Summary
تقدم هذه المقالة بروتوكولا معياريا لعلم الدهون في الأنسجة وعلم النسخ ، والدهون في البلازما في نماذج فئران الأمراض العصبية التي تستهدف الدهون الكامنة وراء الالتهاب والنشاط العصبي ، والدهون الغشائية ، والرسل في اتجاه المصب ، والإنزيمات / المستقبلات المشفرة للحمض النووي الريبوزي المرسال الكامنة وراء وظيفة الدهون. يتم تحديد إجراءات أخذ العينات ومعالجة العينات واستخراجها وقياسها كميا.
Abstract
تعمل الدهون كواجهة أساسية لإهانات الدماغ أو المحفزات المفضية إلى الأمراض العصبية وهي خزان لتخليق الدهون مع مختلف الإشارات أو وظيفة الرباط التي يمكن أن تؤكد على ظهور الأمراض وتطورها. غالبا ما تتغير الدهون على مستوى الأعراض السابقة ، وهي مصدر ناشئ لأهداف الأدوية والمؤشرات الحيوية. تظهر العديد من الأمراض العصبية التهابا عصبيا وتنكسا عصبيا واستثارة عصبية كسمات مميزة مشتركة ، يتم تعديلها جزئيا بواسطة أنظمة إشارات دهون محددة. إن الاعتماد المتبادل والترابط بين توليف الدهون المختلفة يدفع إلى تحليل متعدد الدهون ومتعدد الإنزيمات والمستقبلات المتعددة من أجل اشتقاق القواسم المشتركة والخصائص للسياقات العصبية والإسراع في كشف الجوانب الميكانيكية لظهور المرض وتطوره. إن إسناد أدوار الدهون إلى مناطق الدماغ المتميزة يعزز تحديد النمط الظاهري الجزيئي الدهني والمورفولوجيا المرتبطة بمرض عصبي.
يظهر هنا بروتوكول معياري مناسب لتحليل الدهون الغشائية وإشارات الدهون في اتجاه المصب جنبا إلى جنب مع mRNA للإنزيمات والوسطاء الكامنة وراء وظائفها ، المستخرجة من مناطق الدماغ المنفصلة ذات الصلة بمرض عصبي معين و / أو حالة عصبية. لضمان التنميط الدهني المقارن الدقيق ، تم تحسين سير العمل ومعايير التشغيل وتوحيدها من أجل: i) أخذ عينات الدماغ وتشريح المناطق ذات الاهتمام ، ii) الاستخراج المشترك لإشارات الدهون المتعددة والدهون الغشائية ، iii) استخراج الدهون المزدوجة / mRNA ، iv) القياس الكمي عن طريق مراقبة التفاعلات المتعددة للكروماتوغرافيا السائلة (LC / MRM) ، و v) التنميط القياسي mRNA. سير العمل هذا قابل للتعاريف لكميات الأنسجة المنخفضة التي يتم الحصول عليها عن طريق أخذ عينات من المناطق الفرعية المنفصلة وظيفيا في الدماغ (أي عن طريق لكم الدماغ) ، وبالتالي منع التحيز في التحليل متعدد الجزيئات بسبب عدم تجانس الأنسجة و / أو التباين الحيواني. للكشف عن العواقب الطرفية للأمراض العصبية وإنشاء قراءات جزيئية انتقالية لحالات الأمراض العصبية ، يتم أيضا متابعة ووصف عينات الأعضاء الطرفية ومعالجتها وتحليلها الدهني اللاحق ، وكذلك الدهون في البلازما. يتم عرض البروتوكول على نموذج فأر الصرع الحاد.
Introduction
التطورات الحديثة في وظيفة الدهون ودورها في ظهور الأمراض العصبية وتطورها تفتح أماكن جديدة للبحث والتطوير لأهداف علاجية جديدة وتوضيح آلية المرض1. الاختلافات الموثقة في تكوين الدهون في مناطق الدماغ المختلفة ، والتي تؤكدها تقنيات التصوير الجزيئي الحديثة مثل التصوير الطيفي الكتلي والتنميط المتقدم لقياس الطيف الكتلي ، تحول نموذج التحقيق في الدهون من الدماغ كله إلى مناطق الدماغ المتميزة وظيفيا والمنفصلة. حقيقة أن تكوين الدهون يختلف في مناطق الدماغ المختلفة يدفع إلى تصور جديد لكل من حساسية الدهون الغشائية وإشارات الدهون في اتجاه المصب استجابة لإهانة الدماغ أو المحفزات عبر مناطق الدماغ المتميزة وظيفيا. وبالتالي ، تتطلب بروتوكولات الدهون تطورات جديدة لمواجهة التحدي المتمثل في انخفاض كميات الأنسجة للكشف عن الدقة المكانية الأعلى وتحديدها كميا ، وفي الوقت نفسه ، تحليل المكونات الدهنية المتعددة لأغشية الخلايا ومسارات الإشارات. أيضا ، يعد تحديد الإنزيمات وروابط الدهون والمستقبلات المشاركة في تنظيم مستوياتها ووظيفتها أمرا بالغ الأهمية لتوضيح مسارات الإشارات المتأثرة بمرض عصبي وتوجيه التحقيقات الميكانيكية الجديدة في سياق فسيولوجي مرضي.
بالإضافة إلى زيادة الدقة المكانية للدماغ ، هناك صعوبتان رئيسيتان تتحديان تطوير مناهج جديدة للدهون العصبية. أولا ، عادة ما تكون جزيئات إشارات الدهون ذات وفرة منخفضة للغاية مقارنة بالدهون المكونة للغشاء. ثانيا ، تظهر القبة الشحمية عدم تجانس هيكلي عال ، يصعب تشريحها باستخدام نهج تحليلي واحد. وبالتالي ، يتم تصميم طرق الاستخراج والتحليل لفئات الدهون المختلفة ويتم إجراؤها عادة في عينات الأنسجة المتميزة.2. طرق البندقية الدهنية3 هي أدوات ممتازة للكشف بسرعة عن ملف تعريف واسع من الدهون الغشائية ، في حين يتم الاستفادة من زيادة الحساسية والانتقائية التي توفرها طرق الاكتشاف المستهدفة والقياس الكمي للطيف الكتلي للتحقيق في الدهون ذات الإشارات المنخفضة بما في ذلك: i) الدهون الالتهابية و ii) الدهون المشاركة في تعديل النشاط العصبي ، مثل endocannabinoids (eCBs) ، والدهون المرتبطة بالأحماض الأمينية ، الخ.4,5. لتشمل تغيرات الدهون على كل من غشاء الخلية ومستوى الإشارات التي تحدث في مناطق الدماغ من نماذج الأمراض العصبية ، عادة ما يتم استخراج الدهون وتحليلها في عينات أنسجة متميزة ، يتم الحصول عليها من دفعات حيوانية متميزة أو من نصفي الكرة الأرضية مختلفين ، أو عن طريق تشريح منطقة نسيج أكبر إلى قطع متعددة. عندما تكون مستويات الحمض النووي الريبوزي المرسال من مستقبلات الإنزيم ذات أهمية أيضا ، فإن تحقيقها يتطلب عادة شراء عينة أنسجة متميزة. على سبيل المثال ، سيتطلب التحقيق في الدهون الغشائية ، والقنب الداخلي ، والحمض النووي الريبي المرسال ثلاث عينات مختلفة من الأنسجة ، (على سبيل المثال ، عينتان لطريقتي استخراج الدهون - دهون الغشاء والدهون المشيرة - وطريقتان لاحقتان لتحليل الدهون - وعينة واحدة لتحليل الحمض النووي الريبي المرسال). يتطلب التحقيق في الدهون الالتهابية والقنب الداخلي عينتين متميزتين من الأنسجة ، طرق الاستخراج ، وطرق التحليل ، على التوالي. مثال آخر هو التحقيق في الحمض النووي الريبوزي المرسال وأي فئة من الدهون في عينة التشريح المجهري للدماغ أو الليزر والتي تتطلب بالتالي حيوانين متميزين لشراء عينتين لكل منطقة دماغية (فرعية). وكثيرا ما يحدث في مثل هذه الحالات قدر كبير من التباين و/أو ضعف تكرار النتائج، وينشأ عن التباين البيولوجي و/أو عدم تجانس الأنسجة. واسترشادا بهذه القيود العملية للتحليل متعدد الجزيئات، الذي يحدث بشكل خاص عند الدقة المكانية العالية في الدماغ، تم تصميم بروتوكول للدهون العصبية المكون من ثلاث وحدات يشمل: 1) الاستخراج المشترك والتحليل المشترك بواسطة LC/MRM للدهون الالتهابية (على سبيل المثال، eicosanoids (eiCs)) والدهون المشاركة في تعديل النشاط العصبي، مثل eCBs2; 2) الاستخراج المشترك للدهون الفوسفاتية (PLs) و eCBs مع LC / MRM متعدد المسح اللاحق وتحليل مسح فقدان السلائف / محايدة2; و 3) الاستخراج المزدوج للدهون الغشائية (الفوسفو) و eCBs وكذلك mRNA ، مع تحليل تسلسل LC / MRM و qPCR أو RNA اللاحق6. اعتمادا على السؤال البيولوجي الذي يجب معالجته في مرض عصبي ومنطقة الدماغ ذات الأهمية ، يمكن تطبيق مزيج من البروتوكول الأول والثاني ، أو البروتوكول الأول والثالث ، على نفس عينة الأنسجة للأنسجة التي تزن حوالي 4 ملغ. يمكن تطبيق البروتوكولين الأول والثالث بشكل مستقل على الأنسجة حوالي 2 ملغ. يمكن تطبيق البروتوكول الثاني على الأنسجة التي تزن أقل من 0.5 ملغ. بغض النظر عن وحدة البروتوكول العصبي الدهني المختارة ، فإن أخذ عينات الأنسجة والمعالجة قبل التحليلية ، وعزل الدماغ وتشريح المنطقة ، بالإضافة إلى إجراء التضحية بالنموذج الحيواني موحدة ومتطابقة لجميع الوحدات الثلاث للبروتوكول. في تحقيقنا في الأمراض العصبية ، يتم دائما جمع وتحليل الأعضاء الطرفية ذات الصلة بالعواقب المرضية للمرض باستخدام هذه البروتوكولات المعيارية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أخذ عينات من الدم بانتظام لدهون البلازما لتكون بمثابة أداة قراءة للأمراض العصبية مع عرض التطبيقات الانتقالية المحتملة. بروتوكول الدهون المعياري المعروض هنا متعدد الاستخدامات للغاية: قابل للقياس إلى كميات أكبر من الأنسجة وقابل للتطبيق بسهولة على أي نوع من الأنسجة والأمراض تقريبا. لتطبيق البروتوكول المعياري (الشكل 1) في الأمراض العصبية ، فإن أي نموذج قياسي للقوارض لظهور وتطور الاضطرابات العصبية ، مثل إصابات الدماغ الرضحية أو مرض باركنسون أو مرض الزهايمر أو الصرع يمكن علاجه.
تم تطبيق هذه البروتوكولات على نطاق واسع لدراسة التغيرات في الأنسجة الدهنية و / أو النسخ في المرحلة الحادة من الصرع في نموذج الفأر الناجم عن حمض الكانيك (KA) من الصرع 2,7 ، وهو نموذج يستخدم على نطاق واسع في الدراسات قبل السريرية بسبب التشابه مع صرع الفص الصدغي البشري (TLE) 8,9,10,11. باستخدام هذه البروتوكولات ، تم تقييم الإمكانات العلاجية للعقاقير مثل Palmitoylethanolamide (PEA) 12,13 في نفس نموذج الفأر من الصرع. حددت الدراسة تغيرات الدهون والحمض النووي الريبوزي المرسال بدقة مكانية عالية ومنخفضة في الدماغ والمحيط، في نقطة زمنية من أقصى شدة النوبات الحادة (في 60 دقيقة بعد تحريض النوبة)، وعند العلاج شبه المزمن والحاد مع PEA في أربع نقاط زمنية مختلفة (20 و 60 و 120 و 180 دقيقة) بعد تحريض نوبة KA، وهي نافذة زمنية تغطي المرحلة الحادة من الصرع. تم جمع البلازما والأدمغة والأعضاء الطرفية للفئران غير المعالجة بحقن KA ، والفئران الحادة والمعالجة بشكل مزمن ب PEA ، وكذلك فئران التحكم في المركبات ومركبات PEA ، في كل نقطة زمنية 12,13 ، وتم التحقيق فيها باستخدام هذا التحليل الجزيئي. ارتبطت البيانات الجزيئية بالأنماط الظاهرية السلوكية التي تم الحصول عليها عن طريق تسجيل النوبات ، وكذلك مع البيانات المشتقة من الكيمياء النسيجية المناعية حول العمليات التنكسية العصبية ، من أجل كشف تطور مرحلة الصرع الحاد وإمكانات PEA للتخفيف من حدتها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الإجراءات التجريبية الموصوفة هنا تتوافق مع توجيه مجلس الجماعة الأوروبية المؤرخ 22 سبتمبر 2010 (2010/63EU) وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الحيوانات المحلية في ولاية راينلاند بالاتينات ، ألمانيا (مرجع الملف: 23 177-07 / G16-1-075).
1. نموذج حيواني للصرع الحاد والمعالج وقائيا الناجم عن KA
- إجراء تحريض النوبات وعلاجها وتسجيلها السلوكي.
- الفئران المنفصلة (الحد الأدنى n = 6 الفئران لكل مجموعة) في أقفاص واحدة.
- إعداد محلول حقن تحريض النوبات والمركبة المقابلة (انظر الجدول 1) ، وكذلك محلول حقن العلاج والمركبة المقابلة (انظر الجدول 2).
- حقن الفئران داخل الصفاق (i.p.) (10 مل / كغم من كتلة جسم الفأر) دون تخدير وفقا لهوية مجموعتها: المرض أو العلاج أو المعالجة بالمركبة (أي KA ، KA المعالجة ب PEA ، ومجموعتي المركبات). انظر الشكل 2 والجدول 1 والجدول 2.
- مراقبة وتسجيل السلوك وفقا لمقياس شدة النوبة الموحد التالي: 0 = لا توجد استجابة. 1 = الجمود والتحديق ؛ 2 = الطرف الأمامي و / أو تمديد الذيل ، الموقف الصلب ؛ 3 = الحركات المتكررة ، تمايل الرأس ؛ 4 = التربية والسقوط. 5 = التربية والسقوط المستمرين. 6 = نوبات منشط كلوني شديدة; 7 = الوفاة14,15 (الشكل 3).
- إجراء التضحية للتحليل الدهني والنسخي.
- في أربع نقاط زمنية (أي 20 و 60 و 120 و 180 دقيقة بعد حقن KA أو السيارة على التوالي) ، ضحى بستة فئران من كل مجموعة من المجموعات التالية: PEA المعالجة ، مركبة الصرع غير المعالجة ب PEA 1 ، والسيارة 2 ، وفقا للبروتوكولات المعتمدة من IACUC.
- بعد عشر ثوان من الوصول إلى كل نقطة زمنية ، قم بتخدير الفئران باستخدام نسيج منقوع بالإيزوفلوران في غرفة زجاجية. تأكد من التخدير عن طريق فقدان منعكس التصحيح ، المشار إليه بعدم القدرة على الحركة أثناء قلب الغرفة الزجاجية ببطء. قطع رؤوس الفئران باستخدام مقص جراحي وجمع البلازما والدماغ والأعضاء الطرفية (انظر الخطوات 2.2.2-2.2).
تنبيه: تختلف اللوائح الأخلاقية لإجراءات التضحية بين لجان الحيوانات المحلية. تأكد من التحقق من اللوائح الصادرة عن لجنة الحيوانات المحلية واتباعها.
- اتبع إجراء التضحية لتحليل الكيمياء النسيجية المناعية.
- بالنسبة للتلطيخ الكيميائي النسيجي المناعي13 ، قم بتسجيل ثلاثة فئران سلوكيا من كل مجموعة من المجموعات التالية: PEA المعالج ، والصرع غير المعالج ب PEA ، ومجموعات المركبات ، على مدار الوقت بأكمله (180 دقيقة).
- التضحية والفئران perfuse بعد 5 أيام. تخدير الفئران بعمق (انظر الخطوة 1.3.1 لمجموعات الفئران) عن طريق حقن i.p. من البنتوباربيتال (100 ملغ / كغ) والبوبرينورفين (0.1 ملغ / كغ) كعقاقير مخدرة. تأكيد التخدير العميق عن طريق فقدان رد الفعل بين أصابع القدم.
- ثبت الماوس على صفيحة البوليسترين وافتح الصدر على الفور باستخدام مقص دقيق وملقط قياسي. ضع الفراشة في بطين القلب الأيسر واقطع الأذين الأيمن باستخدام مقص دقيق.
- اضبط سرعة وضغط المضخة على تدفق تمعجي ثابت بمعدل 2-3 مل / دقيقة. تخلص من محلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد (PBS) لمدة 5 دقائق تقريبا. إذا لزم الأمر ، استبدل الفراشة.
ملاحظة: مع التروية المناسبة ، تبدأ الأعضاء الداخلية (باستثناء الطحال) في التبييض في غضون 1-2 دقيقة. - قم بتبديل التروية إلى محلول بارافورمالدهيد (PFA) البارد المثلج لمدة 5 دقائق تقريبا. اعزل الأدمغة الكاملة كما هو موضح في الخطوة 2.2.2 وقم بإصلاحها لمدة 24 ساعة في محلول PFA بنسبة 4٪ عند 4 درجات مئوية.
- احتضان الأدمغة في محلول السكروز بنسبة 30٪ لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة السكروز المتبقي بورق مناديل جاف وقم بتجميد الأدمغة على صفيحة معدنية (-80 درجة مئوية). قم بتخزين الأدمغة عند -80 درجة مئوية لإجراءات التلطيخ13.
2. إجراءات أخذ العينات لتحليل الدهون / النسخ
- الاستعداد لأخذ العينات.
- تبريد مسبق لأنابيب EDTA لأخذ عينات البلازما إلى 4 درجات مئوية. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي والدوامة إلى 4 درجات مئوية. قم بتبريد الصفيحة المعدنية المغطاة بورق الألومنيوم (لالتقاط الدماغ المجمد و / أو الأنسجة الأخرى ذات الأهمية) على الثلج الجاف (-80 درجة مئوية). قم بتبريد الأنابيب المصنفة 2 مل و 5 مل على الثلج الجاف (-80 درجة مئوية) لأليكوتات البلازما والأنسجة المجمدة وجمع الدماغ ، على التوالي. استخدم أنابيب العنبر لحماية الجزيئات الحساسة للضوء، مثل eiCs.
- قم بتنظيف معدات أخذ عينات الأنسجة وعزلها (المقص الجراحي ، المقص الدقيق الحاد المستقيم ، الملقط القياسي السلس المستقيم ، الملقط الناعم مع الانتهاء من المرآة ، الملقط المنحني والملعقة ، لوحة رغوة البوليسترين ، والإبر للتثبيت) باستخدام مطهر (على سبيل المثال ، 70٪ إيثانول).
- بروتوكولات أخذ العينات
- تحديد ترتيب أخذ العينات.
- جمع الدم مباشرة بعد قطع الرأس في أنابيب EDTA المبردة مسبقا 1 مل (انظر الخطوة 2.2.3).
- قم بإزالة الدماغ بالكامل وقم بتجميد المفاجئة مباشرة بعد الإزالة. ستستغرق هذه الخطوة من 1 إلى 2 دقيقة. تخزين الأدمغة المجمدة عند -80 درجة مئوية لمزيد من المعالجة (انظر الخطوة 2.2.2).
- قم بإزالة الأعضاء الطرفية ذات الأهمية (مثل الرئة والقلب والكبد) ، في غضون 5 دقائق بعد إزالة الدماغ ، وقم بتجميدها وتخزينها عند -80 درجة مئوية لمزيد من المعالجة (انظر الخطوة 2.2.4).
- إزالة الدماغ لإجراءات التشريح أو اللكم. يستغرق هذا الإجراء 1-2 دقيقة / الدماغ.
- بعد قطع الرأس (انظر الخطوة 1.2) ، ابدأ في إجراء شق خط الوسط في الجلد باستخدام مقص دقيق. حرر الجمجمة عن طريق قلب الجلد فوق العينين. الوصول إلى الجزء العلوي من الجمجمة وإجراء شق ذيلي صغير بدءا من مستوى العظم داخل الجدارية. تجنب قطع الدماغ.
- قطع بقوة من خلال الجزء الأمامي من الجمجمة بين العينين لتسهيل إزالة الدماغ. قم بإمالة جانب واحد من العظم الجداري باستخدام ملقط ضيق منحني وقطعه. كرر الخطوة الأخيرة للجانب الآخر.
- إزالة السحايا الدماغية. حرك ملعقة تحت الجزء الأمامي من الدماغ (أي المصباح الشمي) وقم بإمالة الدماغ بلطف لأعلى. حرك الملعقة لأسفل لكسر الأعصاب البصرية والأعصاب القحفية الأخرى.
- ارفع الدماغ من الجمجمة وقم بتجميد الدماغ بالكامل على الفور على لوحة معدنية مبردة مسبقا (-80 درجة مئوية) مع الجانب البطني المواجه للصفيحة المعدنية (الظهرية لأعلى).
- اسمح للأدمغة بالتجميد التام والانتقال إلى أنابيب 5 مل مبردة مسبقا وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى تشريح مناطق الدماغ أو إجراء اللكم (انظر الخطوتين 3.1. و 3.2).
- إجراء أخذ عينات البلازما.
- أنابيب EDTA المبردة مسبقا من Spike مع 10 ميكرولتر من تخفيف الإندوميتاسين المحضر حديثا إلى تركيز مستهدف يبلغ 10 ميكرومتر.
- جمع الدم الجذع مباشرة بعد قطع الرأس عن طريق الضغط اللطيف على الجسم في أنابيب EDTA المبردة مسبقا إلى الحد الأقصى لحجم الدم من 1 مل.
ملاحظة: في حالة ضغط الدم السليم ، لا يلزم الضغط. إذا كان حجم الدم أقل من 1 مل ، فقم بتقليل وقت حضانة الأيزوفلوران لتمكين تدفق الدم السليم. - قم على الفور بطرد أنابيب الدم المركزية عند 2000 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة مرحلة البلازما العليا الناتجة ولغرض تحليل الدهون المتعددة ، حدد أليكوت أحجام البلازما في أنابيب 2 مل المبردة مسبقا على النحو التالي: 50 ميكرولتر لتحليل eCBs / eiCs ، و 30 ميكرولتر لتحليل PLs ، وحجم البلازما المتبقي كعينة احتياطية أو لأنواع أخرى من التحليل.
- تخزين عينات البلازما عند -80 درجة مئوية لمزيد من الاستخراج (انظر الخطوتين 4-1-2 و4-1-4).
- إجراء أخذ عينات من الأعضاء الطرفية.
ملاحظة: استخدم مراجع تشريح الفئران16 والوثائق المقدمة للدورات الإلزامية (FELASA) التي يحضرها المحققون في الحيوانات لتحديد الأعضاء الفردية وأنسجتها الضامة و / أو الأوعية الدموية.- شل حركة جذع الفأر لتسهيل إزالة الأعضاء باستخدام الإبر. قم بعمل شق بطني في خط الوسط باستخدام مقص حاد مستقيم في ارتفاع العانة. استخدم ملقط قياسي حاد لتثبيت جدار البطن أثناء القطع لفتح تجويف البطن.
- شل حركة الجلد للسماح بإزالة أعضاء البطن باستخدام ملقط حاد. لإزالة القلب أو الرئة، استمر في القطع الإنسي في اتجاه كهف الثدي. قم بإزالة الرئة و / أو القلب باستخدام ملقط ناعم.
- افتح تجويف الثدي بعناية لتجنب النزيف. قطع الأنسجة الضامة والأوعية الدموية التي ترسو العضو المعني دون قطع العضو.
- انقل قطع الأنسجة على الفور على ألواح معدنية مبردة مسبقا (-80 درجة مئوية) واتركها تتجمد تماما. انقل قطع الأنسجة إلى أنابيب مبردة مسبقا وخزنها عند -80 درجة مئوية لمزيد من المعالجة (انظر الخطوة 4.1).
- تحديد ترتيب أخذ العينات.
3. معالجة المواد البيولوجية
ملاحظة: للاستخراج المشترك ل eCBs / eiCs ، استخدم أنابيب كهرمان 2 مل كأنابيب استخراج وأضف في كل أنبوب سبع كرات فولاذية مبردة مسبقا. للاستخراج المشترك ل PLs / eCBs وللاستخراج المشترك المزدوج للدهون والحمض النووي الريبي ، استخدم 2 مل من أنابيب الاستخراج الخالية من الحمض النووي الريبي المربوطة بخرز السيراميك (جدول المواد).
- إجراء تشريح الدماغ ومعالجة الأعضاء الطرفية.
ملاحظة: استخدم المصابيح المكبرة لزيادة رؤية الدماغ للتشريح.- نظف الأدوات الجراحية ، بما في ذلك الملقط بأطراف فائقة الدقة ، 2x مع 70٪ من الإيثانول.
- انقل الأدمغة المجمدة من -80 درجة مئوية إلى طبق بتري يحتوي على عازل فسيولوجي مبرد مسبقا (درجة الحموضة 5.5) تأكد من أن طبق بتري عند 4 درجات مئوية. اسمح للأدمغة بإلغاء التجميد تماما للسماح بالتشريح. اختبر بعناية باستخدام الملقط.
تحذير: لا تبقي الأدمغة عند 4 درجات مئوية لفترة أطول مما هو مطلوب للذوبان. - قم بتبريد صفيحة معدنية على الجليد (4 درجات مئوية) وقم بتغطيتها بأنسجة مبللة غارقة في المخزن الفسيولوجي البارد (الرقم الهيدروجيني 5.5) ونقل الدماغ مع الجانب البطني بعناية إلى لوحة معدنية مبردة مسبقا (4 درجات مئوية) على الجليد. قم بتغطيته بأنسجة مبللة غارقة في المخزن الفسيولوجي البارد (الرقم الهيدروجيني 5.5).
- تشريح مناطق الدماغ في غضون 5 دقائق كحد أقصى باستخدام ملقط طرف فائق الدقة. ابدأ بمنطقة ما تحت المهاد (HYP) وأدر الجانب الظهري لأعلى للمضي قدما في الجانب الأيمن. عزل الحصين (HCr) وقشرة الفص الجبهي (PFCr) والمخطط (STRr) والقشرة الدماغية (cCTXr). ثم تشريح الجانب الأيسر. عزل الحصين (HCl) وقشرة الفص الجبهي (PFCl) والمخطط (STRl) والقشرة الدماغية (cCTXl). تشريح المخيخ ومنطقة المهاد. استخدم المراجع التشريحية المنشورة16,17 لتحديد منطقة الدماغ.
- انقل كل قطعة تشريح مباشرة على لوحة معدنية مغطاة بورق الألمنيوم ومبردة مسبقا (-80 درجة مئوية). السماح بتجميد ونقل مناطق الدماغ المعزولة في أنابيب 2 مل المبردة مسبقا.
- سحق قطع الأنسجة باستخدام طاحن الأنسجة (عند -80 درجة مئوية) ، وتجنب ذوبان الأنسجة. في الغرفة الباردة ، مسحوق أنسجة aliquot في أنابيب استخراج ملصقة ومبردة مسبقا تحتوي على حبات السيراميك أو كرات فولاذية. لتحليل الدهون المزدوجة / النسخ ، قم بوزن مسحوق الأنسجة في الغرفة الباردة. لتحليل الدهون فقط ، اختر بين التطبيع إلى وزن الأنسجة أو محتوى البروتين. بالنسبة للأخير ، استمر في ذلك دون وزن الأنسجة.
- قطع أنسجة الأعضاء الطرفية في قطع بحد أقصى للوزن 20 ملغ. المضي قدما في سحق الأنسجة كما هو الحال في الخطوة 3.1.6.
- تابع استخراج عينات الأنسجة (انظر الخطوات 4.1.1 أو 4.1.3 أو 4.1.5) أو قم بتخزين الأنابيب عند -80 درجة مئوية لاستخراجها لاحقا.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام مصفوفة الدماغ إذا سمح تصميم الدراسة بذلك. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة أكثر ملاءمة لعدد منفصل ومحدود من مناطق الدماغ ، وليس من العملي تشريح وعزل جميع مناطق الدماغ المذكورة أعلاه ضمن الإطار الزمني المحدد.
- أداء اللكم الدماغ.
- قم بتركيب الأدمغة الكاملة المجمدة على نظام التركيب (جدول المواد) في الكريستات. اضبط السماكة على 50 ميكرومتر وقم بتقطيعها إلى شرائح في وضع القطع بالقرب من المنطقة محل الاهتمام.
- شريحة دماغية وصمة عار (18-20 ميكرومتر) باستخدام أزرق تولويدين (0.1٪ −1٪) كمرجع لتوطين المنطقة دون الإقليمية محل الاهتمام. افحص الشرائح الملطخة باستخدام المجهر لتحديد المناطق ذات الأهمية المراد لكمها. استخدم أطلس الفأر كمرجع للعثور على المناطق التشريحية المناسبة للدماغ16. خذ اللكمات بقطر 0.8-1.0 مم باستخدام عينات من اللكمات في أنابيب مبردة مسبقا.
- قم بوزن اللكمات المجمدة في الغرفة الباردة في أنابيب استخراج 2 مل مبردة مسبقا تحتوي على حبات خزفية أو كرات فولاذية. استخدم أنابيب العنبر للاستخراج المشترك ل eCBs و eiCs.
- ابدأ الاستخراج (راجع الخطوات 4.1.1 أو 4.1.3 أو 4.1.5) أو قم بتخزين الأنابيب عند -80 درجة مئوية لمزيد من الاستخراج.
- إجراء معالجة البلازما.
- ضع عينات البلازما المجمدة على الجليد (4 درجات مئوية) واتركها تذوب (~ 20 دقيقة).
- تأكد من أن البلازما غير مجمدة تماما قبل البدء في الاستخراج.
- تابع إجراء استخراج البلازما (انظر الخطوات 4.1.2 أو 4.1.4).
ملاحظة: يجب أن تبقى عينات البلازما عند -80 درجة مئوية حتى الاستخراج. تجنب دورات الذوبان وإعادة التجميد.
4. إجراءات الاستخراج
- نفذ بروتوكولات الاستخراج المشترك للدهون السائلة السائلة (LLE).
- إجراء استخراج مشترك من eCBs و eiCs من قطع الدماغ أو اللكمات أو عينات مسحوق الأنسجة.
ملاحظة: مطلوب سحب دقيق طوال الإجراء.- ضع أنابيب الاستخراج التي تحتوي على عينات الأنسجة وسبع كرات فولاذية على الجليد (4 درجات مئوية). أضف 600 ميكرولتر من MTBE المثلج البارد و 50 ميكرولتر من ACN / H2O (1: 1 ؛ v / v) التي تحتوي على المعايير الداخلية. والتركيز المستهدف للمعايير الداخلية في الحجم النهائي للتحليل (50 ميكرولتر) هو كما يلي: 1 نانوغرام/مل AEA-d4، 125 نانوغرام/مل 2-AG-d5، 3000 نانوغرام/مل AA-d8، 2 نانوغرام/مل OEA-d4؛ PEA-d4 ، 12.5 نانوغرام / مل 1-AG-d5 ، 2.5 نانوغرام / مل PGF2α-d4 و 5 نانوغرام / مل ل PGD2-d4 ؛ PGE2-d9 ؛ 5(S)-HETE-d8; 12 (ق)-HETE-d8; 20-HETE-d6 ، و TXB2-d4 ، على التوالي.
- أضف 400 ميكرولتر من 0.1 M من حمض الفورميك وتجانس باستخدام محلل الأنسجة (30 s-1 min). جهاز طرد مركزي المتجانس لمدة 15 دقيقة عند 5000 × g عند 4 درجات مئوية. اسمح بتجميد المرحلة السفلية المائية لمدة 10 دقائق عند -80 درجة مئوية لتسهيل نقل المرحلة العضوية العليا.
- نقل المرحلة العضوية في أنابيب جديدة. تبخر تحت تيار لطيف من N2 عند 37 درجة مئوية وإعادة تشكيلها في 50 ميكرولتر من ACN / H2O (1: 1 ؛ v / v) لمزيد من التحليل.
- قم بتخزين المرحلة المائية عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية لمزيد من تحليل محتوى البروتين.
- إجراء الاستخراج المشترك ل eCBs و eiCs من عينات البلازما.
- إذابة البلازما aliquots عند 4 درجات مئوية. أضف 800 ميكرولتر من MTBE و 50 ميكرولتر من ACN/H2O (1:1؛ v/v) التي تحتوي على المعايير الداخلية (مماثلة لتلك المستخدمة لتحليل الأنسجة، انظر الخطوة 5.1.1). تحسين التركيز القياسي الداخلي للارتفاع باستخدام عينات البلازما المرجعية.
- أضف 600 ميكرولتر من 0.1 M من حمض الفورميك وعينات الدوامة عند 4 درجات مئوية لمدة دقيقتين. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 4000 × g لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- انقل الطور العضوي إلى أنابيب جديدة ، وتبخر تحت تيار لطيف من N2 عند 37 درجة مئوية ، وأعد تشكيله في 50 ميكرولتر من ACN / H2O (1: 1 ؛ v / v) لتحليل LC / MRM.
ملاحظة: إذا كان ذلك ممكنا ، تجنب تخزين المستخلصات المجففة من eiCs وانتقل على الفور إلى تحليل LC / MRM. إذا لم يكن من الممكن تجنب التخزين ، فلجأ إلى التخزين لفترة قصيرة لمدة 2-3 أيام فقط عند 4 درجات مئوية مع عينات في مذيب حقن LC.
- إجراء استخراج مشترك من PLs و eCBs من مناطق الدماغ أو اللكمات أو عينات مسحوق الأنسجة الأخرى.
- ضع أنابيب الاستخراج التي تحتوي على عينات الأنسجة والخرز الخزفي على الجليد (4 درجات مئوية). أضف 800 ميكرولتر من MTBE/MeOH (10:3؛ v/v) و10 ميكرولتر من MeOH التي تحتوي على المعايير الداخلية. التركيز المستهدف للمعايير الداخلية في المجلد النهائي للتحليل (100 ميكرولتر) هو كما يلي: 150 نانوغرام / مل للكمبيوتر الشخصي 17: 0 / 14: 1 ، PE 17: 0 / 14: 1 ، PA 17: 0 / 14: 1 ، 100 نانوغرام / مل PG 17: 0 / 14: 1 ؛ ع 17:0/14:1; PI 17:0/14:1; LPC 17:0; LPA 17:0; SM d18: 1/12: 0,1 نانوغرام / مل AEA-d4 ، 60 نانوغرام / مل 2-AG-d5 ، 4000 نانوغرام / مل AA-d8 ، 2 نانوغرام / مل OEA-d2 و 3 نانوغرام / مل PEA- d4 على التوالي.
- أضف 200 ميكرولتر من 0.1٪ من حمض الفورميك الذي يحتوي على 25 ميكرومتر رباعي هيدروليبستاتين / URB597 و 50 ميكروغرام / مل BHT. تجانس مع مجانس الأنسجة (جدول المواد) وأجهزة الطرد المركزي عند 5000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
- استرجع المرحلة العضوية العليا في أنابيب جديدة وتبخر تحت تيار لطيف من N2 عند 37 درجة مئوية. أعد تشكيلها في 90 ميكرولتر من MeOH وإما تخزينها عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية أو المضي قدما في الخطوة التالية.
- أضف 10٪ H2O إلى أليكوت من مستخلص الدهون (4.1.3.3) وحقن 10 ميكرولتر في LC / MS لتحليل PLs. لمزيد من تحليل eCB ، تابع الخطوة 4.3.5.
- خذ أليكوت من المستخلص (4.1.3.3) ، وتبخر إلى الجفاف وأعد تشكيله في ACN / H2O (1: 1 ؛ v / v). استخدم 20 ميكرولتر لحقن LC / MS لتحليل eCB.
- إجراء استخراج مشترك ل PLs و eCBs من عينات البلازما.
- إذابة البلازما aliquots عند 4 درجات مئوية ، إضافة 1000 ميكرولتر من MTBE / الميثانول (10: 3 ؛ v / v) و 10 ميكرولتر MeOH تحتوي على معايير داخلية (مماثلة للخطوة 4.1.3) ودوامة عند 4 درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة.
- أضف 250 ميكرولتر من H2O والدوامة لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية. عينات أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 5000 × جم و 4 درجات مئوية. استعادة المرحلة العضوية العليا ، والتبخر تحت تيار لطيف من N2 عند 37 درجة مئوية ، وإعادة تشكيل في 90 ميكرولتر من الميثانول لمزيد من تحليل LC / MS. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية أو انتقل إلى الخطوة التالية.
- لتحليل PLs ، أضف 10٪ من الماء إلى أليكوت من مستخلص الدهون (4.1.2.2).
- لتحليل eCB ، أضف 10٪ من الماء إلى أليكوت من مستخلص الدهون (انظر 4.1.4.3) ، وتبخر إلى الجفاف ، وأعد تشكيله بنسبة 50٪ ACN / H2O (1: 1 ؛ v / v).
- إجراء استخراج مزدوج للحمض النووي الريبي والدهون (الاستخراج المشترك ل PLs و eCBs) من عينات الأنسجة.
تنبيه: تأكد من العمل في ظل ظروف خالية من الحمض النووي الريبي لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي.- قم بإذابة مسحوق الأنسجة أو عناقيد الدماغ (عند 4 درجات مئوية) وإضافة 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت RLT الذي يحتوي على 5 ميكرومتر THL / URB597 و 10 ميكروغرام / مل BHT و 1٪ β-mercaptoethanol (للحصول على النسب المئوية للحجم النهائي من المخزن المؤقت للتجانس ، انظر الخطوة 4.1) جنبا إلى جنب مع 200 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى أنابيب الاستخراج التي تحتوي على لكمات الدماغ المجمدة والخرز الخزفي.
- عينات سبايك مع 10 ميكرولتر من الخليط القياسي الداخلي للاستخراج المشترك PLs و eCB (انظر الخطوة 4.1.3) وتجانس عبر مجانس الأنسجة (سرعة عالية ، 20 ثانية).
- انقل الليزات إلى أنابيب أجهزة طرد مركزي جديدة وأجهزة طرد مركزي لمدة 5 دقائق بأقصى سرعة و 4 درجات مئوية لتمكين فصل الطور.
- استعادة واستخدام المرحلة العليا لاستخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعات إجراءات استخراج الحمض النووي الريبي القياسية (جدول المواد). الحمض النووي الريبي اللوت في حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase وتخزينها في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: العينة في الخطوة 4.1.5.4 قابلة لكل من تسلسل الحمض النووي الريبي و qPCR باستخدام الطرق والأجهزة المناسبة. - استخدم المرحلة السفلية المحتوية على الكلوروفورم لاستخراج الدهون. أضف 800 ميكرولتر من MTBE / الميثانول (10: 3 ؛ v / v) و 200 ميكرولتر من 0.1٪ من حمض الفورميك والدوامة لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية. استرجع المرحلة العضوية العليا وتبخر تحت تيار لطيف من N2 عند 37 درجة مئوية.
- إعادة تشكيل في 90 ميكرولتر من الميثانول لمزيد من تحليل LC / MS. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية أو انتقل إلى الخطوة 5.
- أضف 10٪ H2O إلى أليكوت من مستخلص الدهون (انظر الخطوة أعلاه 4.1.5.6) وحقن 10 ميكرولتر في LC / MS لتحليل PLs. لمزيد من تحليل eCB ، تابع الخطوة 5.7.
- خذ أليكوت من المستخلص (انظر الخطوة أعلاه 4.1.5.6) يتبخر إلى الجفاف ويعاد تشكيله في ACN / H2O (1: 1 ؛ v / v). استخدم 20 ميكرولتر لحقن LC/MS لتحليل eCB (مماثلة للخطوة 4.3.5).
- إجراء استخراج مشترك من eCBs و eiCs من قطع الدماغ أو اللكمات أو عينات مسحوق الأنسجة.
5. LC / MRM التنميط النوعي والكمي
- إعداد أنظمة المذيبات LC وحلول المعايرة وعينات مراقبة الجودة.
- بالنسبة ل PLs ، قم بإعداد المرحلة المتنقلة A: الميثانول / الماء (1: 1 ؛ v / v) التي تحتوي على 7.5 mM من تنسيق الأمونيوم و 0.1٪ TEA. تحضير المرحلة المتنقلة B: الميثانول / الأيزوبروبانول (2: 8 ؛ v / v) التي تحتوي على 7.5 mM فورمات الأمونيوم و 0.1 ٪ TEA. تخزين المذيبات في زجاجات LC.
- لفصل eCB و eiC ، قم بإعداد مذيبات LC التالية: 0.1٪ حمض الفورميك كمرحلة متنقلة A ، و 100٪ ACN تحتوي على 0.1٪ من حمض الفورميك كمرحلة متنقلة B. تخزين المذيبات في زجاجات LC.
- إعداد ضوابط الجودة باستخدام معايير المعايرة والمعايير الداخلية (الجدول 3) بتركيز متساوي الممول أو محدد من قبل المستخدم.
- قم بإعداد منحنيات المعايرة بسبع نقاط تركيز. استخدم نفس الدفعة القياسية الداخلية للارتفاع في محلول منحنى المعايرة وفي العينات المراد تحليلها.
- استخدم طريقة LC-MRM لتحديد ملامح الدهون النوعية والكمية.
- افتح علامة التبويب طريقة اكتساب الإنشاء في البرنامج التجاري (على سبيل المثال، المحلل) وحدد وضع LC/MRM مع تبديل القطبية. حدد في الطريقة التحولات الأيونية (كما هو موضح في الجدول 3) للتنميط الكمي. اضبط وقت الاستقرار على 50 مللي ثانية.
- بالنسبة لتوصيف PLs ، قم بتعيين معلمات مصدر الأيونات التالية: غاز الستارة = 40 رطل لكل بوصة مربعة ؛ درجة حرارة سخان المصدر = 550 درجة مئوية ؛ جهد الرش الأيوني = -4,500 فولت في وضع الأيونات السالبة و= +5,200 فولت في وضع الأيونات الموجبة.
- ولأغراض التحليل المشترك لل eCBs و eiCs، ضع المعلمات التالية: غاز الستارة = 40 رطل لكل بوصة مربعة؛ وغاز الستارة = 40 رطل لكل بوصة مربعة؛ وغاز الستارة = 40 رطل لكل بوصة مربعة؛ وغاز الستارة = 40 رطل لكل بوصة مربعة؛ وغاز الستارة درجة حرارة سخان المصدر = 550 درجة مئوية ؛ جهد الرش الأيوني = -4,500 فولت في وضع الأيونات السالبة و= +4,500 فولت في وضع الأيونات الموجبة.
- لتحليل PL ، اضبط تسخين العمود على 45 درجة مئوية ومعدل التدفق على 200 ميكرولتر / دقيقة واضبط التدرج التالي: min 0 = 40٪ B ؛ الحد الأدنى 3 = 40٪ ب ؛ الحد الأدنى 42 = 90٪ ب ؛ الحد الأدنى 43 = 99٪ ب ؛ الحد الأدنى 50 = 99٪ B ، والحد الأدنى 52 = 40٪ B. تعيين حجم الحقن إلى 10 ميكرولتر.
- بالنسبة لتحليل eCBs و eiCs ، اضبط درجة حرارة العمود على درجة حرارة الغرفة واضبط التدرج التالي: min 0 = 20٪ B; الحد الأدنى 1 = 20٪ ب ؛ الحد الأدنى 5 = 50٪ B ، الحد الأدنى 12 = 50٪ B ؛ الحد الأدنى 13 = 90٪ B ، الحد الأدنى 17 = 90٪ B ؛ الحد الأدنى 17.5 = 20٪ B ؛ الحد الأدنى 20 = 20٪ B. تعيين حجم الحقن إلى 20 ميكرولتر.
ملاحظة: قد تختلف ظروف MRM بين المنصات المفيدة ، وبالتالي يجب الاستدلال على شروط التجزئة و MRM تجريبيا ويجب اختبار معلمات التأين وتعديلها إذا لزم الأمر من أجل الحصول على أقصى قدر من الحساسية والانتقائية.
- إجراء تحليل الدفعات.
- افتح دفعة اكتساب الإنشاء واملأ المعلمات المطلوبة لوصف العينة والموقع في حامل عينة أخذ العينات التلقائي وطريقة الاكتساب (تم تعيينها كخطوة 5.2).
- قم دائما بتضمين ضوابط الجودة في بداية التحليل ونهايته وضمن الدفعة. بعد كل 25-30 عينة، قم بتضمين ثلاثة منحنيات معايرة على الأقل داخل الدفعة وقم بتضمين خطوة غسيل مع مذيب من اختيارك بعد كل عينة لمراقبة الجودة، ومنحنى المعايرة، وفي نهاية دفعة العينة.
- نقل العينات التي تم الحصول عليها في الخطوة 4 في قوارير LC/MS. ضع العينات في رفوف التحميل الخاصة بجهاز أخذ العينات التلقائي LC وفقا للموضع المحدد في الدفعة وقم بتحميل حامل العينة في جهاز أخذ العينات التلقائي LC.
- إرسال دفعة وبدء تحليل قائمة الانتظار.
- تحديد كمية الدهون
- استخدم البرمجيات التجارية (مثل المحلل) ووحدة القياس الكمي المضمنة للقياس الكمي ل eCBs و eiCs والبرامج التجارية (على سبيل المثال ، Multiquant) لتحديد كمي PLs.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام البرنامج الحاسوبي الثاني في عمليات eCBs و eiCs ، خاصة عندما يتم استخدام معيار داخلي واحد لتحديد كمية التحليلات المتعددة. - افتح طريقة القياس الكمي للبناء واملأ المعلمات الخاصة بالتحليلات والمعايير الداخلية وانتقالات MRM ونسب المعايير الداخلية إلى التحليلات المراد تحديدها كميا (الجدول 3). اضبط الحد الأدنى لارتفاع الذروة على 500 cps.
- استخدام المعايير التالية أو الجمع بينها لتحديد هوية الدهون والقياس الكمي اللاحق6: مطابقة وقت الاحتفاظ بالتحليلات الداخلية للدهون مع معايير المعايرة، و/أو المعايير الداخلية المحايدة، حيثما كان ذلك متاحا؛ مطابقة أيون الشظايا عن طريق تجزئة وضع الأيونات الموجبة والسالبة لتحليل معين للدهون m/z لا توجد معايير لها ؛ سلوك الاستخلاص المستنبط من الأدب للدهون في ظل ظروف LC المستخدمة بشكل مماثل لتشريح الهياكل الأيزومرية و / أو متساوي الضغط ؛ وحيثما كان ذلك متاحا، تحليل LC/MS وMS/MS مع قياس الطيف الكتلي عالي الاستبانة، باستخدام ظروف LC مماثلة للتحليل المستهدف (باستخدام LC/MRM)، لتحديد هوية الدهون الداخلية ذات الأهمية وسلوكها بدقة 18,19.
- للتحقق من صحة تحليل الدفعات ، استخدم المعايير التالية: دقة القياس الكمي ≤ ±20٪. معامل الانحدار ≥0.97 (من الناحية المثالية ≥0.99).
ملاحظة: اتبع المبادئ التوجيهية لتطوير طريقة التحليل الحيوي والتحقق من صحتها لضمان تحليل موثوق به وقابل للتكرار للجزيئات المستهدفة.
- استخدم البرمجيات التجارية (مثل المحلل) ووحدة القياس الكمي المضمنة للقياس الكمي ل eCBs و eiCs والبرامج التجارية (على سبيل المثال ، Multiquant) لتحديد كمي PLs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن الجمع بين مجموعة البروتوكولات الموصوفة على مستويات مختلفة بطريقة محددة الهدف، مثل اختيار النموذج الحيواني، وطريق أخذ العينات، وطريقة الاستخراج، والتنميط (الشكل 1).
من أجل تحديد التغيرات في مستوى الدهون في الدماغ ومحيطه على مدى فترة زمنية من حالة نوبة الصرع الحادة والكشف عن التأثير المضاد للصرع المحتمل13 من PEA وتأثيره على تغيرات الدهون في الدماغ والمحيط، عولجت ثلاث مجموعات من التجارب باستخدام مركبة، KA للحث على الصرع الحاد، وPEA كمرشح دواء مضاد للصرع. تم إعطاء PEA عن طريق i.p. قبل حقن KA (على سبيل المثال ، مع حقنة PEA واحدة للعلاج الحاد وحقنتين PEA للعلاج دون المزمن). لغرض التحليل الجزيئي المتعدد و / أو تلطيخ الكيمياء النسيجية المناعية في 5 أيام بعد العلاج ، تم تكرار التجارب على الحيوانات حسب الحاجة (الشكل 2).
يؤدي تحريض KA لنوبات الصرع الحادة إلى أقصى شدة للنوبة 1 ساعة بعد الحقن15 (الشكل 3). لكشف التغيرات في مستوى الدهون في الدماغ والمحيطية في حالة شدة النوبات القصوى ، تم التضحية بالفئران في 1 ساعة بعد حقن KA ، تليها البلازما والدماغ وأخذ عينات من الأعضاء الطرفية. تم تشريح الأدمغة المجمدة في ست مناطق في الدماغ (انظر الخطوة 3.1). وتم سحق مناطق الدماغ وأنسجة الأعضاء الطرفية (القلب والرئة) للحصول على عينات متجانسة من الأنسجة ومن ثم تم الاستشهاد بها للتنميط الدهني ل eCBs و eiCs (الشكل 4A والخطوة 4.1.1) و PLs و eCBs (الشكل 4B والخطوة 4.1.3).
تم تطبيق بروتوكول الاستخراج المزدوج (انظر الخطوة 4.1.5) لأداء PLs / eCBs و RNA بدقة مكانية أعلى عن طريق التنميط من لكمات الدماغ في مناطق مختلفة: تحت المهاد (HYP) ، اللوزة القاعدية (BLA) والحصين البطني (vHC) والظهري (dHC) (الشكل 5). تم أخذ عينات من اللكمات (انظر الخطوة 3.2) من الفئران المصابة بالصرع الناجم عن KA والفئران الضابطة في حالة النوبة القصوى في 1 ساعة بعد حقن KA (الشكل 2).
لتقييم مدى التنكس العصبي وعزو تغيرات الدهون إلى مدى التنكس العصبي مع الصرع وعند علاج الصرع الجديد باستخدام PEA ، تم إجراء تلطيخ مزدوج كيميائي نسيجي مناعي على أقسام الدماغ (انظر الخطوة 1.3) أخذ عينات بعد 5 أيام من نوبات الصرع الناجمة عن KA (الشكل 2) في الفئران دون علاج PEA المزمن (الوسط) ، مع علاج PEA شبه المزمن (يمين) ، وفي الفئران المحقونة بمحلول ملحي (يسار) (الشكل 6 ). تسبب الصرع الناجم عن KA (SE) في فقدان هائل لإشارة NeuN ، في الغالب في منطقة CA1 و CA3 و hilus في الحصين ، مصحوبة بأحداث استماتية تشير إليها إشارة caspase-3 (CASP3) (الشكل 6 ، الصورة الوسطى) مقارنة بالتحكم (الشكل 6 ، الصورة اليسرى). علاج PEA شبه المزمن (الصورة اليمنى) المحفوظة بشكل خاص إشارة بروتين النوى العصبية (NeuN) ، في حين أن إشارة (CASP3) بالكاد يمكن اكتشافها.
| KA- ومحلول حقن SAL . |
| محلول حقن KA (الحجم النهائي 8 مل): |
| 1. وزن 24 ملغ KA في أنبوب 15 مل (تحذير: ارتداء الكراث والقناع) |
| 2. أضف 8 مل من المياه المالحة والدوامة لمدة 10 دقائق |
| 3. يحفظ في 4 درجات مئوية للتخزين intermdediate |
| 4. تجديد إلى درجة حرارة الغرفة والدوامة قبل الحقن |
| محلول حقن السيارة 1 (الحجم النهائي 8 مل): |
| تخطي الخطوة 1 والمتابعة مع الخطوات 2-4 |
الجدول 1: إعداد المخدرات المسببة للنوبات وتطبيق السيارة 1. خطوات تحضير محلول حقن حمض كاينيك (KA) ل 24 حقنة داخل الصفاق (10 مل / كجم) بتركيز نهائي قدره 30 مجم / كجم ومحلول حقن السيارة المقابل (السيارة 1)1.
| محلول حقن PEA- و SAL / DMSO / Cremophor (18: 2: 1 ، (v / v / v)) |
| محلول حقن PEA (الحجم النهائي 8 مل): |
| 1. وزن 32 ملغ PEA في أنبوب 15 مل |
| 2. أضف 0.4 مل DMSO والدوامة لمدة 10 دقائق |
| 3. أضف 3.4 مل SAL ودوامة لمدة 5 دقائق |
| 4. خليط سونيكات لمدة 5 دقائق عند 36 درجة مئوية |
| 5. أضف 0.4 مل كريموفور ودوامة لمدة 5 دقائق |
| 6. سونيكات لمدة 1 دقيقة عند 36 درجة مئوية وإضافة 3.4 مل SAL |
| 7. دوامة لمدة 30 ثانية وسونيكات لمدة 3 دقائق في 36 درجة مئوية |
| 8. حافظ على المحلول عند 36 درجة مئوية بسرعة منخفضة في الخفق والدوامة قبل الحقن |
| محلول حقن السيارة 2 (الحجم النهائي 8 مل): |
| تخطي الخطوة 1 والمتابعة مع الخطوات من 2 إلى 8 |
الجدول 2: تحضير الأدوية المضادة للصرع وتطبيق السيارة 2. خطوات نموذجية لإعداد محلول حقن بالميتويل إيثانولاميد (PEA) ل 24 حقنة داخل الصفاق (10 مل / كجم) بتركيز نهائي قدره 40 مجم / كجم ومحلول حقن السيارة المقابل (السيارة 2)1.
| وضع الأيونات الموجبة | ||||||
| معايير المعايرة المحددة PLs | المعايير الداخلية المقابلة | |||||
| التحليل | أيون السلائف | أيون المنتج م / ض | التحليل | أيون السلائف | أيون المنتج م / ض | |
| اسم | م / ض | اسم | م / ض | |||
| ايه اي ايه | 348.3 | 62.1 | AEA-d4 | 352.3 | 66.1 | |
| 2-AG | 379.1 | 287.2 | 2-AG-d5 | 384.2 | 287.2 | |
| OEA | 326.2 | 62.1 | OEA-d2 | 328.2 | 62.1 | |
| البازلاء | 300.2 | 62.1 | PEA-d4 | 304.2 | 62.1 | |
| الكمبيوتر 16:0/18:1 | 760.59 | 184.07 | كمبيوتر 17:0/14:1 | 718.54 | 184.07 | |
| الكمبيوتر 18:2_20:4 | 806.57 | 184.07 | ||||
| الكمبيوتر 18:0_20:4 | 810.6 | 184.07 | ||||
| LPC 18:0 | 524.37 | 184.07 | LPC 17:0 | 510.36 | 184.07 | |
| LPC 20:4 | 544.34 | 184.07 | ||||
| SM d18:1/18:0 | 731.61 | 184.07 | SM d18:1/12:0 | 647.51 | 184.07 | |
| وضع الأيونات السالبة | ||||||
| معايير المعايرة المحددة PLs | المعايير الداخلية المقابلة | |||||
| التحليل | أيون السلائف m/z | أيون المنتج م / ض | التحليل | أيون السلائف | أيون المنتج م / ض | |
| اسم | اسم | م / ض | ||||
| أ أ | 303.05 | 259.1 | AA-d8 | 311.04 | 267 | |
| 5 (ق)-HETE | 319.48 | 115 | 5 (ق)-HETE-d8 | 327.48 | 116 | |
| 8 (ق)-HETE | 319.48 | 155 | 12 (ق)-HETE-d8 | 327.48 | 184 | |
| 12 (ق)-HETE | 319.48 | 179 | ||||
| 15 (ق)-HETE | 319.48 | 219 | ||||
| 19 (ق)-HETE | 319.48 | 231 | ||||
| 20-HETE | 319.48 | 289 | 20-HETE-d6 | 325.48 | 295 | |
| LxA4 | 351.5 | 115.2 | LxA4-d5 | 356.5 | 115 | |
| PGF2 α | 353.48 | 309.2 | PGF2 α-d4 | 357.5 | 313.3 | |
| TxB2 | 369 | 169 | TxB2-d4 | 373 | 173 | |
| PGE2 | 351.47 | 315.3 | PGE2-d9 | 360.25 | 324.3 | |
| PGD2 | 351.47 | 315.3 | PGD2-d4 | 355.25 | 319.3 | |
| 11β-PGF2 α | 353.24 | 193 | ||||
| آر في دي1 | 375.22 | 215.1 | RvD1-d5 | 380.22 | 180.2 | |
| PE 16:0/18:1 | 716.52 | 281.25 | PE 17:0/14:1 | 674.48 | 225.19 | |
| ٣٨: ٤ | 766.54 | 303.23 | ||||
| PE 40: 6 | 790.54 | 303.23 | ||||
| ٤٠: ٤ | 794.57 | 303.23 | ||||
| السلطة الفلسطينية 16:0/18:1 | 673.48 | 255.23 | السلطة الفلسطينية 17:0/14:1 | 631.43 | 269.25 | |
| LPA 16:0 | 409.24 | 153 | LPA 17:0 | 423.25 | 153 | |
| LPA 20:4 | 457.24 | 153 | ||||
| LPI 20:4 | 619.29 | 303.23 | ||||
| ص 16:0/18:1 | 747.52 | 281.25 | ص 17:0/14:1 | 705.47 | 225.19 | |
| بي جي 16:1_20:4 | 767.49 | 303.23 | ||||
| بي جي 18:1_20:4 | 795.52 | 303.23 | ||||
| PI 16:0/18:1 | 835.53 | 281.25 | PI 17:0/14:1 | 793.49 | 269.25 | |
| PS 16:0/18:1 | 760.51 | 255.23 | PS 17:0/14:1 | 718.47 | 269.25 | |
| PS 36:4 | 782.49 | 303.23 | ||||
| PS 38:4 | 810.53 | 303.23 | ||||
| PI 16:0/18:1 | 835.53 | 281.25 | PI 17:0/14:1 | 793.49 | 269.25 | |
| PI 36:4 | 857.52 | 303.23 | ||||
| PI 38:4 | 885.55 | 303.23 | ||||
| C1P d18:1/16:0 | 616.47 | 78.9 | C1P d18:1/12:0 | 560.41 | 78.9 | |
| S1P d18:1 | 378.24 | 78.9 | S1P d17:1 | 364.23 | 78.9 | |
الجدول 3: معايير الدهون وتحولات MRM لتحليل الدهون المستهدفة. نشر محتوى الجدول أصلا في Lerner et al.2
الشكل 1: نظرة عامة على وحدات سير العمل. اعتمادا على هدف الدراسة والطرق المختلفة لأخذ العينات ، يمكن الجمع بين الاستخراج والتنميط لتمكين نتيجة مهمة للدراسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التصميم التجريبي لنموذج نوبات الصرع الناجم عن حمض الكاينيك الحاد (KA) في الفئران. يتم التعامل مع الفئران إما مع 1) المالحة (10 مل / كغ i.p.) ؛ 2) KA (30 مغ / كغ i.p.) ؛ و / أو 3) (فرعي) المعالجة مسبقا بشكل مزمن (1-2 × 40 مغ / كغ i.p) مع المركب المضاد للصرع المحتمل Palmitoylethanolamide (PEA). تم التعامل مع أربعة وعشرين فأرا لكل مجموعة على النحو الوارد أعلاه وتم تسجيل السلوك لتقييم شدة النوبات. تم التضحية بستة فئران لكل مجموعة في كل من النقاط الزمنية الأربع المختلفة (T1−T4) لتحديد التغيرات في مستوى الدهون على مدى فترة زمنية من حالة نوبة الصرع الحادة في الدماغ والأعضاء الطرفية والبلازما. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التسجيل السلوكي على مدى دورة زمنية من الصرع الناجم عن حمض الكاينيك الحاد (KA) مقابل الضوابط. تقييم شدة النوبات على مدى فترة زمنية مدتها 180 دقيقة بعد تحريض نوبة KA (n = 24) أو الحقن الملحي (n = 24) كمتوسط درجات سلوكية. لم يتم العثور على أي اختلافات بين مجموعات حقن السيارة 1 والمركبة 2. أشرطة الخطأ = SEM. أسفر القياس المتكرر ANOVA عن تفاعلات كبيرة بين النقاط الزمنية للقياسات ومجموعات الاختبار ، مما يشير إلى تأثيرات كبيرة لعلاج KA على الدرجات السلوكية. تم نشر كثافة النوبات من الفئران المعالجة ب KA في الأصل في Post et al.13يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مستويات الدهون في الدماغ والأنسجة الطرفية في حالة نوبة الصرع الحادة. يتم عرض التغيرات في مستوى الدهون كقيمة متوسطة ± SEM عند أقصى شدة للنوبة (على سبيل المثال ، 1 ساعة بعد حقن KA) عبر ست مناطق في الدماغ (n = 9): القشرة الدماغية (cCTX) ، المخطط (STR) ، المنطقة المهادية (THL) ، الحصين (HC) ، ما تحت المهاد (HYP) ، المخيخ (CER) ، وكذلك أنسجة القلب والرئة في الفئران الصرع الناجمة عن KA (القيمة العليا) والضوابط (القيمة الأدنى). يتم تصوير مستويات الدهون القاعدية في الأنسجة باللون الرمادي. يتم إعطاء قيم PLs و 2-AG و AA بالنانومول / g. وقيم NAEs و eiCs و AEA في pmol / g ، على التوالي. يتم تطبيع جميع مستويات الدهون إلى وزن الأنسجة. لتسليط الضوء على التغيرات الجزيئية المحددة ، يتم تمثيل مستويات الدهون في الفئران المعالجة ب KA كنسبة مئوية من الحقن الملحي (KA / sal) في خريطة حرارية تعرض قيما منخفضة عند شدة النوبات الحادة مقارنة بالتحكم يتم تصويرها باللون الأزرق الفاتح والمستويات المتزايدة مقارنة بالتحكم باللون الأحمر ، على التوالي. وهي تعتبر معنوية عند قيمة p <0.05. تم نشر هذه البيانات في الأصل في Lerner et al.2يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الاستخراج المزدوج ل eCBs / PLs و RNA للتنميط الكمي من لكمات دماغ الفئران. (أ) التوزيع الكمي لمجموعات مختارة من PLs و eCBs عبر: 1) منطقة دون إقليمية من منطقة ما تحت المهاد (HYP)؛ 2) اللوزة القاعدية (BLA) ؛ و 3) المناطق الفرعية البطنية (vHC) والظهرية (dHC) في الحصين ، من الفئران نوبة الصرع الناجمة عن KA (القيمة العليا) مقابل الضوابط (القيمة الأدنى) (n = 10). يتم تطبيع المستويات إلى وزن الأنسجة (اللكمات تتوافق مع حوالي 0.5-1.5 ملغ) ويتم التعبير عنها بالنانومول / غرام. يتم التعبير عن AEA فقط في pmol / g. يتم تقديم مستويات الدهون كقيمة متوسطة ± SEM. متوسط التباين لكل منطقة دماغية مثقوبة (SEM كنسبة مئوية من المتوسط ، متوسط على جميع الدهون) هو: HYP = 7.83٪. BLA = 7.80٪ ؛ vHC = 6.28٪ ؛ و dHC = 7.90٪ ، على التوالي. (ب) مستويات التعبير النسبية للإنزيمات والمستقبلات الداخلية المنشأ المشاركة في إشارات الدهون، فضلا عن علامات نشاط الدماغ التي تم التحقيق فيها على مستوى الحمض النووي الريبوزي المرسال في مناطق مختلفة من الدماغ/المناطق دون الإقليمية من الفئران المعرضة لنوبات الصرع الناجمة عن كا (الأحمر) والضوابط (الرمادي الفاتح). تم إجراء تحليلات إحصائية للفرق بين وسائل المجموعة باستخدام اختبار t للطالب غير المقترن ثنائي الذيل واعتبرت معنوية عند قيمة p <0.05 (n = 10). تم نشر هذه البيانات في الأصل في Lerner et al.7يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: صبغة مزدوجة كيميائية نسيجية مناعية NeuN و CASP3. تم إجراء الكيمياء النسيجية المناعية بعد خمسة أيام من حقن KA على أقسام الدماغ من الفئران غير المعالجة بالمحلول الملحي (يسار) ، والفئران المعالجة مسبقا PEA تحت المزمن (الوسط) ، والفئران الصرع دون معالجة مسبقة (يمين). تظهر المعالجة المسبقة ل PEA تأثيرات وقائية عصبية مقارنة بالفئران الصرعية غير المعالجة (n = 3). تم نشر هذه البيانات في الأصل في Post et. al.13يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعد منهجية الخلايا العصبية الشحمية والنسخ الموصوفة هنا وسيلة قابلة للتطبيق للتحقيق في أي مرض أو تطور صحي بدقة مكانية عالية ومنخفضة في الدماغ والأعضاء الطرفية. نظرا لإجراءات أخذ عينات البلازما ومعالجتها المحسنة ، يمكن أيضا إجراء تحليل الدهون في البلازما من نفس الحيوانات التي تم التضحية بها من أجل الدهون في الأنسجة والنسخ ، وبالتالي تحسين موثوقية الارتباطات الجزيئية لدم الأنسجة واكتشاف المؤشرات الحيوية. إن توفير مجموعة واسعة من البيانات عن طريق تطبيق أي من البروتوكولات الثلاثة أو مجموعاتها ، له قيمة للتحقيق ليس فقط في مرض عصبي في سياق (تجربة النموذج الحيواني) ولكن أيضا عبر سياقات النموذج التجريبي وفيما بينها. علاوة على ذلك ، فإن المستوى العالي من توحيد العينات والمعالجة والتحليل الجزيئي يسهل قابلية عالية لاستنساخ البيانات الجزيئية ، وبالتالي الرجوع بشكل موثوق إلى التغيرات الجزيئية بين الدراسات والمختبرات وداخلها.
ومع ذلك ، لتحقيق ذلك ، فإن إعداد تصميم تجريبي يوفر أقصى قدر من إمكانات القراءة لهدف الدراسة المحدد أمر بالغ الأهمية. لتحقيق مقارنة موثوقة للتغيرات الجزيئية بين المجموعات التجريبية ، يوصى باستخدام ما لا يقل عن عشرة للتعويض عن التباين الحيواني والنطاق البيولوجي لمستويات الدهون. عندما يكون شراء الحيوانات و / أو الخدمات اللوجستية لمناولة الحيوانات مقيدا ، فإن استخدام ما لا يقل عن ستة لكل مجموعة أمر حتمي لتوفير تحليل إحصائي واثق. تحتاج حسابات حجم المجموعة إلى التعويض عن معدلات الوفيات المرتبطة بالنموذج (أي أن ما لا يقل عن ستة ، من الناحية المثالية عشرة ، الحيوانات لكل مجموعة مطلوبة للدراسة على الرغم من معدل الوفيات المحتمل للنموذج). ومن المتطلبات الحاسمة ضمان مطابقة الحيوانات للعمر والجنس والإجهاد لكل مجموعة تجريبية. بالنسبة لمرحلة الاكتشاف ، من الضروري استخدام نفس المزود لحيوانات التجارب لجميع الدراسات ونفس الدفعة الحيوانية إن أمكن ، من أجل تجنب تحيز النتائج بسبب الاختلافات السلوكية والجزيئية المحتملة في النمط الظاهري بين دفعات الحيوانات. لضمان موثوقية وقابلية تكرار النمط الظاهري الجزيئي والسلوكي المحدد في الدراسات ، من الأهمية بمكان إجراء تحليل بيولوجي للتكاثر كلما أمكن ذلك.
ومن الخطوات الحاسمة الأخرى إعداد عمل تجريبي موحد ومجدول مع مجموعات حيوانية. من الضروري علاج الحيوانات في نفس النافذة الزمنية من اليوم للتحايل على التباين الجزيئي اليومي. يجب تحديد الوقت من اليوم وفقا للتأثير المعروف للإيقاع اليومي على تخليق وتدهور الجزيئات المستهدفة أو الحفاظ على اتساقها لجميع المجموعات التجريبية عندما لا تتوفر معلومات عن تأثيرات إيقاع الساعة البيولوجية. وبالمثل ، يجب الحفاظ على ظروف السكن والتغذية قبل التضحية بالحيوانات متسقة وخاضعة للرقابة الصارمة عبر النماذج التجريبية. هذا مهم بشكل خاص للتنميط الدهني بسبب تأثير التغذية على بلازما الدهون واستقلاب الأنسجة. وينبغي دائما إعطاء الأدوية العلاجية أو المسببة للأمراض بالتوازي مع إعطاء المركبات في المجموعات الضابطة، حيث يجب أن تكون المركبة هي نفسها المستخدمة في إعطاء الدواء. ومن أجل اختيار أنسب سلالات القوارض و/أو السلالات الفرعية لأغراض الدراسة، ينبغي تنفيذ استراتيجيات العلاج القائمة على العقاقير وفقا لخصوصية الدواء من حيث وقت وتواتر إعطائه، والجرعات ومسار الإعطاء، والقابلية المحددة للعقاقير ذات السلالات المختلفة المستنبطة من الأدبيات و/أو الخبرات السابقة. من المستحيل إجراء دراسة مسار زمني لمرض ما والاستجابة للعلاج الذي يشمل مجموعات كبيرة من الأتراب أو مجموعات حيوانية متعددة في يوم واحد من حيث العلاج والتضحية وأخذ العينات. في مثل هذه الحالات ، يجب جدولة معالجة المجموعات الحيوانية وتنفيذها في أيام متتالية ، مع الحفاظ على نفس الشروط من حيث الوقت من اليوم ، والتصميم التجريبي ، ووقت المعالجة ، والباحثين ، وما إلى ذلك. يعد تحضير الحقن الكيميائية خطوة حاسمة أخرى. يجب تحضير المركبات المسببة للأدوية أو الأمراض طازجة قبل تناولها ووفقا لمواصفات الدواء. يوصى باستخدام نفس دفعة الإنتاج من الدواء لجميع الأفواج المراد مقارنتها. هذا مهم بشكل خاص في حالة التركيبات المركبة الطبيعية مثل حمض الكاينيك (KA) المستخدم في هذه الدراسة لتحريض الصرع.
لتمكين التنميط الدهني أو النسخي الموثوق به ، يجب إجراء عملية التضحية بالحيوانات باستمرار عبر المجموعات الحيوانية في غضون إطار زمني مدته 5 دقائق. إذا تم جمع الدم بعد قطع الرأس ، فمن المهم الحفاظ على كمية ثابتة من الأيزوفلوران في الغرفة الزجاجية. لهذا الغرض ، نقع بشكل متكرر (بعد خمسة استخدامات) مع الأيزوفلوران ولا تتجاوز 10 ثوان طوال مدة التخدير باستخدام الأيزوفلوران ، من أجل تجنب ظهور عدم انتظام ضربات القلب والخفقان وضمان ضغط الدم المناسب لأخذ عينات البلازما.
ويجب التقيد الصارم بشروط أخذ عينات المواد البيولوجية ومناولتها (مثل النافذة الزمنية وترتيب أخذ عينات المواد البيولوجية ومناولتها) والحفاظ عليها متطابقة بالنسبة لجميع الفئات. لتجنب درجات متفاوتة من ذوبان الأنسجة وبالتالي تغيرات الأنسجة خارج الجسم الحي غير المتسقة لمستويات الدهون و / أو الحمض النووي الريبوزي المرسال ، من الضروري الحفاظ على ظروف الوقت ودرجة الحرارة الخاضعة للرقابة الصارمة لما بعد أخذ العينات.
خزن. تشريح الأنسجة أو اللكم ، ومعالجة العينات وتحليلها لاحقا (انظر القسمين 3 و 4). يمكن تشريح الأدمغة الكاملة التي تم أخذ عينات منها حديثا على الفور على صفيحة معدنية مبردة مسبقا (4 درجات مئوية) دون تجميد مسبق ، إذا كان حجم مجموعات التجارب يسمح بالتضحية بالحيوانات وإزالتها وتشريحها دون تغيير الإطار الزمني المشار إليه هنا لكل من هذه الإجراءات. إذا لم يكن حجم المجموعات التجريبية عمليا لهذه الإجراءات ، فمن المستحسن تجميد الأدمغة والتشريح اللاحق للسماح بوقت مماثل وخاضع للرقابة للمعالجة. عند اتباع البروتوكولات والمبادئ التوجيهية للجدول الزمني المشار إليها هنا بدقة ، لم يلاحظ أي تناقض بين المستويات الجزيئية التي تم الحصول عليها عن طريق استخراج مناطق الدماغ التي تم تشريحها حديثا ومناطق الدماغ التي تم تشريحها من الأدمغة المجمدة.
ومن الجوانب الحاسمة لتحقيق الحد الأدنى من التباين القابل للتكرار والحد الأدنى من مستويات الدهون داخل المجموعات وفيما بينها، بصرف النظر عن معالجة العينات في ظل ظروف درجة حرارة خاضعة للرقابة الصارمة، توفير مضادات الأكسدة (انظر القسمين 2 و 3). إن تجنب أي عوامل إجهاد (مثل رائحة الدم) للحيوانات قبل التضحية أمر بالغ الأهمية ، لأن العديد من الدهون المشاركة في النشاط العصبي مثل eCBs يمكن أن تتغير بسرعة استجابة للإجهاد.
لاستخراج الدهون وتحليلها ، من الضروري إعداد المعايير الداخلية ومحاليل المعايرة ومذيبات الاستخراج في يوم الاستخراج. يجب استخدام نفس مصدر المعايير الداخلية لكل من إعداد منحنى المعايرة واستخراج العينات. أيضا ، يعد اتباع ظروف درجة الحرارة التي يتم التحكم فيها بدقة لاستخراج العينات وتخزينها وتحليلها أمرا بالغ الأهمية لتقليل ومراقبة التغيرات الأنزيمية أو الكيميائية خارج الجسم الحي للجزيئات. بالنسبة لتحليل LC / MRM ، يمكن تصميم مجموعة الدهون المستهدفة وفقا لهدف الدراسة عن طريق إضافة أو إزالة الأهداف والمعايير والمعايرات الداخلية المقابلة ، شريطة أن يتم تحسين الفصل والكشف وانتقالات MRM لمجموعة جديدة من الدهون. وتسمح بروتوكولات الاستخراج المقدمة بتوفير نسختين متماثلتين من LC/MRM ل eCBs و eiCs ، وهو أمر مفيد لحالات الفشل التقني أو عندما يكون تحليل النسخ المتماثل ذا أهمية للدراسة. تجعل بروتوكولات استخراج PL كميات العينات / الاستخراج مناسبة لما لا يقل عن 10 تحليلات لكل مستخلص (على سبيل المثال تجارب المسح الضوئي المتعددة القائمة على أيون السلائف والمسح الضوئي المحايد للفقدان2 ، على التوالي ؛ تحليلات LC / MRM الإضافية ؛ أو نسخ LC / MRM للتعويض عن الفشل الفني أثناء التشغيل). لا يقتصر تحليل الدهون على LC / MRM. في الواقع ، فإن مستخلصات الدهون التي تم الحصول عليها باستخدام أي من هذه البروتوكولات قابلة للتحليل الطيفي الكتلي المتطور وغير المتطور. باستثناء لكمات الدماغ أو كمية دقيقة من الأنسجة التي تم الحصول عليها من مناطق منفصلة (أقل من 3 ملغ) ، يمكن اقتباس الأنسجة المسحوقة المجمدة في المناطق التي يزيد حجمها عن 2-3 ملغ واستخدامها لوحدات استخراج متعددة كما هو موضح هنا لتحليل النسخ المتماثل و / أو للتحقيقات الأخرى القابلة للتطبيق في مسحوق الأنسجة.
تتمثل الميزة العامة للبروتوكولات الموصوفة هنا مقارنة بالبروتوكولات الشائعة الاستخدام في زيادة فعالية الوقت الإجمالي والحساسية لاستخراج المركبات المتعددة وتحليلها عند انخفاض نفقات الموارد الحيوانية والمواد الاستهلاكية وتكاليف التحليل. والأهم من ذلك، أن بروتوكول استخراج الدهون المزدوجة/الحمض النووي الريبوزي المرسال يوفر أيضا كفاءة أعلى لاستخراج الحمض النووي الريبوزي المرسال20،21 وسلامة الحمض النووي الريبوزي المرسال مقارنة بالبروتوكولات القياسية المتاحة المقابلة، وفي الوقت نفسه زيادة كفاءة استخراج الدهون7. من المحتمل أن يكون هذا أيضا بسبب انخفاض تأثير المصفوفة لكل من كسور الدهون والحمض النووي الريبي المرسال عند استخراجها بشكل مزدوج. ونتيجة لذلك ، فإن هذه الطريقة قابلة للتطبيق بسهولة على التنميط عالي الدقة المكانية كما هو الحال في لكمات الدماغ.
ومع ذلك ، فإن أحد القيود الحالية للبروتوكول هو أن الدهون الالتهابية غير قابلة للتحليل والقياس الكمي باستخدام استخراج الدهون المزدوجة / mRNA. وبالتالي، فإن البروتوكول يخضع لمزيد من التحسين. تحقيقا لهذه الغاية ، يمكن استخراج الدهون الالتهابية في الأنسجة والبلازما و endocannabinoids وتحليلها بشكل مشترك ، وهي أداة محسنة للتحقيق في وقت واحد في العمليات العصبية الالتهابية والنشاط العصبي المعدل من endocannabinoids (انظر الاستخراج المشترك ل eiCs و eCBs). ومن المتوقع أن يكون إدراج الدهون الفوسفاتية في هذا الفحص الأخير ممكنا.
وبالنظر إلى النهج المتعددة الأوميك المحتملة للأمراض العصبية، من المتوقع أن يكون التحليل البروتيني لكسور البروتين التي تم الحصول عليها بعد بروتوكول استخراج الدهون (أي الاستخراج المشترك ل eCBs و eiCs، وكذلك الاستخراج المشترك ل PLs و eCBs) ممكنا. ومع ذلك ، هذا غير ممكن بعد عند استخدام بروتوكول الدهون المزدوجة / mRNA. بالنسبة للأخير ، تمنع البيئة الكيميائية للاستخراج حتى تحديد كمية البروتين باستخدام مقايسات البروتين القياسية مثل فحص حمض البيسينكونينيك (BCA). ومن المقرر إجراء مزيد من التطورات للتغلب على هذا القيد والتعجيل بإدراج التنميط البروتيني في هذه البروتوكولات.
باستخدام البروتوكول المعياري الموصوف هنا ، كان من الممكن الحصول على خريطة إقليمية للدماغ ل eiCs و eCBs و PLs في نموذج حيواني لنوبات الصرع الحادة (الشكل 4). أظهر البروتوكول تعديل الحصين للعمليات الالتهابية بواسطة eiCs وتعديل النشاط العصبي بواسطة eCBs في الفئران المعالجة وغير المعالجة مع النوبات الحادة الناجمة عن KA 13. كما لوحظ توطين الدماغ دون الإقليمي للفوسفوليبيد و endocannabinoid و mRNA في حالات نوبات الصرع الحادة ، على التوالي ، (الشكل 5). تسلط هذه النتائج الضوء على قيمة وقابلية تطبيق الأساليب الموصوفة هنا في تطوير المعرفة حول مجموعة واسعة من الدهون المشاركة في تعديل الأمراض العصبية المعقدة مثل الصرع في مناطق الدماغ والمناطق دون الإقليمية. هذه البروتوكولات قابلة للتطبيق بشكل عام في التحقيق في الأمراض العصبية وما بعدها مع استمرار تطوير البروتوكولات والتطبيقات لمجموعات الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نهدي هذه المقالة إلى الدكتورة إرميليندا لومازو. أثناء الانتهاء من هذه المخطوطة، توفيت الدكتورة إرميليندا لومازو. إنها تجسيد للشغف بالعلوم والمشاركة غير الأنانية في العمل الجماعي لتحقيق غرض بحثي ذي مغزى. كانت تحلم دائما بالمساهمة بشكل هادف في تحقيق رفاهية أكبر للبشر. لم تتعرض طبيعتها الطيبة للخطر أبدا بسبب الطرق الشاقة للعلم والحياة. ستبقى لا تقدر بثمن ، وإلى الأبد ، في قلوبنا.
تم تمويل جوليا م. بوست من قبل برنامج التركيز لعلم الأعصاب الانتقالي (FTN) في المركز الطبي الجامعي التابع لجامعة يوهانس غوتنبرغ ماينز ويتم تمويله حاليا من قبل مشروع SPP-2225 EXIT إلى LB. تم تمويل ريسا ليرنر جزئيا من قبل مشروع DZHK 81X2600250 إلى LB و Lipidomics Core Facility. تم توفير تمويل جزئي لهذه الدراسات من قبل المرفق الأساسي Lipidomics ، ومعهد الكيمياء الفسيولوجية ، والأموال الداخلية (إلى LB) من المركز الطبي الجامعي بجامعة يوهانس غوتنبرغ ماينز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12(S)-HETE | Biomol | Cay10007248-25 | Lipid Std |
| 12(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay334570-25 | Lipid Std |
| 1200 series LC System | Agilent | Instrumentation/LCMS | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Instrumentation/qPCR | |
| 5(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay 334230 | Lipid Std |
| ABI 7300 Real-Time PCR cycler | Applied Biosystems | Instrumentation/qPCR | |
| Acetonitrile LC-MS Chroma Solv | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| amber eppendorf tubes | Eppendorf | Sample Prep. | |
| Analyst 1.6.2 Software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | Instrumentation/Sample prep. | |
| Arachidonic Acid-d8 MS Standard | Biomol | Cay-10007277 | Lipid Std |
| Bessmann Tissue Pulverizer | Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) | Instrumentation/Sample prep. | |
| Bino | Zeiss | Microscopy | |
| cleaved Caspase 3 antibody | Cellsignaling | 9661S | Microscopy |
| Cryostat, Leica CM3050 S | Leica Biosystems | Instrumentation/Sample prep. | |
| CTC HTC PAL autosampler | CTC Analytics AG | Instrumentation/LCMS | |
| Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 | FST | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) | FST | 11252-00 | Surgical Tools |
| EDTA 1000 A Röhrchen | Kabe Labortechnik | 078001 | Sample Prep. |
| EP-1 EconoPump | BioRAD | 700BR07757 | Instrumentation/Sample prep. |
| Fine Forceps Mirror Finish | FST | 11412-11 | Surgical Tools |
| Fine Iris Scissors straight sharp | FST | 14094-11 | Surgical Tools |
| Fine Scissor Tungsten Carbide straight | FST | 14568-09 | Surgical Tools |
| Iris Spatulae | FST | 10094-13 | Surgical Tools |
| Kainic acid | Abcam | ab120100 | Epileptic drug |
| Lipid View software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| LPC 17:0 | Avanis Polaris | 855676P | Lipid Std |
| LPC 18:0 | Avanis Polaris | 855775P | Lipid Std |
| Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column | Phenomenex | 00D-4446-B0 | Instrumentation/LCMS |
| Magnifying lamp | Maul GmbH | Instrumentation/Sample prep. | |
| Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| Motic Camara | Motic | Microscopy | |
| MTBE | Honeywell | 34875-1L | Solvent/LCMS |
| MultiQuant 3.0 quantitation software package | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Scientific | Instrumentation/qPCR | |
| PA 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840857P | Lipid Std |
| PA 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1404 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide | Biomol | Cay90350-100 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide-d5 | Biomol | Cay9000573-5 | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1004 | Lipid Std |
| PE 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850757P | Lipid Std |
| PE 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1104 | Lipid Std |
| PG 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840457P | Lipid Std |
| PG 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1204 | Lipid Std |
| PI 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1504 | Lipid Std |
| Precelleys 24 | Peqlab | Instrumentation/Sample prep. | |
| Precellys Keramik-Kügelchen | Peqlab | 91-pcs-ck14p | Sample Prep. |
| Precellys Stahlkugeln 2,8mm | Peqlab | 91-PCS-MK28P | Sample Prep. |
| Precellys-keramik-kit 1,4 mm | VWR | 91-PCS-CK14 | Sample Prep. |
| Prostaglandin D2 | Biomol | Cay 12010 | Lipid Std |
| Prostaglandin D2-d4 | Biomol | Cay 312010 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2 | Biomol | Cay10007211-1 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2-d9 | Biomol | Cay10581-50 | Lipid Std |
| PS 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1304 | Lipid Std |
| Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS | AB SCIEX | AU111609004 | Instrumentation/LCMS |
| Real Time PCR System | Appliert Biosystem | Instrumentation/qPCR | |
| Resolvin D1 | Biomol | Cay10012554-11 | Lipid Std |
| Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | Sample Prep. |
| Security Guard precolumn | Phenomenex | Instrumentation/LCMS | |
| Shandon coverplates | Thermo Fisher | 72110017 | Microscopy |
| Shandon slide rack and lid | Thermo Fisher | 73310017 | Microscopy |
| SM 18:0 | Avanis Polaris | 860586P | Lipid Std |
| SM d18:1/12:0 | Avanis Polaris | LM-2312 | Lipid Std |
| Standard Forceps straight Smooth | FST | 11016-17 | Surgical Tools |
| Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern | FST | 14130-17 | Surgical Tools |
| T3000 Thermocycler | Biometra | Instrumentation/qPCR | |
| Thromboxane B2 | Biomol | Cay19030-5 | Lipid Std |
| Thromboxane B2-d4 | Biomol | Cay319030-25 | Lipid Std |
| Tissue Lyser II | Qiagen/ Retsch | 12120240804 | Instrumentation/Sample prep. |
| Tissue Tek | Sakura Finetek | 4583 | Microscopy |
| Toluidinblau | Roth | 0300.2 | Microscopy |
| Vapotherm | Barkey | 4004734 | Instrumentation/Sample prep. |
| Wasser LC-MS Chroma Solv | VWR | 9814920 | Solvent/LCMS |
References
- Aronica, E., et al. Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models. Epilepsia. 58, 27-38 (2017).
- Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L. Targeting brain and peripheral plasticity of the lipidome in acute kainic acid-induced epileptic seizures in mice via quantitative mass spectrometry. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (2), 255-267 (2017).
- Schuhmann, K., Almeida, R., Baumert, M., Herzog, R., Bornstein, S. R., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
- Puppolo, M., Varma, D., Jansen, S. A. A review of analytical methods for eicosanoids in brain tissue. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 964, 50-64 (2014).
- Blewett, A. J., Varma, D., Gilles, T., Libonati, J. R., Jansen, S. A. Development and validation of a high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry method for the simultaneous determination of 23 eicosanoids. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 46 (4), 653-662 (2008).
- Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. 59, 283-297 (2017).
- Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. , 1-48 (2018).
- Lévesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, (2016).
- Eyo, U. B., Murugan, M., Wu, L. J.
- Zhu, J., Zheng, X. Y., Zhang, H. L., Luo, Q. Kainic acid-induced neurodegenerative model: Potentials and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 457079 (2011).
- Park, S. H., Sim, Y. B., Kim, C. H., Lee, J. K., Lee, J. H., Suh, H. W. Role of α-CGRP in the regulation of neurotoxic responses induced by kainic acid in mice. Peptides. 44, 158-162 (2013).
- Lerner, R., Cuadrado, D. P., Post, J. M., Lutz, B., Bindila, L. Broad lipidomic and transcriptional changes of prophylactic PEA administration in control mice. Frontiers in Neuroscience. 13, 527 (2019).
- Post, J. M., et al. Antiepileptogenic Effect of Subchronic Palmitoylethanolamide Treatment in a Mouse Model of Acute Epilepsy. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, (2018).
- Schauwecker, P. E., Steward, O. Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: Implications for gene targeting approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (8), 4103-4108 (2002).
- Monory, K., et al. The Endocannabinoid System Controls Key Epileptogenic Circuits in the Hippocampus. Neuron. 51 (4), 455-466 (2006).
- Konsman, J. P.
- Spijker, S. Dissection of Rondent Brain Regions. Neuroproteomics. Li, K. W. 57, 13-27 (2011).
- Gross, R. W. The evolution of lipidomics through space and time. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (8), 731-739 (2017).
- Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
- Abbott, S. K., et al. An improved high-throughput lipid extraction method for the analysis of human brain lipids. Lipids. 48 (3), 307-318 (2013).
- Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).
