Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bireysel Autoreactive Germinal merkezleri Photoactivation otoimmünite, karışık Chimeric modeli tarafından sorguya

Published: April 11, 2019 doi: 10.3791/59397
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedicine, Aarhus University

Summary

Bu iletişim kuralı hangi autoreactive photoactivatable yeşil flüoresan protein (PA-GFP) muhabir lenfositleri taşımak spontan otoimmün germinal merkezleri ile karışık fare kemik iliği chimeras nesil açıklar. Bu hücresel aşağı akım moleküler ve fonksiyonel analizleri kurcalayarak konumda bağlantı olanağı sağlar.

Abstract

Otoimmün hastalıklar önemli sağlık yük mevcut. Geliştirme ve Otoimmün hastalık ilerlemesi ile ilgili temel soru cevapsız kalır. Bir anlayışımız gelişmeler temel hastalığı mekanizmaları ve hücre dinamiği için hücre alt kümeleri aşağı akım moleküler veya fonksiyonel analizleri ile microanatomical konumunu hassas kaplin gereklidir; geleneksel olarak elde etmek zor oldu bir hedef. İstikrarlı photoactivatable biyolojik fluorophores ve kendi entegrasyon muhabir suşları içine son zamanlarda kesin microanatomical etiketleme ve fare modellerinde hücresel alt kümeleri izlenmesini sağladı. Burada, biz nasıl autoreactive lenfosit tek germinal merkezleri üzerinden analiz yeteneği otoimmünite, yeni anlayışlar sağlamak için yardımcı otoimmünite roman chimeric modeli photoactivatable gazeteci örnek olarak kullanarak tarif . Biz oluşturmak için bir yordam chimeras spontan autoreactive ile photoactivatable yeşil flüoresan protein muhabir taşıyan lenfositler tarafından doldurulan germinal merkezleri karışık göstermek. İçinde vivo etiketleme stratejileri kullanarak, tek germinal merkezleri explanted lenfoid doku ve onların hücresel bileşenlerinin photoactivated İki fotonlu mikroskobu tarafından görüntülenmeyecektir. Photoactivated lenfositler tek germinal merkezleri dan sonra analiz edilebilir veya akış cytometrically, tek hücreler olarak veya toplu olarak sıralanmış ve ek karşıdan akış moleküler ve fonksiyonel değerlendirmeler için tabi olabilir. Kemik iliği chimeras ve photoactivation yordam oluşturma yordamı Ayrıca bulaşıcı hastalıklar çalışmalarda geniş uygulama bulabilirsiniz, ancak bu yaklaşım otoimmünite alanda yenilenmiş anlayışlar sağlamak için doğrudan uygulanabilir ve Tümörün metastaz.

Introduction

Otoimmün hastalık insidansı hızlı son yıllarda, özellikle Batı toplumlarında arttı. Bugün, otoimmün hastalığı sırada üçüncü morbidite ve mortalite Batı dünyasının1' deki en yaygın nedenleri listesi üzerinde. Geliştirme ve Otoimmün hastalık ilerlemesi ile ilgili temel soru cevapsız kalır. Bir anlayışımız gelişmeler temel hastalığı mekanizmaları ve hücre dinamiği için hücre alt kümeleri aşağı akım moleküler veya fonksiyonel analizleri ile microanatomical konumunu hassas kaplin gereklidir. Son on yılda istikrarlı photoconvertible, photoactivatable veya photoswitchable biyolojik fluorophores ve kendi entegrasyon muhabir suşları içine bir dizi geliştirme kesin microanatomical etiketleme ve hücresel izlenmesini sağladı fare modellerinde alt kümeleri.

Kaede, taşlı mercan kaynaklanan bir photoconvertible floresan protein geri dönüşü olmayan yeşil Floresans maruz Menekşe veya ultraviyole ışık2üzerine kırmızı Floresans için photoconversion uğrar. Başlangıçta bireysel hücrelerin organotypic beyin dilimler3gelişmekte olan dinamik davranış izleyin için istihdam, çakma fare daha sonra hücresel hareketi içinde vivo izleme izin bir Kaede ve sistem nesil analizleri için uygulanan bağışıklık hücre göç için ve lenf düğümleri4. Bu yaklaşım daha sonra ikinci nesil muhabir5ile rafine. Benzer bir muhabir Dendra6son zamanlarda lenf nodu Metastazlari vivo7izlemek için kullanılan,'dır.

Geliştirilen ilk photoactivatable protein dalga boyu bölgesinde çok düşük bir Absorbans için önde gelen 450 550 nm8bir tek nokta mutasyon (T203H), ile tasarlanmış bir yeşil flüoresan protein (GFP) olduğunu. Mor ışık tarafından photoactivation sonra bu photoactivatable yeşil flüoresan protein (PA-GFP) ise emme en ~ 400 üzerinden geçer ~ 500 nm, yaklaşık bir 100-fold yoğunluk verimli artırmak 488 bir dalga boyu ile heyecanlı zaman nm. Transgenik fareler hematopoetik hücrelerin tümünü PA-GFP hızlı nesil girebilir, ilk kez, anatomik olarak tanımlanmış aydınlık ve karanlık bölgelerinde B hücre seçimini germinal Merkez9derinlemesine analiz.

Photoactivation floresan bir devlet olmayan floresan durumundan geri dönüşü olmayan bir dönüştürme ve photoconversion bir dalga boyu tek yönlü bir geçiş diğerine ise photoswitchable proteinler koşulların her ikisi de10 arasında mekik edebiliyoruz . Bu ikinci kapasite son zamanlarda protein etkinliği11optik kontrol mühendisi harnessed.

PA-GFP muhabir kullanmak, biz son zamanlarda tek germinal merkezleri, spontan lupus benzeri otoimmünite12yeni bir modeli B hücre kapsayacağını karakterize. Bu model 1 ölçü ilik bir autoreactive B hücre reseptör knock-2 parça kemik iliği herhangi ile birlikte içinde ribonuclear-protein kompleksleri (564Igi13,14) için özgüllük ile yataklık ile karışık chimeras dayanır istenen donör. Yaklaşık 6 hafta sonrası sulandırma homeostatik koşullar içinde spontan hangi autoreactive germinal merkezleri dalak ve lenf bezleri Kutanöz mevcut elde edilir. Özellikle, germinal B hücre popülasyonu neredeyse sadece merkezidir (~ %95) Sigara 564Igi yuvası türetilmiş hücre oluşur ve bu vahşi türü türetilen B hücreleri autoreactive haline gelmiştir. Bu nedenle, model autoreactive germinal Merkez B hücreleri çeşitli transgenes, knock-çıkışları ve gazetecilere kullanarak analiz için bir 'Tak ve Kullan' yaklaşım sağlar. Burada, PA-GFP muhabir taşıyan lenfositler tarafından doldurulan spontan autoreactive germinal merkezleri ile karışık chimeras oluşturma yordamı açıklanmaktadır. İçinde vivo etiketleme stratejileri kullanarak, tek germinal merkezleri explanted lenfoid doku ve iki fotonlu mikroskop kullanarak onların hücresel bileşenlerinin photoactivated görselleştirildiği. Photoactivated lenfosit tek germinal merkezleri üzerinden daha sonra Akış Sitometresi tarafından analiz veya fluorochrome aktif hücre tarafından (FACS) sıralama ve saklanabilir ek karşıdan akış moleküler ve fonksiyonel değerlendirmeler için tabi. Autoreactive lenfosit tek germinal merkezleri üzerinden analiz yeteneği doğrudan otoimmünite alanda yenilenmiş anlayışlar sağlamak için uygulanabilir ama teknikleri ve yaklaşımlar açıklanan ilgili uygulamalar çalışmalarda Ayrıca bulabilirsiniz bulaşıcı hastalıklar ve tümörün metastaz.

Protocol

Tüm hayvan kullanımı Avrupa toplum kuralları için standartlarla uyumlu ve Danimarka hayvan araştırma Müfettişliği (2017-15-0201-01348) tarafından kabul edildi.

1. genel fare yetiştiriciliği ve arabellekleri ve araçları hazırlanması

  1. Ev faresi çizgiler standart esaslarına göre Sağlık durumunun periyodik izleme ile belirli patojen ücretsiz (SPF) koşullar altında.
  2. İsteğe bağlı: spontan germinal merkezleri tarafından izlenen adventif enfeksiyonlar nedeniyle saf farelerde yokluğu doğrulayın. Bu ayirt mikroskobu (germinal Merkez yapıların varlığı) tarafından yapılabilir veya Akış Sitometresi (frekans germinal Merkez B hücre) yukarıda açıklanan12olarak.
    Not: Her iki kadın ya da erkek-ebilmek var olmak kullanılmış. Genellikle bir uyumsuzluk seks teorik olarak doğru erkek Y-antijen alloreactivity kadın alıcıları/bağış15tarafından yol açabilir gibi seks maç bağış ve alıcıların, ideal budur.
  3. Kullanım CD45.1 alıcılar (B6. SJL -Ptprcbir Pepcb/BoyJ), yaklaşık 6-10 hafta-in yaş. 564Igi kullanın (B6. Cg-Ightm1 (Igh564) TikIgktm1 (Igk564) Tik/J) ve PA-GFP (6-12 hafta-in yaş, B6.Cg-Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J) bağış.
  4. Cerrahi alet (düz iyi makas ve Dumont forseps #5 ve #7) tarafından ısıyla sterilize rutin sterilizasyon esaslarına göre onları.
  5. Kemik iliği (BM) arabelleği içeren fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS), %2 Fetal sığır Serum (FBS), 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) pH 7.4 500 mL hazırlayın. BM arabellek hazırlamak için ısı inaktive (1 saat içinde tamamlayıcı devre dışı bırakabilirsiniz için 56 ° C su banyosu) 10 mL ekleyin FBS ve 1,25 mL (pH 7.4 düzeltilmiş) 400 mM EDTA çözeltisi PBS, pH 7,4 ve mix iyi 500 ml. 0.2 µm filtre kabı kullanarak arabellek filtre.
  6. Kırmızı kan hücre (RBC) lizis arabellek (155 mM NH4Cl, 12 mM NaHCO3, 0,1 mM EDTA) 10 mL reaktif sınıf su ile toplam hacminin 10 ml 10 x stokunun 1 mL sulandrarak hazırlayın. PBS 50 mL 5 mM EDTA, pH 7.4 ile hazırlayın.

2. karışık kemik iliği chimeras kurulması

  1. Işınlama alıcıların (0 gün)
    1. CD45.1 kemik iliği alıcılar bir uygun ışınlama kapsayıcısına getirin ve 1100 ile ışınlatayım gama irradiator Rad.
      Not: Alternatif ışınlama kaynakları kullanılabilir. Ne olursa olsun kaynak, doz/zamanlama maksimal myeloablative etkisi en az teminat doku hasarı ile hayvanlar için verim için optimize edilmiş olması gerekiyor.
    2. Antibiyotik su (1 mg sulfadiazin ve trimetoprim/mL içme suyu 0.2 mg) ad libitum yerleştirin.
  2. Ayıklama kemik (gün 1)
    1. %4 isoflurane havada, sürekli akış tarafından 564Igi kemik iliği bağış anestezi ve servikal çıkığı tarafından ötenazi. Etanol ile bağış aşağı sprey ve steril cerrahi yastıkları akışı başlıklı üzerine koyun. Steril koşullarda, steril tamponlar ve ekipmanlar kullanarak Bakımı çalışmaya devam edin.
    2. Femur ve tibia ayıklamak için ilk bileklerinden bir kesi yapmak ve yukarı doğru düz iyi makas kullanarak kalça sonuna kadar genişletme. Ağır bir forseps veya başparmak ve işaret parmakları kullanarak, cilt ve vücut doğru bacak kapalı çekin. Benzer şekilde cildi aşağı ve ayak uzakta çekin.
    3. Diz ve ayak bileği eklem pop bacak, kalça kapma ve ayak zorla çekerek. Ayak bileği eklem break ve böylece tendon ve kas tibia off sıyırma tibia tutarken ayak vücut doğru çekmek için devam edin.
    4. Diz sürümü tibia için ortak break ve benzer şekilde bunu böylece tendon ve kas uyluk kemiği off sıyırma uyluk tutarken doğru beden çek. Bir kesik Kalça eklemi yapmak ve tendonlar kesebilir ve sonra uyluk kemiği kalça soketten dışarı çekin. 2.2.2-2.2.4 kontralateral tarafı için yineleyin.
    5. Kemikleri dikkatle onları tüm kalan kas ve bağ dokusu kaldırmak için bir kaba kağıt havlu ile sürtünme temizleyin. Sonra nihayet taze soğuk BM arabelleğe Dumont #7 forseps bir çift kullanarak buza aktarmadan önce buz gibi BM arabellekte yıka. 2.2 PA-GFP bağış için yineleyin.
      Not: Kemik iliği hücreleri tek bir donörden cinsiyet ve yaşa göre değişir. Ölçek bağış İstenen giriş kemik iliği oranları ve numaraları göre sayısı ve istenen alıcı sayısı. Eğer bağış kıt, ön bacaklarda kemik iliği çıkarma için dahil edilebilir. Bu genellikle bir ek 1/3 ½ hind uzuvların elde edilen hücre üretir. Genellikle, her yerde 50-200 milyon hücrelerden başına donör, yaş, cinsiyet, arka plan ve sadece arka veya hem arka ve ön bacaklarda dahil olup bağlı olarak elde edilebilir.
  3. Kemik iliği hücre çıkarma
    1. Buz gibi BM arabellekte durulama tarafından harç hazırlayın. Durulama arabellek drenaj ve bir elektrik pipet denetleyicisi bir 10 mL serolojik pipet ile 10 mL taze buz gibi BM arabellek eklemek için kullanın.
    2. Kemikleri 564Igi bağışçılardan Dumont #7 forseps bir çift kullanarak harç transfer edecek ve havaneli ezmek ve kemik iliği serbest bırakmak için kemikleri çektirmek için. Kemik iliği özü bir 10 mL serolojik pipet ile Aspire edin ve buz üzerinde 50 mL tüp içine 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçer.
    3. Taze buz gibi BM arabellek ek bir 10 mL için harç ekleyin ve hücre tam kurtarma sağlamak için yineleyin. Harç bir kağıt havlu ile kemik malzeme kaldırmak, uygun şekilde atın ve dikkatle % 70 etanol BM arabellek tarafından takip, harçla durulayın. 2.3 PA-GFP kemik iliği donör grubu için yineleyin.
  4. Kemik iliği Hücre sayımı
    1. Bir micropipette kullanarak, RBC lizis arabelleği plastik parafin film bir parça üzerinde 40 µL içeren bir damlacık yerleştirin. 564Igi kemik iliği tüp birkaç kez ters çevir ve 10 µL bir micropipette kullanarak aliquot al. RBC lizis arabellek bırak 40 µL ile karıştırın.
    2. Daha sonra Trypan mavi (sulu çözelti içinde % 0,4) 50 µL için açılan ekler. Hemen bir Burker-Türk hemasitometre ve mikroskop altında sayısı alanındaki elde edilen karışımı 10 µL yükleyin. Kullanarak toplam seyreltme faktörü x 10 mL başına hücre sayısını hesaplayın. Yeterli hücre canlılığı Onayla > % 90. 2.4 PA-GFP kemik iliği donör grubu için yineleyin.
  5. Donör süspansiyonlar hazırlanıyor
    1. Adım 2.4 ve alıcılar için istediğiniz sayıyı elde sayar dayanarak, donör kemik iliği bağışı mix tüpte karışık olması iki donör grubun her birinden hacmi hesaplamak.
      Not: Örneğin, 1:2 karışık 564Igi:PA bir grubunun kurulması-6 CD45.1 alıcılı GFP chimeras: her alıcı için 20 x 106 donör hücreleri toplam, 1 Bölüm 564Igi ve 2 parça PA-GFP. Böylece, bu 6 x 1/3 x 20 x 10 gerektirir6 40 x 106 564Igi donör hücreleri ve 6 x 2/3 x 20 x 10 =6 = 80 x 106 PA-GFP donör hücre.
    2. PA-GFP ve 564lgi donör kemik iliği 50 mL konik tüp içinde uygun miktarda karıştırın. Kemik iliği karışım 200 g ve 4 ° C x 10 dakika sallanan bir kova rotor kullanarak santrifüj kapasitesi.
    3. Süpernatant dikkatle boşaltmak ve buz gibi BM arabellek mL başına 1 x 108 hücre yoğunluğu, hücrelerde resuspend. Precooled 1.5 mL microcentrifuge tüp buza aktarın.
  6. Kemik iliği alıcılarla başlamaktan donör kemik iliği
    1. Anestezi indüksiyon ile % 4 isoflurane bakım %3,75 ardından, havada, sürekli akış kullanan alıcılar. Anestezi yeterli uçak toe-çimdik refleks yokluğunda tarafından doğrulayın.
    2. Dikkatli kemik iliği hücrelerinin yeterli resuspension, o zaman aspiratı 200 µL 0.3 ml (~ 20 x 106 hücreler), kemik iliği karışımı sağlamak için kemik iliği karışımını içeren tüp tekrarlarsam, insülin şırınga 30 ölçmek.
    3. Alıcı onun yanına koyun, yavaşça cilt üzerinde ve biraz 'göz dışarı pop için ' göz altında germek ve yavaşça şırınga ucu yaklaşık 30 ° açıyla göz ve çevreleyen doku önlemek için dikkat çekici göz çukuru ön içine yerleştirin. İğne ucu göz çukuru altını kemik dokunmak hissettiğinde, biraz geri çek (~0.5 mm) ve yavaş yavaş donör kemik iliği sabit basınç kullanarak enjekte.
      Not: Orada kanama yok, sıvı ve Hayır çok küçük şişkin göz üzerine enjeksiyon için hiçbir sızıntı olmalı.
    4. Belgili tanımlık kafes ad libitum antibiyotik su ile fare dönmek ve acil kurtarma yordamı doğrulayın. 2.6 her alıcı için yineleyin.
      Not: Kuyruk-damar enjeksiyon retroorbital enjeksiyon ile benzer sonuçlar yerine kullanılabilir, ancak, bizim elimizde hangi-ebilmek var olmak bir endişe alıcılar büyük gruplar ile çalışırken seçilmesinden çok daha yavaş. Bir aspirasyon ve boğulma riski oluşturduğu kurtarma doğrudan üzerinde küçük çaplı yatak anaesthetized hayvanların kaçınılmalıdır
  7. Antibiyotik su (gün 14) kaldırma
    1. Antibiyotik su cage(s) kaldırın ve normal içme suyu ile değiştirin.

3. başarılı sulandırma kontrol ve chimerism (hafta 6) uygun ölçüde doğrulanıyor

  1. Chimeras ve kontrol Retroorbital kanama
    1. Kan toplama tüpler 1.5 mL microcentrifuge tüpler alıcı kulak etiketi numaraları göre etiketleme ve 5 mM EDTA içeren PBS 50 µL ekleme hazırlamak.
      Not: PA-GFP, CD45.1 ve CD45.2 ve 9 d 11 (idiotype) için uygun denetimler içerir. Bu 1 ekleyerek yapılabilir PA-GFP + fare, 1 CD45.1 fare, 1 B6 fare ve 1 564Igi fare.
    2. Fareler anestezi ve anestezi adım 2.6.1 olduğu gibi yeterli uçak doğrulayın. Chimera onun yanına koyun, yavaşça cilt üzerinde ve biraz 'göz dışarı pop için ' göz altında germek.
    3. Yavaşça bir BoPET sarılmış heparinized kılcal tüp (60 µL iç hacim) yaklaşık 40 ° açıyla göz ve çevreleyen doku zarar görmesini önlemek için dikkat çekici göz çukuru ön içine yerleştirin. Yavaşça twist/tüp kan ile doldurmak başlayana kadar döndürün.
    4. Pasif tüp kılcal eylemle, neredeyse tamamen dolu kadar doldurmak için kan izin sonra tüp geri çekmek ve aynı zamanda hemen kavrama göze izin vermek için göz çevresinde rahatlatıcı karşılık gelen önceden etiketli toplama tüp içine yerleştirin pozisyon içine yerleşmek. Kanama hemen durdurmanız gerekir.
    5. "Sharps" kap içinde atmak ve kılcal tüp toplama tüp içine boşalttı emin olun. Tüp kapatın ve tam PBS/EDTA ile karıştırma sağlamak için üç kez tersine çevirin.
    6. Fare kafes dönmek ve acil kurtarma yordamı doğrulayın. 3.1 deneysel her fare ve uygun denetimler için adımları yineleyin.
      Not: Bunlar tamamen yeniden önce bu yöntemi adventif enfeksiyon radyoaktif alıcılar için daha büyük bir risk oluşturabilecek gibi submandibular ven ponksiyon kullanırken dikkatli olun. Ayrıca, deneyim, biz toplanan kan kan hacmi ve aşırı kanama nedeniyle kayıp kan miktarını daha fazla değişkendir bulabilirsiniz. Kemik iliği chimeras sulandırma aşamasında hassas olarak önce yeni kemik iliği tamamen engrafted ve hematopoiesis normal düzeyleri devam ediyor bu hususlar her ikisi de önemlidir.
  2. Periferik kan mononükleer hücre (PBMC) arıtma
    1. Kan toplama, kısaca tamamlanmasından sonra (10 s) düşük hızda tüpler santrifüj kapasitesi (< 200 x g) seyreltilmiş toplamak için stabilize kan tüpleri dibinde.
    2. Bir 10 mL şırınga lenfosit ayrılık orta ile doldurun ve bir 18 G iğne ekleyin. İlk tüp altına iğne takın ve kan örneği ile 1 mL lenfosit ayrılık orta underlayer. Dikkatle iğne çekilme ve Çapraz bulaşma sonraki örnek önlemek için kağıt havlu ile silin.
    3. Tüm örneklerini devam sonra 800 x g, oda sıcaklığında, sallanan-kova santrifüj 25 dakika santrifüj kapasitesi frene düşük/kapama için ayarlayın.
    4. Buna bağlı olarak etiketli 1,5 mL birtakım buz gibi BM arabelleği 1 mL içeren microcentrifuge tüpleri hazırlayın.
    5. Her örnek için aşağıdaki Santrifüjü 200 µL micropipette üst (plazma) katmanla girin ve hemen üstünde belgili tanımlık arayüzey mononükleer hücre (MNC) katmanı Aspire edin. Hücreleri içeren 1 mL BM arabelleği buna bağlı olarak etiketli tüp aktarın. Kapağı kapatın ve karıştırmak için tersine çevirin. Lenfosit ayrılık orta içeren tüp atmak.
    6. 200 x g 5 min, sallanan bir kova Open End 4 ° C için de santrifüj kapasitesi ve tüm örnekleri ile devam edin. Aspire edin ve süpernatant atın ve Pelet buz gibi BM arabellek 200 µL içinde resuspend. Örnekleri antikor boyama ve akış sitometrik çözümlemesi için hazırsınız.
  3. Akış sitometrik değerlendirme için boyama
    Not: panel önerdi: CD45.1-FITC, B220-PerCP-Cy5.5, 9D 11-A568, CD45.2-APC. Sigara aktif PA-GFP Pasifik turuncu (veya eşdeğer) kanal algılanır. Lenfosit ayrılık ölü hücrelerden kurtulur hiç canlılığı boya gerekmemektedir.
    1. Bir micropipette kullanarak hücre süspansiyon her chimera ve denetim örnek için iyi başına 100 µL 96-şey plakasına ekleyin.
    2. 3 sigara-PA-GFP kontrol örnekleri için her örnek (300 µL toplam) kalan 100 µL havuz. Günahı kontrol ve kumanda lekeli kuyu bu malzemenin 50 µL ekleyin. PA-GFP tek lekeli denetimi için Ayrıca 50 µL günahı PA-GFP örneği ekleyin.
    3. Her şey (günahı) arabelleği 100 µL eklemek için tek antikor (PA-GFP tazminat denetim dışında tek lekeli tazminat denetimleri) veya antikor mix (örnekler). Buz üzerinde 20 dakikadır kuluçkaya.
    4. De 200 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Arabellek hafifçe vur. Her şey için BM arabelleği 200 µL ekleyin ve tekrar yıkamak için santrifüj kapasitesi. Arabellek fiske ve BM arabelleği 200 µL her kuyuya hücrelerde resuspend. Örnekleri bir Akış Sitometresi (şekil 1) çözümleme için hazırsınız.
      Not: Chimeras Germinal Merkez yanıtlarında herhangi bir noktadan itibaren 6 hafta, analiz edilebilir.

4. In vivo tek germinal merkezleri tanımlaması yardım için marjinal bölge/subkapsüler sinüs etiketleme

Not: Mevcut protokol footpad/hock (popliteal lenf nodu) ve şarapla (damar yolu, dalak) enjeksiyonları için gösterilmiştir, ancak hedef siteye göre değiştirilebilir.

  1. Popliteal lenf nodu etiketleme için ikili footpad enjeksiyon
    1. Fareler gibi adım 2.6.1 anestezi.
    2. 1.5 mL microcentrifuge tüp 2 µL PE etiketli fare Anti-fare CD169 antikor 18 µL PBS, pH 7.4 oranında seyreltin. Karışımı 10 µL her iki damlacıkları plastik parafin film bir parça yerleştirin. 0.3 mL insülin ile 30 gauge iğne kullanarak her damlacık Aspire edin.
    3. Mix'a footpad etiketleme 10 µL enjekte (footpad, ayak parmakları, başından itibaren proksimal orta kısmında bir 5-10 ° açıyla iğne ile girin ve iğne topuk doğru yaklaşık yarım Ekle) veya hock (iğneyle bir 5 - at girin 10 ° açı sadece topuk ve hakkında eklemek yarıya kadar diz doğru yönde Aşil tendonu eksen boyunca onun uzunluğu). Fareler için onların kafes dönmek ve adım 5 işlemine devam etmeden önce yaklaşık 15 dakika bekleyin.
  2. Dalak etiketleme için intravenöz enjeksiyon
    1. Fareler gibi noktası 2.6.1 anestezi.
    2. 1.5 mL microcentrifuge boru PE etiketli fare Anti-fare CD169 antikor PBS 90 µL içinde 10 µL sulandırmak. Karışım 0.3 mL insülin şırıngayla Aspire edin.
    3. Retroorbital IV enjeksiyon adım 2.6 göre gerçekleştirin. Fareler için onların kafes dönmek ve adım 5 işlemine devam etmeden önce yaklaşık 15 dakika bekleyin.
      Not: Alternatif olarak isoflurane, ketamin/Xylazine karışımı kullanılan gibi anestezik enjeksiyon; Ancak, bu genellikle daha yavaş süreleri için yol açar. Lenfatik drenaj genellikle iskelet kas hareketi tarafından etkilenir olduğundan, bu yavaş drenaj zaman kurşun bekleniyor.

5. explanting dalak ve lenf bezleri ve photoactivation için hazırlanıyor

  1. Çift taraflı görüntüleme ve photoactivation odası hazırlama
    1. Pistonu 20 mL şırıngadan çıkarın ve geri-Bu vakum yağ ile bir tüp vakum yağ meme içine ekleyerek yük. Daha sonra pistonu 5 mL şırıngadan çıkarın ve geri-Bu vakum yağ ile yük için 20 mL şırınga kullanın.
    2. Bir kare coverslip düz bir yüzeye yerleştirerek ve vakum yağlı (yaklaşık 1-2 mm kenarlarından) coverslip kenarları boyunca izleme tarafından görüntüleme ve photoactivation odası hazırlamak için vakum-yağ yüklü 5 mL şırınga kullanın.
      Not: microdroplets vakum yağ daldırma su emülsiyon objektif kontamine gibi daha sonra mikroskop objektif temas gelen tüm yüzeylerin vakum yağ kirlenmesini önlemek için dikkat ediniz.
    3. Kapak kaymaz vakum yağ odası buz gibi BM arabelleği ile doldurmak ve soğuk düz bir yüzeye yerleştirin.
  2. Lenf düğümleri ve dalak hasat
    1. İçinde vivo chimeric fare 2.2.1 adım başı olarak çözümlenmesi için etiketli ötenazi. Karkas % 70 etanol ile aşağı sprey.
    2. Popliteal lenf düğümü'ne erişmek için diz çukuru altında sadece deride bir kesi yapmak için düz iyi makas kullanın ve hamstring hattı boyunca yukarı doğru kesme neredeyse Kalça eklemi kadar uzatmak. Dumont #5 veya #7 forseps kullanarak, her cilt dışarı doğru popliteal fossa (şekil 2A) dokusunda ortaya çıkarmak için maruz kanatları çekin.
    3. Dumont #5 forseps bir çift kullanarak, dikkatle popliteal fossa sadece medial popliteal ven girin ve incelemek ekleme ve açma ve temel popliteal lenf nodu göstermek bacak, ekseni boyunca forseps kapatma yağ açın.
    4. Fessalar dışında lenf nodu kuadriseps kas başparmak ve işaret parmağı (şekil 2B) kullanarak diz proksimal ön taraftan pinching tarafından pop. Çevre dokudan (şekil 2C) kurtarmak ve 5.1 adımda hazırlanan vakum yağ odası yer için Forseps ile aşağıdan lenf nodu bul.
    5. 5.2.2-5.2.4'ten kontralateral tarafı için yineleyin. Birden fazla lenf düğümleri tek bir odasında istenirse takılabilir.
    6. Sonunda odası ikinci coverslip vakum yağ RIM üstüne yerleştirerek ve yavaşça aşağı, tüm hava kabarcıkları A'ya kulak tuşuna basarak kapatın.
      Not: Bazı arabellek de itilmiş ama vakum yağ kaçağı sıvı (şekil 2B) önlenmesi sıkı bir mühür oluşturmalıdır. Lenf düğümleri çift taraflı bir görüntüleme odasında oldular.
    7. Dalak, fare, ön orta hattına proksimal sol tarafında bir kesi karın duvarı düz iyi makas yapmak bir çift kullanarak erişmek için göğüs kafesi sadece ve posterior aksiler hattına vücut etrafında uzatmak. Dalak ucu görünür (şekil 3A) olmalıdır.
    8. Dalağını Dumont #7 forseps bir çift ile çekin ve yapışıklıklar serbest bırakmak için alt üzerinde kesti. Düz iyi makas çifti ~ 2 mm kalınlığında, kesitsel, dilim kesmek için kullanın.
    9. 5.1. adımda hazırlanan vakum yağ odasında dilimi yerleştirin. Birden çok dalak dilimleri tek bir odasında istenirse takılabilir.
    10. Sonunda odası ikinci coverslip vakum yağ RIM üstüne yerleştirerek ve yavaşça aşağı, tüm hava kabarcıkları A'ya kulak tuşuna basarak kapatın. Buz üstünde tüm görüntüleme chambers, görüntüleme ve photoactivation sırasında her zaman, hariç tutmak.
      Not: Bazı arabellek de itilmiş ama vakum yağ sıvı sızıntısını önleme sıkı bir mühür oluşturmalıdır. Dalak dilimler şimdi bir çift taraflı görüntüleme odasında (şekil 3B) olur.

6. Photoactivation

  1. Tanımlayıcı tek germinal merkezleri
    Not: Bu protokol için dalak açıklanan, ancak tamamen lenf düğümleri için benzerdir.
    1. Görüntüleme odası mikroskop sahnesinde yerini. 3,5 mL plastik transfer pipet kullanarak, bir damla distile su üst coverslip üstüne yerleştirin ve amacı iletişim noktası kadar düşük. İletilen ışık kullanarak doku üstüne odaklanmak.
    2. Karanlık modu ve iki fotonlu uyarma geçin ve lazer 940 için ayar nm.
      Not: uygun filtre setleri ile bu dalga boyu uyarma ve kolajen içeren yapıları büyük gemiler ve yapı elemanları ile ilgili yanı sıra adım 4.2, enjekte CD169 PE ikinci harmonik üretimi tespiti izin verir hangi marjinal Zon tanımlar. Ancak, 940 nm uyarma değil photoactivate PA-GFP yok.
    3. (CD169-PE boyama tarafından kapsanan) bireysel beyaz hamuru alanlarda doku yüzeye yakın yerelleştirilmesine ve merkezi arteriyol ile ilişkili ikinci harmonik üretimi tarafından periarteriolar lenfoid kılıf (PALS, T hücre bölge) tanımlar. Son derece autofluorescent, varlığı aktif tingible vücut makrofajlar (güçlü autofluorescent sinyal tüm kanalları, blob gibi bir görünüm karanlık çarpıtmalar ile) SARSAK ve marjinal Zon arasındaki bölgede bakın (şekil 4A).
      Not: gerekirse, doku istenmeyen yönünü nedeniyle, görüntüleme odası açtım ve görüntüleme diğer yönden gerçekleştirilebilir.
    4. 6.1.3. adımda tanımlanan işaretlerinden dayalı., bir bölge tek germinal merkez alan tanımlayan ilgi çekmek. Bir Z-yığını kurmak 100-150 µm derinlik, doku yüzeyinden başlayarak ve ~ 3 µm adım boyutunu kullanarak.
    5. 830 nm uyarma dalga geçin. Kapat veya duyarlilik dedektörleri için önlemek için tüm kanallar dim (gibi lazer güç ve çıkış Floresans genellikle bu dalga boyu önemli ölçüde daha yüksek) ve o zaman 'resim yığını'.
      Not: Doku, kullanılan belirli doku ve görüntüleme sistemi derinlemesine lazer güç ve piksel Işınma Zamanı gibi belirli ayarları bağlıdır. Her uygulama kullanılan belirli görüntüleme sistemi için optimize var. O yığın boyunca verimli photoactivation almak için gerekli olmakla birlikte, duyarlilik değil hücreleri özen gösterilmelidir.
    6. Geri 940 nm uyarma dalga boyları için geçiş ve kanalları yeniden açın. (Şekil 4B) boyunca verimli photoactivation ve duyarlilik (diffüz, hücre sınırlı PA-GFP sinyal, siyah noktaları veya yüksek derece autofluorescence photoactivated alanında) yokluğu onaylamak için yığını üzerinden tarama.
    7. Photoactivate için tüm ilgili doku görüntüleme odasında devam, sonra hemen daha fazla işleme kadar buz geri döner. Ek görüntüleme odaları photoactivation ile devam edin.
      Not: Doku explanting, montaj ve özellikle photoactivation zaman alan işlemler olmakla birlikte, toplam teslimi etrafında zaman 4-6 saat hücre canlılığı dramatik bir düşüş önlemek için sınırlanması.

7. kurtarma ve photoactivated hücre analizi

  1. Lenf düğümleri ve dalak lenfositlerin çıkarma
    1. Her photoactivated örnek için BM arabelleği buz üzerinde 500 µL içeren bir buna göre etiketli 1.5 mL microcentrifuge tüpü hazırlayın. Bir PA GFP denetimi ve bir sigara aktif PA-GFP fare örnekleri içerir. Bu bir B6 denetim ve bir PA-GFP kontrol fare gibi tarafından gerçekleştirilebilir.
    2. Dikkatli bir şekilde üst kapak notu görüntüleme Odası (tek bir bölmede birden fazla örnekleri varsa) örnekleri konumunu korumak ve her örnek, ilgili örnek tüp içine yerleştirmek için dikkat çekici, kaldırın.
    3. Bir havaneli ile homogenizer kullanarak doku sıkmak ve havaneli lenfositler serbest bırakmak için tüpte twist. Bir micropipette kullanarak, lysate Aspire edin ve 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla bir taze, önceden soğutulmuş 1.5 mL microcentrifuge tüpüne filtre. Lenf nodu örnekleri için 7.1.5 adıma atlayın.
    4. Dalak örnekleri için santrifüj kapasitesi 200 x g sallanan bir kova Open End 4 ° C'de 5 min için de. Süpernatant atın ve Pelet RBC lizis arabellek 200 µL içinde resuspend. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya sonra buz gibi BM arabelleği 800 µL ekleyin ve 7.1.5 adıma devam edin.
    5. Vasıl 200 x g sallanan bir kova Open End 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi. Süpernatant atın ve buz gibi BM arabellek 200 µL içinde resuspend. Örnekleri isterseniz akış sitometrik değerlendirme için boyama ve sıralama, için hazırsınız.
  2. Akış sitometrik değerlendirme için boyama
    Not: panel önerdi: CD169-PE, B220-PerCP-Cy5.5, 9D 11-A647, CD38-PE-Cy7, düzeltilebilir canlılığı boya Efluor-780, GL7-Pasifik mavi. Sigara aktif PA-GFP Pasifik turuncu (veya eşdeğer) kanal algılanır. Photoactivated PA-GFP GFP kanalda algılanır. CD169-PE ile boyama ve bu dökümü kapısı olarak kullanarak (ki olabilir veya CD169-PE ile etiketli içinde vivo yapılmamış olabilir) herhangi bir ortak arıtılmış makrofajlar dışlanabilir.
    1. Bir micropipette kullanarak hücre süspansiyon her chimera ve denetim örnek için iyi başına 100 µL bir 96-şey tabak içinde ekleyin.
    2. B6 kontrol örnekleri için 50 µL günahı kontrol ve kumanda lekeli kuyu bu malzemenin ekleyin. Sigara aktif PA-GFP tek lekeli denetimi için Ayrıca 50 µL günahı olmayan aktif PA-GFP örneği ekleyin. Tek lekeli aktif PA-GFP kumandasında tüm photoactivated örnekleri için kalan malzeme havuz.
    3. Her şey, (günahı ve PA-GFP tazminat denetler) arabelleği 100 µL eklemek için tek antikor (tek lekeli tazminat denetimleri) veya antikor mix (photoactivated örnekleri). Buz üzerinde 20 dakikadır kuluçkaya.
    4. De 200 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Arabellek hafifçe vur. Her şey için BM arabelleği 200 µL ekleyin ve tekrar yıkamak için santrifüj kapasitesi. Arabellek fiske ve BM arabelleği 200 µL her kuyuya hücrelerde resuspend. Örnekleri analiz bir Akış Sitometresi veya sıralayıcı ( şekil 5temsilcisi sonuçları) için hazırsınız.

Representative Results

Karışık kemik iliği chimeras nesil

Mevcut Protokolü (bakınız istatistiksel anlamlılık için 12' ye) şekil 1 ' deki temsilcisi sonucu gösterildiği gibi karışık kemik iliği chimeras tamamlamak chimerism B hücre yerde ile sağlam elde eder. 6 hafta serotyping ortaya normalleştirilmiş B hücre sayılarında sulandırma (şekil 1A), düşük frekans 9 d 11 (idiotype) ile pozitif dolaşımdaki B hücrelerinin 564Igi yuvası (şekil 1B) kaynaklanan posta. Toplam lenfosit kapı içinde kalan alıcı türetilmiş hücre, ~ %6 düşük frekans işte chimerism ~ %94 (şekil 1 c) genel bir derecesini gösteren CD45.1 (Q1),. Donör içinde bölüm (CD45.1-, Q4 + Q3) 564Igi oranı (Q4) PA-GFP için (Q3) olduğunu yaklaşık %23 77. Bu biraz düşük giriş % 33-66 oranı B hücre negatif ağır seçerek açıkladı 564Igi yuvası 12den türetilmiş. Şekil 1 dgörüldüğü gibi işte hemen hemen tam chimerism B hücre bölümünde (% 99.9 CD45.1-) ve PA-GFP kemik iliği türevi B hücreleri (Q3), B hücreleri 564Igi kaynaklı ağır negatif seçim sonucu olan hakimiyeti.

Hasat doku, işleme ve akış sitometrik değerlendirme

Şekil 2 ve şekil 3 için yordamlar göstermektedir ve explanting sonuçlarını taze lenf düğümleri ve dalak dilimleri izole. Şekil 4 ve photoactivation bir explanted dalak dilim bir tek germinal Merkez alanında içinde vivo etiketleme için temsil edici bir sonucu sunar. Olarak görülebilir (şekil 4A), içinde vivo CD169-PE ile etiketleme sağlam etiketli marjinal Zon (kırmızı, gösterilen "MZ tarafından"). İkinci harmonik sinyali kolajen içeren yapı elemanları ve büyük gemiler (mavi), periarteriolar lenfoid kılıf (PALS) Merkezi arteriyol dahil olmak üzere açıkça görülür. Son derece autofluorescent, harekete geçirmek tingible vücut makrofajlar (ok uçları) germinal Merkez aktivitesiyle ilişkili. Birlikte ele alındığında, marjinal Zon, SARSAK ve vücut tingible makrofajlar, büyük olasılıkla tek bir germinal Merkez içeren ilgi bir bölgenin kimliği sağlar. Bölgenin ilgi photoactivated şekil 4B' gösterildiği gibi olur. Gösterildiği gibi photoactivation microanatomically kesin9harekete geçirmek tanımlanmış bir alanı verimli,'dur. Sunulan sonuçları Ayrıca PA yüksek yoğunluklu teyidi olarak hizmet-GFP + lenfositlerinin Sulandırılan chimeras ve spontan germinal merkezleri varlığı. Aşağı akım akış sitometrik değerlendirme daha fazla normalleştirilmiş B hücre kompartıman numaraları (şekil 5 d), bir spontan germinal Merkez nüfus (şekil 5E) ve olmuştur germinal Merkez B hücre alt grubunu varlığını doğruladı photoactivated (şekil 5F).

Böylece, mevcut iletişim kuralı sağlam bir yöntem karışık kemik iliği chimeras oluşturulmasında ile spontan autoreactive photoactivatable muhabir taşıyan vahşi-türü türetilen B hücreleri ile ağırlıklı olarak oluşan germinal merkezleri, sunuyor. Bu sırayla bireysel germinal merkezleri ( şekil 6grafik genel bakış) aşağı akım analizlerini sağlar.

Figure 1
Şekil 1: Akış sitometrik değerlendirilmesi 564Igi kan chimerism derecesini (CD45.1-, PA - GFP-): PA-GFP (CD45.1-, PA-GFP +) chimeras öğrenirim radyoaktif CD45.1 alıcılar (CD45.1 +, PA - GFP-) içinde karışık, 6 hafta sonrası sulandırma. Singlet lenfositler üzerinde ön kapı B220 + B hücrelerinin çoğunluğuna gösterilen A) arsa. Komplo A, B hücre nüfus içindeki gösteren 9 d 11 + (idiotype) sıklığını B) Subgate. C) arsa, PA-GFP singlet lenfositler üzerinde ön kapı CD45.1 karşı. D) arsa, PA-GFP komplo A. B hücre subgate CD45.1 karşı Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Hasat ve popliteal lenf düğümleri görüntüleme ve photoactivation için montaj için yordam. A) bir kesi diz altında yapılan ve Kalça eklemi kadar genişletilmiş ve kenarları yanlara, popliteal fossa (ok ucu) göstermek çekildi. B) örten fatpad açılır ve popliteal lenf nodu maruz kalan (ok ucu) olduğunu. C) popliteal lenf nodu fossa alınır. D) yordamı kontralateral tarafı için yinelenir ve her iki düğüm BM arabellek ile dolu bir çift taraflı coverslip/vakum-yağ odası monte edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: hasat ve dalak görüntüleme ve photoactivation için montaj için yordam. Bir) bir kesi ön medial satırından hemen göğüs kafesi altında yapılan ve posterior aksiler hattına vücut etrafında genişletilmiş ve dalak (ok ucu) ucu ortaya çıkarmak için kenarları geri çekildi. B) dalak geri çekildi ve güvenliğe ve BM arabellek ile dolu bir çift taraflı coverslip/vakum-yağ odası monte edilmiştir (1-2 mm) ince dilimler halinde kesin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Photoactivation. A) İki fotonlu dalak photoactivation önce bir germinal merkezde test. İn vivo anti-CD169-PE ile etiketleme marjinal Zon etiketlemek için dalak hasat daha önce gerçekleştirilen (kırmızı, gösterilen "MZ tarafından"). İkinci harmonik sinyali olduğunu belirgin deri ve büyük gemiler (mavi) ile ilişkili içinde kolajen içeren yapıları. Ok uçları son derece autofluorescent, germinal Merkez aktivitesiyle ilişkilendirilmiş aktif gövde tingible makrofajlar tanımlayın. Düşsel 940 nm uyarma gerçekleştirildi. Ölçek çubuğu sol üst köşedeki 200 µm. Bgösterir) A gelince, ama sonra photoactivation 830, nm. Photoactivated şimdi görünür (yeşil) tanımlanmış bir bölgede sınırlı ilgi marjinal Zon ve önceden tanımlanan tingible vücut makrofajlar kapsayan tarafından hücrelerdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: Akış sitometrik analizinde photoactivated germinal Merkez B hücreleri. Yan dağılım ve lenfosit geçit karşı ileri A) arsa. B) arsa ileri dağılım yükseklik lenfosit kapısı ve elde edilen singlet kapı içinde bir fonksiyonu olarak ileri dağılım alanının. C) canlılık dışlama arsa singlet kapısı ve elde edilen canlı hücre kapısı içinde boya. D) Gating B220 + B hücre. E) Gating B220 + kapı içindeki CD38lo GL7hi hücreleri olarak tanımlanan germinal Merkez B hücrelerinin. F) Gating photoactivated hücre hücreleri aktif olmayan ortak ifade ve photoactivated PA-GFP alt olarak tanımlanan GC B hücre nüfus içinde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: Protokolü'nün grafik genel bakış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Çok sayıda otoimmünite fare modelleri mevcuttur, bunların çoğu spontan germinal merkezleri16ile mevcut. Ancak, birçok mevcut modelleri karmaşık genetik arka plan veya merkez düzenleyiciler mutasyonların lenfosit proliferasyonu ya da harekete geçirmek onları kötü intercrossing muhabir çizgileri ve çalışmalar normal lenfosit davranışının uygun işleme, liman otoimmünite içinde anılan sıraya göre. Mevcut modeli, aksine, mevcut durumda tarafından temsil edilen transgenes, knock-çıkışları ve gazetecilere, istenen herhangi bir bileşimini kullanarak autoreactive germinal Merkez B vahşi türü türetilmiş hücre derinlemesine analiz için 'Tak ve Kullan' yaklaşım sağlar photoactivatable GFP. İçinde vivo etiketleme stratejileri kullanarak, tek germinal merkezleri explanted lenfoid doku ve iki fotonlu mikroskop kullanarak onların hücresel bileşenlerinin photoactivated görselleştirildiği. Photoactivated lenfosit tek germinal merkezleri üzerinden sonra tek hücreler olarak veya toplu olarak analiz veya sıralanmış akış cytometrically, olabilir. Bu hücreler daha sonra ek karşıdan akış moleküler ve fonksiyonel analiz otoimmünite alanda yenilenmiş anlayışlar sağlamak için tabi olabilir.

Bu yordamın başarılı performans için kritik bazı adımlar vardır. Temsilcisi sonuçlarına göre ışınlama gösterildiği gibi (1100 Rad) ve donör kemik iliği sulandırma başarıyla yerine yakınındaki tamamlamak chimerism B hücre yerde verimli alıcı kemik iliği bölme. Artık alıcı türetilen B hücreleri bir alt germinal Merkez nüfusunun 'karanlık' vermek istiyorsunuz gibi bu önemli bir noktadır. Işınlama için kullanılan kaynağı ne olursa olsun, radyoterapi doz/zamanlama maksimal myeloablative etkisi en az teminat doku hasarı ile hayvanlar için verim için optimize edilmiş olması gerekiyor. Sulandırma için sağlam yüksek sulandırma derece verim için kemik-crush Protokolü ve sulandırma 20 milyon toplam donör hücreleri ile bulunmuştur. Kemik iliği çıkarılması için steril ve soğuk/üzerinde buz çalışma yüksek canlılık donör kemik iliği sağlar. İstenen donör kemik iliği oranları ulaşmak için büyük aliquots hem kendisi sayma ve sayım için kemik iliği subsample yaptırmayı ne zaman hücre sayım sırasında dikkatli olun esastır. Karıştırma ve yerine centrifuging ve ayrı ayrı resuspending ve sonra karıştırma, donör iliği co peletleme Hücre sayımı takip donör oranları herhangi bir farklılığı önlemek için hizmet vermektedir.

Karışık kemik iliği chimera üretimi iletişim kuralının tek başınıza mücadele edersiniz ve chimeras autoreactive germinal merkezleri ile nesil herhangi bir istenen muhabir, transgene veya knock-out ile sağlar. Ancak, bu bir sınırlama uyumlu donör kullanmak için ihtiyaçtır. 564Igi gerilme C57Bl/6J congenic arka plan üzerinde ve sonuç olarak, diğer donor(s) ve alıcıların bir H-2b congenic arka planı olmalıdır (ya da alternatif olarak, 564Igi zorlanma istenen zorlanma ve otoimmün fenotip backcrossed «««doğrulanmadı) yeni arka plan üzerinde. Işınlama Prosedürü bir tolerogenic ortamı17lehine eğilimi ve bazı küçük MHC antijenleri uyuşmazlıkları tolere. Ancak, bu yönü iyice, özellikle erkek ve dişi bağış ve/veya alıcıları, erkek tarafından kısıtlanmış Y-antijenleri ile kadın reaktivite potansiyeli nedeniyle karıştırma Eğer düşünülmelidir.

Benzer şekilde, protokol photoactivation yönünü tek başına ve birçok farklı bağlamlarda kullanılabilir olur. Ancak, PA-GFP muhabir şu anda yalnızca değil de stromal hücreler ama tüm hematopoetik lineage hücrelerdeki etkin olduğu UBC promotor ile kullanılabilir. Giriş bölümünde de belirtildiği gibi diğer photoactivatable, photoswitchable veya photoconvertible muhabir suşları mevcuttur ve PA-GFP için deneysel koşullar uygun düzeltilmesi yerine olabilir.

Lazer 900 çok üzerinde tutarak istenmeyen alanların yanlışlıkla photoactivation önlemek önemlidir, bu dalga boyu olacak gibi değil photoactivate PA-GFP Imaging zaman nm. Photoactivation kendisi, doku, kullanılan belirli doku ve görüntüleme sistemi derinlemesine lazer güç ve piksel Işınma Zamanı gibi belirli ayarları bağlıdır ve her uygulama kullanılan belirli görüntüleme sistemi için optimize edilmiş olması gerekir. Aynı zamanda aktif hücreleri yeterli bir temsili için aşağı akım analizleri almak için yığın boyunca verimli photoactivation almak için gerekli değildir değil duyarlilik hücreleri özen gösterilmelidir Germinal Merkez B hücreleri genellikle her yerde %0,5 dalak veya Kutanöz lenf nodu B hücrelerinin % ~ 2 teşkil ve temsilcisi sonuçlarından (şekil 5) görüldüğü gibi photoactivated tek germinal Merkez B hücreleri ~ %1 Toplam yapabilir nüfus bir tek dalak dilim içinde mevcut. Bu nedenle, başarılı analiz veya hücre önemli sayıda sıralama olaylar, çok sayıda işleme gerektirir.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

SE Degn Lundbeckfonden adam ve Carlsberg temel ayırt edici adam var. Bu eser kısmen Ayrıca bir NNF Biyomedikal Grant (SE Degn) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody, 9D11-A568 In-house generated 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Biotium 92255
Antibody, 9D11-A647 In-house generated 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Nordic Biosite ABD-1031
Antibody, FITC anti-mouse CD45.1 Biolegend 110705
Antibody, Pacific Blue anti-mouse/human GL7 Antigen (T and B cell Activation Marker) Biolegend 144613
Antibody, PE anti-mouse CD169 (Siglec-1) Biolegend 142403
Antibody, PE/Cy7 anti-mouse CD38 Biolegend 102717
Antibody, PerCP/Cy5.5 anti-mouse/human CD45R/B220 Biolegend 103235
Capillary tube, Mylar-wrapped, heparinized Fisher Scientific 211766
Cell strainer, 70 µm Falcon 352350
Conical tubes, 50 mL Falcon 352235
Cover slip, square, 22x22 mm, 0.13-0.17 mm Thermo Fisher Scientific 22X22-1
EDTA Merck 1,084,180,250
Ethanol, 70% VWR 8301.360
Fetal bovine serum Life Technologies 10270106
Flow cytometer, FACS Canto II BD Biosciences 338962
Flow cytometer, LSRFortessa SORP BD Biosciences - Special order product with 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm and 640 nm)
Grease, high vacuum, Dow Corning VWR DOWC1597418
Hemocytometer, Burker-Türk VWR 630-1544
Isoflurane, IsoFlo vet. Orion Pharma 9658
Lymphocyte separation medium (Lympholyte-M Cell Separation Media) Cedarlane CL5035
Microcentrifuge tube, 1.5 mL (Eppendorf) Sarstedt 72.690.550
Microscope, Two-photon Prairie Technologies (now Bruker) - Special order Ultima In Vivo Two Photon Microscope
Mortar w. lip, unglazed, 75 ml VWR 410-0110
NaHCO3 Merck 1063290500
Needle, 18 gauge BD Medical 304622
NH4Cl VWR 87,769,290
PBS Sigma d8537
Pestle homogenizer VWR 47747-358
Pestle, unglazed, 175 mm VWR 410-0122
Pipette, Serological, 10 ml VWR 612-3700
Pipette, transfer, plastic Sarstedt 861,172,001
Plastic paraffin film (Parafilm M) Bemis PM996
Plate, 96-well Falcon 353910
Surgical forceps, Student Dumont #5 Forceps FST - Fine Science Tools 91150-20
Surgical forceps, Student Dumont #7 Forceps FST - Fine Science Tools 91197-00
Surgical scissors, Student Fine Scissors, Straight FST - Fine Science Tools 91460-11
Syringe, 10 mL Terumo SS-10ES1
Syringe, 20 mL Terumo SS-20ES1
Syringe, 5 mL Terumo SS-05S1
Syringe, Insulin, 0.3 cc BD Medical 324827
Tribrissen vet. 24% inj., containing 200 mg sulfadiazin and 40 mg trimethoprim/ml MSD Animal health 431577
Trypan blue solution, 0.4% VWR K940-100ML
Viability dye, eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 Thermo Fisher Scientific 65-0865-14

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lerner, A., Jeremias, P., Matthias, T. The World Incidence and Prevalence of Autoimmune Diseases is Increasing. International Journal of Celiac Disease. 3 (4), 151-155 (2015).
  2. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
  3. Mutoh, T., Miyata, T., Kashiwagi, S., Miyawaki, A., Ogawa, M. Dynamic behavior of individual cells in developing organotypic brain slices revealed by the photoconvertable protein Kaede. Experimental neurology. 200 (2), 430-437 (2006).
  4. Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein “Kaede” transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10871-10876 (2008).
  5. Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030 (2014).
  6. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
  7. Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science (New York, NY). 359 (6382), 1403-1407 (2018).
  8. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science (New York, NY). 297 (5588), 1873-1877 (2002).
  9. Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
  10. Habuchi, S., et al. Reversible single-molecule photoswitching in the GFP-like fluorescent protein Dronpa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9511-9516 (2005).
  11. Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science (New York, NY). 338 (6108), 810-814 (2012).
  12. Degn, S. E., et al. Clonal Evolution of Autoreactive Germinal Centers. Cell. 170 (5), 913-926 (2017).
  13. Berland, R., et al. Toll-like receptor 7-dependent loss of B cell tolerance in pathogenic autoantibody knockin mice. Immunity. 25 (3), 429-440 (2006).
  14. Chatterjee, P., et al. Complement C4 maintains peripheral B-cell tolerance in a myeloid cell dependent manner. European journal of immunology. 43 (9), 2441-2450 (2013).
  15. Toubai, T., et al. Induction of acute GVHD by sex-mismatched H-Y antigens in the absence of functional radiosensitive host hematopoietic-derived antigen-presenting cells. Blood. 119 (16), 3844-3853 (2012).
  16. Luzina, I. G., et al. Spontaneous formation of germinal centers in autoimmune mice. Journal of leukocyte biology. 70 (4), 578-584 (2001).
  17. Sachs, D. H., Kawai, T., Sykes, M. Induction of tolerance through mixed chimerism. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 4 (1), a015529 (2014).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sayı: 146 Photoactivation photoactivatable yeşil flüoresan protein (PA-GFP) otoimmünite dalak lenf nodu fare explant karışık kemik iliği chimera İki fotonlu mikroskobu
Bireysel Autoreactive Germinal merkezleri Photoactivation otoimmünite, karışık Chimeric modeli tarafından sorguya
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wittenborn, T. R., Hagert, C., Degn, … More

Wittenborn, T. R., Hagert, C., Degn, S. E. Interrogating Individual Autoreactive Germinal Centers by Photoactivation in a Mixed Chimeric Model of Autoimmunity. J. Vis. Exp. (146), e59397, doi:10.3791/59397 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter