Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Toplam Frekans Üretimi TitreşimSpektroskopisi Ile Ortaya Çıkan Polimerlerin ve Biyomakromoleküllerin İnterasfer Moleküler Düzey Yapıları

Published: August 13, 2019 doi: 10.3791/59380
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Bioelectronics, School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University

Summary

Kapsamlı olarak kullanılan, toplam frekans üretimi (SFG) titreşimsi polimer ve biyomakromolekül arayüzlerinde meydana gelen zincir konformasyonel düzen ve ikincil yapısal değişim ortaya çıkarmak için yardımcı olabilir.

Abstract

İkinci dereceden doğrusal olmayan optik spektroskopi olarak, sum frekans üretimi (SFG) titreşimsel spektroskopi çeşitli yüzeylerin ve arayüzlerin araştırılmasında yaygın olarak kullanılmıştır. Bu non-invaziv optik teknik monolayer veya submonolayer duyarlılık ile yerel moleküler düzeyde bilgi sağlayabilir. Burada hem makromoleküller hem de biyomakromoleküller için gömülü arayüzü seçici olarak nasıl tespit edebileceğimize ilişkin deneysel metodoloji salıyoruz. Bu göz önünde bulundurularak, model kısa zincirli oligonükleotid dubleks etrafındaki ipek fibroinin in interfasiyal sekonder yapıları ve su yapıları tartışılmıştır. Eski bir zincir-zincir örtüşme veya mekansal hapsi etkisi gösterir ve ikinci su chiral omurga üstyapısı ndan kaynaklanan Ca2 + iyonları karşı bir koruma fonksiyonu gösterir.

Introduction

Toplam frekans üretimi gelişimi (SFG) titreşimsi spektroskopisi Shen ve ark. otuz yıl önce1,2tarafından yapılan işe geri tarihli olabilir . Interfasiyal seçicilik ve alt-monolayer duyarlılık teklik SFG titreşimsi spektroskopi fizik, kimya, biyoloji ve malzeme bilimi, vb 3 alanlarında araştırmacıların çok sayıda tarafından takdir yapar,4 ,5. Şu anda, yüzeyler ve arayüzler ile ilgili bilimsel konular geniş bir yelpazede, özellikle polimerler ve biyomakromoleküller ile ilgili karmaşık arayüzler için, zincir yapıları ve yapısal gevşeme gibi SFG kullanılarak araştırılmaktadır gömülü polimer arayüzleri, protein ikincil yapıları ve interfacial su yapıları9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25,26.

Polimer yüzeyler ve arayüzler için, ince film örnekleri genellikle istenilen yüzeyleri veya arayüzleri elde etmek için spin-kaplama ile hazırlanır. Sorun, hazırlanan filmlerin iki arabiriminden gelen sinyal paraziti nedeniyle ortaya çıkar, bu da toplanan SFG spektrum27,28,29'unanalizinde rahatsızlık sağlar. Çoğu durumda, sadece tek bir arabirimden gelen titreşim sinyali, film/substrat veya film/diğer ortam, arzu edilir. Aslında, bu sorunun çözümü oldukça kolaydır, yani, deneysel arzu arayüzü ışık alanları maksimize etmek ve diğer arayüz ışık alanları en aza indirmek. Bu nedenle, Fresnel katsayıları veya yerel alan katsayıları ince film modeli ile hesaplanması ve deneysel sonuçlara göre doğrulanması gerekir3,9,10,11, 12,13,14,15,30.

Yukarıdaki arka plan göz önünde bulundurularak, temel bilimi moleküler düzeyden anlamak için bazı polimer ve biyolojik arayüzler araştırılabilir. Aşağıda, örnek olarak üç interfasiyal konu ele: probing poli (2-hidroksietil metakrilat) (PHEMA) yüzey ve substrat 9 ile gömülü arayüz,polistiren (PS) yüzeyinde ipek fibroin (SF) ikincil yapıların oluşumu ve model kısa zincirli oligonükleotid dubleks çevreleyen su yapıları16,21, Biz Nasıl SFG titreşimsi spektroskopi altta yatan bilim ile bağlantılı olarak interfacial moleküler düzeyde yapıları ortaya çıkarmak için yardımcı olacağını gösterecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SFG deneysel

  1. Bir Nd:YAG lazerdayalı ,~ 20 ps ve 50 Hz bir frekans ile temel bir 1064 nm Kiriş sağlayan ticari bir pikosecond SFG sistemi (Tablo Malzemeler) kullanın.
  2. İkinci ve üçüncü harmonik modülleri kullanarak temel 1064 nm ışını 532 nm'lik bir Kirişe ve 355 nm'lik Bir Kirişe dönüştürün. Optik parametrik nesil (OPG)/optik parametrik amplifikasyon (OPA)/ ile frekans aralığını 1000 ile 4000 cm-1 arasında değişen diğer giriş orta kızılötesi (IR) ışını doğrudan bir giriş ışık demeti olarak yönlendirin ve diğer giriş orta kızılötesi (IR) ışını oluşturun. fark frekans ı oluşturma (DFG) işlemi.
  3. İki giriş ışınının olay açılarını, yüzey normaline göre sırasıyla 53° (IR) ve 64° (görünür) olarak ayarlayın.
  4. Polimer interfacial yapıları (film/substrat arabirimi veya film/diğer orta arayüz) tespit etmek için ssp (s-polarize sum-frekans ışını, s-polarize görünür ışın ve p-polarize kızılötesi ışın) ve ppp polarizasyon kombinasyonlarını kullanın.
  5. İnterasiyal protein ikincil yapıları ve DNA'yı çevreleyen su yapılarını saptamak için ssp ve ppp'nin yanı sıra chiral spp ve psp polarizasyon kombinasyonları kullanılmıştır.
  6. Numunelerin zarar görmemesini sağlamak için kızılötesi ve görünür darbe enerjilerinin sırasıyla ~70 ve ~30 mJ olmasını kontrol edin. SFG prosesinin enerji seviyesi diyagramı ile şemaları Şekil1'de gösterilmiştir. Şekil 2 temiz odamızda SFG sistemini göstermektedir.

2. Fresnel katsayıları

  1. Burada tartışılan tüm deneyler için sağ açı prizmaları substrat olarak kullanın. Katı substrat üzerinde polimer film için iki arayüz vardır, yani, hava ve polimer / substrat arayüzü polimer yüzey. Her iki arabirimde de ters dönüş simetrisi bozulduğa göre her ikisi de SFG sinyalleri üretebilir. Bu nedenle, toplanan bir SFG spektrumbir müdahale biridir. Ancak, iki arayüzde yerel alan katsayıları veya Fresnel katsayıları ya olay açıları veya film kalınlığı bir seferde veya aynı anda31,32değiştirerek ayarlanabilir . Bu bize sadece bir arayüzsi SFG titreşim sinyali araştırmak için fırsat sağlar. Burada, CaF2 prizma phema film örnek9olarak alınmıştır.
  2. Şekil3'te gösterildiği gibi, alt Takip filmden üretilen SFG sinyallerini tespit etmek için sağ açılı prizma geometrisini kullanır. Yansıyan moddaki SFG çıkış yoğunluğu,
    Equation 1(1)
    etkili Equation 2 ikinci dereceden doğrusal olmayan duyarlılık tensörlerini gösterir.
    Equation 2prizma/polimer arabirimi, polimer/alt orta arabirimi (alt orta kısım gaz, sıvı veya katı içerir.) ve aşağıdaki denklemde gösterildiği gibi rezonans dışı arka plan olmak üzere üç bölümden oluşur.
    Equation 3(2)
    Burada alt orta hava, su ya da başka bir şey olabilir. F, yerel alan düzeltmesi için sorumlu ilgili Fresnel katsayısını temsil eder.
  3. Bu durumda Fresnel katsayılarını hesaplamak için ince film modeli uygulayın. Burada yalnızca kısa hesaplama yordamları sunulur.
    1. Prizma/polimer arabirimi için,
      Equation 4(3)
      Equation 5(4)
      Equation 6(5)
      Gösterilen her parametrenin anlamı aşağıda sunulmuştur.
      1. ωi ışın frekansını gösterir.
      2. tp ve tgenel iletim katsayılarını gösterir ve
        Equation 7(6)
        Equation 8(7)
      3. tp12 ve ts12 prizma/polimer arabiriminde ışık ışınının doğrusal iletim katsayılarını gösterir.
      4. rp23 ve rs23, polimer/orta arabirimdeki ışık ışınının doğrusal yansıma katsayılarını gösterir.
      5. α, polimer ince film boyunca yayıldığı için yansıtıcı bir Kiriş ile ikincil yansıtıcı ışını arasındaki faz farkını temsil eder ve daha sonra
        Equation 9(8)
      6. λ ışık Demeti dalga boyunu temsil eder ve d polimer film kalınlığıdır.
      7. Φ1 ve Φ2, sırasıyla prizma/polimer arabiriminde ve polimer/orta arabirimdeki olay açılarını temsil eder.
      8. n1 ve n2 sırasıyla prizma ve polimer filmin kırılma indeksini temsil eder.
      9. n12 prizma/polimer için polimer interfacial tabakalarının kırılma indeksini temsil eder.
    2. Polimer/orta arayüz için,
      Equation 10(9)
      Equation 11(10)
      Equation 12(11)
      1. Δ, iki arabirimdeki ışık elektrik alanlarının faz farkını temsil eder.
      2. Giriş ışınlarının darbe genişliği ~20 ps olduğundan, dağılım etkisiile ilişkili zaman gecikmesinden kaynaklanan hata ihmal edilebilir.
      3. Çıkış SFG için bu faz farkının ifadesi, giriş görünür ve giriş kızılötesi Kirişler ayrı ayrı yazılabilir
        Equation 13(12)
        Equation 14(13)
        Equation 15(14)
         
  4. Yukarıdaki tartışmadan, prizma-polimer film-orta (1-2-3) sistemi için, prizma/polimer ve polimer/orta arayüzler için toplam Fresnel katsayılarını aşağıdaki denklemler olarak, ssp ve ppp polarizasyon kombinasyonları için ifade edin . Tabii ki, her iki arayüz azimutally isotropic olarak kabul edilir.
    1. Prizma/polimer arabirimi için hem ssp hem de ppp polarizasyon kombinasyonları için toplam Fresnel katsayıları ifadeleri aşağıdaki gibi sunulmuştur.
      1. SSPiçin, denklem
        Equation 16(15)
      2. Ve pppiçin, denklem
        Equation 5(16)
        Equation 5(17)
        Equation 5(18)
        Equation 5(19)
         
      3. t10 ve t01 sırasıyla hava/prizma ve prizma/hava arabirimlerindeki doğrusal iletim katsayılarını gösterir.
    2. Polimer/orta arayüz için hem ssp hem de ppp polarizasyon kombinasyonları için toplam Fresnel katsayıları ifadeleri aşağıdaki gibi açıklanmıştır.
      1. SSPiçin, denklem
        Equation 21(20)
      2. pppiçin, denklemler
        Equation 5(21)
        Equation 5(22)
        Equation 5(23)
        Equation 5(24)
           
         
  5. Sıkıştırılmış modeli kullanarak Fresnel katsayıları hesaplandıktan sonra, Şekil4'te gösterildiği gibi, film kalınlığının bir fonksiyonu olarak çizin.
    NOT: Bu durumda, yaklaşık 150 nm olan diğer arabirimden ihmal edilebilir katkısı ile CaF2 prizma/PHEMA arabiriminden SFG sinyalini toplamak için bir kalınlık aralığı vardır. Benzer şekilde, CaF2 prizma/PHEMA arabiriminin ihmal edilebilir katkısı ile PHEMA/alt orta arabiriminin tespiti için uygun bir kalınlık seçilebilir.

3. Chiral SFG polarizasyon kombinasyonu

  1. Normal achiral arayüzü için, genellikle, topluluk ortalama33,34açısından C』v simetri kullanın. Ters simetrinin çalışması ile, sıfır olmayan ikinci dereceden doğrusal olmayan duyarlılık onsor bileşenleri, cxxz, cxzx, czxx, cyyz, cyzy, czyy ve czzz ( bir izotropik arayüz varsayılması halinde mevcut terimler daha da azaltılabilir, yani x ve y aynıdır). Ancak, chiral arayüzü için durum farklı olacaktır. Chiral arabirimi C simetrisi ile karşılanır, sadece dönme simetrisi işlemine izin verilir. Bu durumda, normal achiral terimlerin yanı sıra, daha ikinci dereceden doğrusal olmayan duyarlılıklar sıfırsız olacaktır, bu da chiral terimleri olarak adlandırılabilir, yani, czyx, czxy ve cyzx elektronik olmayan dikkate alınarak Rezonans. Bu nedenle, pspkullanılarak , pps ve spp polarizasyon kombinasyonları, chiral SFG spektrumları toplanabilir33,34.

4. Örnek hazırlama

  1. PHEMA filminin hazırlanması
    1. Çözeltiyi sırasıyla %2 wt ve %4 wt ile hazırlamak için sususuz etanoldeki PHEMA tozunu (Bkz. MalzemeTablosu) çözün.
    2. PHEMA filmleri birikintisinden önce, CaF 2'nin dik açılı prizmalarını önce toluen çözücüye batırın ve ardından etanol ve ultra saf suyla yıkayın (18.2 MΩ·cm).
    3. Daha sonra, plazma temizleyicisi ile olası organik kirleticileri gidermek için substratları (CaF2 dik açı prizmalar) oksijen plazmasına maruz bırakınız (bkz. MalzemelerTablosu).
      1. Önce plazma temizleyicisini açın ve yüzeyleri içine koyun.
      2. Sonra süpürge vakumlamak için elektrikli pompa yı açın. Oksijeni içine sok.
      3. Son olarak temizlik için 4 dakika ayarlayın. Bundan sonra, sıralı PHEMA film hazırlığı için temiz yüzeyleri koruyun.
      4. Daha sonra Bir spin-coater tarafından CaF2 prizmalar üzerinde PHEMA filmleri hazırlamak (Malzeme Tablosubakınız). Film kalınlıklarını çözelti konsantrasyonuna ve dönüş hızına göre ayarlayın.
        1. Spin-coater emme disküzerinde CaF2 prizma immobilize.
        2. 1 dk için 1.500 rpm temiz yüzeyler üzerine hazırlanan PHEMA çözeltisi bir damla damla (film kalınlığı 100 nm için% 2 wt ve 200 nm için 4 wt).
      5. Anneal tüm hazırlanan PHEMA filmleri bir vakum fırında 80 °C gecede.
  2. İpek fibroin (SF) hazırlanması
    NOT: Kaplan ve ark.35 tarafından önerilen protokol kabul edilmiştir.
    1. Kaynayan sodyum karbonat (Na2CO3, 0,02 M) sulu çözeltiye (3 L) 30 dk. Lifli SF'yi temiz bir kapta çıkarın.
    2. Elde edilen fibröz SF'yi, sericin moleküllerini çıkarmak ve lifli numunede sadece SF moleküllerini bırakmak için üç kez karıştırarak deiyonize su ile yıkayın.
    3. Lifli SF örneğini bir gecede 60 °C'de bir vakum fırınında kurutun.
    4. Daha sonra, degummed fibröz SF numunesini lityum bromür (LiBr, 9,3 M) sulu çözeltide eritin (1 g SF, LiBr çözeltisinin ~4 mL'sinde çözüldü.) ve karıştırma altında 2 saat boyunca 60 °C'de kuluçkaya yatırın.
    5. Çözünmüş LiBr'i çıkarmak için 3 gün boyunca deiyonize suya (3.500 Da diyaliz torbası) karşı SF çözeltisini diyalize çevirin. Yeni deiyonize suyu her gün üç kez değiştirin. Son olarak, daha sonraki SFG deneyleri için işlenmiş SF çözeltisini 4 °C'de saklayın.
  3. Kısa zincirli oligonükleotid dupleks hazırlanması
    1. Tek iplikli oligonükleotid örneğini, kolesterol-trietilen glikol (Chol-TEG) (5'-GCTTCCGAAGGTCGA-3') ile modifiye edilmiş tek iplikli oligonükleotid örneğini ticari bir şirketten (bkz. Malzemeler Tablosu)ve tamamlayıcı olandan sipariş edin. Her bir iplikçik için, numune tozundan 10 nmol'u 0,5 ml ultra saf suda çözün. Daha sonra dupleks oligonükleotid çözeltisi (10 nmol/mL) oluşturmak için karıştırın.
    2. Mix 2 mg 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DPPC) ve 2 mg deuterated DPPC (d-DPPC) ve lipid çözeltisi hazırlamak için kloroform 1 mL onları eritin.
    3. DPPC & d-DPPC monolayer'ın Langmuir−Blodgett (LB) oluk tarafından hazırlanması
      1. Lb çukurunun sulu ortamına dik olarak batırılmış bir prizma yüzü olan ev yapımı bir numune tutucuya sağ açılı CaF2 prizmasını takın.
      2. Daha sonra, yüzey basıncı 34 mN·m−1'inaltında belirli bir değere ulaşana kadar su yüzeyine daha önce hazırlanmış karışık lipid çözeltisini enjekte edin.
      3. Yüzey basınç seviyeleri düştükten sonra, 34 mN·m−1 yüzey basıncına ulaşılıncaya kadar lipid monotabakasını 5 mm/dk oranında sıkıştırmak için iki Teflon bariyer kullanın.
      4. Prizmayı bir lipit monolayer ile dikey olarak 1 mm/dk hızla sudan kaldırın.
    4. Diğer lipid monotabakasının hazırlanması
      1. Dupleks oligonükleotid ve lipid moleküllerinin hidrofobik etkileşim (kolesterol ve lipid alkil zinciri) ile biraraya gelebilmek için, dupleks oligonükleotid çözeltisini 1:100 molar oranında lipid çözeltisi ile karıştırın (oligonükleotit lipid).
      2. 34 mN·m−1 yüzey basıncına ulaşılıncaya kadar karışık lipid ve dupleks oligonükleotid çözeltisini ev yapımı teflon kapta su yüzeyine enjekte edin.
    5. Son olarak, sfg ölçümü için son örneği oluşturmak için su yüzeyine eklenen dupleks oligonükleotidler ile lipid monotabakası ile temas prizma nın alt kısmında lipid monolayer koyun.
  4. Lorentz denklemi
    1. Belirli bir titreşim modu için titreşim bilgilerini ayıklamak için SFG spektrumu sığdırmak için Lorentz denklemini kullanın.
      Equation 26(25)
      Equation 27 qth titreşim modunun yoğunluğunu temsil Equation 28 eder, rezonans frekansını temsil eder, Equation 29 yarım genişliği yarım Equation 30 maksimum (HWHM) gösterir ve olayın tarama frekansını temsil eder IR ışını.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokol Bölümü Fresnel katsayısı bölümünde, teorik olarak, tek bir arabirimi aynı anda seçici olarak algılamanın mümkün olduğunu gösterdik. Burada, deneysel olarak, şekil 5 ve Şekil6'da gösterildiği gibi, bu metodolojinin temelde doğru olduğunu doğruladık.

Şekil 5 ~ 150 nm PHEMA hidrojel film ile su intrusion sonra gömülü interfacial PHEMA yapısını gösterir ve Şekil 6 ~ 430 nm PHEMA hidrojel film ile su yüzey yapısını gösterir. A ve B panelleri her iki rakam için sırasıyla CH ve CO aralıklarına karşılık gelir. Gömülü arabirimde, gözlemlenen tüm titreşim zirveleri keskin ve berraktır. Bunun nedeni, CaF2 substratpürüzsüz ve PHEMA molekülleri tarafından nüfuz edilemez, keskin bir CaF2/ PHEMA arayüzü yol. Ancak, yüzeyde, su molekülleri PHEMA ile etkileşim emebileceği ve toplu içine yayılabilir, Çünkü PHEMA / su arayüzü gömülü biri kadar keskin olmaz. Bu nedenle, bu iki arayüz için farklı spektral profiller gözlenmektedir.

Figure 1
Şekil 1 . SFG sürecinin şematik gösterisi (sol panel) enerji geçiş diyagramı (sağ panel). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2 . Laboratuardaki SFG sistemi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3 . Şema, SFG deneyi için prizmadaki ışık yayılma yolunu gösterir. 0, 1, 2 ve 3 sayıları sırasıyla hava, prizma, PHEMA ve alt ortamı (alt orta hava, katı veya sıvı olabilir.) temsil eder. Li, X'ten üretilir; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. Makromoleküller 2016, 49, 3116−3125 (ref 9). Telif Hakkı 2016 American Chemical Society. Bu rakam [9] den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4 . SSP ve ppp polarizasyon kombinasyonları için sudaki prizma geometrisi için film kalınlığının bir fonksiyonu olarak hesaplanan Fresnel katsayıları. A1'den C1'e kadar olan paneller CH aralığına, A2'den C2'ye kadar olan paneller CO aralığına karşılık gelir. Li, X'ten üretilir; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. Makromoleküller 2016, 49, 3116−3125 (ref 9). Telif Hakkı 2016 American Chemical Society. Bu rakam [9] den değiştirilmiştir.

Figure 5
Şekil 5 . suya maruz kaldıktan sonra CaF2/PHEMA arabiriminin ssp ve ppp spektrumları. C: CH ve OH aralığı; B: CO aralığı. Siyah eğriler Lorentz denklemi kullanılarak donatılmış sonuçlardır. Spektrumlar netlik için dengelendi. Li, X'ten üretilir; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. Makromoleküller 2016, 49, 3116−3125 (ref 9). Telif Hakkı 2016 American Chemical Society. Bu rakam [9] den değiştirilmiştir.

Figure 6
Şekil 6 . CaF2 prizminde PHEMA yüzeyinin ssp ve ppp spektrumları. C: CH ve OH aralığı; B: CO aralığı. Örnek suyla temas almıştır. Siyah eğriler Lorentz denklemi kullanılarak donatılmış sonuçlardır. Spektrumlar netlik için dengelendi. Li, X'ten üretilir; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. Makromoleküller 2016, 49, 3116−3125 (ref 9). Telif Hakkı 2016 American Chemical Society. Bu rakam [9] den değiştirilmiştir.

Figure 7
Şekil 7 . Normalleştirilmiş chiral (psp) SFG spektrumları amide I (Panel A) ve N-H (Panel B) aralıkları ps/SF çözeltisi için (90 mg/mL) metanol eklemeden önce ve sonra arabirimler. Noktadeneysel veriler ve düz çizgiler monte eğrileri vardır. Spektrumlar netlik için dengelendi. Li, X'ten üretilir; Deng, G.; Ma, L.; Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 9453−9459 (hakem 16). Telif Hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam [16]'dan değiştirilmiştir.

Figure 8
Şekil 8 . Normalleştirilmiş chiral (psp) SFG spektrumları amide I (Panel A) ve N-H (Panel B) aralıkları ps/SF çözeltisi (1 mg/mL) arabirimi metanoleklemeden önce ve sonra . Nokta deneysel veriler ve düz çizgiler monte eğrileri (mavi) vardır. Spektrumlar netlik için dengelendi. Li, X'ten üretilir; Deng, G.; Ma, L.; Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 9453−9459 (hakem 16). Telif Hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam [16]'dan değiştirilmiştir.

Figure 9
Şekil 9 . Achiral (ssp, A) ve chiral(spp, B) Farklı konsantrasyonlarda (0.6 mM ile 6 mM) Ca2 + çözeltileri ile temas dubleks oligonükleotid demirlemiş lipid çift katmanlı için SFG spektrum. Veri noktaları yaklaşık Lorentz denklemi kullanılarak monte edildi. Ca2+ konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak su titreşim sinyalleri için entegre alanın değişimi sunulmuştur (ssp, C; spp, D). Tüm spektrumlar normalleştirildi ve netlik için dengelendi. Li, X'ten üretilir; Ma, L.; Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 14774−14779 (ref 21). Telif Hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam [21]'den değiştirilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yapısal bilgileri moleküler düzeyden araştırmak için SFG'nin, katı/katı, katı/ katı gibi çeşitli arayüzleri incelemek için uygulanabilen doğal avantajları (yani, monolayer veya alt-monolayer duyarlılığı ve interfacial seçicilik) vardır. sıvı, katı/gaz, sıvı/gaz, sıvı/sıvı arayüzleri. Ekipman bakımı ve optik hizalama hala zaman alıcı olmasına rağmen, ödeme yüzeylerde ve arayüzlerde ayrıntılı moleküler düzeyde bilgi elde edilebilir önemli.

Probing Poly(2-hidroksietil metakrilat) Çözeltide Yüzey ve Gömülü arayüz: Yukarıda da gösterdiğimiz gibi, ışık alanı katsayıları ayarlanabilir. Bunu deneysel olarak doğrulayabiliriz. CaF2 substrat yüzeyi pürüzsüz olduğundan ve PHEMA molekülleri tarafından nüfuz edilemez, çünkü substrat ile gömülü arayüzü, bu arayüz keskin bir tanesidir. Ancak, su ile yüzeyde, su molekülleri PHEMA molekülleri ile etkileşim emilebilir ve toplu içine yayılır. Bu nedenle bu arayüz bulanık ve gömülü bir kadar keskin değil. Bu nedenle, bu iki arayüz için farklı SFG spektral profiller gözlenecektir. Deneysel SFG verilerimiz bunu kanıtlayarak gömülü arabirimi yüzeyle veya çözeltideki yüzeyle seçici olarak inceleyerek inceleyebilme yeteneğini gösterdi.

İpek Fibroin Sekonder Yapıların Oluşumunda Zincirler Arası Etkileşim veya Hapsetme Etkisi: Önemli bir faktör kritik çakışan konsantrasyondur (C*). SF için C* ~1.8 mg/mL'dir. Deneysel olarak, ~90 mg/mL (C*'nin üzerinde) SF çözeltisi için, Şekil7'de gösterildiği gibi indükleyen bir ajan-metanol eklenmedikçe SF çözeltisi/PS arabiriminde chiral(psp)sf titreşim sinyalleri saptanmadı. Ancak, ~1 mg/mL (C*altında) SF çözeltisi için, chiral(psp)SFG titreşim sinyalleri, Şekil8'de gösterildiği gibi, sf'de sıralanmış ikincil yapıların zaten oluştuğunu gösteren metanol eklenmeden doğrudan tespit edilebilir çözüm/PS arabirimi. C* zincirleme çakışma için bir eşik konsantrasyonu olduğundan, zincir-zincir etkileşimi veya mekansal hapsi, arayüzdeki SF ikincil yapıların oluşumu için burada düzenleyici bir faktör olarak alınmalıdır.

Su Moleküler Yapılar Çevreleyen Kısa zincirli Oligonükleotid Dubleks: Su çözeltisindeki kısa zincirli oligonükleotid dubleks için, chiral su SFG titreşim sinyalleri minör oluktaki chiral omurganın hidrasyon tabakasına karşılık gelir . Achiral su SFG titreşim sinyalleri çoğunlukla oligonükleotid dubleks zinciri ve bilayer çevreleyen su tabakası karşılık (su tabakasının chiral omurga da katkıda bulunur)33. Şekil9'da gösterildiği gibi, 0,6 ila 6 mM arasında bir Ca2+ konsantrasyon aralığında, chiral su titreşim sinyalleri için Ca2+ konsantrasyonu açısından belirgin bir değişiklik olmadığını bulduk. Ancak Ca2+ konsantrasyonu değiştiğinde achiral su titreşim sinyalleri güçlü bir şekilde etkilenmiştir. Bu, oligonükleotid dublekse sıkıca bağlanan su tabakasının chiral omurgasının normal biyolojik durumda oligonükleotiti Ca2+ iyonlarından koruyabileceğini gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Açıklayacak bir şeyimiz yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, Çin Temel Araştırma Devlet Anahtar Geliştirme Programı (2017YFA0700500) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (21574020) tarafından desteklenmiştir. Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumları (PAPD) ve Deneysel Biyomedikal Mühendisliği Ulusal Gösteri Merkezi Öncelikli Akademik Program Geliştirme tarafından finanse edilen bir proje olan Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları Eğitim (Güneydoğu Üniversitesi) de büyük beğeni topladı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)  Avanti Polar Lipids, Inc. 850355P-1g
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 100092680 ≥99.7%
CaF2 prism Chengdu YaSi Optoelectronics Co., Ltd.
Calcium chloride anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10005817 ≥96.0%
deuterated DPPC (d-DPPC) Avanti Polar Lipids, Inc. 860345P-100mg
Electromagnetic oven Zhejiang Supor Co., Ltd C21-SDHCB37
Langmuir-Blodgett (LB) trough KSV NIMA Co., Ltd. KN 2003
Lithium bromide anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 20056926
Milli-Q synthesis system Millipore Ultrapure water
Plasma cleaner Chengdu Mingheng Science&Technology Co., Ltd PDC-MG Oxygen plasma cleaning
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) Sigma-Aldrich Co., LLC. 192066 MSDS Mw = 300 000
Polystyrene Sigma-Aldrich Co., LLC. 330345 MSDS Mw = 48 kDa and Mn = 47 kDa
Silk cocoons From Bombyx mori
Single complementary strand of oligonucleotide Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. H03596 5'-CGAAGGCTTCCAGCT-3'
Single strand of oligonucleotide Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. H04936  3¢-end modified by cholesterol-triethylene glycol(Chol-TEG) (5¢-GCTTCCGAAGGTCGA-3¢)
Sodium carbonate anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10019260 ≥99.8%
Spin-coater Institute of Microelectronics of the Chinese Academy of Sciences KW-4A For the prepartion of ploymer films 
Step profiler Veeco DEKTAK 150 For the measurement of film thickness
Sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy system EKSPLA A commercial picosecond SFG system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shen, Y. R. Optical Second Harmonic Generation at Interfaces. Annual Review of Physical Chemistry. 40, 327-350 (1989).
  2. Shen, Y. R. Surface properties probed by second-harmonic and sum-frequency generation. Nature. 337, 519-525 (1989).
  3. Lu, X., et al. Studying Polymer Surfaces and Interfaces with Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (1), 466-489 (2017).
  4. Chen, X., Clarke, M. L., Wang, J., Chen, Z. Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy Studies on Molecular Conformation and Orientation of Biological Molecules at Interfaces. International Journal of Modern Physics B. 19 (4), 691-713 (2005).
  5. Eisenthal, K. B. Liquid Interfaces Probed by Second-Harmonic and Sum-Frequency Spectroscopy. Chemical Reviews. 96 (4), 1343-1360 (1996).
  6. Richmond, G. L. Molcular Bonding and Interactions at Aqueous Surfaces as Probed by Vibrational Sum Frequency Spectroscopy. Chemical Reviews. 102 (8), 2693-2724 (2002).
  7. Wang, H., Gan, W., Lu, R., Rao, Y., Wu, B. Quantitative spectral and orientational analysis in surface sum frequency generation vibrational spectroscopy(SFG-VS). International Reviews in Physical Chemistry. 24 (2), 191-256 (2007).
  8. Shultz, M. J., Schnitzer, C., Simonelli, D., Baldelli, S. Sum frequency generation spectroscopy of the aqueous interface: Ionic and soluble molecular solutions. International Reviews in Physical Chemistry. 19 (1), 123-153 (2010).
  9. Li, X., et al. Detecting Surface Hydration of Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) in Solution in situ. Macromolecules. 49, 3116-3125 (2016).
  10. Li, X., Lu, X. Evolution of Irreversibly Absorbed Layer Promotes Dewetting of Polystyrene Film on Sapphire. Macromolecules. 51, 6653-6660 (2018).
  11. Lu, X., Spanninga, S. A., Kristalyn, C. B., Chen, Z. Surface Orientation of Phenyl Groups in Poly(sodium 4-styrenesulfonate) and in Poly(sodium 4-styrenesulfonate): Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) Mixture Examined by Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Langmuir. 26 (17), 14231-14235 (2010).
  12. Lu, X., Clarke, M. L., Li, D., Wang, X., Chen, Z. A Sum Frequency Generation Vibrational Study of the Interference Effect in Poly(n-butyl methacrylate) Thin Films Sandwiched between Silica and Water. Journal of Physical Chemistry C. 115, 13759-13767 (2011).
  13. Lu, X., et al. Directly Probing Molecular Ordering at the Buried Polymer/Metal Interface 2: Using P-Polarized Input Beams. Macromolecules. 45, 6087-6094 (2012).
  14. Lu, X., Myers, J. N., Chen, Z. Molecular Ordering of Phenyl Groups at the Buried Polystyrene/Metal Interface. Langmuir. 30, 9418-9422 (2014).
  15. Li, B., Lu, X., Ma, Y., Han, X., Chen, Z. Method to Probe Glass Transition Temperatures of Polymer Thin Films. ACS Macro Letters. 4, 548-551 (2015).
  16. Li, X., Deng, G., Ma, L., Lu, X. Interchain Overlap Affects Formation of Silk Fibroin Secondary Structure on Hydrophobic Polystyrene Surface Detected via Achiral/Chiral Sum Frequency Generation. Langmuir. 34, 9453-9459 (2018).
  17. Kai, S., Li, X., Li, B., Han, X., Lu, X. Calcium-dependent hydrolysis of supported planar lipids was triggered by honey bee venom phospholipase A2 with the right orientation at the interface. Physical Chemistry Chemical Physics. 20, 63-67 (2018).
  18. Wang, J., Buck, S., Chen, Z. Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy Studies on Protein Adsorption. Journal of Physical Chemistry B. 106, 11666-11672 (2002).
  19. Wang, J., et al. Detection of Amide I Signals of Interfacial Proteins in Situ Using SFG. Journal of American Chemical Society. 125, 9914-9915 (2003).
  20. Nguyen, K. T., et al. Probing the Spontaneous Membrane Insertion of a Tall-Anchored Membrane Protein by Sum Frequency Generation Spectroscopy. Journal of American Chemistry Society. 132, 15112-15115 (2010).
  21. Li, X., Ma, L., Lu, X. Calcium Ions Affect Water Molecular Structures Surrounding an Oligonucleotide Duplex as Revealed by Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Langmuir. , (2018).
  22. Sartenaer, Y., et al. Sum-frequency generation spectroscopy of DNA monolayers. Biosensors & Bioelectronics. 22, 2179-2183 (2007).
  23. Asanuma, H., Noguchi, H., Uosaki, K., Yu, H. Metal Cation-induced Deformation of DNA Self-Assembled Monolayers on Silicon: Vibrational Sum Frequency Generation Spectroscopy. Journal of American Chemistry Society. 130, 8016-8022 (2008).
  24. Howell, C., Schmidt, R., Kurz, V., Koelsch, P. Sum-frequency-generation spectroscopy of DNA films in air and aqueous environments. Biointerphases. 3 (3), FC47 (2008).
  25. Walter, S. R., Geiger, F. M. DNA on Stage: Showcasing Oligonucleotides at Surfaces and Interfaces with Second Harmonic and Vibrational Sum Frequency Generation. Journal of Physical Chemistry Letters. 1, 9-15 (2010).
  26. Li, Z., Weeraman, C., Azam, M. S., Osman, E., Gibbs-Davis, J. The thermal reorganization of DNA immobilized at the silica/buffer interface: a vibrational sum frequency generation investigation. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 12452-12457 (2015).
  27. Lambert, A. G., Neivandt, D. J., Briggs, A. M., Usadi, E. W., Davies, P. B. Interference Effects in Sum Frequency Spectra from Monolayers on Composite Dielectric/Metal Substrates. Journal of Physical Chemistry B. 106, 5461-5469 (2002).
  28. Tong, Y., et al. Interference effects in the sum frequency generation spectra of thin organic films. I. Theoretical modeling and simulation. Journal of Chemical Physics. 133, 034704 (2010).
  29. McGall, S. J., Davies, P. B., Neivandt, D. J. Interference Effects in Sum Frequency Vibrational Spectra of Thin Polymer Films: An Experimental and Modeling Investigation. Journal of Physical Chemistry B. 108, 16030-16039 (2004).
  30. Li, B., et al. Interfacial Fresnel Coefficients and Molecular Structures of Model Cell Membranes: From a Lipid Monolayer to a Lipid Bilayer. Journal of Physical Chemistry C. 118, 28631-28639 (2014).
  31. Zhou, J., Anim-Danso, E., Zhang, Y., Zhou, Y., Dhinojwala, A. Interfacial Water at Polyurethane-Sapphire Interface. Langmuir. 31 (45), 12401-12407 (2015).
  32. Gautam, K. S., et al. Molecular Structure of Polystyrene at Air/Polymer and Solid/Polymer Interfaces. Physical Review Letters. 85 (18), 3854-3857 (2000).
  33. Yan, E. Y., Fu, L., Wang, Z., Liu, W. Biological Macromolecules at Interfaces Probed by Chiral Vibrational Sum Frequency Generation Spectroscopy. Chemical Reviews. 114, 8471-8498 (2014).
  34. Belkin, M. A., Kulakov, T. A., Ernst, K. H., Yan, L., Shen, Y. R. Sum-Frequency Vibrational Spectroscopy on Chiral Liquids: A Novel Technique to Probe Molecular Chirality. Physical Review Letters. 85, 4474 (2000).
  35. Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6, 1612-1631 (2011).

Tags

Biyokimya Sayı 150 Analitik Tanı salagve Tedavi Teknikleri ve Ekipmanları Araştırma Teknikleri Fenomenler ve Süreçler Fiziksel Olgular Kimya ve Malzemeler Kimya ve Malzemeler (Genel) İnorganik Organik ve Fiziksel Kimya Fizik Atom ve Moleküler Fizik Optik SFG Fresnel katsayıları moleküllerarası moleküler seviye yapılar polimerler biyomakromoleküller chiral yapısı mekansal hapsi
Toplam Frekans Üretimi TitreşimSpektroskopisi Ile Ortaya Çıkan Polimerlerin ve Biyomakromoleküllerin İnterasfer Moleküler Düzey Yapıları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, X., Ma, L., Lu, X. Interfacial… More

Li, X., Ma, L., Lu, X. Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. J. Vis. Exp. (150), e59380, doi:10.3791/59380 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter