यह प्रोटोकॉल सहज स्व-प्रतिरक्षित अंकुल केंद्रों के साथ मिश्रित म्यूरिन अस्थि मज्जा chimeras की पीढ़ी का वर्णन है, जिसमें autoreactive लिम्फोसाइटों एक photoactivatable हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (फिलीस्तीनी अथॉरिटी-gfp) रिपोर्टर ले । यह अनुप्रवाह आण्विक और कार्यात्मक विश्लेषण के साथ ऊतकों में सेलुलर स्थान लिंक करने की क्षमता प्रदान करता है ।
Autoimmune रोगों एक महत्वपूर्ण स्वास्थ्य बोझ मौजूद है । मौलिक विकास और स्व-प्रतिरक्षित रोग की प्रगति के बारे में सवाल अनुत्तरित रह । अंतर्निहित रोग तंत्र और सेलुलर गतिशीलता की हमारी समझ में प्रगति के लिए एक आवश्यकता अनुप्रवाह आणविक या कार्यात्मक विश्लेषण के साथ सेल सबसेट के microसंरचनात्मक स्थान का सटीक युग्मन है; एक लक्ष्य है कि परंपरागत रूप से प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो गया है । स्थिर photoactivatable जैविक फ्लोरोहोरेज़ के विकास और रिपोर्टर उपभेदों में उनके एकीकरण हाल ही में सटीक microसंरचनात्मक लेबलिंग और म्यूरिन मॉडल में सेलुलर सबसेट की ट्रैकिंग सक्षम है । यहां, हम वर्णन कैसे करने के लिए एक अंकुरण केंद्रों से autoreactive लिम्फोसाइटों का विश्लेषण करने की क्षमता autoimmunity में उपंयास अंतर्दृष्टि प्रदान करने में मदद कर सकते हैं, एक उदाहरण के रूप में एक photoactivatable रिपोर्टर के साथ autoimmunity के एक उपंयास chimeric मॉडल के संयोजन का उपयोग . हम एक photoactivatable हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन रिपोर्टर को लेकर लिम्फोसाइटों द्वारा आबादी सहज autoreactive अंकुल केंद्रों के साथ मिश्रित chimeras पैदा करने के लिए एक प्रक्रिया का प्रदर्शन । Vivo लेबलिंग रणनीतियों में उपयोग करते हुए, एकल अंकुरल केंद्र explanted लिम्फोइड ऊतकों और उनके सेलुलर घटक दो-photon माइक्रोस्कोपी द्वारा photoसक्रियित में कल्पना किया जा सकता है । एकल अंकुरल केंद्रों से Photoएक्टिवेट लिम्फोसाइटों तो विश्लेषण या प्रवाह cytometrically सॉर्ट किया जा सकता है, एकल कोशिकाओं या थोक में के रूप में, और अतिरिक्त बहाव आणविक और कार्यात्मक विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है. यह दृष्टिकोण सीधे autoimmunity के क्षेत्र में नए सिरे से अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन अस्थि मज्जा chimeras और photoactivation प्रक्रिया पैदा करने के लिए प्रक्रिया इसके अतिरिक्त संक्रामक रोगों के अध्ययन में व्यापक आवेदन मिल सकता है और ट्यूमर मेटास्टेसिस ।
पिछले दशकों में, विशेष रूप से पश्चिमी समाजों में स्व-प्रतिरक्षित रोग की घटना तेजी से बढ़ी है । आज, ऑटोइम्यून रोग पश्चिमी दुनिया1में रुग्णता और मृत्यु दर के सबसे प्रचलित कारणों की सूची में तीसरे स्थान पर है । मौलिक विकास और स्व-प्रतिरक्षित रोग की प्रगति के बारे में सवाल अनुत्तरित रह । अंतर्निहित रोग तंत्र और सेलुलर गतिशीलता की हमारी समझ में प्रगति के लिए एक आवश्यकता अनुप्रवाह आणविक या कार्यात्मक विश्लेषण के साथ सेल सबसेट के microसंरचनात्मक स्थान के सटीक युग्मन है । पिछले एक दशक में, स्थिर photoconvertible, photoactivatable, या photoswitchable जैविक फ्लोरोफोरेज़ और रिपोर्टर उपभेदों में उनके एकीकरण के एक नंबर के विकास सटीक microसंरचनात्मक लेबल और सेलुलर की ट्रैकिंग सक्षम है म्यूरिन मॉडल में सबसेट ।
Kaede, एक photoconvertible फ्लोरोसेंट एक पथरीले कोरल से उत्पन्न प्रोटीन, बैंगनी या पराबैंगनी प्रकाश2के लिए जोखिम पर लाल प्रतिदीप्ति के लिए हरी प्रतिदीप्ति से अपरिवर्तनीय photoconvertible से गुजरती है । शुरू में व्यक्तिगत कोशिकाओं के गतिशील व्यवहार का पालन करने के लिए organotypic मस्तिष्क स्लाइसें3विकसित करने में नियोजित, एक kaede दस्तक की पीढ़ी माउस में बाद में vivo में सेलुलर आंदोलन की अनुमति दी, और प्रणाली के विश्लेषण के लिए लागू किया गया था प्रतिरक्षा सेल माइग्रेशन और लिम्फ नोड्स से4. यह दृष्टिकोण बाद में एक दूसरी पीढ़ी के रिपोर्टर5के साथ परिष्कृत किया गया था । एक ऐसे ही रिपोर्टर Dendra6है, जो हाल ही में vivo7में लिम्फ नोड मेटास्टेसिस ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।
पहली photoactivatable प्रोटीन विकसित एक बिंदु उत्परिवर्तन (T203H) के साथ एक ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) इंजीनियर था, ४५० से ५५० एनएम8के तरंग दैर्ध्य क्षेत्र में एक बहुत कम absorbance के लिए अग्रणी । वायलेट लाइट द्वारा photoactivation के बाद, इस photoactivatable हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (फिलीस्तीनी अथॉरिटी-GFP) अपने अवशोषण अधिकतम स्विच ~ ४०० से ~ ५०० एनएम, एक अनुमानित १०० गुना तीव्रता वृद्धि जब ४८८ एनएम की एक तरंग दैर्ध्य के साथ उत्साहित । ट्रांसजेनिक चूहों की पीढ़ी जिसमें सभी हेमटोपोइटिक कोशिकाओं को PA-GFP की अनुमति है, पहली बार के लिए, अंकुरक केंद्र9के शारीरिक रूप से परिभाषित प्रकाश और अंधेरे क्षेत्रों में बी कोशिका चयन का गहराई से विश्लेषण ।
जबकि photoactivation एक फ्लोरोसेंट राज्य के लिए एक प्रतिदीप्त राज्य से एक अपरिवर्तनीय रूपांतरण है, और photoactivation एक तरंग दैर्ध्य से दूसरे करने के लिए एक मार्ग संक्रमण है, photoswitchable प्रोटीन दोनों शर्तों के बीच शटल करने में सक्षम है10 . यह उत्तरार्द्ध क्षमता हाल ही में प्रोटीन गतिविधि11के ऑप्टिकल नियंत्रण इंजीनियर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
फिलीस्तीनी अथॉरिटी-GFP रिपोर्टर का उपयोग, हम हाल ही में सहज रक्तिम के एक उपंयास मॉडल में एकल अंकुरल केंद्रों के बी सेल repertoires विशेषता-autoimmunity12की तरह । इस मॉडल के साथ मिश्रित chimeras पर आधारित है 1 भाग अस्थि मज्जा एक autoreactive बी सेल रिसेप्टर दस्तक शरण ribonuclear के लिए विशिष्टता के साथ-प्रोटीन परिसरों (564igi13,14) किसी भी वांछित से 2 भागों अस्थि मज्जा के साथ संयुक्त दाता. लगभग 6 सप्ताह के बाद पुनर्गठन, समस्थिति स्थितियों में प्राप्त कर रहे है जिसमें सहज autoreactive अंकुअल केंद्रों तिल्ली और त्वचीय लिम्फ नोड्स में मौजूद हैं । विशेष रूप से, अंकुर केंद्र बी सेल जनसंख्या लगभग विशेष रूप से है (~ ९५%) गैर-564Igi डिब्बे से व्युत्पंन कोशिकाओं से बना है, और इन जंगली प्रकार व्युत्पंन बी कोशिकाओं स्वतः सक्रिय हो गए हैं । इसलिए, मॉडल विभिन्न transgenes, दस्तक-बहिष्कार और संवाददाताओं का उपयोग autoreactive अंकुर केंद्र बी कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए एक ‘ प्लग और प्ले ‘ दृष्टिकोण की अनुमति देता है. यहां, हम सहज autoreactive अंकुर PA-gfp रिपोर्टर ले जाने लिम्फोसाइटों द्वारा आबादी केंद्रों के साथ मिश्रित chimeras पैदा करने के लिए प्रक्रिया का वर्णन । Vivo लेबलिंग रणनीतियों में उपयोग करते हुए, एकल अंकुरल केंद्रों को एक दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के उपयोग से explanted लसीकाभ ऊतकों और उनके सेलुलर घटकों में विज़ुअलाइज्ड किया जा सकता है । एकल अंकुरल केंद्रों से प्रकाशसक्रिय लिम्फोसाइटों को बाद में प्रवाह कोशिकामिति द्वारा विश्लेषित किया जा सकता है या फ्लूरोक्रोम-एक्टिवेट सेल सॉर्टिंग (FACS) द्वारा छांटा जाता है और अतिरिक्त डाउनस्ट्रीम आण्विक और कार्यात्मक विश्लेषणों के अधीन है । एकल अंकुरल केंद्रों से स्वत: सक्रिय लिम्फोसाइटों का विश्लेषण करने की क्षमता सीधे autoimmunity के क्षेत्र में नए सिरे से अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन तकनीकों और दृष्टिकोण के अध्ययन में इसके अतिरिक्त प्रासंगिक अनुप्रयोगों मिल सकता है वर्णित संक्रामक रोग और ट्यूमर मेटास्टेसिस ।
Autoimmunity के म्यूरिन मॉडल की एक बड़ी संख्या में उपलब्ध हैं, जिनमें से कई सहज अंकुरित केंद्रों16के साथ मौजूद हैं । हालांकि, उपलब्ध मॉडल के कई बंदरगाह जटिल आनुवंशिक पृष्ठभूमि या लिम्फोसाइट प्रसार या सक्रियण के केंद्रीय नियामकों में उत्परिवर्तनों, उंहें खराब रिपोर्टर लाइनों और सामांय लिम्फोसाइट व्यवहार के अध्ययन के साथ intercrossing के अनुकूल प्रतिपादन स्वत: प्रतिरक्षा में, क्रमशः । वर्तमान मॉडल, इसके विपरीत पर, एक ‘ प्लग और ‘ खेलने के दृष्टिकोण की अनुमति देता है में-autoreactive जंगली की गहराई से विश्लेषण-प्रकार व्युत्पंन अंकुल केंद्र बी कोशिकाओं transgenes के किसी भी वांछित संयोजन का उपयोग कर, दस्तक-बहिष्कार और पत्रकारों, वर्तमान मामले में द्वारा प्रतिनिधित्व photoactivatable GFP. Vivo लेबलिंग रणनीतियों में उपयोग करते हुए, एकल अंकुरल केंद्रों को एक दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के उपयोग से explanted लसीकाभ ऊतकों और उनके सेलुलर घटकों में विज़ुअलाइज्ड किया जा सकता है । एकल अंकुरल केंद्रों से Photoसक्रियित लिम्फोसाइटों तो विश्लेषण या प्रवाह cytometrically, एकल कोशिकाओं या थोक में के रूप में क्रमबद्ध किया जा सकता है. इन कोशिकाओं को बाद में अतिरिक्त बहाव आणविक और कार्यात्मक विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है के लिए autoimmunity के क्षेत्र में नए सिरे से अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं ।
इस कार्यविधि के सफल निष्पादन के लिए कुछ महत्वपूर्ण चरण हैं । के रूप में प्रतिनिधि परिणाम, विकिरण (१,१०० Rad) और दाता अस्थि मज्जा पुनर्गठन के द्वारा प्रदर्शन सफलतापूर्वक प्राप्तकर्ता अस्थि मज्जा बी सेल डिब्बे में पूरी तरह से chimerism उपज डिब्बे की जगह । यह एक महत्वपूर्ण बिंदु है, के रूप में अवशिष्ट प्राप्तकर्ता-B कोशिकाओं अंकुरण केंद्र जनसंख्या ‘ डार्क ‘ का एक सबसेट प्रदान करेगा । विकिरण के लिए इस्तेमाल किया स्रोत की परवाह किए बिना, खुराक/विकिरण के समय के लिए पशुओं के लिए ंयूनतम संपार्श्विक ऊतक नुकसान के साथ अधिकतम myeloablative प्रभाव उपज अनुकूलित किया जाना है । पुनर्गठन के लिए, अस्थि-क्रश प्रोटोकॉल और २०,०००,००० कुल रक्तदाता कोशिकाओं के साथ पुनर्गठन के लिए उच्च पुनर्गठन डिग्री के लिए अत्यधिक उपज पाया गया है । अस्थि मज्जा निष्कर्षण के लिए बाँझ और ठंड काम कर रही है और दाता मज्जा की उच्च व्यवहार्यता सुनिश्चित करता है । वांछित दाता अस्थि मज्जा अनुपात तक पहुंचने के लिए, यह महान देखभाल व्यायाम करने के लिए आवश्यक है जब कोशिकाओं के aliquots गिनती, दोनों ही गिनती के लिए और जब बाहर गिनती के लिए अस्थि मज्जा के उपप्रतिदर्श ले । मिश्रण और सह, बजाय सेंट्रीफ्यूज और फिर से शुरू करने के लिए दाता marrows, पेल्टिंग और फिर मिश्रण, सेल गिनती के बाद दाता अनुपात में किसी भी तिरछा को रोकने के लिए कार्य करता है ।
प्रोटोकॉल के मिश्रित अस्थि मज्जा कल्पना पीढ़ी अकेले खड़े कर सकते हैं, और यह किसी भी वांछित रिपोर्टर, transgene या दस्तक बाहर के साथ autoreactive अंकुअल केंद्रों के साथ chimeras के उत्पादन में सक्षम बनाता है । हालांकि, यह करने के लिए एक सीमा histocompatible दानदाताओं का उपयोग करने की आवश्यकता है । 564igi तनाव पर एक C57Bl/6j समस्वरिक पृष्ठभूमि है, और एक परिणाम के रूप में, अंय दाता (ओं) और प्राप्तकर्ताओं एक H-2b समस्वरिक पृष्ठभूमि होना चाहिए (या वैकल्पिक रूप से, 564igi तनाव वांछित तनाव और स्व-प्रतिरक्षित phenotype को backcrossed होना चाहिए नई पृष्ठभूमि पर सत्यापित) । विकिरण प्रक्रिया के लिए एक सहनशीलता17पर्यावरण एहसान जाता है, और कुछ मामूली histocompatibility एंटीजन में बेमेल बर्दाश्त किया जा सकता है । हालांकि, इस पहलू पर अच्छी तरह से विचार किया जाना चाहिए, विशेष रूप से अगर पुरुष और महिला दाताओं और/या प्राप्तकर्ताओं, पुरुष प्रतिबंधित Y-एंटीजन के साथ महिला जेट के लिए क्षमता के कारण मिश्रण ।
इसी तरह, प्रोटोकॉल के photoactivation पहलू अकेले खड़े हो सकते हैं, और कई अलग संदर्भों में इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, PA-gfp रिपोर्टर वर्तमान में केवल ubc promotor के साथ उपलब्ध है, जो सभी टेम वंश कोशिकाओं में सक्रिय है, लेकिन stromal कोशिकाओं में नहीं है । जैसा कि परिचय में कहा गया है, अंय photoactivatable, photoactivatable, या photoपरिवर्तनीय रिपोर्टर उपभेदों उपलब्ध हैं, और PA-GFP के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है, प्रायोगिक परिस्थितियों के उचित समायोजन के साथ ।
यह अवांछित क्षेत्रों के अनजाने photoactivation से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, ९०० एनएम जब इमेजिंग के ऊपर अच्छी तरह से लेजर बनाए रखने के द्वारा, के रूप में इस तरंग दैर्ध्य पीए GFP photoactivation नहीं होगा । खुद photoactivation के लिए, लेजर शक्ति और पिक्सेल ध्यान केंद्रित समय के रूप में विशिष्ट सेटिंग्स, ऊतक में गहराई पर निर्भर करेगा, विशिष्ट उपयोग ऊतक, और इमेजिंग प्रणाली, और प्रत्येक अनुप्रयोग के लिए विशिष्ट इमेजिंग इस्तेमाल किया प्रणाली के लिए अनुकूलित किया है । देखभाल करने के लिए नहीं किया जाना चाहिए photoक्षतिग्रस् त कोशिकाओं, लेकिन यह एक ही समय में आवश्यक है ढेर भर में कुशल धूप पाने के लिए, क्रम में बहाव के विश्लेषण के लिए सक्रिय कोशिकाओं का एक पर्याप्त प्रतिनिधित्व प्राप्त करने के लिए । अंकुरित केंद्र बी कोशिकाओं आमतौर पर कहीं भी ०.५% से प्लीहा या त्वचीय लिम्फ नोड बी कोशिकाओं के ~ 2% का गठन, और के रूप में प्रतिनिधि परिणामों से देखा जा सकता है (चित्रा 5), photoसक्रियित एकल अंकुल केंद्र बी कोशिकाओं को कुल का ~ 1% कर सकते है एक तिल्ली स्लाइस में मौजूद जनसंख्या । इसलिए, सफल विश्लेषण या कक्षों की एक महत्वपूर्ण संख्या की छंटाई घटनाओं की एक बड़ी संख्या में प्रसंस्करण की आवश्यकता है ।
The authors have nothing to disclose.
SE Degn एक Lundbeckfonden साथी और एक Carlsberg फाउंडेशन प्रतिष्ठित साथी है । यह काम अतिरिक्त रूप से एक NNF जैव चिकित्सा अनुदान (एसई Degn) द्वारा समर्थित था ।
Antibody, 9D11-A568 | In-house generated | 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Biotium 92255 | |
Antibody, 9D11-A647 | In-house generated | 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Nordic Biosite ABD-1031 | |
Antibody, FITC anti-mouse CD45.1 | Biolegend | 110705 | |
Antibody, Pacific Blue anti-mouse/human GL7 Antigen (T and B cell Activation Marker) | Biolegend | 144613 | |
Antibody, PE anti-mouse CD169 (Siglec-1) | Biolegend | 142403 | |
Antibody, PE/Cy7 anti-mouse CD38 | Biolegend | 102717 | |
Antibody, PerCP/Cy5.5 anti-mouse/human CD45R/B220 | Biolegend | 103235 | |
Capillary tube, Mylar-wrapped, heparinized | Fisher Scientific | 211766 | |
Cell strainer, 70 µm | Falcon | 352350 | |
Conical tubes, 50 mL | Falcon | 352235 | |
Cover slip, square, 22×22 mm, 0.13-0.17 mm | Thermo Fisher Scientific | 22X22-1 | |
EDTA | Merck | 1,084,180,250 | |
Ethanol, 70% | VWR | 8301.360 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
Flow cytometer, FACS Canto II | BD Biosciences | 338962 | |
Flow cytometer, LSRFortessa SORP | BD Biosciences | – | Special order product with 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm and 640 nm) |
Grease, high vacuum, Dow Corning | VWR | DOWC1597418 | |
Hemocytometer, Burker-Türk | VWR | 630-1544 | |
Isoflurane, IsoFlo vet. | Orion Pharma | 9658 | |
Lymphocyte separation medium (Lympholyte-M Cell Separation Media) | Cedarlane | CL5035 | |
Microcentrifuge tube, 1.5 mL (Eppendorf) | Sarstedt | 72.690.550 | |
Microscope, Two-photon | Prairie Technologies (now Bruker) | – | Special order Ultima In Vivo Two Photon Microscope |
Mortar w. lip, unglazed, 75 ml | VWR | 410-0110 | |
NaHCO3 | Merck | 1063290500 | |
Needle, 18 gauge | BD Medical | 304622 | |
NH4Cl | VWR | 87,769,290 | |
PBS | Sigma | d8537 | |
Pestle homogenizer | VWR | 47747-358 | |
Pestle, unglazed, 175 mm | VWR | 410-0122 | |
Pipette, Serological, 10 ml | VWR | 612-3700 | |
Pipette, transfer, plastic | Sarstedt | 861,172,001 | |
Plastic paraffin film (Parafilm M) | Bemis | PM996 | |
Plate, 96-well | Falcon | 353910 | |
Surgical forceps, Student Dumont #5 Forceps | FST – Fine Science Tools | 91150-20 | |
Surgical forceps, Student Dumont #7 Forceps | FST – Fine Science Tools | 91197-00 | |
Surgical scissors, Student Fine Scissors, Straight | FST – Fine Science Tools | 91460-11 | |
Syringe, 10 mL | Terumo | SS-10ES1 | |
Syringe, 20 mL | Terumo | SS-20ES1 | |
Syringe, 5 mL | Terumo | SS-05S1 | |
Syringe, Insulin, 0.3 cc | BD Medical | 324827 | |
Tribrissen vet. 24% inj., containing 200 mg sulfadiazin and 40 mg trimethoprim/ml | MSD Animal health | 431577 | |
Trypan blue solution, 0.4% | VWR | K940-100ML | |
Viability dye, eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher Scientific | 65-0865-14 |