Summary
冠状动脉流动储备(CFR),定义为最大冠状动脉血流与休息冠状动脉血流的比例。我们提出了通过超声波评估大鼠CFR的协议,这为在没有阻塞性冠心病的情况下预测心血管危险因素提供了机会。
Abstract
冠状动脉疾病是全世界的主要死因。急性心肌梗死后,通过冠状动脉的再造进行早期和成功的心肌干预是减少缺血性心肌大小的最有效的策略。冠状微血管在体内无法可视化和成像,但有几个侵入性和非侵入性技术可用于评估直接依赖于冠状微血管功能的参数。缺血再灌注后的内皮功能也可通过冠状动脉流动储备(CFR)在冠状动脉循环水平上进行评估。在这项研究中,在休息和压力挑战(多布他明诱导)期间,通过跨胸多普勒超声心动图在大鼠体内测量左前下降(LAD)冠状动脉的峰值速度。正常心脏在压力诱导期间,其冠状动脉血液流量可增加至静息值的四倍以上。继缺血再灌注后,我们发现CFR显著减少,可作为冠状微血管功能障碍的标志。CFR打开了一扇关于微血管功能障碍重要性的窗口,并已证明可以预测心血管风险,而与是否存在严重的阻塞性疾病无关。
Introduction
心肌缺血再灌注(IR)是血液供应仅限于心脏,然后恢复灌注和同时再氧1的条件。冠状动脉的闭塞可由栓塞或胆固醇斑块破裂引起,导致代谢供求严重失衡,导致组织缺氧。通过再灌注疗法,抢救危害性心肌,改善左心室功能,提高急性心肌梗死患者的存活率。然而,在冠状动脉重新血管化后,小冠状血管的功能异常可能发生2、3、4、5。尽管冠状动脉流动已经恢复,但相当一部分患者(可能多达40%)不会恢复微血管和心肌灌注。冠状微血管的可视化和评估在体内可能很困难,但有许多侵入性和非侵入性技术可以直接根据冠状微血管功能评估参数6 ,7.此外,内皮功能可以通过CFR5在冠状环流水平上进行评估。
跨胸多普勒超声心动图是一种非侵入性工具,它使我们能够研究冠状动脉流速和CFR 5。CFR表示最大冠状动脉血流与休息冠状动脉血流比8。在压力挑战期间,正常心脏增加冠状动脉血流量,比休息值高四倍。当CFR减少9时,心血管风险增加。石原等人显示,CFR在冠状血管造形5后立即严重受损。在没有冠状动脉狭窄的情况下,CFR在冠状微血管功能障碍期间减少,在大约一半的冠状动脉疾病10患者中存在。
该方法的总体目标是通过超声心动图对大鼠左前下冠状动脉(LAD)功能进行非侵入性可视化,用于计算CFR。这为诊断微血管功能障碍和评估潜在的治疗提供了重要的评估工具。
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Protocol
所有程序都按照路易斯维尔大学机构动物护理和使用委员会(IACUC批准的18223号协议)和NIH《实验室动物护理和使用指南》11批准的程序进行。
1. 动物
- 使用4个月大的雌性费舍尔344大鼠(BW=150-180g)进行研究。
2. 红外手术前的超声成像
- 用异常鲁兰麻醉大鼠 - 感应室,5%,1.5~2.0 L/min O2流量,然后是1.5~2.0%,电流为1.5~2.0升/分钟O2流量。这种麻醉在整个实验过程中,在休息和压力阶段保持。
- 将动物置于上部位置,并扫描胸部。使用内置的加热平台将体温保持在37-38°C。使用软件监控心率。
注:适当的麻醉对于保持心率在正常生理速率(295-350拍/分钟之间)至关重要。 - 应用眼科兽医膏,以防止眼睛干燥之前成像。
- 使用 13~24 MHz 线性探头(例如 MS250)执行超声心动图(图 1A)。
- 将动物放在加热平台上的上部位置。确保麻醉通过鼻锥控制。然后定位探头,以便使用导轨系统获得截带短轴视图 (PSAX)(图1B)。
- 从 PSAX 向罗斯拉尔方向移动探头,定位肺动脉(图1B)。
- 从肺动脉向胆小方向微移探头,以查看 LAD 并存储图像。
注: 如果没有彩色多普勒,很难找到 LAD,因此 LAD 的 B 模式图像并不总是可能的。 - 当个别差异导致难以定位 LAD 冠状动脉时,请遵循以下技术:
- 将探头横向移到肺动脉上。
- 将平台倾斜,使动物向右侧倾斜、倒置或稍微倾斜,以便探头更容易看到左心室。
- 一旦在B模式下的图像被捕获或电影存储,点击触摸屏上的彩色多普勒(图1C)。在短轴中可视化冠状动脉(白色箭头表示 LAD)(图 1C)。实时看到的红色表示流动的方向(即血流流向探头)。
- 在彩色多普勒模式下可视化 LAD 后,将模式更改为脉冲波(PW) 模式。查找冠状动脉上是否存在黄色指示线(图 2A)。
- 将黄色 PW 线放在冠状动脉中间。确保角度与流动方向平行。
注: 流速高度依赖于 PW 线的角度,因此请确保将屏幕探头的角度与 LAD 的角度相匹配。使用触摸屏调整角度;PW 角度应小于 60°。 - 使用cine存储捕获静止的LAD冠状流在峰值的波形(图2B)。
- 获得静止的LAD流速后,测量拉速在应力期间的最大流速以计算CFR。要测量应力期间的最大流速,通过尾静脉 8(图 2C) 以 20 μg/kg/min的剂量注入多布他明。
注:多布他明输注不应超过8分钟。使用输注泵,将输液泵的直径设置为14.43,用于BD 10 mL注射器。- 使用25-G输注蝶套的尾静脉罐。要放置输液针,在大鼠尾巴底部周围放置一小块纱布,然后用止热剂抓住并扭转止液以施加压力,使静脉变大。
- 直接连接到多布他明注射器时放置针头。
注意:在抽取血液时要格外小心,不要意外引入药物,以确保针头正确放置在尾静脉中。此外,一定要避免将气泡引入静脉,因为栓塞可能对动物致命。 - 一旦针被放置,用胶水和一块手术胶带稳定它,固定输注线到尾巴。
- 取出止动器和止动器以恢复流量。
- 将多布他明注射器放入输注泵,并将其设置为注射20微克/千克/分钟。
- 在多丁胺输注期间,仔细监测LAD的峰值和心率。在多普勒模式下定期记录 LAD PW 峰值,特别是当它因多布他胺响应而增加时。
注:多布他胺引起的压力挑战使心脏工作更加努力;这往往导致心脏和LAD的运动。准备好移动动物、探头或两者,以便保持 LAD 处于视野。 - 在挑战期间LAD峰值和心率趋于稳定后,停止多布他明输注,取出尾静脉输液套,并将动物从平台上取出。让动物在家里的笼子里恢复。
- 选择峰值 Vel工具从图 2B 和 C中所示的图像中获取峰值舒张速度。
- 将 CFR 指数计算为 LAD 应力(多布胺)峰值舒张流速与静止的 LAD 峰值舒张流速的比率(图2A)。
3. 缺血再灌注损伤
- 用异常鲁兰麻醉大鼠 - 感应室,5%,1.5~2.0 L/min O2流量,后1.5~2.0%,电流1.5~2.0升/分钟O2流量。
- 确认麻醉的深度,缺乏踏板退出反射。在眼睛上使用眼科兽医膏,以防止干燥。使用加热垫或动物温度控制器保持37-38°C的合适体温。
- 在手术前施用Meloxicam,5mg/kg肌肉,手术前15分钟,然后是2 mL皮下0.9%盐水,以防止手术期间脱水。使用了无菌手套和仪器,并采用了无菌技术。使用光纤光源,使用 18 度 IV 导管对大鼠进行插管,并连接到呼吸机。
- 使用 8-0 使用利盖特 LAD在第5个间空间通过15毫米开口缝合单丝缝合。系一个普通结,离开30分钟。通过心脏表面变色,目视确认所有大鼠缺血。释放结扎后30分钟,并验证重新灌注,通过以前变色的心肌区域变红1-2分钟12。
- 使用4-0可吸收缝合线,用中断的缝合线模式关闭肋骨保持架,然后用5-0不可吸收的丝缝合线与连续缝合图案合上皮肤。
- 将动物从麻醉中取出。让动物在家庭笼子里恢复。5mg/kg Meloxicam每24小时注射一次肌肉内,然后给动物安乐死(手术后72小时)。
4. 红外手术后的超声成像
- 72小时后,IR手术后,再次测量冠状动脉流量和CFR。将测量值与红外测量前相比。如上文所述,重复步骤 2.1 到 2.15。
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Representative Results
在这项研究中,我们使用了12只雌性费舍尔344只大鼠。我们使用多布他明进行了压力测试,并在红外手术前和72小时后测量了LAD冠状动脉速度。在IR手术之前,休息的LAD冠状动脉速度被测量为423×59mm/s,在多布他明输注(1005×77mm/s)后增加(图3A)。72 h缺血再灌注后,休息的LAD冠状动脉速度明显高于在IR手术前休息的LAD冠状动脉速度(743 × 40mm/s vs 423 × 59 mm/s) (图3A)。与红外手术前的反应(937 ± 67ms/s vs 1005 = 77mm/s) 相比,IR手术后对多布他明测试的压力反应显著减少(图3A)。
CFR计算为应力(多布他明)期间的峰值流速与静止流速(多布他明输注前测量)8的比率。 在红外手术前,幼鼠的CFR为2.1 ±0.35,但IR手术72小时后显著减少(1.1 ± 0.25),即使这些大鼠的休息LAD冠状动脉速度高于IR手术前获得的数据(图 3C.此外,在72小时进行IR手术后,大鼠左心室的收缩功能没有显著变化(图3C)。
图1:冠状动脉位置。A.在获得LAD冠状动脉速度时对大鼠的探针位置。B.肺动脉、主动脉和LAD冠状动脉的短轴解剖表征。C. LAD冠状动脉在超声心动图上的解剖可视化。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:LAD冠状动脉的脉冲波速度成像。A.脉冲波速度传感器在LAD冠状动脉上的放置的表示。B. LAD冠状动脉脉冲波图像在休息条件下。C. LAD冠状动脉脉冲波图像在应力(多布他明)条件下。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.使用多普勒超声心动图测量冠状动脉流量。A.在休息期间(Cont B)和多布他明输注(Cont D)期间和动物在休息期间(IR B)和多布他明挑战(IR D)期间72小时,在控制中测量的脉冲波速度,p <0.05 Cont B vs. 缺血再灌注 B (*)。B. CFR是根据实验动物的脉冲波(n=9),p <0.05 Cont vs. IR (*)计算的。C.实验组的分数缩短评估(n=9)。数据以均值 = SD 形式呈现,使用单向方差分析进行分析。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
本研究的主要发现是,即使在没有任何残留血管狭窄的情况下,IR也会增加休息的LAD冠状动脉速度,并损害CFR。
了解冠状动脉生理学是心脏病学家治疗冠状动脉疾病的临床决策的重要组成部分。CFR是了解冠状微循环病理生理学的重要功能参数之一。CFR是一种评估冠状动脉狭窄和冠状动脉微血管循环的非侵入性方法,是心肌供血指标,明确表明冠状动脉在应激条件下增加血流量的能力7。正常的CFR(>2.0)通常反映良好的预后,而CFR小于1.90提供增量诊断信息,用于识别高风险冠状动脉疾病14,15,16。
结果表明,即使收缩功能在缺血再灌注后得以保留(图3C),CFR也明显较低(图3B)。因此,动脉冠状动脉的重新灌管不会改善微血管灌注。CFR降低可检测缺血再灌注后受损的微血管血管扩张。
本研究演示了串行CFR评估,以探索使用非侵入性转胸多普勒超声心动图的各种药理疗法的效果。这种冠状动脉功能评估方法可作为一种可行可行的临床诊断工具,用于小动物研究。这将导致尽量减少小动物模型中对动物使用、安乐死或尸检的要求。该协议的关键步骤是可视化冠状动脉和获得良好的质量的PW速度图像。另一个关键步骤是在压力状态期间保持 LAD 可视化。在多布他明挑战期间,心率增加,LAD可能从视野中移动;研究人员应该准备移动领域,以跟踪冠状动脉。目前研究的局限性包括样本量相对较小,CFR与大鼠体内冠状动脉流明直径之间缺乏相关性,因为难以获得对大鼠尺寸测量的精确可视化。冠状动脉。然而,这里描述的方法是可靠的,可重复的,并提供关于缺血再灌注后心脏微血管损伤的有见地的信息。
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Disclosures
作者没有什么可透露的
Acknowledgments
我们要感谢赫尔姆斯利基金会提供超声波设备来进行我们的实验。这项工作得到了NIA R01 053585赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | BD Syringe | 302995 | |
| 250S 13–24 MHz linear probe | FUJIFILM VisualSonics Inc | ||
| Dobutamine hydrochloride | Sigma | D0676-10mg | |
| Isoflurane | RRC | 27376 | |
| Legato 100 Syringe pump | KD Scientific | 788100 | |
| Vevo 3100 | FUJIFILM VisualSonics Inc | ||
| Winged infusion set, 27G x 1/2", | Medline.com | TMOSV27ELZ |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nature medicine. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- French, C. J., Zaman, A. K., Sobel, B. E. Failure of erythropoietin to render jeopardized ischemic myocardium amenable to incremental salvage by early reperfusion. Coronary Artery Disease. 20 (4), 295-299 (2009).
- Marzilli, M., Mariani, M. Ischemia-reperfusion and microvascular dysfunction: implications for salvage of jeopardized myocardium and reduction of infarct size. Italian Heart Journal. 2 Suppl 3, 40s-42s (2001).
- Prasad, A., Gersh, B. J. Management of microvascular dysfunction and reperfusion injury. Heart (British Cardiac Society). 91 (12), 1530-1532 (2005).
- Ishihara, M., et al. Impaired coronary flow reserve immediately after coronary angioplasty in patients with acute myocardial infarction. British heart journal. 69 (4), 288-292 (1993).
- Camici, P. G., d'Amati, G., Rimoldi, O. Coronary microvascular dysfunction: mechanisms and functional assessment. Nature Reviews Cardiology. 12 (1), 48-62 (2015).
- Chung, K. S., Nguyen, P. K. Non-invasive measures of coronary microcirculation: Taking the long road to the clinic. Journal of Nuclear Cardiology. , (2017).
- Kelm, N. Q., et al. Adipose-derived cells improve left ventricular diastolic function and increase microvascular perfusion in advanced age. PLoS One. 13 (8), e0202934 (2018).
- Pan, M., et al. Late recovery of coronary flow reserve in patients successfully treated with a percutaneous procedure. Revista Española de Cardiología. 56 (5), 459-464 (2003).
- Samim, A., Nugent, L., Mehta, P. K., Shufelt, C., Bairey Merz, C. N. Treatment of angina and microvascular coronary dysfunction. Current treatment options in cardiovascular medicine. 12 (4), 355-364 (2010).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edition, The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health (2011).
- Ciuffreda, M. C., et al. Rat experimental model of myocardial ischemia/reperfusion injury: an ethical approach to set up the analgesic management of acute post-surgical pain. PloS one. 9 (4), e95913-e95913 (2014).
- van de Hoef, T. P., Siebes, M., Spaan, J. A. E., Piek, J. J. Fundamentals in clinical coronary physiology: why coronary flow is more important than coronary pressure. European Heart Journal. 36 (47), 3312-3319 (2015).
- Naya, M., et al. Preserved coronary flow reserve effectively excludes high-risk coronary artery disease on angiography. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 55 (2), 248-255 (2014).
- Cortigiani, L., et al. Diagnostic and prognostic value of Doppler echocardiographic coronary flow reserve in the left anterior descending artery. Heart (British Cardiac Society). 97 (21), 1758 (2011).
- Kawata, T., et al. Prognostic value of coronary flow reserve assessed by transthoracic Doppler echocardiography on long-term outcome in asymptomatic patients with type 2 diabetes without overt coronary artery disease. Cardiovascular diabetology. 12, 121-121 (2013).
