Summary
관상 동맥 유량 예비물(CFR)은, 휴식하는 관상 동맥 혈류에 대한 최대 관상 동맥 혈류의 비율로 정의된다. 우리는 폐쇄성 관상 동맥 질환이없는 상태에서 심혈관 위험 요소를 예측 할 수있는 기회를 제공하는 초음파를 통해 쥐에서 CFR을 평가하기위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
관상 동맥 질환은 전 세계적으로 사망의 주요 원인입니다. 급성 심근 경색 후, 관상 동맥의 재카를 통한 조기 및 성공적인 심근 개입은 허혈성 심근의 크기를 줄이는 가장 효과적인 전략입니다. 관상 동맥 미세 혈관 구조는 생체 내에서시각화및 이미지화 할 수 없지만 관상 동맥 미세 혈관 기능에 직접 의존하는 매개 변수를 평가하는 데 사용할 수있는 몇 가지 침습적이고 비 침습적 인 기술이 있습니다. 허혈 재관류 후 내피 기능은 관상 동맥 유량 예비 (CFR)를 통해 관상 동맥 순환의 수준에서도 평가 될 수있다. 이 연구에서, 왼쪽 전방 내림차순의 피크 속도 (LAD) 관상 동맥 휴식 과 스트레스 도전 동안 Transthorcic 도플러 심초음파를 통해 생체 내 쥐에서 측정 되었다 (도부타민에 의해 유도). 정상적인 심장은 스트레스 유도 동안 휴식 값보다 최대 4 배까지 관상 동맥 혈류량을 증가시킬 수 있습니다. 허혈 재관류 다음, 우리는 관상 동맥 미세 혈관 기능 장애의 마커로 사용할 수있는 크게 감소 CFR을 발견했다. CFR은 미세 혈관 기능 장애의 중요성에 창을 열고 심각한 폐쇄성 질환이 존재하는지 여부에 관계없이 심혈관 위험을 예측하는 것으로 나타났습니다.
Introduction
심근 허혈 재관류 (IR)는 혈액 공급이 심장으로 제한되고 관류 및 동시 재산소화의 복원이 뒤따르는 상태입니다1. 관상 동맥의 폐색은 색전또는 콜레스테롤 플라크 파열에 의해 발생할 수 있습니다, 이는 신진 대사 공급과 수요의 심각한 불균형을 초래, 조직 저산소증을 일으키는. 위태로운 심근의 회수, 좌심실 기능 개선, 급성 심근 경색 환자에서 생존을 향상시키는 재관류 요법이 관찰되었습니다. 그러나 관상 동맥의 재절하 후, 작은 관상 동맥의 기능적 이상이발생할수 있습니다 2,3,4,5. 환자의 상당한 비율, 아마도 많은 40%, 관상 동맥 흐름의 복원에도 불구하고 미세 혈관과 심근 관류를 회복하지 않습니다. 관상 동맥 미세 혈관 구조의 시각화 및 평가는 생체 내에서 어려울 수 있지만 관상 동맥 미세 혈관 기능에 따라 매개 변수를 직접 평가하는 데 사용할 수있는 여러 가지 침습적 및 비 침습적 기술이 있습니다6 ,7. 또한, 내피 기능은 CFR 5를 통해 관상 동맥 순환의 수준에서평가 될 수있다.
경피도부 심초음파는 관상 동맥 흐름 속도 및 CFR5를연구할 수 있는 비침습적 도구입니다. CFR은 휴식 관상 동맥 혈류에 대한 최대 관상동맥 혈류량의 비율을 나타낸다 8. 스트레스 도전 중, 정상적인 심장은 휴식 값보다 최대 4 배까지 관상 동맥 혈류를 증가시킵니다. CFR이 감소될 때 심장 혈관 리스크는 증가합니다9. 이시하라 등은 관상동맥 혈관성형술 5 직후 CFR이 심하게손상된 것으로 나타났다. 관상 동맥 협착증이 없는 경우, CFR은 관상 동맥 기능 장애 동안 감소하고 안정된 관상 동맥 질환 (10)을 가진 환자의 약 절반에 존재한다.
이 방법의 전반적인 목표는 CFR을 계산하기 위하여 이용될 수 있는 심초음파를 통해 쥐에 있는 좌측 전방 내림차순 관상 동맥 (LAD) 기능의 비침범성 시각화입니다. 이 미세 혈관 기능 장애를 진단 하 고 잠재적인 치료 치료를 평가 하기 위한 중요 한 평가 도구를 제공 합니다.
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Protocol
모든 절차는 루이빌 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC 승인 프로토콜 18223)와 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 NIH 가이드에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었다11.
1. 동물
- 연구에 4개월 된 암컷 피셔 344마리(BW~150-180 g)를 사용하십시오.
2. IR 수술 전에 초음파 이미징
- 이소플루란으로 쥐를 마취 - 유도 챔버에서 5% 1.5-2.0 L/min O2 흐름 다음에 1.5-2.0% 1.5-2.0 L/min O2 흐름. 이 마취는 휴식과 스트레스 단계 동안 실험 전반에 걸쳐 유지됩니다.
- 동물을 척추 위치에 놓고 흉부면도하십시오. 내장 된 온난화 플랫폼을 사용하여 37-38 °C에서 체온을 유지하십시오. 소프트웨어를 사용하여 심박수를 모니터링합니다.
참고: 적절한 마취는 정상적인 생리적 속도로 심박수를 유지하는 데 매우 중요합니다(295-350 비트/분). - 화상 진찰 의 앞에 눈의 건조를 방지하기 위하여 안과 수의사 연고를 바하십시오.
- 13-24MHz 선형 프로브(예: MS250)(그림 1A)를사용하여 심초음파를 수행합니다.
- 가열 된 플랫폼에 척추 위치에 동물을 놓습니다. 마취가 코 콘을 통해 제어되도록하십시오. 그런 다음 레일 시스템을 사용하여 파라스테날 짧은 축 뷰(PSAX)를 얻기 위해 프로브를 위치시큐합니다(도1B).
- PSAX로부터 로스트랄 방향으로 프로브를 이동하여 폐 동맥을 찾습니다(도1B).
- 프로브를 폐 동맥에서 약간 방향으로 이동하여 LAD를 보고 이미지를 저장합니다.
참고 : LAD는 컬러 도플러없이 찾기 가 어렵기 때문에 LAD의 B 모드 이미지가 항상 가능한 것은 아닙니다. - 개인의 차이로 인해 LAD 관상 동맥을 찾기가 어려울 때 아래에 언급 된 기술을 따르십시오.
- 프로브를 폐 동맥으로 측면으로 이동합니다.
- 좌심실이 프로브로 더 쉽게 볼 수 있도록 동물이 기울어지거나, 반전되거나, 오른쪽으로 약간 향하게 되도록 플랫폼을 각도로 조정합니다.
- B 모드의 이미지를 캡처하거나 시네저장하면 터치 스크린에서 컬러 도플러를 클릭합니다(그림1C). 관상 동맥을 시각화 (흰색 화살표는 LAD를 나타냅니다)를 짧은 축에서 (그림1C). 실시간으로 볼 수 있듯이 적색은 흐름의 방향을 나타냅니다(즉, 혈류가 프로브쪽으로 향합니다).
- 컬러 도플러 모드에서 LAD를 시각화한 후 모드를 펄스 파(PW) 모드로 변경합니다. 관상 동맥에 노란색 표시선의 존재를 찾습니다 (그림2A).
- 관상 동맥 의 중간에 노란색 PW 라인을 배치합니다. 각도가 흐름 방향과 평행해야 합니다.
참고: 흐름의 속도는 PW 라인의 각도에 따라 크게 달라지므로 화면 프로브의 각도와 LAD 각도를 일치해야 합니다. 터치 스크린을 사용하여 각도를 조정합니다. PW 각도는 60° 미만이어야 합니다. - 시네 저장소를 사용하여 피크 디토롤에서 휴식하는 LAD 관상 동맥 흐름의 속도를 파형으로 캡처합니다(그림2B).
- 휴식 LAD 유속을 얻은 후 응력 중에 LAD의 최대 유속을 측정하여 CFR을 계산합니다. 응력 중 최대 유속을 측정하려면 도부타민을 꼬리 정맥 8(그림2C)을통해 20 μg/kg/min의 용량으로 주입합니다.
참고 : 도부타민 주입은 8 분 이상이어야한다. 주입 펌프를 사용하고 BD 10 mL 주사기에 대한 주입 펌프의 직경을 14.43로 설정하십시오.- 꼬리 정맥 통조림에 25G 주입 나비 세트를 사용하십시오. 주입 바늘을 배치하려면 쥐꼬리 의 기저부 주위에 작은 거즈 스트립을 배치 한 다음 지혈대를 잡고 지혈대를 비틀어 압력을 가하고 정맥이 확대됩니다.
- 바늘을 Dobutamine 주사기에 직접 연결하는 동안 놓습니다.
참고 : 꼬리 정맥에 바늘의 적절한 배치를 보장하기 위해 혈액을 그릴 때 실수로 약물을 도입하지 않도록주의하십시오. 또한 색전증이 동물에게 치명적일 수 있기 때문에 정맥에 기포가 유입되는 것을 피하십시오. - 바늘이 놓이면 접착제와 수술 용 테이프로 안정화하여 꼬리에 주입 라인을 고정하십시오.
- 흐름을 복구하기 위해 지혈대와 지혈대를 제거합니다.
- 주입 펌프에 Dobutamine 주사기를 놓고 20 μg / kg / min을 주입하도록 설정하십시오.
- 도부타민 주입 중에 LAD 피크와 심박수를 주의 깊게 모니터링하십시오. 도플러 모드에서 LAD PW 피크를 주기적으로 기록하며, 특히 도부타민에 반응하여 증가할 때마다 기록합니다.
참고: Dobutamine에 의해 유도 된 스트레스 도전 더 열심히 작동 하는 심장 원인; 이것은 종종 심장과 LAD의 움직임을 초래합니다. LAD를 보기 위해 동물, 프로브 또는 둘 다를 이동할 준비를 하십시오. - LAD 피크와 심박수가 도전 중에 고원 을 한 후, Dobutamine 주입을 중지, 꼬리 정맥 주입 세트를 제거하고 플랫폼에서 동물을 제거. 동물이 집 새장에서 회복되도록 하십시오.
- 그림 2B 및 C에 표시된 이미지에서 피크 확장속도를 얻으려면 피크 벨 도구를 선택합니다.
- CFR 지수를 RESTing LAD 피크 확장기 유속(도부타민) 피크 확장기 유속의 비율로 계산합니다(그림2A).
3. 허혈 재관류 부상
- 이소플루란으로 쥐를 마취 - 유도 챔버에서 5% 1.5-2.0 L/min O2 흐름다음에 1.5-2.0% 1.5-2.0 L/min O2 흐름.
- 페달 철수 반사의 부족에 의해 마취의 깊이를 확인합니다. 안과 수의사 연고를 눈에 사용하여 건조를 방지하십시오. 가열 패드 또는 동물 온도 조절기등을 사용하여 37-38°C의 적절한 체온을 유지합니다.
- 수술 전 멜록시캄을 투여, 5 mg / kg 근육 내, 15 수술 전에 분, 다음 2 mL 피하 볼루스의 0.9% 수술 중 탈수를 방지하기 위해 식염수. 멸균 장갑과 기구를 사용했으며 무균 기술이 사용되었습니다. 광섬유 광원을 사용하여 18 게이지 IV 카테터를 사용하여 쥐를 삽관하고 인공 호흡기에 연결하십시오.
- 8-0을 이용한 라이게이트 LAD 5번째 늑간 공간에서 15mm 개구부를 통해 모노 필라멘트 봉합사. 일반 매듭을 묶고 30 분 동안 둡니다. 30 분 후에 합자를 풀어 내고 1-2 분12동안 심장 근육의 이전에 변색 된 영역의 붉어짐에 의해 재관류를 확인하십시오.
- 중단 된 봉합사 패턴으로 4-0 흡수 성 봉합사를 사용하여 늑골 케이지를 닫은 다음 연속 봉합 패턴으로 5-0 비 흡수성 실크 봉합사를 사용하여 피부를 닫습니다.
- 마취에서 동물을 제거하십시오. 동물이 홈 케이지에서 회복되도록 하십시오. 5mg/kg 멜록시캄은 동물을 안락사하기 전에 24시간마다 근육내주사(수술 후 72시간)를 주입하였다.
4. IR 수술 후 초음파 이미징
- IR 수술 후 72 시간, 관상 동맥 흐름 및 CFR을 다시 측정하십시오. IR 측정 전과 측정값을 비교합니다. 위에서 설명한 대로 2.1~2.15단계를 반복합니다.
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Representative Results
이 연구를 위해, 우리는 사용 12 여성 피셔 344 쥐. 우리는 Dobutamine를 가진 긴장 시험을 수행하고 IR 수술 전후 및 72 시간 전에 LAD 관상 동맥 속도를 측정했습니다. IR 수술 전에, 휴식 LAD 관상 동맥 속도 423 ±59 mm/s로 측정되었다, 이는 도부타민 주입 후 증가했다 (1005 ± 77mm / s) (그림3A). 허혈 재관류의 72 시간 후, 휴식 LAD 관상 동맥 속도는 IR 수술 전에 휴식 LAD 관상 동맥 속도에 비해 상당히 높았다 (743 ± 40mm / s대 423 ± 59 mm / s) (그림 3A). IR 수술 후 도부타민 시험에 대한 스트레스 반응은 IR 수술 반응 전(937±67ms/s 대 1005±77mm/s)에 비해 현저히 감소하였다(도3A).
CFR은 응력(Dobutamine) 동안의 피크 유속과 나머지 유속(도부타민 주입 전 측정)의 비율로계산된다 8. CFR은 IR 수술 전 어린 쥐에서 2.1±0.35였으나 IR 수술 72시간 후(1.1±0.25) 현저히 감소하였으나, 휴식LAD 관상동맥 속도가 IR 수술 전에 얻은 데이터에 비해 이들 랫트에서 더 높았음에도 불구하고 ( 그림3C)를 참조하십시오. 또한, IR 수술의 72시간 후 쥐에서 좌심실의 수축기 기능에 유의한 변화가없었다(도 3C).
그림 1: 관상 동맥 위치. A. LAD 관상 동맥 속도를 얻는 동안 쥐에 프로브 위치. B. 폐 동맥, 대동맥 및 LAD 관상 동맥의 짧은 축 해부학적 표현. C. 심초음파에 LAD 관상 동맥의 해부학 시각화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: LAD 관상 동맥의 펄스파 속도 이미징. A. LAD 관상 동맥에 펄스 파 속도 센서 배치의 표현. B. LAD 관상 동맥 맥박 파 영상 휴식 상태 동안. C. LAD 관상 동맥 맥박 파 영상 동안 스트레스 (도부타민) 조건. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 도플러 심초음파를 이용한 관상동맥 흐름의 측정. A. 나머지 동안 제어에서 측정 펄스 파 속도 (콘트 B) 및 도부타민 주입 동안 (Cont D) 및 동물에서 72 나머지 동안 IR 수술의 시간 (IR B) 및 도부타민 도전 동안 (IR D), p & 0.05 콘트 B 대 허혈 재관류 B (*). B. CFR은 실험 동물(n=9), p< 0.05 Cont 대 IR(*)에서펄스파로부터 계산하였다. C.실험군으로부터의 분수 단축 평가(n=9). 데이터는 단방향 ANOVA로 분석된 평균 ± SD로 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 연구 결과에서 중요한 사실 인정은 IR이 어떤 잔류 혈관 조영술협증의 부재에도, 휴식 LAD 관상 동맥 속도를 증가시키고 CFR을 손상한다는 것입니다.
관상 동맥 질환을 치료하는 심장 전문의를 위한 임상 의사 결정의 필수적인 부분입니다 관상 동맥 생리학을 이해하는 것은 필수입니다. CFR은 관상 동맥 미세 순환7,13의병리생리학을 이해하는 데 중요한 기능적 매개 변수 중 하나이다. CFR은 관상동맥 협착증과 관상동맥 미세혈관 순환을 모두 평가하는 비침습적 방법이며 심근 혈류의 지표이며, 관상동맥이 스트레스 조건하에서 혈류를 증가시키는 능력을 명시적으로 7. 정상 CFR(> 2.0)은 종종 양호한 예후를 반영하는 반면, CFR은 1.90 미만은 고위험 관상동맥 질환의 식별을 위한 증분 진단 정보를 제공하는 반면14,15,16.
우리의 결과는 허혈 재관류 후 수축기 기능이 보존되었음에도 불구하고(도3C),CFR이 현저히 낮았다는 것을 보여준다(도3B). 따라서, 협착 관상 동맥의 재절하는 미세 혈관 관류를 개선하지 않습니다. 감소된 CFR은 허혈 재관류 후 손상된 미세 혈관 혈관 확장을 감지할 수 있게 합니다.
이 연구는 비침습적 경피적 도플러 심초음파를 사용하여 다양한 약리학적 치료의 효과를 탐구하는 직렬 CFR 평가를 보여줍니다. 관상 동맥 기능 평가의 이 방법은 실행 가능하고 실행 가능한 임상 진단 공구로 작은 동물 연구에서 이용될 수 있습니다. 이것은 작은 동물 모형에 있는 동물 사용, 안락사, 또는 부검의 필요를 최소화하는 지도할 것입니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 관상 동맥을 시각화하고 좋은 품질의 PW 속도 이미지를 얻는 것입니다. 또 다른 중요한 단계는 응력 상태 동안 LAD 시각화를 유지하는 것입니다. 도부타민 도전 도중, 심박수가 증가하고 LAD는 보기의 필드에서 이동할 수 있습니다; 연구원은 관상 동맥을 따르기 위하여 필드를 움직일 준비를 해야 합니다. 현재 연구에서 제한은 쥐의 생체 내 CFR과 관상 동맥 루멘 직경 사이의 상관 관계의 부족, 크기 측정을 위한 정확한 시각화를 얻기에 어려움으로 인하여 상대적으로 작은 샘플 크기를 포함합니다. 관상 동맥. 그러나 여기에 설명된 방법은 신뢰할 수 있고 재현 가능하며 허혈 재관류 다음심장 미세 혈관 구조에 가해지는 손상에 대한 통찰력있는 정보를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다
Acknowledgments
우리는 우리의 실험을 수행하기 위해 초음파 장비를 제공하는 Helmsley 재단에 감사드립니다. 이 작품은 NIA R01 053585 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | BD Syringe | 302995 | |
| 250S 13–24 MHz linear probe | FUJIFILM VisualSonics Inc | ||
| Dobutamine hydrochloride | Sigma | D0676-10mg | |
| Isoflurane | RRC | 27376 | |
| Legato 100 Syringe pump | KD Scientific | 788100 | |
| Vevo 3100 | FUJIFILM VisualSonics Inc | ||
| Winged infusion set, 27G x 1/2", | Medline.com | TMOSV27ELZ |
References
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