Summary
冠状流れ予備(CFR)は、休止冠動脈血流に対する最大冠状血流の比率として定義される。我々は、閉塞性冠動脈疾患がない場合の心血管リスク因子を予測する機会を提供する超音波を介してラットのCFRを評価するためのプロトコルを提示する。
Abstract
冠状動脈疾患は、世界中の主要な死因です。急性心筋梗塞の後、冠状動脈の再カナリゼーションによる早期および成功した心筋介入は、虚血性心筋のサイズを小さくするための最も効果的な戦略である。冠状の微小血管系は、生体内で視覚化および画像化することはできませんが、冠状動脈微小血管機能に直接依存するパラメータを評価するために使用できる侵襲的で非侵襲的な技術がいくつかあります。虚血再灌流後の内皮機能は、冠状動脈流量(CFR)を介した冠動脈循環のレベルでも評価することができる。本研究では、左前下下(LAD)冠動脈のピーク速度を、安静およびストレスチャレンジ中の経胸部ドップラー心エコー検査(ドブタミンによって誘発される)を介して生体内のラットで測定した。正常な心臓は、ストレス誘導中に休息値を最大4倍上回る冠状動脈血流を増加させることができる。虚血再灌流に続いて、冠状動脈微小血管機能障害のマーカーとして使用できるCFRが著しく減少していることが分かった。CFRは、微小血管機能障害の重要性に関する窓を開き、重篤な閉塞性疾患が存在するかどうかに関係なく心血管リスクを予測することが示されている。
Introduction
心筋虚血再灌流(IR)は、血液供給が心臓に制限され、その後、灌流と同時再酸素化1の回復が続く状態である。冠状動脈の閉塞は塞栓またはコレステロールプラーク破裂によって引き起こされ、代謝の需給の深刻な不均衡を引き起こし、組織低酸素症を引き起こす。危険な心筋の救済は、左心室機能を改善し、急性心筋梗塞患者の生存率を高め、再灌流療法によって観察されている。しかし、冠動脈の再カナリゼーション後、小さな冠状血管の機能異常が2、3、4、5に起こりうる。患者のかなりの割合は、おそらく40%も、冠状動脈の流れの回復にもかかわらず、微小血管および心筋灌流を取り戻さない。冠状動脈微小血管系の可視化と評価は、生体内では困難な場合がありますが、冠状動脈微小血管機能に応じてパラメータを直接評価するために使用できる侵襲的で非侵襲的な技術が数多くあります6 、7.また、内皮機能は、CFR5を介して冠動脈循環のレベルで評価することができる。
経胸部ドップラー心エコー検査は、冠状動脈流速度およびCFR5を研究することを可能にする非侵襲的なツールである。CFRは、安静冠冠動脈血流8に対する最大冠動脈血流の比率を表す。ストレスチャレンジの間、正常な心臓は、安静時値の4倍まで冠状動脈血流を増加させる。CFRが9を減少させると心血管リスクが増加する。石原らは、冠状血管形成術5の直後にCFRが重度の障害を受けたことを示した。冠動脈狭窄がない場合、CFRは冠状動脈機能障害の間に減少し、安定した冠動脈疾患10の患者の約半分に存在する。
この方法の全体的な目標は、心エコー検査を介してラットにおける左前下冠動脈(LAD)機能の非侵襲的視覚化であり、これはCFRの計算に使用することができる。これは微小血管機能障害を診断し、潜在的な治療処置を評価するための重要な評価ツールを提供する。
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Protocol
すべての手順は、ルイビル大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC承認プロトコル18223)および実験動物のケアと使用のためのNIHガイド11によって承認されたプロトコルに従って行われました。
1. 動物
- 研究のために4ヶ月の雌フィッシャー344ラット(BW〜150-180 g)を使用してください。
2. IR手術前の超音波イメージング
- イソムランでラットを麻酔する - 誘導室は1.5-2.0 L/min O2流れで5%、続いて1.5〜2.0%、1.5-2.0 L/分O2流れ。 この麻酔は、休息およびストレス段階の間、実験全体を通して維持される。
- 動物をスナップの位置に置き、胸郭を剃ります。内蔵の温暖化プラットフォームを使用して、体温を37~38°Cに維持します。ソフトウェアを使用して心拍数を監視します。
注:適切な麻酔は、正常な生理的速度(295-350拍/分の間)で心拍数を維持するために重要です。 - イメージングの前に目の乾燥を防ぐために眼科獣医の歯質を適用します。
- 13~24 MHzのリニアプローブ(MS250など)を使用して心エコー検査を実行します(図1A)。
- 加熱されたプラットフォーム上のスナイン位置に動物を置きます。鼻コーンを介して麻酔が制御されていることを確認します。次に、プローブを配置して、レールシステム(図1B)を使用してパラスタール短軸ビュー(PSAX)を得ます。
- プローブをPSAXからrostral方向に動かし、肺動脈を見つけます(図1B)。
- プローブを肺動脈から方向に少し動かしてLADを見て、画像を保存します。
注:LADはカラードップラーなしで見つけるのが難しいので、LADのBモード画像は常に可能であるとは限りません。 - 個人差でLAD冠動脈の見つけにくい場合は、以下の方法に従ってください。
- プローブを肺動脈に横に移動します。
- 動物が傾斜、反転、またはわずかに右側に向かって傾くようにプラットフォームを角度を付け、左心室がプローブでより容易に見えるようにします。
- B モードのイメージをキャプチャまたはシネで保存したら、タッチスクリーン上のカラードップラー (図1C)をクリックします。冠状動脈を短軸で可視化(白い矢印はLADを示す)を短軸で可視化する(図1C)。赤色は、リアルタイムで見られるように、流れの方向を示す(すなわち、血流はプローブに向かっている)。
- カラードップラーモードでLADを視覚化した後、モードをパルス波(PW)モードに変更します。冠状動脈上に黄色のインジケーターラインが存在する(図2A)。
- 黄色のPW線を冠動脈の中央に置く。角度が流れの方向に平行であることを確認します。
注:流れの速度はPWラインの角度に大きく依存するので、画面上のプローブの角度とLADの角度を一致するようにしてください。角度を調整するには、タッチスクリーンを使用してください。PW 角度は 60°未満にする必要があります。 - シネストアを使用して、ピーク拡張期における安静LAD冠動脈流の速度を波形として捕捉する(図2B)。
- 安静時LAD流速を得た後、応力中のLADの最大流速を測定してCFRを計算する。応力中の最大流速を測定するには、尾静脈8(図2C)を介して20 μg/kg/minの用量でドブタミンを注入する。
注:ドブタミン注入は8分を超えてはなりません。- 尾静脈のカニュレーションのための25G注入蝶セットを使用する。注入針を置くには、ラットの尾のベースの周りにガーゼの小さなストリップを配置し、その後、ヘモスタットでつかみ、圧力を適用し、静脈を拡大させるトルニケットをねじります。
- ドブタミン注射器に直接接続しながら針を置きます。
注:尾静脈の針の適切な配置を確保するために血液を引き出す際に誤って薬物を導入しないように特別な注意を払います。また、塞栓症は動物に致命的な可能性があるため、気泡を静脈に導入しないようにしてください。 - 針を置いたら、接着剤と外科テープで安定させ、尾部への注入ラインを確保する。
- 流れを回復するために、ヘモスタットとトルニケットを削除します。
- ドブタミンシリンジを注入ポンプに入れ、20μg/kg/minを注入するように設定します。
- ドブタミン注入中, 慎重にLADピークと心拍数を監視.DOブタミンに応答して増加するたびに、ドップラーモードでLAD PWピークを定期的に記録します。
注:ドブタミンによって誘発されるストレスチャレンジは、心臓をより一生懸命働かします。これはしばしば心臓およびLADの動きをもたらす。LADを視野に入れておくために、動物、プローブ、またはその両方を動かす準備をしてください。 - LADのピークと心拍数が挑戦の間に高原した後、ドブタミン注入を停止し、尾静脈注入セットを取り除き、プラットフォームから動物を取り除く。動物が自宅のケージで回復できるようにします。
- 図 2B および Cに示す画像からピーク拡張速度を取得するには、[ピーク ベル] ツールを選択します。
- 残りのLADピーク拡張期流速度に対するLAD応力(ドブタミン)ピーク拡張流速度の比としてCFR指数を計算する(図2A)。
3. 虚血再灌流損傷
- イソムランでラットを麻酔する - 誘導室は1.5-2.0 L/min O2流れで5%、続いて1.5〜2.0%、1.5~2.0 L/分O2流れ。
- ペダル離脱反射の欠如によって麻酔の深さを確認する。乾燥を防ぐために目に眼科獣医のチントを使用してください。暖房パッドまたは動物温度コントローラを使用して、37~38°Cの適切な体温を維持します。
- 手術前のメロキシカムを投与し、5 mg/kgの筋肉内、手術前15分、続いて手術中の脱水を防ぐために0.9%の生理食塩水の2mL皮下ボーラスを投与する。無菌手袋や器具を使用し、無菌技術を採用しました。光ファイバ光源を用いて、18ゲージIVカテーテルを用いてラットを挿管し、人工呼吸器に接続する。
- 8-0 を使用したリゲート LAD5番目の肋間スペースで15mmの開口部を通してモノフィラメント縫合糸。平いの結び目を結び、30分間放置し、心臓表面の変色を介してすべてのラットの虚血を目視で確認する12.30分後に合字を放出し、1-2分12分間の心筋の以前に変色した領域の赤化によって再灌流を確認する。
- 中断された縫合パターンで4-0吸収性縫合糸を使用して肋骨ケージを閉じ、連続的な縫合パターンで5-0非吸収性シルク縫合を使用して皮膚を閉じます。
- 麻酔から動物を取り除く。動物がホームケージで回復できるようにします。5mg/kgメロキシカムは、動物を安楽死させる前に24時間ごとに筋肉内に注射した(手術後72時間)。
4. IR手術後の超音波イメージング
- IR手術後72時間、冠動脈流とCFRを再度測定する。測定値を IR 測定前と比較します。前述の手順 2.1 から 2.15 を繰り返します。
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Representative Results
本研究では、12匹の雌フィッシャー344匹を用いて行った。ドブタミンでストレステストを行い、IR手術の前と72時間後にLAD冠動脈速度を測定しました。IR手術の前に、安静時LAD冠動脈速度は423±59mm/sと測定され、ドブタミン注入後に増加した(1005±77mm/s)(図3A)。虚血再灌流の72時間後、安静時LAD冠動脈速度は、IR手術前の安静時LAD冠動脈速度と比較して有意に高かった(743±40mm/s対423±59mm/s)(図3A)。IR手術後のドブタミン検査に対するストレス応答は、IR手術前の応答(937±67ms/s対1005±77mm/s)と比較して有意に減少した(図3A)。
CFRは、ストレス(ドブタミン)と休止流速度(ドブタミン注入前に測定される)8に対するピーク流速の比率として計算される。 CFRはIR手術前の若いラットでは2.1±0.35であったが(図3B)、IR手術の72時間後に有意に減少した(1.1±0.25)が、これらのラットでは安静時LAD冠動脈速度がIR手術前に得られたデータと比較して高かったにもかかわらず、図 3C)また、IR手術の72時間後のラットにおける左心室の収縮機能に有意な変化はなかった(図3C)。
図1:冠状動脈の位置。A. LAD冠動脈速度を得ながらラット上のプローブ位置。B.肺動脈、大動脈、およびLAD冠動脈の短軸解剖学的表現。心エコー検査におけるLAD冠動脈の解剖学的可視化この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:LAD冠動脈のパルス波速度イメージング。A. LAD冠動脈におけるパルス波速度センサの配置の表現。B. LAD冠動脈パルス波画像の残りの状態の間に。C. LAD冠動脈パルス波画像ストレス(ドブタミン)状態。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.ドップラー心エコー検査を用いての冠動脈流の測定A.残りの間(コントB)中およびドブタミン注入中(続きD)および残りの間(IR B)およびドブタミンチャレンジ(IR D)中、p< 0.05コントB対虚血再灌流B(*)の間にIR手術の72時間後に動物で測定されたパルス波速度。B. CFRは実験動物のパルス波(n=9)、p<0.05コント対IR(*)から計算した。C.実験群からの分画短縮評価(n=9)。データは平均±SDとして提示され、一方通行の分散分析で分析されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究の主な知見は、IRが残存LAD冠動脈速度を増加させ、残留血管造影狭窄がない場合でもCFRを損なう。.
冠状動脈生理学を理解することは、心臓専門医が冠状動脈疾患を治療するための臨床意思決定の重要な部分です。CFRは、冠状動脈微小循環7、13の病態生理学を理解する上で重要な機能パラメータの一つである。CFRは、冠動脈狭窄と冠動脈微小血管循環の両方を評価する非侵襲的な方法であり、心筋血液供給の指標であり、ストレス条件下で血流を増加させる冠動脈の能力7を明示的に示す。通常のCFR(> 2.0)は良好な予後を反映することが多く、1.90未満のCFRは、リスクの高い冠動脈疾患14、15、16の同定のための増分診断情報を提供する。
我々の結果は、虚血再灌流(図3C)の後に収縮期関数が保存されたにもかかわらず、CFRが有意に低かっていることを示した(図3B)。したがって、ステノティック冠動脈の再カナリゼーションは、微小血管灌流を改善しない。CFRの低下は虚血再灌流後の損なわれた微小血管血管拡張の検出を可能にする。
本研究は、非侵襲的横胸部ドップラー心エコー検査を用いて様々な薬理学的療法の効果を調べるシリアルCFR評価を示す。冠状動脈機能評価のこの方法は、実現可能で実行可能な臨床診断ツールとして小動物研究に使用することができる。これは、小動物モデルにおける動物の使用、安楽死、または壊死の要件を最小限に抑えるにつながります。このプロトコルの重要なステップは冠状動脈を視覚化し、良質のPW速度イメージを得ることである。もう 1 つの重要な手順は、応力状態中に LAD ビジュアライゼーションを維持することです。ドブタミンチャレンジ中に、心拍数が増加し、LADが視野から移動することがあります。研究者は、冠状動脈に従うためにフィールドを移動する準備をする必要があります。現在の研究における制限は、比較的小さなサンプルサイズ、ラットにおける生体内におけるCFRと冠動脈内膜径との相関の欠如、のサイズ測定のための正確な可視化を得ることの困難さ冠状動脈。しかし、ここで説明する方法は、信頼性が高く、再現性があり、虚血再灌流後の心臓微小血管系に与える損傷に関する洞察に富んだ情報を提供する。
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Disclosures
著者は開示するものが何もない
Acknowledgments
実験を行うための超音波装置を提供してくださったヘルムズリー財団に感謝申し上げます。この作業はNIA R01 053585助成金によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | BD Syringe | 302995 | |
| 250S 13–24 MHz linear probe | FUJIFILM VisualSonics Inc | ||
| Dobutamine hydrochloride | Sigma | D0676-10mg | |
| Isoflurane | RRC | 27376 | |
| Legato 100 Syringe pump | KD Scientific | 788100 | |
| Vevo 3100 | FUJIFILM VisualSonics Inc | ||
| Winged infusion set, 27G x 1/2", | Medline.com | TMOSV27ELZ |
References
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