the right orientation at the interface. Physical Chemistry Chemical Physics. 20, 63-67 (2018).
  18. Wang, J., Buck, S., Chen, Z. Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy Studies on Protein Adsorption. Journal of Physical Chemistry B. 106, 11666-11672 (2002).
  19. Wang, J., et al. Detection of Amide I Signals of Interfacial Proteins in Situ Using SFG. Journal of American Chemical Society. 125, 9914-9915 (2003).
  20. Nguyen, K. T., et al. Probing the Spontaneous Membrane Insertion of a Tall-Anchored Membrane Protein by Sum Frequency Generation Spectroscopy. Journal of American Chemistry Society. 132, 15112-15115 (2010).
  21. Li, X., Ma, L., Lu, X. Calcium Ions Affect Water Molecular Structures Surrounding an Oligonucleotide Duplex as Revealed by Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Langmuir. , (2018).
  22. Sartenaer, Y., et al. Sum-frequency generation spectroscopy of DNA monolayers. Biosensors & Bioelectronics. 22, 2179-2183 (2007).
  23. Asanuma, H., Noguchi, H., Uosaki, K., Yu, H. Metal Cation-induced Deformation of DNA Self-Assembled Monolayers on Silicon: Vibrational Sum Frequency Generation Spectroscopy. Journal of American Chemistry Society. 130, 8016-8022 (2008).
  24. Howell, C., Schmidt, R., Kurz, V., Koelsch, P. Sum-frequency-generation spectroscopy of DNA films in air and aqueous environments. Biointerphases. 3 (3), FC47 (2008).
  25. Walter, S. R., Geiger, F. M. DNA on Stage: Showcasing Oligonucleotides at Surfaces and Interfaces with Second Harmonic and Vibrational Sum Frequency Generation. Journal of Physical Chemistry Letters. 1, 9-15 (2010).
  26. Li, Z., Weeraman, C., Azam, M. S., Osman, E., Gibbs-Davis, J. The thermal reorganization of DNA immobilized at the silica/buffer interface: a vibrational sum frequency generation investigation. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 12452-12457 (2015).
  27. Lambert, A. G., Neivandt, D. J., Briggs, A. M., Usadi, E. W., Davies, P. B. Interference Effects in Sum Frequency Spectra from Monolayers on Composite Dielectric/Metal Substrates. Journal of Physical Chemistry B. 106, 5461-5469 (2002).
  28. Tong, Y., et al. Interference effects in the sum frequency generation spectra of thin organic films. I. Theoretical modeling and simulation. Journal of Chemical Physics. 133, 034704 (2010).
  29. McGall, S. J., Davies, P. B., Neivandt, D. J. Interference Effects in Sum Frequency Vibrational Spectra of Thin Polymer Films: An Experimental and Modeling Investigation. Journal of Physical Chemistry B. 108, 16030-16039 (2004).
  30. Li, B., et al. Interfacial Fresnel Coefficients and Molecular Structures of Model Cell Membranes: From a Lipid Monolayer to a Lipid Bilayer. Journal of Physical Chemistry C. 118, 28631-28639 (2014).
  31. Zhou, J., Anim-Danso, E., Zhang, Y., Zhou, Y., Dhinojwala, A. Interfacial Water at Polyurethane-Sapphire Interface. Langmuir. 31 (45), 12401-12407 (2015).
  32. Gautam, K. S., et al. Molecular Structure of Polystyrene at Air/Polymer and Solid/Polymer Interfaces. Physical Review Letters. 85 (18), 3854-3857 (2000).
  33. Yan, E. Y., Fu, L., Wang, Z., Liu, W. Biological Macromolecules at Interfaces Probed by Chiral Vibrational Sum Frequency Generation Spectroscopy. Chemical Reviews. 114, 8471-8498 (2014).
  34. Belkin, M. A., Kulakov, T. A., Ernst, K. H., Yan, L., Shen, Y. R. Sum-Frequency Vibrational Spectroscopy on Chiral Liquids: A Novel Technique to Probe Molecular Chirality. Physical Review Letters. 85, 4474 (2000).
  35. Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6, 1612-1631 (2011).

Tags

ביוכימיה סוגיה 150 טכניקות אנליטיות וטיפוליות וציוד טכניקות חקירה תופעות ותהליכים תופעות פיזיות כימיה וחומרים כימיה וחומרים (כללי) אי-אורגנית אורגני ופיזי כימיה פיסיקה פיסיקה אטומית ומולקולרית אופטיקה SFG מקדמי פרנל מבנים ברמה מולקולרית הפנים פולימרים biomacromolecules מבנה שיראאל הכליאה המרחבית
מבנים ברמת הפנים המולקולריים של פולימרים וBiomacromolecules מתגלים דרך תדר סיכום הדור ספקטרוסקופיה ויברtional
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, X., Ma, L., Lu, X. Interfacial… More

Li, X., Ma, L., Lu, X. Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. J. Vis. Exp. (150), e59380, doi:10.3791/59380 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter