Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Interfacial molekyl niveau strukturer af polymerer og Biomakromolecules afsløret via sum frekvens generation Vibrational spektroskopi

Published: August 13, 2019 doi: 10.3791/59380
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Bioelectronics, School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University

Summary

At være omfattende udnyttet, sum frekvens generation (SFG) vibrationelle spektroskopi kan bidrage til at afsløre kæde konformationsmæssige orden og sekundær strukturel ændring sker på polymer og biomakromolecule grænseflader.

Abstract

Som en anden-Order ikke-lineære optisk spektroskopi, sum Frequency generation (SFG) vibrationelle spektroskopi har bredt været anvendt til at undersøge forskellige overflader og grænseflader. Denne ikke-invasive optiske teknik kan give den lokale molekyl niveau information med enkeltlags eller submonolayer følsomhed. Vi her giver eksperimentel metodologi for, hvordan man selektivt detekterer den begravede grænseflade for både makromolekyler og biomakromolekyler. Med dette i tankerne diskuteres grænseflade sekundære strukturer af silke fibroin og vand strukturer omkring modelkort kædede oligonukleotid duplex. Førstnævnte viser en kæde-kæde overlapning eller rumlig indespærring effekt og sidstnævnte viser en beskyttelse funktion mod ca2 + ioner som følge af chiral rygsøjlen overbygning af vand.

Introduction

Udvikling af sum Frequency generation (SFG) vibrationelle spektroskopi kan dateres tilbage til det arbejde, der udføres af Shen et al. tredive år siden1,2. Det unikke ved grænseflade selektivitet og sub-monolayer følsomhed gør SFG vibrationelle spektroskopi værdsat af et stort antal forskere inden for fysik, kemi, biologi, og materialevidenskab, etc3,4 ,5. I øjeblikket undersøges en bred vifte af videnskabelige spørgsmål vedrørende overflader og grænseflader ved hjælp af SFG, navnlig for komplekse grænseflader med hensyn til polymerer og biomakromolekyler, såsom kæde strukturer og strukturel afslapning ved begravet polymer interfaces, protein sekundære strukturer, og de grænseflade vand strukturer9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25,26.

For polymer overflader og grænseflader fremstilles tynde film prøver generelt ved spin-coating for at opnå de ønskede overflader eller grænseflader. Problemet opstår på grund af signalet interferens fra de to grænseflader af de as-forberedte film, hvilket fører til ulejlighed for at analysere de indsamlede SFG Spectra27,28,29. I de fleste tilfælde, det vibrationelle signal kun fra en enkelt grænseflade, enten film/substrat eller film/det andet medium, er ønskelig. Faktisk, løsningen på dette problem er ganske let, nemlig at eksperimentelt maksimere lyset felter på ønskelig grænseflade og minimere de lyse felter på den anden grænseflade. Derfor skal Fresnel-koefficienterne eller de lokale felt koefficienter beregnes via den tynde film model og valideres med hensyn til forsøgsresultaterne3,9,10,11, 12,13,14,15,30.

Med ovenstående baggrund i tankerne, nogle polymer og biologiske grænseflader kunne undersøges for at forstå grundlæggende videnskab fra det molekylære niveau. I det følgende, at tage tre grænseflade spørgsmål som eksempler: sondering poly (2-hydroxyethyl methacrylat) (phema) overflade og begravet grænseflade med substrat9, dannelse af silke fibroin (SF) sekundære strukturer på polystyren (PS) overflade og vand strukturer omkring modelkort kædede oligonukleotid duplex16,21, vil vi vise, hvordan SFG vibrationelle spektroskopi hjælper med at afsløre de grænseflade molekyl niveau strukturer i forbindelse med den underliggende videnskab.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SFG-eksperimentel

  1. Brug et kommercielt pikosekund SFG system (tabel over materialer), som giver en grundlæggende 1064 nm stråle med en pulsbredde på ~ 20 PS og en frekvens på 50 Hz, baseret på en nd: YAG laser.
  2. Konverter den grundlæggende 1064 nm stråle til en 532 nm stråle og en 355 nm stråle ved hjælp af anden og tredje harmoniske moduler. Direkte guide 532 nm stråle som en indgang lysstråle og generere den anden indgang Mid-infrarød (IR) stråle, der dækker frekvensområdet fra 1000 til 4000 cm-1 gennem den optiske parametrisk generation (opg)/optisk parametrisk forstærkning (Opa)/ processen for generering af difference frekvens (DFG).
  3. Indstil hændelses vinkler for to indgangs bjælker til henholdsvis 53 ° (IR) og 64 ° (synlig) i forhold til normal overfladen.
  4. For at detektere polymer grænseflade strukturer (enten film/substrat interface eller film/den anden medium grænseflade), bruge SSP (s-polariseret sumfrekvens stråle, s-polariseret synlig stråle og p-polariseret infrarød stråle) og PPP polarisering kombinationer.
  5. For at detektere det grænseflade protein sekundære strukturer og vand strukturer omkring DNA, foruden SSP og PPP, bruges chiral spp og PSP-polariserings kombinationer.
  6. For at sikre, at prøverne ikke blev beskadiget, styre de infrarøde og synlige puls energier til at være ~ 70 og ~ 30 mJ, hhv. En skematisk af SFG-processen med energi niveau diagrammet blev vist i figur 1. Figur 2 viser SFG-systemet i vores Clean Room.

2. Fresnel-koefficienter

  1. Brug retvinklet prismer som substrater for alle de eksperimenter, som diskuteres her. Der findes to interfaces til en polymer film på det faste substrat, dvs polymer overflade i luft og polymer/substrat interface. Begge kan generere SFG signaler, da inversion symmetri er brudt på begge grænseflader. Derfor er et samlet SFG-spektrum et indgreb. De lokale felt koefficienter eller Fresnel koefficienterne ved de to grænseflader kan dog justeres ved at variere enten hændelses vinklen eller filmtykkelsen én ad gangen eller samtidigt31,32. Dette giver os mulighed for at sonde SFG vibrationelle signal fra kun én grænseflade. Her blev PHEMA filmen på CaF2 prisme taget som et eksempel9.
  2. Som vist i figur 3, ansætte højre-vinkel prisme geometri til at detektere SFG signaler genereret fra bunden phema film. SFG-output intensiteten i reflekteret tilstand udtrykkes som
    Equation 11
    hvor Equation 2 betegner den effektive anden-Order ikke-lineær følsomhed tensor.
    Equation 2består af tre dele, nemlig Prism/polymer-grænsefladen, polymer/bottom medium-grænsefladen (bund medium omfatter gas, væske eller fast.) og den ikke-resonante baggrund, som vist i følgende ligning.
    Equation 32
    Her kan det nederste medium være luft, vand eller noget andet. F repræsenterer den tilsvarende Fresnel-koefficient, der er ansvarlig for den lokale felt korrektion.
  3. Anvend en tynd-film model til beregning af Fresnel koefficienter i dette tilfælde. Her præsenteres kun korte beregningsprocedurer.
    1. Til Prism/polymer-grænsefladen skal du bruge
      Equation 43
      Equation 54
      Equation 65
      Betydningen af hver vist parameter er præsenteret nedenfor.
      1. ω angiver stråle frekvensen.
      2. tp og ts angiver de samlede transmissions koefficienter og kan udtrykkes som
        Equation 76
        Equation 87
      3. tP12 og tS12 angiver de lineære transmissions koefficienter for lysstrålen ved prisme/polymer-grænsefladen.
      4. rP23 og rS23 angiver de lineære refleksions koefficienter for lysstrålen på polymer/medium-grænsefladen.
      5. α repræsenterer fase forskellen mellem en reflekterende stråle og dens sekundære reflekterende stråle, efter at den er formeret på tværs af polymer tynd film og derefter reflekterer tilbage, som kan udtrykkes som
        Equation 98
      6. λ repræsenterer lysstrålens bølgelængde, og d er polymer filmens tykkelse.
      7. Φ1 og φ2 repræsenterer hændelses vinklen ved Prism/polymer-grænsefladen og polymer/medium-grænsefladen.
      8. n1 og n2 repræsenterer brydnings indeksene for henholdsvis prisme og polymer film.
      9. n12 repræsenterer de brydnings indekser af polymer grænseflade lag for prisme/polymer.
    2. Til polymer/medium-grænsefladen anvendes
      Equation 109
      Equation 1110
      Equation 1211
      1. Δ repræsenterer fase forskellen på de lyse elektriske felter ved to grænseflader.
      2. Da puls bredden for vores indgangs bjælker er ~ 20 PS, kan fejlen fra den tidsforsinkelse, der er forbundet med dispersions effekten, ignoreres.
      3. Udtryk for en sådan faseforskel for output SFG, input synlige og input infrarøde stråler kan skrives separat som
        Equation 1312
        Equation 1413
        Equation 1514
         
  4. Fra ovenstående diskussion, for Prism-polymer film-medium (1-2-3) system, udtrykke de samlede Fresnel koefficienter for prisme/polymer og polymer/medium grænseflader som følgende ligninger, for SSP og PPP polarisering kombinationer . Selvfølgelig, begge grænseflader betragtes azimuthally isotropic.
    1. For Prism/polymer-grænsefladen præsenteres udtrykkene for de totale Fresnel-koefficienter for både SSP -og PPP -polariserings kombinationer på følgende måde.
      1. For SSPer ligningen
        Equation 1615
      2. Og for PPPer ligningen
        Equation 516
        Equation 517
        Equation 518
        Equation 519
         
      3. t10 og t01 betegner de lineære transmissions koefficienter ved henholdsvis luft/prisme og prisme/luft grænseflader.
    2. For polymer/medium-grænsefladen beskrives udtrykkene for de totale Fresnel-koefficienter for både SSP -og PPP -polariserings kombinationer som følger.
      1. For SSPer ligningen
        Equation 2120
      2. For PPPer ligningerne
        Equation 521
        Equation 522
        Equation 523
        Equation 524
           
         
  5. Efter beregning af Fresnel koefficienterne ved hjælp af den sandwichede model, plot dem som en funktion af filmens tykkelse, som vist i figur 4.
    Bemærk: i dette tilfælde findes der et tykkelsesområde til opsamling af SFG-signalet fra CaF2 Prism/phema-grænsefladen med negligerbar bidrag fra den anden grænseflade, som er omkring 150 nm. Tilsvarende kan en passende tykkelse vælges til påvisning af PHEMA/bottom medium-grænsefladen med negligerbar bidrag fra CaF2 Prism/phema-grænsefladen.

3. Chiral SFG polariserings kombination

  1. For normal achiral grænseflade, almindeligvis, brug C∞ v symmetri i form af ensemble gennemsnit33,34. Ved brug af inversions symmetri kan der udledes ikke-nulpunkts-ikke-lineær modtagelighed for tensor-komponenter, som er cxxz, cxzx, cZxx, cYYZ, cyzy, czyy og cZZZ (den eksisterende termer kan reduceres yderligere, hvis der forudsættes en isotropisk grænseflade, hvilket betyder, at x og y er ens). Men for chiral interface, vil situationen være anderledes. Chiral-interfacet besidder C ∞-symmetrien, kun rotations symmetri operationen er tilladt. I dette tilfælde, foruden de normale achiral vilkår, mere andenrangsikke-lineære modtagelighed vil være nonzero, som kan betegnes som chiral vilkår, nemlig, cZYX, czxy og cYZX under hensyntagen til ikke-elektroniske Resonans. Ved brug af PSP-, PPS -og spp -POLARISERINGS kombinationer kan chiral sfg spectra derfor indsamles33,34.

4. forberedelse af prøver

  1. Forberedelse af PHEMA film
    1. Opløs PHEMA pulver (Se tabel over materialer) i vandfri ethanol for at tilberede opløsningen med henholdsvis 2 vægt% og 4 WT%.
    2. Før deposition af phema-filmene skal du suge CaF2 -højvinkel prismer i toluen-opløsningsmidlet først og derefter vaske dem med ethanol og ultrarent vand (18,2 MΩ · cm).
    3. Bagefter eksponere substrater (CaF2 retvinklet prismer) til ilt plasma for at fjerne mulige organiske forurenende stoffer ved plasma renere (Se tabel over materialer).
      1. Først tænde for plasma renere og sætte substrater i det.
      2. Derefter tænde for vakuumpumpen til at støvsuge renere. Indtast ilt i den.
      3. Endelig sæt 4 minutter til rengøring. Efter at bevare de rene substrater for den sekventielle PHEMA film præparat.
      4. Derefter forberede PHEMA film på CaF2 prismer af en spin-Coater (Se tabel over materialer). Juster film tykkelser ved opløsningen koncentration og spin hastighed.
        1. Immobilize CaF2 prisme på den sugende skive af spin-Coater.
        2. Drop en dråbe af PHEMA opløsningen forberedt før på de rene substrater ved 1.500 rpm i 1 min (filmtykkelse 2 vægt% for 100 nm og 4 WT% for 200 nm).
      5. Anneal alle de forberedte PHEMA film i en vakuum ovn ved 80 °C natten over.
  2. Fremstilling af silke fibroin (SF)
    Bemærk: protokollen foreslået af Kaplan et al.35 blev vedtaget.
    1. Placer 7,5 g silke kokoner af B. Mori i kogende natriumkarbonat (na2Co3, 0,02 M) vandig opløsning (3 L) i 30 min. Fjern fibrøs SF til en ren beholder.
    2. Den fremstillede fibrøse SF vaskes med deioniseret vand i tre gange under omrøring for at fjerne sericinmolekylerne og kun efterlade SF-Molekylerne i den fibrøse prøve.
    3. Tør den fibrøse SF-prøve i en vakuum ovn ved 60 °C natten over.
    4. Derefter opløses den degummede fibrøse SF-prøve i et lithiumbromid (LiBr, 9,3 M) vandig opløsning (1 g SF blev løst i ~ 4 mL LiBr-opløsning.) og inkubaterede den ved 60 °C i 2 timer under omrøring.
    5. Du skal dialysere SF-opløsningen mod deioniseret vand (3.500 da-dialyse poser) i 3 dage for at fjerne den opløste LiBr. Skift nyt deioniseret vand tre gange hver dag. Endelig opbevares den forarbejdede SF-opløsning ved 4 °C til senere SFG-eksperimenter.
  3. Klargøring af kortkædede oligonukleotid duplex
    1. Den enkelt strengede oligonukleotid-prøve med dens 3 '-ende modificeret med kolesterol-triethylenglycol (Chol-TEG) (5 '-GCTTCCGAAGGTCGA-3 ') fra et kommercielt selskab (Se tabel over materialer) samt den supplerende. For hver enkelt streng opløses 10 nmol af prøve pulveret i 0,5 ml ultrarent vand. Bland dem derefter sammen for at danne duplex oligonukleotid-opløsningen (10 nmol/mL).
    2. Bland 2 mg af 1,2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphocholin (dppc) og 2 mg af er dppc (d-dppc) og opløse dem i 1 ml chloroform at forberede lipid opløsning.
    3. Klargøring af dppc & d-dppc enkeltlags af en Langmuir − Blodgett (lb) trug
      1. Fastgør den retvinklede CaF2 prisme til en hjemmelavet prøveholder med et prisme ansigt vinkelret dyppet i det vandige miljø på lb-truget.
      2. Derefter indsprøjtes den blandede lipidopløsning, der blev fremstillet før på vandoverfladen, indtil overflade trykket nåede en bestemt værdi under 34 mN · m− 1.
      3. Når overflade trykket er slukket, skal du bruge to Teflon-barrierer til at komprimere lipid-enkeltlags i et forhold på 5 mm/min, indtil et overfladetryk på 34 MN · m− 1 blev nået.
      4. Løft prismet med en lipid-enkeltlags ud af vandet med en hastighed på 1 mm/min. lodret.
    4. Fremstilling af andre lipid-enkeltlags
      1. For at lette samlingen af duplex oligonukleotid og lipid molekyler via hydrofobe interaktion (kolesterol og en lipid alkyl kæde), bland duplex oligonukleotid opløsning med lipid opløsning i en molær ratio på 1:100 (oligonukleotid til lipid).
      2. Injicér den blandede lipid-og duplex-oligonukleotid-opløsning på vandoverfladen i en hjemmelavet Teflon-beholder, indtil der er nået et overfladetryk på 34 mN · m− 1 .
    5. Endelig sætte lipid enkeltlags i bunden af prisme i kontakt med lipid enkeltlags med indsatte duplex oligonukleotider på vandoverfladen til at danne den endelige prøve for SFG måling.
  4. Lorentz ligning
    1. Brug Lorentz-ligningen til at montere SFG Spectra for at udtrække vibrationsmæssige oplysninger for en bestemt vibrationel tilstand.
      Equation 2625
      hvor Equation 27 repræsenterer intensiteten af QTH Vibrationstilstand, Equation 28 repræsenterer resonansfrekvensen, Equation 29 betegner halv bredden ved halv maksimum (hwhm) og Equation 30 repræsenterer scanningsfrekvensen for hændelsen IR-stråle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I den Fresnel koefficient del af protokollen sektion, har vi vist, at teoretisk set er det muligt selektivt at detektere kun én enkelt grænseflade på én gang. Her, eksperimentelt, vi bekræftede, at denne metode er dybest set korrekt, som vist i figur 5 og figur 6.

Figur 5 viser den begravede grænseflade phema struktur efter vand indtrængen med en ~ 150 nm phema hydrogel film og figur 6 viser overfladen struktur i vand med en ~ 430 nm phema hydrogel film. Panelerne A og B svarer til henholdsvis CH-og CO-intervallerne for begge tal. Ved den begravede grænseflade er alle de observerede vibrationelle toppe skarpe og klare. Årsagen er, at CaF2 -substrat er glat og ikke kan gennemtrænges af phema-molekyler, hvilket fører til en skarp CaF2/phema-grænseflade. Men på overfladen, fordi vandmolekyler kan interagere med PHEMA og diffus i bulk, ville PHEMA/vand grænsefladen ikke være så skarp som den begravede en. Der observeres derfor forskellige spektral profiler for disse to grænseflader.

Figure 1
Figur 1 . Skematisk visning af SFG-processen (venstre panel) med energi overgangs diagrammet (højre panel). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . SFG-systemet i laboratoriet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Skematisk viser lysformeringsstien i prisme for SFG-eksperiment. Tallene 0, 1, 2 og 3 repræsenterer luften, prisme, PHEMA og bund mediet (det nederste medium kan være luft, fast eller flydende.), hhv. Gengivet fra Li, X.; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. Macromolecules 2016, 49, 3116 − 3125 (Ref. 9). Copyright 2016 det amerikanske kemikalie selskab. Dette tal er blevet ændret fra [9]. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Beregnede Fresnel koefficienter som en funktion af filmtykkelsen for prisme geometri i vand til SSP og PPP polariserings kombinationer. Paneler a1 til C1 svarer til ch-området, og panelerne a2 til C2 svarer til co-intervallet. Gengivet fra Li, X.; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. Macromolecules 2016, 49, 3116 − 3125 (Ref. 9). Copyright 2016 det amerikanske kemikalie selskab. Dette tal er blevet ændret fra [9].

Figure 5
Figur 5 . SSP og PPP -spektre fra CaF2/phema-grænsefladen efter vand eksponering. A: CH og OH Range; B: CO-rækkevidde. De sorte kurver er de monterede resultater ved hjælp af Lorentz ligningen. Spektrene er blevet kompensat for klarhed. Gengivet fra Li, X.; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. Macromolecules 2016, 49, 3116 − 3125 (Ref. 9). Copyright 2016 det amerikanske kemikalie selskab. Dette tal er blevet ændret fra [9].

Figure 6
Figur 6 . SSP og PPP Spectra af phema overfladen på CaF2 prisme. A: CH og OH Range; B: CO-rækkevidde. Prøven blev sat i kontakt med vand. De sorte kurver er de monterede resultater ved hjælp af Lorentz ligningen. Spektrene er blevet kompensat for klarhed. Gengivet fra Li, X.; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. Macromolecules 2016, 49, 3116 − 3125 (Ref. 9). Copyright 2016 det amerikanske kemikalie selskab. Dette tal er blevet ændret fra [9].

Figure 7
Figur 7 . Normaliseret chiral (PSP) SFG Spectra i AMID i (panel A) og N-H (panel B) intervaller for PS/SF-opløsning (90 mg/ml) interface før og efter tilsætning af methanol. Prikkerne er eksperimentelle data og de faste linjer er de monterede kurver. Spektre er blevet kompensat for klarhed. Gengivet fra Li, X.; Deng, G.; MA, L.; Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 9453 − 9459 (ref 16). Copyright 2018 det amerikanske kemikalie selskab. Dette tal er blevet ændret fra [16].

Figure 8
Figur 8 . Normaliseret chiral (PSP) SFG Spectra i AMID i (panel A) og N-H (panel B) intervaller for PS/SF-opløsning (1 mg/ml) interface før og efter tilsætning af methanol. Prikkerne er eksperimentelle data, og de faste linjer er de monterede kurver (blå). Spektre er blevet kompensat for klarhed. Gengivet fra Li, X.; Deng, G.; MA, L.; Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 9453 − 9459 (ref 16). Copyright 2018 det amerikanske kemikalie selskab. Dette tal er blevet ændret fra [16].

Figure 9
Figur 9 . Achiral (SSP, A) og chiral (spp, B) SFG Spectra for den duplex oligonukleotidforankrede lipid-tolags i kontakt med ca2 + -opløsninger med forskellige koncentrationer (fra 0,6 mm til 6 mm). Datapunkterne blev omtrent monteret ved hjælp af Lorentz-ligningen. Ændringen af det integrerede område for vand vibrationsmæssige signaler som en funktion af ca2 + koncentrationen blev præsenteret (SSP, C; spp, D). Alle spektre er blevet normaliseret og kompenseret for klarhed. Gengivet fra Li, X.; MA, L.; Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 14774 − 14779 (ref 21). Copyright 2018 det amerikanske kemikalie selskab. Dette tal er blevet ændret fra [21].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For at undersøge de strukturelle oplysninger fra et molekyleniveau har SFG sine iboende fordele (dvs. enkeltlags eller sub-enkeltlags følsomhed og grænseflade selektivitet), som kan anvendes til at studere forskellige grænseflader, såsom solid/solid, solid/ flydende, fast/gas, væske/gas, flydende/flydende grænseflader. Selv om vedligeholdelsen af udstyret og den optiske justering stadig er tidskrævende, er udbyttet signifikant, da de detaljerede molekylære oplysninger på overfladerne og grænsefladerne kan opnås.

Sondering poly (2-hydroxyethyl methacrylat) overflade og begravet grænseflade i opløsning: som vi viste ovenfor, kan lysfelt koefficienterne justeres. Vi kan bekræfte dette eksperimentelt. Ved den begravede grænseflade med substratet, fordi CaF2 substrat overfladen er glat og ikke kan gennemtrænges af phema-molekyler, er denne grænseflade en skarp en. Men på overfladen med vand kan vandmolekyler interagere med PHEMA-molekyler og diffus i bulk. Derfor er denne grænseflade sløret, og ikke så skarp som den begravede en. Der vil derfor blive observeret forskellige SFG-spektral profiler for disse to grænseflader. Vores eksperimentelle SFG data har bevist dette, hvilket indikerer evnen til selektivt at sonde den begravede grænseflade med substratet eller overfladen i opløsning.

Interchain interaktion eller indespærring virkning på dannelsen af silke Fibroin sekundære strukturer: en nøglefaktor er den kritiske overlappende koncentration (C *). For SF er C * ~ 1,8 mg/mL. Eksperimentelt, for SF opløsning af ~ 90 mg/mL (over C *), ingen chiral (PSP) SFG vibrationelle signaler blev påvist ved SF Solution/PS-grænsefladen, medmindre et inducerende middel-methanol blev tilsat, som vist i figur 7. Men for SF opløsning af ~ 1 mg/mL (under C *), chiral (PSP) SFG vibrationelle signaler kan påvises direkte uden tilsætning af methanol, som vist i figur 8, hvilket indikerer, at de bestilte sekundære strukturer er allerede blevet dannet ved SF løsning/PS-grænseflade. Da C * er en tærskelkoncentration for kæde kæde overlapningen, skal kæde interaktionen eller den fysiske indeslutning betragtes som en reguleringsfaktor her for dannelsen af SF-sekundære strukturer ved grænsefladen.

Vandmolekyle strukturer omkring kortkædede oligonukleotid duplex: for en kortkædede oligonukleotid duplex i vand opløsningen, chiral vand SFG vibrationelle signaler svarer til hydrerings laget af chiral rygsøjlen i den mindre Groove . Achiral vand SFG vibrationelle signaler for det meste svarer til vandlaget omkring oligonucleotid duplex kæde og tolags (den chirale ryg af vandlaget bidrager også)33. I en ca2 + koncentrationsområde fra 0,6 til 6 mm, som vist i figur 9, vi fandt, var der ingen indlysende ændring for chiral vand vibrationelle signaler i form af ca2 + koncentration. Men, de achiral vand vibrationelle signaler blev stærkt påvirket, når ca2 + koncentrationen blev ændret. Dette indikerer, at den chirale ryg af vandlaget tæt binding til oligonukleotid duplex kan beskytte oligonukleotid fra ca2 + ioner, i den normale biologiske tilstand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af staten Key Development program for grundforskning i Kina (2017YFA0700500) og National Natural Science Foundation i Kina (21574020). De grundlæggende forskningsmidler til de centrale universiteter, et projekt finansieret af den prioriterede akademiske program udvikling af Jiangsu videregående uddannelsesinstitutioner (PAPD) og det nationale demonstrations Center for eksperimentel biomedicinsk ingeniør Uddannelse (sydøstlige Universitet) blev også meget værdsat.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)  Avanti Polar Lipids, Inc. 850355P-1g
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 100092680 ≥99.7%
CaF2 prism Chengdu YaSi Optoelectronics Co., Ltd.
Calcium chloride anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10005817 ≥96.0%
deuterated DPPC (d-DPPC) Avanti Polar Lipids, Inc. 860345P-100mg
Electromagnetic oven Zhejiang Supor Co., Ltd C21-SDHCB37
Langmuir-Blodgett (LB) trough KSV NIMA Co., Ltd. KN 2003
Lithium bromide anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 20056926
Milli-Q synthesis system Millipore Ultrapure water
Plasma cleaner Chengdu Mingheng Science&Technology Co., Ltd PDC-MG Oxygen plasma cleaning
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) Sigma-Aldrich Co., LLC. 192066 MSDS Mw = 300 000
Polystyrene Sigma-Aldrich Co., LLC. 330345 MSDS Mw = 48 kDa and Mn = 47 kDa
Silk cocoons From Bombyx mori
Single complementary strand of oligonucleotide Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. H03596 5'-CGAAGGCTTCCAGCT-3'
Single strand of oligonucleotide Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. H04936  3¢-end modified by cholesterol-triethylene glycol(Chol-TEG) (5¢-GCTTCCGAAGGTCGA-3¢)
Sodium carbonate anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10019260 ≥99.8%
Spin-coater Institute of Microelectronics of the Chinese Academy of Sciences KW-4A For the prepartion of ploymer films 
Step profiler Veeco DEKTAK 150 For the measurement of film thickness
Sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy system EKSPLA A commercial picosecond SFG system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shen, Y. R. Optical Second Harmonic Generation at Interfaces. Annual Review of Physical Chemistry. 40, 327-350 (1989).
  2. Shen, Y. R. Surface properties probed by second-harmonic and sum-frequency generation. Nature. 337, 519-525 (1989).
  3. Lu, X., et al. Studying Polymer Surfaces and Interfaces with Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (1), 466-489 (2017).
  4. Chen, X., Clarke, M. L., Wang, J., Chen, Z. Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy Studies on Molecular Conformation and Orientation of Biological Molecules at Interfaces. International Journal of Modern Physics B. 19 (4), 691-713 (2005).
  5. Eisenthal, K. B. Liquid Interfaces Probed by Second-Harmonic and Sum-Frequency Spectroscopy. Chemical Reviews. 96 (4), 1343-1360 (1996).
  6. Richmond, G. L. Molcular Bonding and Interactions at Aqueous Surfaces as Probed by Vibrational Sum Frequency Spectroscopy. Chemical Reviews. 102 (8), 2693-2724 (2002).
  7. Wang, H., Gan, W., Lu, R., Rao, Y., Wu, B. Quantitative spectral and orientational analysis in surface sum frequency generation vibrational spectroscopy(SFG-VS). International Reviews in Physical Chemistry. 24 (2), 191-256 (2007).
  8. Shultz, M. J., Schnitzer, C., Simonelli, D., Baldelli, S. Sum frequency generation spectroscopy of the aqueous interface: Ionic and soluble molecular solutions. International Reviews in Physical Chemistry. 19 (1), 123-153 (2010).
  9. Li, X., et al. Detecting Surface Hydration of Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) in Solution in situ. Macromolecules. 49, 3116-3125 (2016).
  10. Li, X., Lu, X. Evolution of Irreversibly Absorbed Layer Promotes Dewetting of Polystyrene Film on Sapphire. Macromolecules. 51, 6653-6660 (2018).
  11. Lu, X., Spanninga, S. A., Kristalyn, C. B., Chen, Z. Surface Orientation of Phenyl Groups in Poly(sodium 4-styrenesulfonate) and in Poly(sodium 4-styrenesulfonate): Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) Mixture Examined by Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Langmuir. 26 (17), 14231-14235 (2010).
  12. Lu, X., Clarke, M. L., Li, D., Wang, X., Chen, Z. A Sum Frequency Generation Vibrational Study of the Interference Effect in Poly(n-butyl methacrylate) Thin Films Sandwiched between Silica and Water. Journal of Physical Chemistry C. 115, 13759-13767 (2011).
  13. Lu, X., et al. Directly Probing Molecular Ordering at the Buried Polymer/Metal Interface 2: Using P-Polarized Input Beams. Macromolecules. 45, 6087-6094 (2012).
  14. Lu, X., Myers, J. N., Chen, Z. Molecular Ordering of Phenyl Groups at the Buried Polystyrene/Metal Interface. Langmuir. 30, 9418-9422 (2014).
  15. Li, B., Lu, X., Ma, Y., Han, X., Chen, Z. Method to Probe Glass Transition Temperatures of Polymer Thin Films. ACS Macro Letters. 4, 548-551 (2015).
  16. Li, X., Deng, G., Ma, L., Lu, X. Interchain Overlap Affects Formation of Silk Fibroin Secondary Structure on Hydrophobic Polystyrene Surface Detected via Achiral/Chiral Sum Frequency Generation. Langmuir. 34, 9453-9459 (2018).
  17. Kai, S., Li, X., Li, B., Han, X., Lu, X. Calcium-dependent hydrolysis of supported planar lipids was triggered by honey bee venom phospholipase A2 with the right orientation at the interface. Physical Chemistry Chemical Physics. 20, 63-67 (2018).
  18. Wang, J., Buck, S., Chen, Z. Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy Studies on Protein Adsorption. Journal of Physical Chemistry B. 106, 11666-11672 (2002).
  19. Wang, J., et al. Detection of Amide I Signals of Interfacial Proteins in Situ Using SFG. Journal of American Chemical Society. 125, 9914-9915 (2003).
  20. Nguyen, K. T., et al. Probing the Spontaneous Membrane Insertion of a Tall-Anchored Membrane Protein by Sum Frequency Generation Spectroscopy. Journal of American Chemistry Society. 132, 15112-15115 (2010).
  21. Li, X., Ma, L., Lu, X. Calcium Ions Affect Water Molecular Structures Surrounding an Oligonucleotide Duplex as Revealed by Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Langmuir. , (2018).
  22. Sartenaer, Y., et al. Sum-frequency generation spectroscopy of DNA monolayers. Biosensors & Bioelectronics. 22, 2179-2183 (2007).
  23. Asanuma, H., Noguchi, H., Uosaki, K., Yu, H. Metal Cation-induced Deformation of DNA Self-Assembled Monolayers on Silicon: Vibrational Sum Frequency Generation Spectroscopy. Journal of American Chemistry Society. 130, 8016-8022 (2008).
  24. Howell, C., Schmidt, R., Kurz, V., Koelsch, P. Sum-frequency-generation spectroscopy of DNA films in air and aqueous environments. Biointerphases. 3 (3), FC47 (2008).
  25. Walter, S. R., Geiger, F. M. DNA on Stage: Showcasing Oligonucleotides at Surfaces and Interfaces with Second Harmonic and Vibrational Sum Frequency Generation. Journal of Physical Chemistry Letters. 1, 9-15 (2010).
  26. Li, Z., Weeraman, C., Azam, M. S., Osman, E., Gibbs-Davis, J. The thermal reorganization of DNA immobilized at the silica/buffer interface: a vibrational sum frequency generation investigation. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 12452-12457 (2015).
  27. Lambert, A. G., Neivandt, D. J., Briggs, A. M., Usadi, E. W., Davies, P. B. Interference Effects in Sum Frequency Spectra from Monolayers on Composite Dielectric/Metal Substrates. Journal of Physical Chemistry B. 106, 5461-5469 (2002).
  28. Tong, Y., et al. Interference effects in the sum frequency generation spectra of thin organic films. I. Theoretical modeling and simulation. Journal of Chemical Physics. 133, 034704 (2010).
  29. McGall, S. J., Davies, P. B., Neivandt, D. J. Interference Effects in Sum Frequency Vibrational Spectra of Thin Polymer Films: An Experimental and Modeling Investigation. Journal of Physical Chemistry B. 108, 16030-16039 (2004).
  30. Li, B., et al. Interfacial Fresnel Coefficients and Molecular Structures of Model Cell Membranes: From a Lipid Monolayer to a Lipid Bilayer. Journal of Physical Chemistry C. 118, 28631-28639 (2014).
  31. Zhou, J., Anim-Danso, E., Zhang, Y., Zhou, Y., Dhinojwala, A. Interfacial Water at Polyurethane-Sapphire Interface. Langmuir. 31 (45), 12401-12407 (2015).
  32. Gautam, K. S., et al. Molecular Structure of Polystyrene at Air/Polymer and Solid/Polymer Interfaces. Physical Review Letters. 85 (18), 3854-3857 (2000).
  33. Yan, E. Y., Fu, L., Wang, Z., Liu, W. Biological Macromolecules at Interfaces Probed by Chiral Vibrational Sum Frequency Generation Spectroscopy. Chemical Reviews. 114, 8471-8498 (2014).
  34. Belkin, M. A., Kulakov, T. A., Ernst, K. H., Yan, L., Shen, Y. R. Sum-Frequency Vibrational Spectroscopy on Chiral Liquids: A Novel Technique to Probe Molecular Chirality. Physical Review Letters. 85, 4474 (2000).
  35. Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6, 1612-1631 (2011).

Tags

Biokemi analytiske diagnostiske og terapeutiske teknikker og udstyr efterforskningsteknikker fænomener og processer fysiske fænomener kemi og materialer kemi og materialer (generelt) uorganiske organiske og fysiske Kemi fysik Atom-og molekylær fysik optik SFG Fresnel koefficienter grænseflade molekyl niveau strukturer polymerer biomakromolecules chiral struktur rumlig indespærring
Interfacial molekyl niveau strukturer af polymerer og Biomakromolecules afsløret via sum frekvens generation Vibrational spektroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, X., Ma, L., Lu, X. Interfacial… More

Li, X., Ma, L., Lu, X. Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. J. Vis. Exp. (150), e59380, doi:10.3791/59380 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter