Summary
Koronar flödes reserven (CFR), definieras som förhållandet mellan maximalt koronarblodflöde till vilande koronarblodflödet. Vi presenterar ett protokoll för att utvärdera CFR hos råttor via ultraljud, vilket ger möjlighet att förutsäga kardiovaskulära riskfaktorer i avsaknad av obstruktiv kranskärlssjukdom.
Abstract
Kranskärlssjukdom är den vanligaste dödsorsaken i världen. Efter en akut hjärtinfarkt, tidig och framgångsrik hjärtinfarkt intervention via recanalization av kranskärlen är den mest effektiva strategin för att minska storleken på ischemisk myocardium. Koronar mikrovaskulatur kan inte visualiseras och avbildas in vivo, men det finns flera invasiva och noninvasiv teknik som kan användas för att bedöma parametrar som är beroende direkt på koronar mikrovaskulära funktion. Endotelfunktionen efter ischemi reperfusion kan bedömas också på nivån av kranskärls cirkulationen via koronar flödes reserven (CFR). I denna studie, topp hastighet av vänster främre fallande (LAD) kranskärlen mättes i råttor in vivo via Transthoracic Doppler ekokardiografi under vila och stress Challenge (induceras av dobutamin). Ett normalt hjärta kan öka sitt koronarblodflöde upp till fyra gånger över vilo värden under spännings induktion. Efter ischemi reperfusion, Vi hittade en betydligt minskad CFR, som kan användas som en markör för koronar mikrovaskulär dysfunktion. CFR har öppnat ett fönster om vikten av mikrovaskulär dysfunktion och har visat sig förutsäga kardiovaskulär risk oberoende av om den allvarliga obstruktiv sjukdom är närvarande.
Introduction
Myokardischemi reperfusion (IR) är ett tillstånd där blodtillförseln är begränsad till hjärtat följt av återställande av perfusion och samtidig reoxygenation1. Ocklusion av kranskärlen kan orsakas av en embolus eller kolesterol plack ruptur, vilket resulterar i en allvarlig obalans i metabolisk tillförsel och efterfrågan, orsakar vävnad hypoxi. Bärgning av äventyras hjärtmuskeln, förbättra vänsterkammarfunktion, och förbättra överlevnaden hos patienter med akut hjärtinfarkt har observerats av reperfusion terapi. Emellertid, efter recanalization av kranskärlen, funktionella avvikelser i små kranskärl kan förekomma2,3,4,5. En betydande andel av patienterna, kanske så många som 40%, inte återfå mikrovaskulär och hjärtinfarkt perfusion trots restaurering av koronar flöde. Visualisering och utvärdering av koronar mikrovaskulatur kan vara svårt in vivo, men det finns ett antal invasiva och noninvasiv teknik som kan användas för att bedöma parametrar direkt beroende på koronar mikrovaskulära funktion6 ,7. Dessutom kan endotelfunktionen bedömas i nivå med kranskärls cirkulationen via CFR5.
Transthoracic Doppler ekokardiografi är ett noninvasiv verktyg som tillåter oss att studera kranskärls flöde hastighet och CFR5. CFR representerar förhållandet mellan maximal koronar blodflödet till vilande koronar blodflödet8. Under stress Challenge, ett normalt hjärta ökar koronara blodflödet upp till fyra gånger över det vilande värdet. Kardiovaskulär risk ökar när CFR minskar9. Ishihara et al visade att CFR var allvarligt nedsatt omedelbart efter koronar angioplastik5. I avsaknad av kranskärls stenos, CFR minskar under koronar mikrovaskulär dysfunktion och finns i ungefär hälften av de patienter med stabil kranskärlssjukdom10.
Det övergripande målet för denna metod är noninvasiv visualisering av vänster främre fallande kranskärlssjukdom (LAD) funktion hos råttor via ekokardiografi, som kan användas för att beräkna CFR. Detta erbjuder ett viktigt bedömningsverktyg för att diagnostisera mikrovaskulär dysfunktion och utvärdera potentiella terapeutiska behandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av University of Louisville institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC-godkända protokoll 18223) och NIH guide för vård och användning av försöksdjur11.
1. djur
- Använd 4-månaders-gammal kvinnlig Fisher 344 råttor (BW ~ 150-180 g) för studien.
2. ultraljud avbildning före IR-kirurgi
- Anesthetize råtta med isofluran-induktion kammare på 5% med 1.5 – 2.0 L/min O2 flöde följt av 1.5 – 2.0% med 1.5 – 2.0 L/min O2 flöde. Denna anestesi upprätthålls under hela experimentet, under vila och stress stadier.
- Placera djuret i liggande läge och raka bröstkorgen. Bibehålla kroppstemperaturen vid 37-38 ° c med hjälp av den inbyggda uppvärmningen plattform. Pulsmätaren med hjälp av programvaran.
Obs: ordentlig anestesi är avgörande för att bibehålla hjärtfrekvensen vid normala fysiologiska frekvenser (mellan 295-350 beats/min). - Applicera oftalmisk vet salva för att förhindra torrhet i ögon före avbildning.
- Utför ekokardiografi med 13 – 24 MHz linjär sond (t. ex. MS250) (figur 1a).
- Placera djuret i ryggläge på den uppvärmda plattformen. Kontrollera att anestesi styrs via näsan konen. Placera sedan sonden för att få fram den korta axelvyn (PSAX) med hjälp av järnvägssystemet (figur 1b).
- Flytta sonden i rostralt riktning från PSAX, lokalisera lungartären (figur 1b).
- Flytta sonden något i riktning caudal från lungartären att Visa LAD och lagra bilden.
Obs: pojken är svårt att hitta utan färg Doppler, så B-läge bilder av pojken är inte alltid möjligt. - När individuella skillnader gör det svårt att lokalisera pojken koronar artären, följ tekniken som nämns nedan:
- Flytta sonden sidled till lungartären.
- Vinkel plattformen så att djuret lutar, inverteras, eller något mot höger sida så att vänster kammare är mer synligt med sonden.
- När bilden i B-läge är fångad eller Cine-lagrad, klicka på Färgdoppleren på pekskärmen (figur 1c). Visualisera hjärtats kranskärl (vita pilen indikerar LAD) i den korta axeln (figur 1c). Den röda färgen, som sett i realtid, är indikativt för riktningen av flödet (dvs., blodflödet är mot sonden).
- Efter att ha visualiserande LAD på en Färgdopplerläge, ändra läget till Pulse Wave (PW)-läge. Leta efter förekomst av en gul-indikatorlinje på hjärtats kranskärl (figur 2A).
- Placera den gula PW-linjen i mitten av hjärtats kranskärl. Se till att vinkeln är parallell med flödets riktning.
Obs: hastigheten på flödet är mycket beroende av vinkeln på PW linjen, så se till att matcha vinkeln på skärmen sonden med vinkeln på pojken. Använd pekskärmen för att justera vinkeln; PW vinkeln bör vara mindre än 60 °. - Använd Cine Store för att fånga hastigheten av vilande lad koronar flöde vid toppen diastole som vågformer (figur 2b).
- Efter erhållande av vilande LAD flöde hastighet, mäta den maximala flödeshastigheten av LAD under stressen att beräkna CFR. För att mäta den maximala flödeshastigheten under stressen, infusera dobutamin vid en dos på 20 μg/kg/min via svans ven8 (figur 2C).
Obs: dobutamin infusion bör inte vara mer än 8 min. Använd en infusionspump och Ställ in diametern på infusionspumpen till 14,43 för BD 10 mL spruta.- Använd 25-G infusion fjärilsset för svans venen kanylering. För att placera infusionen nålen, placera en liten remsa av gasväv runt basen av råttans svans, sedan ta med Peanger och vrid Tourniquet att tillämpa tryck och orsaka venen att förstora.
- Placera nålen medan den är direkt ansluten till dobutamin sprutan.
Obs: var extra noga med att inte oavsiktligt införa drogen vid utarbetandet av blod för att säkerställa korrekt placering av nålen i svansen ven. Också, se till att undvika att införa en luftbubbla i venen, som en emboli kan vara dödlig för djuret. - När nålen är placerad, stabilisera den med ett lim och en bit av kirurgisk tejp, säkra infusionsslang till svansen.
- Ta bort Peanger och Tourniquet att återvinna flödet.
- Placera Dobutaminsprutan i infusionspumpen och Ställ in den så att den injicerar 20 μg/kg/min.
- Under dobutamin infusion, noggrant övervaka LAD Peak och hjärtfrekvens. Regelbundet rekord LAD PW toppar i Doppler läge, särskilt när det ökar som svar på dobutamin.
Obs: stress Challenge induceras av dobutamin orsakar hjärtat att arbeta hårdare; Detta resulterar ofta i förflyttning av hjärtat och pojken. Var beredd att flytta djuret, sonden, eller båda för att hålla pojken i vyn. - Efter lad toppar och hjärtfrekvens har nått sitt tak under utmaningen, stoppa dobutamin infusion, ta bort svansen ven infusionsset och ta bort djuret från plattformen. Låt djuret återhämta sig i sin hembur.
- Välj Peak Vel verktyg för att erhålla de högsta diastoliska hastiteterna från bilderna som visas i figur 2b och C.
- Beräkna CFR index som förhållandet mellan LAD stress (dobutamin) topp diastoliskt flöde hastighet till vilande LAD Peak diastoliskt flöde hastighet (figur 2A).
3. ischemia reperfusion skada
- Anesthetize råtta med isofluran-induktion kammare på 5% med 1.5 – 2.0 L/min O2 flöde följt av 1.5 – 2.0% med 1.5 – 2.0 L/min O2 flöde.
- Bekräfta djupet av anestesi av avsaknaden av pedalen tillbakadragande reflex. Använd oftalmisk vet salva på ögonen för att förhindra torrhet. Upprätthålla rätt kroppstemperatur på 37-38 ° c med hjälp av en värmedyna eller en kontroll av djurens temperatur.
- Administrera pre-kirurgisk meloxikam, 5 mg/kg intramuskulärt, 15 min före operationen, följt av 2 mL subkutan bolus på 0,9% saltlösning för att förhindra uttorkning under operationen. Sterila handskar och instrument användes, och aseptiska tekniker anställdes. Använd den fiberoptiska ljuskällan, intubera råtta med hjälp av 18-gauge IV kateter och Anslut till ventilatorn.
- Ligate LAD med 8-0 monofilament sutur genom 15 mm öppning vid 5: e interkostal rymden. Knyt en vanlig Knut och låt verka i 30 min. visuellt bekräfta ischemi hos alla råttor via missfärgning av hjärtats yta12. Släpp ligatur efter 30 min och kontrollera reperfusion av rodnad av tidigare missfärgade området hjärtmuskeln för 1-2 min12.
- Stäng revbens buren med 4-0 resorberbar sutur med ett avbrutet sutur mönster, stäng sedan huden med 5-0 icke-absorberbara sidensuturen med kontinuerligt sutur mönster.
- Ta bort djuret från anestesi. Låt djuret återhämta sig i hem buren. 5mg/kg meloxikam injicerades intramuskulär i varje dygn före euthanizing djuret (72timmar efter operationen).
4. ultraljud Imaging efter IR-kirurgi
- 72 h efter IR-kirurgi, Mät koronarflödet och CFR igen. Jämför mätningarna med före IR-mätningar. Upprepa steg 2,1 till 2,15 enligt beskrivningen ovan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För denna studie, vi använde 12 kvinnliga Fisher 344 råttor. Vi utförde ett stresstest med dobutamin och uppmätt LAD kranskärls hastighet före och 72 timmar efter IR-operationen. Före IR-operationen mättes vilande LAD kranskärls hastighet som 423 ± 59 mm/s, vilket ökades efter Dobutamininfusion (1005 ± 77mm/s) (figur 3a). Efter 72 h av ischemi reperfusion, vilande lad kranskärls hastighet var signifikant högre jämfört med vilande lad kranskärls hastighet före IR-kirurgi (743 ± 40mm/s vs 423 ± 59 mm/s) (figur 3a). Stress reaktionen på Dobutamintest efter att IR-operationen minskades signifikant jämfört med före IR-kirurgiska svar (937 ± 67ms/s vs 1005 ± 77mm/s) (figur 3a).
CFR beräknas som förhållandet mellan toppflödets hastighet under stress (dobutamin) till vilo flödets hastighet (uppmätt före dobutamin-infusion)8. CFR var 2,1 ± 0,35 hos unga råttor före IR-kirurgi (figur 3b) men signifikant reducerad (1,1 ± 0,25) efter 72 h av IR-kirurgi, även om vilande lad kranskärls hastighet var högre hos dessa råttor jämfört med data som erhållits före IR-kirurgi ( Diagram 3C). Dessutom fanns det inga signifikanta förändringar i den systoliska funktionen av vänster kammare hos råttor efter 72 h av IR-kirurgi (figur 3c).
Figur 1: kranskärls plats. A. sond position på råtta samtidigt få lad kranskärls hastighet. B. kort axel anatomisk representation av lungartären, aorta, och LAD kranskärl. C. anatomisk visualisering av lad kranskärlssjukdom på ekokardiografi. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: pulsen våg hastighet avbildning av lad koronar artär. A. representation av puls vågen hastighetssensor placering på LAD kranskärl. B. lad kranskärls puls våg bild under resten skick. C. lad kranskärls puls våg bild under stress (dobutamin) skick. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Mätning av koronarflödet med hjälp av Dopplerekokardiografi. A. puls Vågs hastighet mätt i kontroll under resten (CONT b) och under dobutamin infusion (CONT D) och hos djur efter 72 h av IR-kirurgi under resten (IR B) och under dobutamin Challenge (IR D), p < 0,05 CONT b vs. ischemi reperfusion B (*). B. CFR beräknades från pulsvåg i försöksdjuren (n = 9), p ≪ 0,05 forts vs. IR (*). C. analys av fraktionerad förkortning från försöks grupperna (n = 9). Data presenteras som medelvärdet ± SD, analyseras med enkelriktad ANOVA. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De viktigaste resultaten från den nuvarande studien är att IR ökar vilande LAD kranskärls hastighet och försämrar CFR, även i avsaknad av kvarvarande angiografisk stenos.
Förstå koronarfysiologi är en viktig del av det kliniska beslutsfattandet för kardiologer att behandla kranskärlssjukdom. CFR är en av de viktiga funktionella parametrarna i förståelsen av patofysiologin för koronar mikrocirkulation7,13. CFR är en noninvasiv metod för att bedöma både kranskärls stenos och koronar mikrovaskulär cirkulation och är en indikator på hjärtinfarkt blodtillförsel, uttryckligen förmågan hos hjärtinfarkt att öka blodflödet under stress villkor7. En normal CFR (>2,0) återspeglar ofta en bra prognos, medan CFR mindre än 1,90 ger inkrementell diagnostisk information för identifiering av högrisk kranskärlssjukdom14,15,16.
Våra resultat visar att, även om den systoliska funktionen bevarades efter ischemisk reperfusion (figur 3c), var CFR signifikant lägre (figur 3b). Således, recanalization av stenotisk kranskärl förbättrar inte mikrovaskulära perfusion. Minskad CFR möjliggör detektion av försämrad mikrovaskulär vasodilatation efter ischemi reperfusion.
Denna studie visar den seriella CFR utvärderingar för att undersöka effekten av olika farmakologiska terapier med noninvasiv transtorakal Doppler ekokardiografi. Denna metod för koronar funktionell bedömning kan användas i smådjur forskning som ett genomförbart och livskraftigt kliniskt diagnostiskt verktyg. Detta kommer att leda till att minimera kravet på djuranvändning, eutanasi, eller obduktion i små djurmodeller. Kritiska steg i detta protokoll visualiserar kranskärlen och få PW hastighet bilder av god kvalitet. Ett annat kritiskt steg är att bibehålla LAD visualisering under stress tillståndet. Under dobutamin Challenge, hjärtfrekvensen ökar och pojken kan flytta från synfältet; forskare bör vara beredda att flytta fältet för att följa hjärtats kranskärl. Begränsningar i den aktuella studien inkluderar relativt liten urvalsstorlek, bristen på korrelation mellan CFR och kranskärls lumen diameter in vivo hos råttor, på grund av svårigheten att få korrekt visualisering för storleksmätning av kranskärlssjukdom. Men de metoder som beskrivs här är tillförlitliga, reproducerbara, och erbjuder insiktsfull information om de skador som orsakats på kardiell mikrovaskulatur efter ischemi reperfusion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja
Acknowledgments
Vi vill tacka Helmsley Foundation för att tillhandahålla ultraljudsutrustning för att utföra våra experiment. Detta arbete stöddes av NIA R01 053585 Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | BD Syringe | 302995 | |
| 250S 13–24 MHz linear probe | FUJIFILM VisualSonics Inc | ||
| Dobutamine hydrochloride | Sigma | D0676-10mg | |
| Isoflurane | RRC | 27376 | |
| Legato 100 Syringe pump | KD Scientific | 788100 | |
| Vevo 3100 | FUJIFILM VisualSonics Inc | ||
| Winged infusion set, 27G x 1/2", | Medline.com | TMOSV27ELZ |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nature medicine. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- French, C. J., Zaman, A. K., Sobel, B. E. Failure of erythropoietin to render jeopardized ischemic myocardium amenable to incremental salvage by early reperfusion. Coronary Artery Disease. 20 (4), 295-299 (2009).
- Marzilli, M., Mariani, M. Ischemia-reperfusion and microvascular dysfunction: implications for salvage of jeopardized myocardium and reduction of infarct size. Italian Heart Journal. 2 Suppl 3, 40s-42s (2001).
- Prasad, A., Gersh, B. J. Management of microvascular dysfunction and reperfusion injury. Heart (British Cardiac Society). 91 (12), 1530-1532 (2005).
- Ishihara, M., et al. Impaired coronary flow reserve immediately after coronary angioplasty in patients with acute myocardial infarction. British heart journal. 69 (4), 288-292 (1993).
- Camici, P. G., d'Amati, G., Rimoldi, O. Coronary microvascular dysfunction: mechanisms and functional assessment. Nature Reviews Cardiology. 12 (1), 48-62 (2015).
- Chung, K. S., Nguyen, P. K. Non-invasive measures of coronary microcirculation: Taking the long road to the clinic. Journal of Nuclear Cardiology. , (2017).
- Kelm, N. Q., et al. Adipose-derived cells improve left ventricular diastolic function and increase microvascular perfusion in advanced age. PLoS One. 13 (8), e0202934 (2018).
- Pan, M., et al. Late recovery of coronary flow reserve in patients successfully treated with a percutaneous procedure. Revista Española de Cardiología. 56 (5), 459-464 (2003).
- Samim, A., Nugent, L., Mehta, P. K., Shufelt, C., Bairey Merz, C. N. Treatment of angina and microvascular coronary dysfunction. Current treatment options in cardiovascular medicine. 12 (4), 355-364 (2010).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edition, The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health (2011).
- Ciuffreda, M. C., et al. Rat experimental model of myocardial ischemia/reperfusion injury: an ethical approach to set up the analgesic management of acute post-surgical pain. PloS one. 9 (4), e95913-e95913 (2014).
- van de Hoef, T. P., Siebes, M., Spaan, J. A. E., Piek, J. J. Fundamentals in clinical coronary physiology: why coronary flow is more important than coronary pressure. European Heart Journal. 36 (47), 3312-3319 (2015).
- Naya, M., et al. Preserved coronary flow reserve effectively excludes high-risk coronary artery disease on angiography. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 55 (2), 248-255 (2014).
- Cortigiani, L., et al. Diagnostic and prognostic value of Doppler echocardiographic coronary flow reserve in the left anterior descending artery. Heart (British Cardiac Society). 97 (21), 1758 (2011).
- Kawata, T., et al. Prognostic value of coronary flow reserve assessed by transthoracic Doppler echocardiography on long-term outcome in asymptomatic patients with type 2 diabetes without overt coronary artery disease. Cardiovascular diabetology. 12, 121-121 (2013).
