Summary
Dit artikel beschrijft de deuteriumoxide verdunningstechniek bij twee zoogdieren, een insectivore en carnivoor, om het totale lichaamswater, de spiermassa, de massa van lichaamsvet en het waterverbruik te bepalen.
Abstract
Body condition scoring systemen en body condition indexen zijn veel voorkomende technieken die worden gebruikt voor de beoordeling van de gezondheidstoestand of fitness van een soort. Body condition scoring systemen zijn evaluator afhankelijk en hebben het potentieel om zeer subjectief. Body condition indices kunnen worden verward door foerageren, de effecten van lichaamsgewicht, evenals statistische en inferential problemen. Een alternatief voor lichaamsconditie scoringsystemen en lichaamsconditieindexen is het gebruik van een stabiele isotoop zoals deuteriumoxide om de lichaamssamenstelling te bepalen. De deuteriumoxideverdunningsmethode is een herhaalbare, kwantitatieve techniek die wordt gebruikt om de lichaamssamenstelling bij mensen, dieren in het wild en in het wild te schatten. Bovendien kan de deuteriumoxideverdunningstechniek worden gebruikt om het waterverbruik van een individueel dier te bepalen. Hier beschrijven we de aanpassing van de deuteriumoxide verdunningstechniek voor het beoordelen van de lichaamssamenstelling bij grote bruine vleermuizen(Eptesicus fuscus)en voor het beoordelen van het waterverbruik bij katten(Felis catis).
Introduction
Body condition scoring systemen en body condition indexen zijn veel voorkomende technieken die worden gebruikt voor de beoordeling van de gezondheidstoestand of geschiktheid van een soort1,2. Veel binnenlandse en zoölogische soorten hebben unieke body condition scoring (BCS) systemen die worden gebruikt om de spier van een dier en oppervlakkig vetweefsel te beoordelen3. BCS-beoordeling is echter afhankelijk van de evaluator, wat betekent dat BCS een objectieve of semikwantitatieve meting is wanneer deze wordt beoordeeld door een getrainde beoordelaar. Bij wilde diersoorten worden lichaamsconditieindexen vaak gebruikt in plaats van BCS en zijn gebaseerd op een verhouding van lichaamsmassa tot lichaamsgrootte of lichaamsmassa tot onderarm2. Lichaamsconditie indicis zijn vaak verward door de effecten van foerageren en kan worden verward door de lichaamsgrootte, alsmede statistische en inferentieve problemen4.
Een alternatief voor lichaamsconditie scoringsystemen en lichaamsconditieindexen is het gebruik van een stabiele isotoop om de lichaamssamenstelling te bepalen. Een veelgebruikte stabiele isotoop is deuteriumoxide (D2O), een niet-radioactieve vorm van water waarin de waterstofatomen deuteriumisotopen zijn. De deuteriumoxideverdunningsmethode die in deze studie wordt beschreven, kan een niet-subjectieve, kwantitatieve en herhaalbare techniek zijn die wordt gebruikt om de lichaamssamenstelling bij mensen te schatten5 en een breed scala aan soorten4,6,7. Deze techniek kan voordelig zijn voor het bestuderen van de lichaamssamenstelling in het wild. Het kan bijvoorbeeld worden gebruikt om longitudinale veranderingen in lichaamssamenstelling te beoordelen, zoals voor en na een beheersactie. Bij sommige wilde diersoorten kan deuteriumoxide echter het werkelijke watergehalte overschatten8. Daarom is het bij de aanpassing van de techniek voor een soort belangrijk om de methode te valideren door de deuteriumoxidemethode te vergelijken met karkasanalyse voor niet-bedreigde soorten. Voor bedreigde en bedreigde soorten moet een niet-destructieve methode, zoals dubbele röntgenonthouding (DXA), worden beschouwd als een alternatieve vergelijkingsmethode voor de goudstandaarddestructieve methode voor volledige karkasanalyse.
Naast de lichaamssamenstelling kan de D2O verdunningstechniek worden gebruikt om het waterverbruik van een individueel dier te bepalen9. Deze unieke toepassing van D2O kan worden gebruikt om niet alleen onderzoeksvragen te beantwoorden, maar kan ook nuttig zijn voor het beoordelen van het waterverbruik van individuele dieren(en) die in grote sociale omgevingen zijn gehuisvest.
Hier beschrijven we de aanpassing van de D2O verdunningstechniek voor het beoordelen van lichaamssamenstelling in een insectivore, grote bruine vleermuizen(Eptesicus fuscus), en voor het beoordelen van het waterverbruik bij een carnivoor, katten (Felis catis).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten hier beschreven werden goedgekeurd door de Universiteit van Missouri Animal Care and Use Committee en uitgevoerd onder de Missouri Department of Conservation (MDC) Wildlife Scientific Collection vergunning (Vergunning #16409 en #17649).
1. Bereiding van steriele, isotone, verzilte D2O-voorraadoplossing
- Maak een 50 mL voorraad oplossing van 9,0 g/L salinated D2O.
- Weeg 450 mg nacl van farmaceutische kwaliteit en breng alle NaCl over in een 100 mL, gesteriliseerd bekerglas. Noteer de exacte hoeveelheid NaCl tot 4 decimalen in het laboratoriumnotitieblok.
- Meet met behulp van een steriele gegradueerde cilinder 50 g ≥ 99,8% deuteriumoxide en breng over naar het steriele bekerglas met de NaCl. Noteer de exacte hoeveelheid deuteriumoxide tot 4 decimalen in het laboratoriumnotebook of spreadsheet.
- Filter 10 mL isosmotische sterkte NaCl (9,0 g/L) door een niet-pyrogene steriele schijffilter met submicron poriën (0,2 μm).
- Bevestig een naald van 20 G aan het niet-pyrogene steriele schijffilter met submicron poriën (0,2 μm) voorzien van een spuitvat van 10 mL. Voeg in het septum van een steriele lege flacon van 100 mL.
- Bevestig een vacuümbuis aan een naald van 22 G en steek de naald in het septum van de 100 mL steriele lege flacon.
- Giet 10 mL van de voorraadoplossing in het spuitvat. Zet het vacuüm langzaam aan totdat de D2O-voorraadoplossing langzaam in de steriele flacon begint te filteren. Blijf de D2O-voorraadoplossing in het spuitvat gieten totdat alle 50 mL is gefilterd.
OPMERKING: De voorraadoplossing moet mogelijk worden verdund of geconcentreerd, afhankelijk van de vereiste dosis. De dosis D2O zal variëren op basis van de soort en de gevoeligheid van de analysemethode. Voor katten werd de werkoplossing gebruikt om een dosis van 0,7 g/kg D2O toe te dienen. De hierboven beschreven voorraadoplossing minimaliseert de hoeveelheid NaCl-oplossing die onderhuids aan het dier wordt geïntroduceerd en tegelijkertijd een nauwkeurige meting van de dosis mogelijk maakt. Voor kleine zoogdieren zoals vleermuizen moet deze concentratie worden verdund tot een werkoplossing zoals 0,1600 g/mL. Met deze concentratie kan de dosis van 0,75 g/kg D2O nauwkeurig worden gemeten en toegediend in ongeveer 100 μL of minder NaCl-oplossing.
2. Bereiding van steriele, isotone, verzilte D2O-voorraadwerkoplossing voor vleermuizen
- Weeg een 10 mL lege steriele flacon en neem gewicht op tot de dichtstbijzijnde 4 decimalen. Tare schaal.
- Gebruik een 1,0 mL spuit om 0,65 mL van de D2O voorraad oplossing over te brengen naar de geteerd, 10 mL lege steriele flacon. Record gewicht van D2O tot 4 decimalen. Tare schaal.
- Bereken het volume van D2O in de 10 mL lege flacon. Gebruik de volgende vergelijking.
waarbij W is geregistreerd gewicht en D is de dichtheid van 99,8% D2O (1.107 g/mL). - Gebruik het berekende volume en het bekende gewicht van de D2O om het volume van isotone zoutoplossing te bepalen die nodig is om ~ 0,1600 g/mL-werkoplossing te maken.
- Steek in het septum van de 10 mL steriele flacon, de 22 G naald (bevestigd aan de vacuümbuis). Steek in het septum van de 10 mL steriele flacon, de 20 G naald (bevestigd aan een 0,22 μm spuitfilter uitgerust met een spuitvat van 10 mL).
- Giet de berekende massa/volume van isotone NaCl in het spuitvat en zet het vacuüm aan om een langzame druppel in de steriele flacon van 10 mL mogelijk te maken.
- Noteer het gewicht van de flacon en zorg ervoor dat er een ~0,1600 g/mL-werkoplossing wordt gecreëerd.
3. Bepaling van de lichaamssamenstelling van grote bruine vleermuizen(Eptesicus fucsus)met D2O
LET OP: De voorraadoplossing van D2O die in het protocol wordt gebruikt, is 0,1598 g/mL. Zorg er voor het verzamelen van bloed ervoor dat het verwijderen van maximaal 200 μL bloed ≤ 10% van het totale bloedvolume van de vleermuis bedraagt en binnen de vastgestelde richtlijnen van het Comité voor de institutionele dierenverzorging en het gebruik (IACUC) is vastgesteld. Alle dieren moeten worden vasten of buik palpated om een lege maag te garanderen. Een recente maaltijd kan het gewicht van het dier veranderen, wat resulteert in verwarde resultaten, omdat berekeningen voor het bepalen van lichaamsvet afhankelijk zijn van de lichaamsmassa van het dier.
- Verdoven een grote bruine vleermuis.
- Gebruik 5,0% isoflurane voor inductie. Handhaaf een stabiel anesthesievlak met 0,5%−3,0% isoflurane.
- Bepaal de juiste anesthesiediepte door de pedaalontwenningsreflex te testen (knijpen de tenen van de vleermuis). De vleermuis mag niet reageren op het gevoel en de ademhalingsfrequentie moet traag en stabiel blijven. Pas isoflurane aan als dat nodig is om een stabiel anesthesievlak te behouden.
- Record isoflurane niveau, hartslag, ademhalingsfrequentie, en andere informatie zoals vereist door IACUC.
- Weeg de grote bruine vleermuis en neem het gewicht op tot 4 decimalen.
- Reinig het uropatagium (staartmembraan) over de interfemorale ader met een alcoholpreppad en laat drogen. Breng een dunne laag vaseline over de interfemur ader.
- Gebruik een 29 G naald om het rugdeel van de interfeorale ader door te boren en verzamel 100 μL bloed met behulp van plastic natriumheparine capillaire buizen. Zorg voor een adequate vermenging van het hele bloed met de natriumheparine door elke buis na het verzamelen voorzichtig te rollen en de buis te etiketteren.
- Met behulp van een DXA machine gekalibreerd voor kleine zoogdieren, het verkrijgen van drie DXA scans van de vleermuis10.
- Bepaal de massa (g) van D2O om te injecteren door het vleermuisgewicht in kg te vermenigvuldigen met de D2O-dosis van 0,75 g/kg. Bepaal het volume van de berekende D2O dosis (V) door het gewicht van de D2O-dosis te delen door de concentratie van de werkoplossing.
- Gebruik een insulinespuit met een 29 G naald bevestigd om het volume van D2O berekend op te stellen. Weeg de D2O, insulinespuit en naald. Record tot 4 decimalen.
- Injecteer de D2O onderhuids over het rugheupgebied van de verdoofde vleermuis.
- Laat vleermuis te herstellen van anesthesie en het tijdstip van injectie registreren.
- Weeg onmiddellijk na de injectie de nu lege insulinespuit met de 29 G naald eraan. Neem het gewicht op tot 4 decimalen.
- Bepaal de dosis D2O geïnjecteerd door het gewicht na de injectie van de insulinespuit af te trekken van de voorinjectie D2O gevulde insulinespuit. Record tot 4 decimalen.
- Gebruik binnen 30 min na de bloedafname een hematocrietcentrifuge om elke capillaire buis gedurende 5 min te draaien. Als de hematocrietcentrifuge meerdere snelheden toelaat, ingesteld op 10.000 x g.
- Gebruik een scherpe schaar om de plastic capillaire buis tussen het hele bloed en plasma te snijden. Gebruik een pipet van 200 μL om het plasma rechtstreeks in een gelabelde 500 μL-opslagbuis te verdrijven.
- Verzamel na de evenwichtsperiode nog eens 100 μL bloed uit de interfemorale ader.
OPMERKING: De evenwichtsperiode zal per soort verschillen en als de vleermuizen in torpor gaan. Voor grote bruine vleermuizen, meestal 2 uur is voldoende voor de equilibratie periode. - Scheid plasma in een tweede geëtiketteerde, 500 μL microcentrifuge schroefbovenbuis door stap 3.13 te herhalen. Bewaar monsters bij -20 °C of kouder tot de analyse.
4. Fourier-transformatie infraroodspectrofotometrie analyse
- Stel de temperatuur van een zandbad in op 60 °C om de distillatie te vergemakkelijken (laat de scheiding van water en D2O van andere bloedbestanddelen mogelijk maken).
- Pipetteer 50 μL van elk plasmamonster en standaard aan de binnenkant van een 1,5 mL conische microcentrifuge buisdop. Inclusief normen die bekende concentraties van D2O als kwaliteitscontrole bevatten.
OPMERKING: Idealiter elk dier zal drie replica's per monster en het gemiddelde van de drie replica's gemeld. Vanwege het beperkte monstervolume en het volume van het monster dat nodig is voor de FT-IR-apparatuur die door de auteurs werd gebruikt, werden er geen replica's uitgevoerd voor de vleermuismonsters. Als een monster minder dan 50 μL plasma bevat, moet u de monsterhoeveelheid op de conische microcentrifugebuisdop laten lopen en het volume registreren. - Houd de microcentrifugedop ondersteboven en schroef de 1,5 mL conische microcentrifugebuis op de dop. Plaats de omgekeerde (ondersteboven) buis met de dop in contact met het zand in het zandbad voor een minimum van 12 uur ('s nachts).
- Verwijder na 12 uur de dop en vervang door een nieuwe, schone dop. Pulseer de microcentrifugebuis gedurende 10 s in een centrifuge.
- Maak de volgende normen: 0 ppm (0 mg D2O in 1 L gedestilleerd water), 293 ppm (293 mg D2O in 1 L gedestilleerd water), 585 ppm (585 mg D2O in 1 L gedestilleerd water), 878 ppm (878 mg D2O in 1 L gedestilleerd water) en 1170 ppm D2O (1170 mg D2O in 1 L gedistilleerd water).
OPMERKING: De bovenstaande waarden worden voorgesteld voor een standaardcurve. Alternatieve waarden zoals 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm, enzovoort kunnen worden gebruikt. - Installeer een vloeibare transmissiecel in de Fourier-transform infraroodspectrofotometrie (FTIR) spectrometer(Table of Materials). Vul de cel met methanol en sluit de injectiepoort aan. Vul de cel langzaam met achtergrondwater terwijl u de methanolspuit zorgvuldig verwijdert om het risico op luchtbellen te verminderen. Bevestig buizen aan de uitgangspoort om verwijdering van de monsters na de analyse mogelijk te maken.
- Bereid de FTIR spectrometer software(Tabel van materialen) voor analyse van D2O in water. De parameterinstellingen voor de spectrometersoftware die in dit protocol wordt gebruikt, worden vermeld in tabel 1.
- Verzamel een achtergrondmonster met behulp van het verdunningsmiddel, 0,22 μm gefilterd, gedestilleerd water. Dit moet hetzelfde water gebruikt voor de normen.
- Injecteer 40 μL van de 0 ppm D2O en neem de spectra op. Sla de spectra op als een CSV-bestand (komma gescheiden waarden).
- Blijf de spectra van alle standaarden injecteren en opslaan om een standaardcurve te creëren.
- Herhaal de achtergrond en standaard curve om de 60−90 min.
- Injecteer 40 μL van elk gedestilleerd monster in de vloeibare transmissiecel en sla de spectra op.
OPMERKING: Wijzig het injectievolume van de normen en gedistilleerde monsters op basis van het volume van de vloeistoftransmissiecel. Gebruik een vloeistoftransmissiecel met een kleiner volume als het monstervolume lager is dan 40 μL of verdun 1:1 met op de achtergrond gedestilleerd water. - Bepaal de concentratie van D2O van elk monster van de FTIR-spectra met behulp van een spreadsheetprogramma zoals beschreven door Jennings et al.11 of de spectrale software. Wanneer replica's worden uitgevoerd, gebruikt u de gemiddelde concentratie om de lichaamssamenstelling te berekenen.
5. Berekening van de lichaamssamenstelling
- Zet de deuteriumverrijking (ppm) om in atomprocentconcentratie voor elk monster met behulp van de volgende vergelijking12:
waarbij x de gemeten deuteriumverrijking (ppm) van het monster is en 0,0001557 de molfractie is van deuterium gerapporteerd in Vienna Standard Mean Ocean Water (VSMOW)13. - Bereken het totale lichaamswater voor elk monster met behulp van de volgende vergelijking4,12,14:
)
waar E de gemeten verrijking (atoom%) is van deuterium in het monster na achtergrondcorrectie, B is de injectiemassa in g, en 0,998 is de concentratie van geïnjecteerde D2O.
OPMERKING: Deuterium uitwisseling met labile waterstof veroorzaakt een 2% overschatting van de totale lichaamswatermassa. Totaal lichaamswater moet worden gecorrigeerd door het verminderen van de totale lichaamswatermassa schatting met 2% van het lichaamsgewicht. - Schat de vetvrije massa (magere lichaamsmassa en alle andere vetvrije componenten) van elke vleermuis met behulp van de volgende vergelijking:
OPMERKING: Gebruik de conventioneel geaccepteerde waarde van 0,732 voor het fractionele vochtgehalte van magere lichaamsmassa voor gezonde, euhydrateerde, niet-zogende vleermuizen. Het fractionele vochtgehalte van vetvrije massa kan veranderen in zogende grote bruinen op basis van de post-partum week15. Voor andere soorten, gebruik maken van de waarden gepubliceerd in de literatuur of bepalen van de fractionele vochtgehalte van mager lichaam massa voorafgaand aan het uitvoeren van berekeningen van de magere lichaamsmassa. - Schat de massa lichaamsvet met behulp van de volgende vergelijking:
- Zet de lichaamsvetmassa in g naar procent lichaamsvet massa met behulp van de volgende vergelijking:
)
6. Bepaling van de watersamenstelling bij een carnivoor (Felis catus, huiskat)
- Bereid de voorraadoplossing voor zoals beschreven in punt 1.
- Weeg elke kat tot de dichtstbijzijnde 3 decimalen en neem gewicht op. Bereken de dosis voor elke kat zoals beschreven in stap 3.6 met behulp van een D2O-dosis van 0,70 g/kg.
- Bereid elke dosis voor zoals beschreven in de stappen 3.7−3.8. met behulp van een 3 mL of 5 mL spuit met een 22 G naald in plaats van een insulinespuit.
- Verzamel 500 μL volbloed en toedienen vervolgens onderhuids de 0,7 g/kg D2O. Centrifuge volbloed bij 2.000 x g voor 15 min en bewaar plasma in 1,5 mLcentrifuge microcentrifuge schroefbovenbuizen op -20°C tot analyse.
- Verzamel 500 μL volbloed 4 h na de injectie. Centrifugeer volbloed bij 2.000 x g voor 15 min en bewaar plasma in 1,5 mL microcentrifuge schroefbovenbuizen bij -20 °C tot analyse.
- Verzamel 500 μL volbloed 14 dagen na de injectie. Centrifugeer volbloed bij 2.000 x g voor 15 min en bewaar plasma in 1,5 mL microcentrifuge schroefbovenbuizen bij -20 °C tot analyse.
OPMERKING: Het aantal dagen tussen de bloedafname kan gebaseerd zijn op de experimentele behoeften en de periode na de injectie waarin D2O boven de achtergrondniveaus kan worden gedetecteerd. Veertien dagen was de lengte van de dieetbehandeling blokken van Hooper et al.9. - Voer FT-IR-analyse uit volgens sectie 4 en bereken de lichaamssamenstelling volgens sectie 5 van dit protocol.
- Bereken het waterverbruik in mL/dag met behulp van de volgende vergelijkingen:
wanneer TBW totaal lichaamswater is, zijn de initiële D2O en de laatste D2O de concentraties gemeten in ppm in de monsters na de injectie D2O.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De deuteriumoxideverdunningstechniek kan worden gebruikt om de lichaamssamenstelling van een verscheidenheid aan soorten te beoordelen. Om het aanpassingsvermogen aan te tonen, rapporteren we het eerste gebruik van de deuteriumoxideverdunningstechniek in een Noord-Amerikaanse insectenetende vleermuissoort, Eptesicus fuscus, de grote bruine vleermuis voor representatieve resultaten. Een timing plateau werd voltooid door het nemen van pre- en post-D2O injectie bloedmonsters zoals moet worden gedaan met elke soort waar de evenwichtsperiode onbekend is. Er werd vastgesteld dat twee uur na de injectie in niet-sorpid vleermuizen voldoende was voor evenwicht. Met de evenwichtstijd bekend, het totale lichaamswater, mager lichaam massa, en lichaamsvet massa voor 13 wild gevangen grote bruine vleermuizen en 8 gevangen grote bruine vleermuizen werden bepaald (Tabel 2). Een extra 2 wild gevangen grote bruine vleermuizen en 5 gevangen grote bruine vleermuizen werden bepaald om een negatieve lichaamsvet massa hebben. Een negatieve lichaamsvetmassa wordt berekend als gevolg van een of meer van de volgende redenen: niet ontvangen van de gehele dosis deuteriumoxide, steeds sorpid tijdens de evenwichtsfase, met abnormaal grote vetmassa's en minimale mager massa, of vleermuizen met minder dan 3%−5% lichaamsvet zoals bepaald door DXA(Tabel 3).
Wit-neus syndroom heeft veroorzaakt veel vleermuissoorten te dalen, dus de techniek werd vergeleken met het lichaamsvet gemeten met behulp van DXA. Figuur 1 toont het percentage lichaamsvet dat wordt bepaald door de D2O verdunningstechniek en DXA (n = 19). De twee technieken waren goed gecorreleerd met een Pearson's r = 0,897 (figuur 2) en waren niet statistisch verschillend (eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA), F-waarde = 0,366, p = 0,549). Het lichaamsvet vertoonde sterke correlaties tussen lichaamsvet en lichaamsgewicht (figuur 3). De D2O verdunning techniek niet consequent over of onderschatten het lichaamsvet massa.
De deuteriumoxidemethode is eerder gevalideerd bij katten16. Tabel 4 toont een voorbeeld van het totale lichaamswater, de magere lichaamsmassa en de massa van het lichaamsvet van een enkele kat9. Hooper et al.9 was de eerste die het gebruik van deuteriumoxideverdunning meldde om het waterverbruik van sociaal gehuisveste dieren te meten met het dagelijkse waterverbruik van de katten tijdens elk voedingsblok van het experiment, zoals blijkt uit figuur 4.
Figuur 1: Deuteriumoxide en DXA-lijnplot. Elk punt vertegenwoordigt het lichaamsvetpercentage van een individuele vleermuis zoals bepaald door DXA of deuteriumoxide. Het gemiddelde is het lichtgroene punt met foutbalken die de standaardfout van het gemiddelde aangeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Percentage lichaamsvet in grote bruine vleermuizen. Deming regressie (vaste blauwe lijn, Pearson's r = 0,897) het vergelijken van het percentage lichaamsvet bepaald door DXA (x-as, de referentiemethode) en het percentage lichaamsvet bepaald door deuteriumoxide (y-as, de testmethode) in grote bruine vleermuizen met 95% betrouwbaarheidsintervallen aangewezen door grijze arcering. De getekende groene streepjesidentiteitslijn vertegenwoordigt de regressielijn wanneer de methoden gelijk zijn. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Percentage lichaamsvet in grote bruine vleermuizen in vergelijking met lichaamsgewicht. Lichaamsgewicht van elke vleermuis uitgezet tegen het lichaamsvet percentage bepaald door D2O of DXA. Er bestaat een sterke correlatie tussen het lichaamsgewicht en lichaamsvet zoals bepaald door DXA (donkerblauwe lijn, Pearson's r = 0,88) en D2O (blauwe lijn, Pearson's r = 0,86). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Waterverbruik van sociaal gehuisveste katten. Representatieve resultaten van het dagelijkse waterverbruik van sociaal gehuisveste katten tijdens een experiment waarin de effecten van voedingsbestanddelen op het waterverbruik worden geëvalueerd. Dit cijfer is gewijzigd van Hooper et al.9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Parameter | Instelling |
| Aantal scans | 64 |
| Resolutie | 2 |
| Gegevensafstand | 0,946 cm-1 |
| Definitieve indeling | Extinctie |
| Correctie | Geen |
| Vaste Y-aslimieten gebruiken in het verzamelvenster | Min -0.01, Max 0.03 |
| Bankbereik | Max 6.38, Min -5.02, Loc 1024 |
| Totale absorberende piekgevoeligheid | 50 |
| randranden of kanaliserengevoeligheid | 80 |
| Afgeleide pieken sensativiteit | 51 |
| Basislijnfoutgevoeligheid | 50 |
| CO2-niveaus gevoeligheid | 19 |
| H2O niveaus gevoeligheid | 19 |
| Apodisatiemodus | Happ-Genzel Happ-Genzel |
| Fasecorrectie | Mertz Mertz |
| Filters ingesteld op basis van | Snelheid |
| low pass-filter | 11,000 |
| high pass-filter | 20 |
Tabel 1: Spectrale software-instellingen. Parameterinstellingen die worden gebruikt voor spectrale opnamesoftware.
| Dierlijke | Soort(en) | Lichaamsgewicht (kg) |
D2O geïnjecteerd g) |
Totaal lichaamswater g) |
Magere lichaamsmassa g) |
Lichaamsvetmassa g) |
Lichaamsvetmassa (%) |
DXA lean + bmc g) |
DXA vet g) |
DXA vet (%) |
| 1 | Eptesicus fuscus | 0.01715 | 0.0740 | 11.80 | 16.15 | 1.00 | 5.80 | 14.65 | 0.75 | 4.80 |
| 2 | Eptesicus fuscus | 0.01950 | 0.0920 | 13.80 | 18.83 | 0.69 | 3.50 | 16.20 | 1.40 | 7.90 |
| 3 | Eptesicus fuscus | 0.01677 | 0.08 | 11.33 | 15.47 | 1.30 | 7.74 | 11.33 | 1.30 | 7.74 |
| 4 | Eptesicus fuscus | 0.02129 | 0.097 | 12.51 | 17.09 | 4.20 | 19.7 | 15.9 | 19.65 | 19.2 |
Tabel 2: Lichaamssamenstelling van grote bruine vleermuizen. De representatieve resultaten van het totale lichaamswater, de magere lichaamsmassa en het lichaamsvet, zoals bepaald door deuteriumoxideverdunning bij grote bruine vleermuizen, worden weergegeven in kolommen 5−8. Representatieve resultaten van de magere lichaamsmassa plus botmineraalgehalte en lichaamsvet zoals bepaald door DXA in dezelfde grote bruine vleermuizen worden weergegeven in kolommen 9−11.
| Dierlijke | Soort(en) | Lichaamsgewicht (kg) |
D2O geïnjecteerd g) |
Totaal lichaamswater g) |
Magere lichaamsmassa g) |
Lichaamsvetmassa g) |
Lichaamsvetmassa (%) |
DXA lean + bmc g) |
DXA vet g) |
DXA vet (%) |
Commentaar |
| 1 | Eptesicus fuscus | 0.0277 | 0.1299 | 34.18 | 46.69 | -19.02 | -68.74 | 9.90 | 26.55 | 62.80 | Equili-bration tijd onvoldoende |
| 2 | Eptesicus fuscus | 0.0185 | 0.0810388 | 64.23 | 87.75 | -69.25 | -374.33 | 14.20 | 17.30 | 17.95 | Volledige dosis niet geïnjecteerd |
| 3 | Eptesicus fuscus | 0.0164 | 0.0719 | 17.38 | 23.74 | -7.33 | -44.68 | 14.15 | 14.40 | 1.70 | Minder dan 3% vet |
| 4 | Eptesicus fuscus | 0.0212 | 0.0994 | 54.57 | 74.54 | -53.37 | -252.0 | 16.41 | 19.01 | 13.65 | Bat werd sorpid (cool om aan te raken) |
Tabel 3: Lichaamssamenstelling van grote bruine vleermuizen. Representatieve resultaten van vleermuizen die niet de volledige dosis deuteriumoxide kregen, werden sorpid tijdens de evenwichtsfase, vleermuizen met abnormaal grote vetmassa en minimale magere massa, of vleermuizen onder 3%−5% lichaamsvet zoals bepaald door DXA. De representatieve resultaten van het totale lichaamswater, de magere lichaamsmassa en het lichaamsvet, zoals bepaald door deuteriumoxideverdunning, worden weergegeven in kolommen 5−8. Representatieve resultaten van de magere lichaamsmassa plus botmineraalgehalte en lichaamsvet zoals bepaald door DXA worden weergegeven in kolommen 9−11.
| Blok | Soort(en) | Lichaamsgewicht (kg) |
D2O geïnjecteerd g) |
Totaal lichaamswater (kg) |
Magere lichaamsmassa (kg) |
Lichaamsvetmassa (kg) |
Lichaamsvetmassa (%) |
Dagelijks waterverbruik (mL/dag) |
Dieetbehandeling |
| 1 | Felis Catus | 4.830 | 3.36 | 2.69 | 3.68 | 1.149 | 23.8 | 96.8 | Controle |
| 2 | Felis Catus | 4.764 | 3.45 | 2.66 | 3.63 | 1.136 | 23.8 | 217.5 | Hoog vocht |
| 3 | Felis Catus | 4.727 | 3.25 | 2.50 | 3.41 | 1.314 | 27.8 | 125.1 | Hoog Selenium |
Tabel 4: Lichaamssamenstelling en waterverbruik in één katachtige. Representatieve resultaten van deuteriumoxide dilutional techniek voor de beoordeling van de magere lichaamsmassa, vetmassa en waterverbruik van een kat op drie verschillende tijdpunten tijdens de studie uitgevoerd door Hooper et al.9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gebruik van deuteriumoxide om TBW te bepalen wordt sinds de jaren 194017 gebruikt en wordt gebruikt bij mensen en een verscheidenheid aan huisdieren- en wilde diersoorten4,6,7. Andere niet-destructieve technieken zijn ontwikkeld, waaronder bio-elektrische impedantie analyse (BIA), DXA, en kwantitatieve magnetische resonantie (QMR). Elke methode heeft voor- en nadelen die in overweging moeten worden genomen alvorens een bepaalde methode voor de beoordeling van de lichaamssamenstelling te selecteren. Dit protocol geselecteerd om DXA te gebruiken als een vergelijkingsmethode voor deuteriumoxide om de lichaamssamenstelling te beoordelen, omdat de apparatuur beschikbaar is als een kern universiteit bron met minimale kosten, minimale tijd nodig is per scan (30 s per vleermuis), en het is niet gevoelig voor variabelen zoals lichaamstemperatuur en huidisolatie.
Bij de aanpassing van de deuteriumoxideverdunningstechniek aan een soort van belang moet een proefstudie worden gestart om de tijd te bepalen die nodig is voor evenwicht18. Dit kan worden gedaan door het nemen van een achtergrond monster, en een bloedmonster om de 15 minuten na de injectie. Voor kleine soorten zoals vleermuizen kunnen verschillende vleermuizen op verschillende tijdstippen worden gebloed in plaats van een enkel dier18. De evenwichtstijd kan veranderen wanneer dieren, zoals vleermuizen, in torpor gaan, wat verklaart waarom sommige van onze dieren een negatief percentage lichaamsvet hadden (tabel 3). Als een negatief percentage lichaamsvet wordt verkregen, en de deuterium dosis had voldoende tijd om volledig te equilibraten met het lichaamswater van het dier, dan is het waarschijnlijk dat de dosis niet volledig werd geïnjecteerd. Omdat de deuteriumoxideverdunningstechniek sterk afhankelijk is van de volledige dosis die wordt toegediend en een nauwkeurige registratie van de hoeveelheid geïnjecteerd deuterium, mag deze techniek alleen worden voltooid door personen die bedreven zijn in het uitvoeren van injecties. Bovendien kunnen verdovende of kalmerende dieren helpen om ervoor te zorgen dat de hele dosis kan worden toegediend.
Bij het toedienen van het deuteriumoxide is het belangrijk om een geschikte concentratie te bepalen om aan het dier toe te dienen. Met behulp van een dosis van 0,7 g/kg voor de katten was de concentratie van de voorraadoplossing passend, terwijl voor de grote bruine vleermuizen een dosis van 0,75 g/kg de voorraadoplossing van deuteriumoxide moest verdunnen. Bij het verdunnen van de voorraadoplossing moet een isotone oplossing zoals 0,9% NaCl worden gebruikt. Om te voorkomen dat het totale lichaamswater van kleine zoogdieren verandert, verdunt u de dosis deuteriumoxide zo minimaal mogelijk, net genoeg om ervoor te zorgen dat de dosis nauwkeurig kan worden gemeten.
De hier gepresenteerde doses zijn detecteerbaar met behulp van FTIR spectrometrie. FTIR spectrometrie is minder duur en gemakkelijker te onderhouden, maar niet zo gevoelig als isotopenratio massaspectrometrie (IRMS)19,20. FTIR spectrometrie kan worden gebruikt om deuteriumverrijking in plasma en speeksel te meten, maar het wordt niet aanbevolen om een FTIR-transmissiecel te gebruiken om deuteriumverrijking in urine te analyseren19. Als urine het gewenste monstertype is, moet een verzwakte totale reflectie (ATR)-bevestiging worden gebruikt met de FTIR of IRMS om deuteriumverrijking te beoordelen voor de berekening van TBW19.
Bovendien waren de doses die voor de katten werden gebruikt voldoende om de detectie van deuteriumoxide 14 dagen na de injectie mogelijk te maken. Omdat de concentratie van het deuteriumoxide 14 dagen na de injectie detecteerbaar was, kon het waterverbruik van de katten worden berekend (figuur 4). Dit innovatieve gebruik van deuteriumoxide kan worden gebruikt in veldstudies om de omzet van lichaamswater te meten voor soorten met hoge heroveringspercentages of voor dieren die in groepen in ex situ- of laboratoriumstudies zijn gehuisvest. Voordat ze echter in veldstudies werken, moeten onderzoekers beoordelen of het dier kan worden gevangen en vastgehouden gedurende de duur van de evenwichtsperiode. Deze langdurige behandelingsperiode is een van de nadelen van de deuteriumoxidetechniek en kan problematisch zijn omdat veel bedreigde diersoorten de duur beperken waarop een bepaald dier kan worden vastgehouden. Bovendien kunnen dieren niet recent gegeten hebben, omdat de washouttechniek afhankelijk is van het meten van de lichaamsmassa; daarom kan een recente maaltijd de resultaten verwarren. Een bijkomende overweging is of een dier moet worden verdoofd of verdoofd voor onderhuidse injectie en bloedafname of dat het dier kan worden beperkt zonder sedatie / anesthesie. Er is gesuggereerd dat de snelheid van de omzet van lichaamswater een belangrijke indicator zou kunnen zijn voor de menselijke gezondheid21. Het toegenomen waterverbruik bij kat 5 (figuur 4) werd gedocumenteerd vóór traditionele biochemische merken van nierfalen, en concentraties van creatinine en bloeduree stikstof (BUN) werden verhoogd, wat suggereert dat lichaamswater omzet kan ook een indicator van de gezondheid bij dieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door MDC Cooperative Agreement (#416), US Forest Service Cooperative Agreement (16-JV-11242311-118), American Academy of Veterinary Nutrition en Waltham/Royal Canin, USA Grant (subsidienummer: 00049049), NIH-opleidingsbeurs (subsidienummer: T32OS011126) en het University of Missouri Veterinary Research Scholars Program. De auteurs bedanken Shannon Ehlers voor het vooraf beoordelen van dit manuscript. Wij danken Dr. Robert Backus voor het verstrekken van de D2O normen en het toestaan van het gebruik van zijn laboratorium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 micron non-pyrogenic disk filter | Argos Technologies | FN32S | nylon, 30mm diameter, 0.22um, sterile |
| 1.5 mL conical microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-9701 | 1.5 ml self-standing microcentrifuge tube, natural with blue cap |
| 10 mL sterile glass vial for injection | Mountainside Medical Equipment | MS-SEV10 | clear, sterile glass injection unit |
| 10 mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | sterile 10 mL syringe individually wrapped |
| 100 mL sterile glass vial for injection | Mountainside Medical Equipment | AL-SV10020 | clear, sterile glass injection unit |
| 20 gauge needle | Exel | 26417 | needles hypodermic 20g x 1" plastic hub (yellow) / regular bevel |
| 22 gauge needle | Exel | 26411 | needles hypodermic 22g x 1" plastic hub (black) / regular bevel |
| deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-25G | 99.9 atom % D |
| isofluorane | Vetone | 3060 | fluriso isoflurane, USP |
| OMNIC Spectra Software | ThermoFisher Scientific | 833-036200 | FT-IR standard software |
| petroleum jelly | Vaseline | 305212311006 | Vaseline, 100% pure petroleum jelly, original, skin protectant |
| plastic capillary tubes | Innovative Med Tech | 100050 | sodium heparin anticoagulant, 50 μL capacity, 30 mm length |
| Sealed liquid spectrophotometer SL-3 FTIR CAF2 Cell | International Crystal Laboratory | 0005D-875 | 0.05 mm Pathlength |
| sodium chloride | EMD Millipore | 1.37017 | suitable for biopharmaceutical production |
| Thermo Electron Nicolet 380 FT-IR Spectrometer | ThermoFisher Scientific | 269-169400 | discontinued model, newer models available |
References
- Schiffmann, C., Clauss, M., Hoby, S., Hatt, J. M. Visual body condition scoring in zoo animals – composite, algorithm and overview approaches. Journal of Zoo Aquarium Research. 5 (1), (2017).
- Peig, J., Green, A. J. New perspectives for estimating body condition from mass/length data: the scaled mass index as an alternative method. Oikos. 118 (12), 1883-1891 (2009).
- Bissell, H. Body Condition Scoring Resource Center. , https://nagonline.net/3877/body-condition-scoring/ (2017).
- McWilliams, S. R., Whitman, M. Non-destructive techniques to assess body composition of birds: a review and validation study. Journal of Ornithology. 154 (3), 597-618 (2013).
- Lukaski, H. C., Johnson, P. E. A simple, inexpensive method of determining total body water using a tracer dose of D2O and infrared absorption of biological fluids. American Journal of Clinical Nutrition. 41 (2), 363-370 (1985).
- Chusyd, D. E., et al. Adiposity and Reproductive Cycling Status in Zoo African Elephants. Obesity (Silver Spring). 26 (1), 103-110 (2018).
- Kanchuk, M. L., Backus, R. C., Calvert, C. C., Morris, J. G., Rogers, Q. R. Neutering Induces Changes in Food Intake Body Weight, Plasma Insulin and Leptin Concentrations in Normal and Lipoprotein Lipase–Deficient Male Cats. The Journal of Nutrition. 132 (6), 1730S-1732S (2002).
- Eichhorn, G., Visser, G. H. Technical Comment: Evaluation of the Deuterium Dilution Method to Estimate Body Composition in the Barnacle Goose: Accuracy and Minimum Equilibration Time. Physiological and Biochemical Zoology. 81 (4), 508-518 (2008).
- Hooper, S. E., Backus, R., Amelon, S. Effects of dietary selenium and moisture on the physical activity and thyroid axis of cats. Journal of Animal Physiolgy and Animal Nutrition (Berl). 102 (2), 495-504 (2018).
- Stevenson, K. T., van Tets, I. G. Dual-Energy X-Ray Absorptiometry (DXA) Can Accurately and Nondestructively Measure the Body Composition of Small, Free-Living Rodents. Physiological and Biochemical Zoology. 81 (3), 373-382 (2008).
- Jennings, G., Bluck, L., Wright, A., Elia, M. The use of infrared spectrophotometry for measuring body water spaces. Clinical Chemistry. 45 (7), 1077-1081 (1999).
- Beuth, J. M. Body Composition, movemement phenology and habitat use of common eider along the southern new england coast. Master of Science in Biological and Environmental Sciences (MSBES) thesis. , University of Rhode Island. (2013).
- Coplen, T. B., Hopple, J., Peiser, H., Rieder, S. Compilation of minimum and maximum isotope ratios of selected elements in naturally occurring terrestrial materials and reagents. U.S. Geological Survey Water-Resources Investigations Report 01-4222. , (2002).
- Karasov, W. H., Pinshow, B. Changes in lean mass and in organs of nutrient assimilation in a long-distance passerine migrant at a springtime stopover site. Physiological Zoology. 71 (4), 435-448 (1998).
- Hood, W. R., Oftedal, O. T., Kunz, T. H. Variation in body composition of female big brown bats (Eptesicus fuscus.) during lactation. Journal of Comparative Physiology B. 176 (8), 807-819 (2006).
- Backus, R. C., Havel, P. J., Gingerich, R. L., Rogers, Q. R. Relationship between serum leptin immunoreactivity and body fat mass as estimated by use of a novel gas-phase Fourier transform infrared spectroscopy deuterium dilution method in cats. American Journal of Veterinary Research. 61 (7), 796-801 (2000).
- Moore, F. D. Determination of Total Body Water and Solids with Isotopes. Science. 104 (2694), 157-160 (1946).
- Voigt, C., Cruz-Neto, A. Ecological and Behavioral Methods in the Study of Bats. Parsons, S., Kunz, T. H. , John Hopkins University Press. Ch. 30 621-645 (2009).
- International Atomic Energy Agency. Assessment of Body Composition and Total Energy Expenditure in Humans Using Stable Isotope Techniques. , (2009).
- International Atomic Energy Agency. Introduction to Body Composition Assessment Using the Deuterium Dilution Technique with Analysis of Saliva Samples by Fourier Transform Infrared Spectrometry. , (2011).
- Shimamoto, H., Komiya, S. The Turnover of Body Water as an Indicator of Health. Journal of Physiological Anthropology and Applied Human Science. 19 (5), 207-212 (2000).
