Summary
3次元 organotypic 培養を用いて唾液腺の形態や機能マーカーを可視化することで、放射線後の組織損傷のメカニズムについて、新たな知見を得ることができます。ここで説明されているのは、電離放射線への曝露の前に、培養、照射、染色、50 ~ 90 μ m の厚い唾液腺切片を断面化するためのプロトコルである。
Abstract
Hyposalivation と口内乾燥症は、放射線治療を受けている頭頸部癌患者の生活の質を低下させる慢性口腔合併症を作り出す。唾液腺機能障害と回復のメカニズムを理解するための実験的アプローチは、生体内モデルに着目しており、治療候補のスクリーニングを体系的に行うことができず、トランスフェクションの効率が低下している特定の遺伝子を操作する能力。この唾液腺 organotypic 培養プロトコールの目的は、培養生存率の最大時間を評価し、ex vivo 放射線治療後の細胞変化を特徴付けることである。Immunofluorescent 染色と共焦点顕微鏡検査を利用して、30日間の培養期間中に特定の細胞集団とマーカーがいつ存在するかを判断しました。さらに、生体内放射線モデルで以前に報告された細胞マーカーは、ex 生体内に照射された培養液中で評価される。前進して、この方法は、唾液機能を改善する治療薬に対するマウスおよびヒトの唾液腺組織応答の迅速な ex インビボ評価のための魅力的なプラットホームである。
Introduction
適切な唾液腺機能は、口腔の健康に不可欠であり、放射線治療1による頭頸部癌処置の後に変化する。2017年、米国では、約5万の新しい頭頸部癌症例が報告された。唾液腺のような周囲の正常組織に対する放射線療法の組織損傷およびしばしば不可逆的効果のために、患者はしばしば重篤な副作用を残し、生活の質を低下させる2、3、 4.放射線障害によって引き起こされる一般的な合併症は、口内乾燥症 (口内乾燥の主観的感覚)、齲蝕、咀嚼・嚥下能力の障害、発話障害、経口フローラ2などの症状に現れる3,4.これらの症状を総称して、罹患した個体5における栄養不良および生存障害を引き起こす可能性がある。この集団における唾液腺機能障害は十分に立証されているが、腺房細胞への損傷の根底にあるメカニズムは論争されており、異なる動物モデル6、7間の統合はほとんどない。
唾液腺機能と放射線による損傷を研究する現在の方法は、in vivo モデルの使用、不死化細胞株、二次元 (2-d) 一次細胞培養、および三次元 (3-d) salisphere の培養8、 9、10、11、12。伝統的に、不死化細胞株と二次元培養物からの細胞培養モデルは、平らな表面で培養された単層細胞を含み、迅速で、簡単で、費用対効果の高い実験に有用である。しかしながら、人工細胞培養条件は、様々な条件に曝露した細胞の分化状態および生理的応答を変化させることができ、そしてその結果は、生物モデル14,15全体に翻訳することがしばしば失敗する。さらに、不死化細胞培養には p53 活性の変調が必要であり、これは DNA 損傷16,17に対する唾液腺応答にとって重要である。
培養中の初期時点での幹細胞および前駆細胞の salisphere 培養が濃縮されており、この唾液腺細胞のこのサブセットの放射線感受性を理解するのに有用である9、18。これらすべての培養モデルの決定的な限界は、細胞外マトリックス (ECM) および細胞細胞相互作用を含む唾液腺の三次元構造を、唾液の調節に極めて重要である様々な層にわたって可視化する上では効果がないことである。分泌15.組織全体の行動を包含する方法の必要性しかし、治療の効果を研究するために実験室条件下で操作することも可能であり、放射線誘発性唾液腺の根底にあるメカニズムをさらに発見する必要がある機能 不全。
生きたティッシュの区分および文化は前に19,20文書化され、多くの場合、脳組織相互作用21を研究するために使用される。これまでの研究では、マウス由来の耳下腺唾液腺組織を約50μ m に切片化し、最大 48 h の培養を行い、その後19個の生存率、細胞死、機能の解析を行った。Su et al.(2016) 顎下腺 (SMGs) を35μ m または50μ m で切片にして20日間培養することにより、この方法論を拡充した。本手法は、50μ m および90μ m で切片となった耳下腺および顎下唾液腺の両方を含み、30日間培養の評価を行うという進歩である。組織の厚さの範囲をカットする能力は、尖 basolateral 極性および分泌の神経支配を含む細胞プロセスに関連する細胞細胞および細胞-ECM 相互作用を評価する上で重要である。さらに、この培養モデルの実現可能性を判断するために培養中に唾液腺切片を照射し、放射線による唾液腺損傷を研究した。
この唾液腺 organotypic 培養プロトコールの目的は、培養生存率の最大時間を評価し、ex vivo 放射線治療後の細胞変化を特徴付けることである。後郭清可能な最大時間切片を決定するために、トリパンブルー染色、生細胞染色、および細胞死に対する免疫組織化染色が実施された。共焦点顕微鏡と immunofluorescent 染色は、特定の細胞集団、形態学的構造、および増殖のレベルを評価するために利用された。組織セクション培養物はまた、この3-d モデルにおける様々なマーカーに対する放射線の影響を決定するために電離放射線に暴露された。細胞死の誘導、骨格破壊、分化マーカーの欠損、および照射された ex インビボ培養物における代償性増殖を、インビボモデルの以前の研究と比較した。この方法論は、放射線損傷後の細胞間相互作用の役割を調査するための手段を提供し、治療的介入の有効性を効率的に評価するための実験的モデルを提供する (遺伝子操作または薬理学的薬剤) は、in vivo モデルにはあまり適していない可能性があります。
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Protocol
1. ビブラトームの準備
- 緩衝トレー、ブレードアタッチメント、アガロースブロックモールド、および 70% エタノールの実験室フィルムを含むビブラトームの取り外し可能なコンポーネントをスプレーし、その後、UV 殺菌を少なくとも30分間行います。
- 氷が落下するのを防ぐために、バッファトレイの上に追加シートフィルムを置き、固定します。
- 氷の部屋を砕いた氷で満たし、実験室のフィルムを緩衝トレーから取り出し、100 mL の氷冷1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 溶液を 1% のペニシリン-ストレプトマイシン-アンピシリン (PSA) で補足して緩衝トレーに充填する。
- ブレードホルダーにステンレススチールかみそりの刃を置きます。ドライバを使用して、ブレードの角度を締め付け/緩め、変更します。
2. アガロースブロック内の組織サンプルの調製およびビブラトームを使用した断面化
- 鉗子、はさみおよびペイントブラシを含むすべての必要な解剖および区分用具をオートクレーブに収めなさい。
- アガロースが溶液に溶解するまで、滅菌 1x PBS およびマイクロ波に 3% の低融点アガロースを準備します。溶液が沸騰していないことを確認し、混合するために定期的にボトルを旋回。
注: 低融点アガロースを温水浴に保つことによって固化しないようにしてください。低メルトアガロースは37° c で、25° c に設定されています。しかし、生理的温度でアガロースを組織の周りに注ぐためには、水浴を40° c 以下にする必要があります。 - 唾液腺を分離し、切開した組織を 2 mL の氷冷 1x PBS に、無菌の30mm 培養皿に 1% の PSA を補充した。
- オートクレーブ鉗子を使用して、1x PBS + 1% PSA 溶液から唾液腺を除去し、埋め込み型の底部に位置します。液体 3% の低融点アガロースで鋳型を充填し、組織をカバーします。
- 鉗子を使用して、ブロックの中央に組織を調整し、適切な面に唾液腺を配置します。顎下と耳下腺にとって最良の断面は垂直面である。
- アガロースブロックを氷上に設置し、10分間硬化させる。
- アガロースの外縁の周りを慎重にかみそりの刃を動かし、ステップ1.1 から UV 滅菌実験室フィルムにブロックをスライドさせて緩めます。
- かみそりの刃を使用して、唾液腺を含むアガロースボックスを切り出します。セクションの平面が、ブロックの反対側 (接着されるサーフェス) と平行になっていることを確認します。アガロースは組織に侵入しないので、組織の周りにあまりにも多くのアガロースをトリミングしないようにして、組織が十分にサポートされるようにします。
- 切断面にブロックを取り付けるには、superglue を使用します。
- 50μ m または90μ m の厚さのセクションでは、0.075 mm/s の速度と 100 Hz の周波数でビブラトームします。
注: 最高周波数でビブラトームを設定し、最も低いブレード速度は最適なスライスを提供します。 - 〜 1 mL の氷冷 PBS を含む24ウェル組織培養皿の切片を、オートクレーブされた天然の毛ブラシを使用して、70% エタノールにスライスコレクション間に入れ、無菌性を維持する。
3. 培養セクション
- マイクロスパチュラおよび鉗子をオートクレーブする。
- ウシ胎児血清 (FBS) の有無にかかわらずストックビブラトーム培養培地を作る: DMEM/F12 培地は、1% PSA、5μ g/mL トランスフェリン、1.1 μ m ヒドロコルチゾン、0.1 μ m レチノイン酸、5μ g/mL インスリン、80 ng/mL 上皮成長因子、5 mM L-グルタミン、50μ g/mL硫酸ゲンタマイシン及び10μ l/mL 微量元素混合物である。適切な量の FBS を追加して、0%、2.5%、5.0%、または 10% のソリューションを作成します。
- 断面化する前に、予温められた培地の300μ l を加えて、12 mm 直径、0.4 μ m の細孔サイズの膜インサートを24ウェル組織培養プレートの各ウェルに入れる。メディアは、培養用の液体空気界面を作成するために、膜底に到達する必要があります。
- 加湿 5% CO2 と 95% 空気雰囲気インキュベーター内の37° c で、マイクロスパチュラと培養を使用して 、膜インサートの上に唾液切片を優しく寝かせます。
- ウェルに約300μ l の一次培養培地を加え、膜インサート (約40μ l) を1日おきに数滴または必要に応じて滴下します。適切な培養は、細胞が生存することができ、最大30日間のインビボで維持することができることを示した。
4. 唾液腺切片の照射
- 60 (またはそれに相当する) 照射装置を使用して、1回の放射線量 (5 Gy) で切片を処理します。
- 温度の変動を避けるために、覆われた発泡スチロール容器を使用して照射装置施設への輸送セクション。さらに、培地が培養蓋に飛び散ることがなく、汚染を誘発しないようにするために、ラボインキュベーターへの輸送中には注意が必要です。
- 放射線源から 80 cm の唾液腺切片を含む24ウェルプレートを、放射線場の 32 "x 32" の中心に置きます。照射装置の放射線量計算と対応する時間は、計器とコバルト-60 崩壊によって異なります。
- セクション3で説明されているように、これらのセクションの監視と培養を続けます。
5. 生存性染色
- 古いメディアを吸引し、無菌の、事前に温められた 1x PBS でスライスを2回洗浄します。
- トリパンブルー染料で汚れのセクション。
- スライスを培養からガラススライドに移動するには、マイクロスパチュラを使用します。
- ティッシュ (10-20 μ l) をカバーする十分な容積が付いているビブラトームのスライスに 0.4% トリパンの青の解決を加えなさい。
- 色素が組織に浸透するために、トリパンブルーの室温 (RT) でスライスを 1 ~ 2 分間インキュベートします。中絶細胞は青色に染色され、生存細胞は未染色されます。
- カルセインを用いて切片を染色し、生細胞染料である。
- 24の井戸版 (200-300 のμ l) の1つの井戸のセクションをカバーするのに十分な量の汚れを加えなさい。
- RT でスライスを15分間インキュベートし、染料の浸透を可能にします。
- 慎重に井戸からセクションを削除し、ガラスのスライド上に配置します。1滴のマウントメディアでスライスをマウントします。
- 488 nm および 515 nm の励起/放出波長の蛍光顕微鏡のイメージのセクション。
6. 抗体染色ビブラトームセクション
注: 以下は、Ki-67 に特異的な一般抗体染色プロトコルを提供します。しかし、このプロトコルは、任意の抗体と共に使用することができる。特に断りのない限り、すべての洗浄は RT で行われる。
- 多井戸組織培養皿では、培地をオフに吸引し、滅菌 1x PBS で少なくとも2x を洗浄する。
- 4° c で一晩 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を使用してセクションを固定します。
- 4% PFA をオフ吸引し、PBT で3倍洗浄します [1x PBS, 1% ウシ血清アルブミン (BSA), 0.1% トリトン X-100].
注: セクションは4° c で 1x PBS に保存され、後で染色することができます。この原稿で試験した最大貯蔵時間は3週間であった。必要な場合は、個々のユーザーがより長いストレージ時間を最適化する必要があります。 - 透過処理は 0.3% トリトン X-100 を 1x PBS で30分間使用しました。
注: このステップは、特定の抗体染色および透過処理に対して修正および最適化することができます。 - Pipet 透過処理ソリューションをオフにします。
- 1x PBS、1% BSA、0.1% トリトン X-100 (PBT) で5分間3倍にしてください。
- 1 h の 1% 正常なヤギの血清が付いているブロックのエージェントが付いているスライスをブロックしなさい。
- PBT で5分間3倍のスライスを洗います。
- 1x PBS で 1% BSA で希釈した500μ l 抗 Ki67 ウサギモノクローナル抗体を使用して、4° c で一晩インキュベートします。
注: ファロイジン染色の場合、ステップ6.9 をスキップし、使用された特定のファロイジンのプロトコルを使用して続行します。DNA 対比染色については、ステップ6.15 にスキップしてください。 - 抗 Ki67 ウサギモノクローナル抗体を吸引する。
- 1x PBS で5分間スライス6x を洗ってください。
- 光から覆われた 1.5 h のために RT で 1x PBS で 1% BSA で希釈した Ki67 抗体と互換性のある蛍光共役二次抗体の500μ l 中のスライスをインキュベートします。
注: 使用される二次抗体に基づいて、二次抗体とのインキュベーション時間は、個々のユーザによってさらに最適化され得る。また、二次抗体は光感受性である。以降のすべての洗浄は、暗所で実行する必要があります。 - 二次抗体を吸引する。
- 1x PBS で5分間、3倍のスライスを洗ってください。
- 脱イオン水で5分間、スライスを洗います。
- RT の 20 min に DAPI (1 μ g/mL) の対比染色スライス。
- 脱イオン水でスライス (1 回) を5分間洗浄します。
- マウントメディアの1滴 (~ 40 μ l) でスライスを取り付けます。余分な泡を避けるために、45°の角度から始めて、スライド上のマウントメディア上にゆっくりとカバースリップを置きます。
- 厚い部分をカバースリップで押しつぶさないようにするには、各スライスをスペーサで取り付けます。スペーサはティッシュセクションのまわりで正方形に真空のグリースの縁を置くことによって作成することができる。
- カバースリップを敷設するとき、カバースリップの端は真空グリースで密封することができます。親指でカバースリップの端を押し下げて、スライド上にしっかりと密着させます。あるいは、クリアマニキュアを使用して顕微鏡スライドにカバースリップを密封します。
7. イメージングビブラトームセクション
- 染色してから5日以内に染色されたスライドを撮影する。
- 共焦点顕微鏡を用いて染色されたビブラトームスライスの光学切片を得る。共焦点顕微鏡では、定義されたステップサイズで z スタックを得るか、またはユーザの実験計画に応じて個々の画像を取る。画像は、共焦点収集後の任意のコンピュータ画面上で調べることができる。
注: ビブラトームスライスの厚さのため、共焦点顕微鏡または z スタック機能を持つ範囲を使用して、サンプル内の詳細を視覚化することをお勧めします。この原稿で使用されている画像については、63x オイルの目的が使用されました。ただし、これは個々のユーザおよび使用される特定のスコープによって調整され、さらに変更することができます。最小の光学的に解決可能な構造体の X と Y の2.5 ピクセルの想定されたナイキストサンプリングを使用して、各目的とズームファクターの推奨ピクセル解像度。ただし、一部のコメンテーターは2.3 ピクセルを提案し、その他は2.8 ピクセルを提案します。これらの計算を行う方法の詳細については、生物共焦点顕微鏡第22巻のハンドブックを参照してください。
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Representative Results
初代2次元培養物は、ウシ胎児血清 (FBS) 補充培地で増殖させ、一方、一次3− D salisphere 培養は、通常、無血清状態で培養される10、11。さらに、唾液腺からのビブラトーム培養を利用した2つの以前の研究では、0% または 10% の FBS を補充した培地19,20でその切片を培養した。マウス顎下スライスを、ビブラトームを用いて50μ m の厚さで切片化し、最適な培養条件を、一連の FBS 濃度 (0%、2.5%、5.0%、および 10%) を用いて決定した。生存特性を測定するために、培養日1、4、7、14、および30の後断面で明視野顕微鏡画像を撮影した (図 1)。さらに、0.4% トリパンブルー染料で腺切片を染色し、示された時点で明視野顕微鏡で40倍に画像化した (図 2a)。非生存細胞は青く染色され、そして生存細胞は明らかなままであった。
同様に、90μ m で断面化された厚いスライスの生存特性を決定するために、トリパンブルー染色の有無にかかわらず明視野顕微鏡画像を 2.5% FBS を添加した培養液中で30日目に採取した (図 2b)。スライスの厚さのために、トリパンブルーの染料で染色された90μ m の切片を全体を画像化し、スライスの中心を評価するために半分に切断した (図 2b)。確認として、生細胞染料を用いて、異なる FBS 培養条件下での細胞生存率を評価した (図 2c)。明視野画像では、高レベルの半透明度、50μ m および90μ m の両方で断面化した組織における生存細胞が観察された。興味深いことに、セクションは暗くなり、全体的な組織面積は培養中に時間が経つにつれて凝縮しますが、セクションのかなりの部分が30日間の培養期間を生き抜くように見えます (図1、図 2)。この凝縮は 0% および 10% FBS の培養条件において最も顕著であった。トリパン青色陽性細胞は、培養条件に関係なく全ての切片の周囲に観察されたが、トリパンの培養条件に比較して 0% FBS 培地では青色陽性細胞面積が増加した (図2a , 2b)。
生細胞染色法を用いて、0% で培養した切片は最も低い染色量を示し、培養培地に FBS を添加すると生細胞の量が改善された。まとめると、0% FBS で培養された切片は、目に見える組織凝縮、上昇したトリパン青色染色領域、および生細胞染色の最低レベルを示した。培養物に 2.5% FBS を添加すると、半透明組織の量が改善され、トリパン青色陽性領域が減少し、生細胞染色のレベルが上昇した。FBS 濃度の増加は、組織の生存性を改善するようには見えなかった。したがって、ビブラトーム培地中の 2.5% FBS は、最適な FBS 濃度であり、その後の全ての実験のための培養条件として利用された。
顎下 ex vivo 組織スライス後郭清の生存率を決定するために、増殖およびアポトーシスマーカーを、培養中の1、3、7、14、および30日目に評価した。増殖活性を、培養スライスのサブセット中の Ki67 免疫染色によって評価した (図 3a)。Ki67 陽性細胞は、評価された全ての時点で観察し、培養中30日目に存在し続けたが、時間点間の差異は最小限であった。同様に、アポトーシスの程度は、切片の別個のサブセットにおいて切断されたカスパーゼ-3 免疫染色によって評価した (図 3b)。切断されたカスパーゼ-3 陽性細胞の低レベルは、培養中の14日目までの全ての時点で観察し、30日目の状態は一部の領域において切断したカスパーゼ-3 陽性細胞の数のわずかな増加を有するように見えた。組織縁の評価は、トリパン青色染色を不在しない切断されたカスパーゼ-3 のより高いレベルを明らかにしなかった (図 2)。全体として、これらの結果は、増殖および生存率の手がかりが、30日間の評価期間中にビブラトームの文化に存在したままであることを示唆している。
厚いセクションビブラトーム培養は、各方向に複数の上皮細胞の厚さを含む深さで特定の組織の細胞成分間の相互作用を評価する機会を可能にします。さらに、産生する唾液タンパク質の組成、組織学的アーキテクチャ、放射線感受性、その他の重要な機能が異なるため、主要な唾液腺の両方を培養できることが重要です。顎下腺培養における異なる細胞集団を決定するために、顎下切片を E-カドヘリン (E-cad) で染色し、上皮細胞、平滑筋アクチン (SMA) を検出し、筋上皮細胞、およびアクチンフィラメント (ファロイジン)培養中の30日の間に細胞骨格構造を検出する (図 4a)。
E −カドヘリン染色は、大多数の細胞の膜上で観察され、30日間の培養期間を通して検出した。SMA + 細胞は、各時点で同様のレベルで、培養期間を通して検出されました。アクチンフィラメントの細胞骨格組織も、評価された各時点において維持するように見えた。対照的に、評価期間全体にわたって一貫して維持されなかった細胞マーカーがあり、これらには CD31 (脈管系)、TUBB3 (ニューロン)、およびアクアポリン-5 (Aqp、腺房マーカー) が含まれていた (図 4b)。共焦点スタックを介した血管構造は、1日目および3日間の培養後に明らかに観察された。しかし、これらの構造は7日目に断片化しているように見えた。同様に、ニューロンプロセスは、培養の最初の日にはそのままであったが、3日目には減少して現れ、次いで培養で7日目に失われた。Aqp5 + 細胞は培養で1、3、7、および14日目に観察された。しかし、14日目では、全体的な染色レベルが低下したように見え、残りの陽性細胞においてより粒状の類似性を有する。これらのデータは、顎下培養が、より短い培養期間のための血管および神経細胞タイプの維持を伴う組織成分の多様性、およびより長い培養期間のための上皮および筋上皮細胞タイプを含むことを示唆する。
耳下腺唾液腺についてはビブラトーム培養が報告されていましたが、培養は 48 h で維持され、研究期間を制限していました。耳下腺を長く維持できるかどうかを判断するために、マウス耳下腺を切片にし、1、3、7、または14日間培養した。マウスのサイズが小さいため、耳下腺から得られた切片が少なくなった。そのため、30日間の培養期間は試みられませんでした。スライスは、Ki67 に対する抗体を用いた immunofluorescent 染色による増殖について評価した。顎下培養と同様に、Ki67 陽性細胞は、全ての時点で観察され、細胞が培養においてある程度の増殖を維持していることを示す (図 5a)。
さらに、機能的腺房マーカー (α-アミラーゼおよび Aqp5) の維持により、上皮マーカー (E-cad)、および血管 (CD31) およびニューロン (TUBB3) 細胞集団が評価された。主な耳下腺細胞の培養中に、耳下腺分化細胞によって産生される最も豊富なタンパク質の一つであり、しばしば失われます。ビブラトーム培養では、腺房細胞中でアミラーゼが観察され、14日間の培養期間を通じて乳管細胞から除外した (図 5b)。顎下培養と同様に、Aqp5 + 細胞は、各時点で耳下腺培養物中に存在し、14日目の培養は、以前の時点と比較して減少したレベルを呈する (図 5c)。E −カドヘリンレベルも、14日間培養期間中の大多数の細胞の膜上に維持された (図 5d)。ニューロン構造は7日培養期間中に維持されたように見え、後の時点で評価しなかった (図 5e)。対照的に、培養の最初の日には血管構造が無傷で現れ、培養では3日目と7時目には小さい構造しか存在しませんでした (図 5f)。これらのデータは、耳下腺培養物の増殖能力およびほとんどの機能能力を7-14 日間にわたって維持し、より長い時間枠のためにより無傷の組織構造を示す可能性があることを示唆しています。
ビブラトーム培養モデルの機能的有用性は、耳下腺または顎下培養を1回の放射線量で治療することによって対処された (図6、図7、 図 8)。前に照射されたマウスモデルでの作業は、耳下腺に着目し、24時間でピークするアポトーシスの誘導、5日目に始まる代償増殖の誘導、5日目に始まるアクチンフィラメントの破壊、および分化マーカー (例えば、アミラーゼ) は14日目によって23、24、26。耳下腺ビブラトーム培養の照射は、1日目のアポトーシスの増加、7日目の増殖の増加、7日目のアクチンフィラメントの破壊、および7日目のアミラーゼの減少につながった (図 6)。顎下ビブラトーム培養の照射により、1日目と3日間でアポトーシスが増加し、7日目の増殖が増加し、7日目にアクチンフィラメントが破壊された (図 7)。E −カドヘリンレベルは、耳下腺および顎下培養物の両方において比較的無傷で現れ、これは in vivo オブザベーション26に類似していた。顎下腺切片における機能的な腺房細胞マーカー Aqp および耳下腺切片中のアミラーゼは14日目に減少し、対応する未処理の時間点と比較した (図 8)。これらのデータは、生体内で観察された放射線誘発組織変化が照射されたビブラトーム培養物においても観察されることを示唆している。
図 1:50 μ m の明視野顕微鏡画像顎下セクションです。雌 FVB マウス (4-8 週齢) からの顎下腺を解剖し、50μ m の厚さに切片化し、1、4、7、14、および30日目の後解剖を 0%、2.5%、5.0%、および 10% ウシ胎仔血清 (FBS) について培地に培養した organotypic 細胞培養液培養特性を決定し、培養条件を最適化します。スケールバー = 200 μ m。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: の生存性染色顎下セクションです。(A) 4 ~ 8 週齢雌 FBV マウスから50μ m 顎下の明視野顕微鏡像を解剖し、トリパンブルーで染色したもの (0.4%)1、3、7、14、および30日目に 2.5% のウシ胎児血清 (FBS) を含有する培地で培養を行う。(B) 90 μ m 顎下切片 (左パネル) の明視野顕微鏡画像を、トリパン青 (中央パネル) で染色し、トリパンブルー (右パネル) で染色し、次いで30日目に培養した後、2.5% FBS を含有する培地で解剖した。(C)種々の FBS 濃度で培養した50μ m 顎下切片の蛍光画像 (0%、2.5%、5%、10%)カルセインで染色し、培養7日目に生細胞 (緑色) を示す。スケールバー = 200 μ m。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3:増殖およびアポトーシスマーカーの評価顎下organotypic 組織スライス雌 FVB マウス (4-8 週齢) からの顎下腺を解剖し、50μ m の厚さにスライスし、organotypic 細胞培養液に 2.5% の FBS を添加した培地で培養し、1、3、7、14、および30日後郭清を挿入した。示された時点で、スライスを固定し、増殖性 (Ki67) およびアポトーシス (切断したカスパーゼ-3) マーカーについて染色した。(A) Ki67 陽性細胞 (緑色) 及び核 (青色) の Immunofluorescent 染色。(B)切断されたカスパーゼ-3-肯定細胞 (赤色) と核 (青) をスライスの2つの視点から Immunofluorescent 染色。一番上の行パネルには、切断されたカスパーゼ-3 陽性細胞がスライスの端に、最下行パネルにはスライスの中央から切断されたカスパーゼ-3 陽性の細胞があります。代表的な共焦点画像は、タイムポイントごとの複数の z スタックから選択された。スケールバー = 30 μ m。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4:細胞構造の存在中顎下organotypic 組織スライス.雌 FVB マウス (4-8 週齢) からの顎下腺を解剖し、50μ m の厚さにスライスし、organotypic 細胞培養液に 2.5% の FBS を添加した培地で培養し、1、3、7、14、または30日後郭清した。示された時点で、スライスを固定し、核 (青) との対応するマーカーについて染色した。(A)顎下切片を、E カドヘリン、平滑筋アクチン (SMA)、および F-アクチン (ファロイジン) のレベルについて、1、7、14、および30日後に評価した。(B)顎下切片を、CD31 (血管系) および TUBB3 (ニューロン) のレベルについて1、3、および7日目に評価した。アクアポリン-5 (Aqp5) を1、3、7、14日目に評価した。代表的な共焦点画像は、タイムポイントごとの複数の z スタックから選択された。スケールバー = 30 μ m。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5:パー organotypic 組織スライスにおける増殖・機能マーカーの評価FVB マウスからの耳下腺 (4-8 週齢) を解剖し、50μ m の厚さにスライスし、organotypic 細胞培養液に 2.5% の FBS を添加した培地で培養し、1、3、7、または14日後郭清した。示された時点で、スライスを固定し、核 (青) との対応するマーカーについて染色した。(A) Ki67 陽性細胞 (緑色) の Immunofluorescent 染色。(B)アミラーゼ陽性細胞の Immunofluorescent 染色 (赤).(C)アクアポリン 5 (Aqp5) 陽性細胞 (緑色) の Immunofluorescent 染色。(D) E-カドヘリン (赤色) 陽性細胞の Immunofluorescent 染色。(E) TUBB3 (マグネラ) 陽性細胞によって示されるニューロンの Immunofluorescent 染色。(F) CD31 (赤色) 陽性細胞によって示される血管系の Immunofluorescent 染色。代表的な共焦点画像は、タイムポイントごとの複数の z スタックから選択された。スケールバー = 30 μ m;d = 導管細胞。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: 耳下腺 organotypic 組織スライスの照射後の細胞変化。FVB マウスからの耳下腺 (4-8 週齢) を解剖し、厚さを50μ m にスライスし、organotypic 細胞培養液に 2.5% の FBS を添加して培養した。1日後の解剖後、スライスのサブセットを 5 Gy 放射線に曝露し、2、4、または8日間の解剖後に維持した (1 日、3日、および7時のポスト放射線に相当する)。無処置および照射される耳下腺の Immunofluorescent 染色(A) Ki67 (緑色) 陽性細胞のレベルを決定し、 (B)切断したカスパーゼ 3 (赤色) 陽性細胞、 (C)ファロイジン (シアン) 陽性細胞、 (D)アミラーゼ (赤)-陽性細胞、および(e) e-カドヘリン (赤) 陽性細胞。すべての核染色は DAPI を利用した (青色)。代表的な共焦点画像を、タイムポイントごとの複数の z スタックから選択した。スケールバー = 30 μ m。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7: 顎下 organotypic 組織スライスの照射後の細胞変化。雌 FVB マウス (4-8 週齢) から顎下腺を解剖し、50μ m の厚さにスライスし、organotypic 細胞培養液に 2.5% FBS を添加した培地で培養した。1日後の解剖後、スライスのサブセットを5Gy で照射し、2、4、または8日間の解剖後に維持した (1 日、3日、および7時のポスト放射線に相当する)。未処理および照射される顎下切片の Immunofluorescent 染色は、 (A) Ki67 (緑色) 陽性細胞のレベルを決定し、 (B)切断したカスパーゼ 3 (赤色) 陽性細胞、 (C)ファロイジン (シアン) 陽性細胞、 (D)アクアポリン 5 (Aqp5) (緑色) 陽性細胞、および(e) e-カドヘリン (赤色) 陽性細胞。すべての核染色は DAPI を利用した (青色)。代表的な共焦点画像を、タイムポイントごとの複数の z スタックから選択した。スケールバー = 30 μ m。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 8: 耳下腺照射および顎下 organotypic 組織スライスにおける機能的腺房マーカーメス FVB マウスから顎下と耳下腺 (4-8 週齢) を解剖し、厚さを50μ m にスライスし、organotypic 細胞培養液に 2.5% FBS を添加した培地で培養した。1日目の後解剖で、スライスのサブセットを5Gy で照射し、照射後14日間維持した。未処理 (UT) および照射された (IR) 切片の Immunofluorescent 染色は、(A)アクアポリン-5 (Aqp5) (緑) 陽性細胞および(B)アミラーゼ (赤) 陽性) 細胞のレベルを決定するために用いた。すべての核染色は DAPI を利用した (青色)。代表的な共焦点画像を、タイムポイントごとの複数の z スタックから選択した。スケールバー = 30 μ m。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
唾液腺研究では、不死化2次元培養、主な2次元培養、3次元 salisphere 培養、および胚外植片からの三次元器官培養を含む多くの培養モデルを利用して、基礎となる生物学と生理学に関する疑問を確認しました。これらの培養モデルは、多様な研究課題にわたって洞察に富んだ情報をもたらし、唾液中の研究においても重要なツールであり続けます。これらの培養モデルの限界には、不死化中の p53 活性の変調、一次培養の一過性生存率、培養中の分化および分泌タンパク質の喪失、および細胞細胞、細胞-ECM および極性の評価不能などが含まれる。成人組織における相互作用.唾液腺の最初の3次元 organotypic スライス培養 (ビブラトーム切片培養) 法が 200818において公表された。しかし、この手法は、他の分野で頻繁に使用されているにもかかわらず、この分野ではほとんど利用できませんでした。48 h のための耳下腺培養作業では、放射線治療後の慢性影響についてこれらの切片を研究する能力、または特定の遺伝子を用いた表現型のトランスフェクションまたは形質導入プロトコルを利用することが制限されています。ここで説明した方法は、培養の時間を長くできるように最適化されており、共焦点顕微鏡によって高解像度の画像を生成し、3次元断面における内部および細胞間動態を研究し、その間に放射線による変化を評価する方法を提供します。少なくとも14日間の培養期間。
この手法の実装には各ステップが必要ですが、断面化および培養メンテナンスを成功させるためには、いくつかのステップが不可欠です。これらには、唾液腺スライスの切断、培養中のスライスの維持、および共焦点顕微鏡によるスライスの染色および画像化が含まれる。提示されたプロトコルは、分析のために最適なスライスを得るために忍耐と練習を必要とするいくつかの課題を提起する。次の提案は、このプロトコルを正常に実行するのに役立ちます。解剖後の周囲の結合組織から唾液腺を完全に分離することが不可欠です。残留結合組織により、ビブラトームブレードはアガロースブロックから腺を引きずり出し、組織をアガロースに再埋め込む必要があります。複数の再埋め込みは、汚染の可能性を高め、スライスの生存率を低下させる可能性があるため、これは大きな制限となる可能性があります。耳下腺の構造はより小葉であり、したがって外来組織が存在する可能性が高いため、耳下腺の培養には特に重要です。
バッファトレイ、スライスコレクションディッシュ、およびビブラトームメディアを含むすべての液体に 1% のペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシン B (PSA) を添加することにより、解剖後のスライスの汚染を最小限に抑えます。アガロース濃度のばらつきが、切断の成功を最適化するために使用されました。唾液腺の密度のために、1.9% のアガロースは柔らかく、腺はブロックから容易に外れていた。他の分野でビブラトーム断面は 5.0% アガロースを使用しています。しかし、この結果、ギザギザのカットやスライスが最適ではありませんでした。いくつかのアガロース率条件を試験した後、3% のアガロースが組織の重量と硬さをサポートするのに最も適していました。特に、ワーナー et al. および Su らにおいて利用されるアガロース濃度はまた、3%19,20であった。
さらに、角度、振動の周波数、およびブレードの前進速度は、断面化される組織に基づいて変更することができます。顎下と耳下腺唾液腺の場合、15°の角度、0.075 mm/s の速度、および 100 Hz の周波数は、断面化に適していた。唾液腺の柔らかさにより、最適な切断条件により、高い振動で組織内をゆっくりと進行する刃を必要としました。Immunofluorescent 染色では、透過処理、インキュベーションの持続時間、および洗浄ステップが最適な汚れに不可欠です。陽性染色が組織スライスの外側の層にのみ現れる場合、プロテイナーゼ K によるより厳しい透過処理が必要であり、不均一な染色または高いバックグラウンド染色が必要な場合がありますが、0.2% トリトン X-100 とのより厳格な染色が要求されます。インキュベーション時間は、高シグナルおよび低バックグラウンドに最適化されており、特定の一次抗体に合わせて調整する必要があります。より長い洗浄ステップは、高いバックグラウンドを減らすために不可欠であり、これは使用される特定の抗体に合わせて調整することができる。
この方法論の主な用途の1つは、唾液腺の放射線曝露に続く運動解析の拡張である。以前の研究は、照射された唾液腺6、24、25、26、およびビブラトーム培養系の急性および慢性相変化の両方を確立し、臨界を分析する強力なツールとなり得る治療後の特定の時点での分子イベント。例えば、文献に報告されている唾液腺の放射線誘起細胞の変化は、アミラーゼの減少、腺房細胞のアポトーシス、腺房細胞の代償的増殖、極性の喪失および混乱の細胞骨格構造。特に、ex vivo を照射したビブラトーム培養は、これらのマーカーにおいて同様の変化を示す。
さらに、唾液腺の急性期反応は、p53 の活動を中心に旋回します。しかし、次の時点で p53 がどのような役割を果たしているのかは、一次培養の ~ 5 日間の生存率のために不明である。このシステムによって、後の時点での生体内での p53 活性の制御された破壊が可能になり、慢性的な損傷や再生応答における役割を明らかにする。さらに、代償増殖応答は、放射線治療の5日後に開始され、この応答の分子調節因子を非定常一次培養で線引きすることは困難である。この方法論の最も広く使用されている用途は、成人組織における細胞細胞、細胞-ECM、および極性相互作用を含む可能性が高い。胚腺からの三次元器官培養においてインパクトのある研究が行われ、唾液腺とニューロンまたは血管ネットワークとの間の複雑な相互作用を明らかにした。27、28、29、 30、31。
ここに記載された方法は、顎下培養およびおそらく耳下腺培養におけるニューロンまたは血管の働きに対してさらなる最適化が必要であることを示している。放射線損傷はまた、junctional 調節因子を破壊し、コラーゲン沈着を誘発し、F-アクチン組織を変化し、分泌顆粒26、30、32を調節する。これらの相互作用を評価するために成人モデルが存在しないことにより、唾液腺再生研究は障害を受けています。この organotypic 培養法は、高度な分子技術を適用し、さらに3-d の文脈でこれらのメディエーターの調節を研究し、効率的に新しい治療法を発見するためのシステムを提供することができます。
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Disclosures
作者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
この作業は、アリゾナ大学の研究と発見と国立衛生研究所 (R01 DE023534) のキルスティン・ Limesand によって提供されるパイロット資金によって部分的にサポートされていました。癌生物学トレーニング助成金、T32CA009213 は、ウェン・ユウ・ウォンのための俸給支援を提供しました。著者は、彼の貴重な技術貢献のために m. ライスに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
| Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
| 24-well plate | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
| Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
| Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
| Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
| Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
| Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
| Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
| Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
| Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
| Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
| Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |
References
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review. Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer. Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).
- Nguyen, N. P., et al. Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer. Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).
- Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy. Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznań and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).
- Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies. Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).
- Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Chan, Y. -H., Huang, T. -W., Young, T. -H., Lou, P. -J. Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns. Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).
- Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands. PLoS ONE. 13 (3), e0193942 (2018).
- Limesand, K. H., et al. Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170 (2003).
- Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-κB pathways. Journal of Oral Pathology & Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).
- Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. RAGE expression and NF-κB activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line. Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis. International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).
- Mitchell, G. C., et al. IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding. of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death & Disease. 1, (2010).
- Lombaert, I. M. A., et al. Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands. PLoS ONE. 3 (4), (2008).
- Warner, J. D., et al. Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).
- Su, X., et al. Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model. Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).
- Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome. PeerJ - The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932 (2015).
- Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , 3rd ed, Springer U.S. Boston, MA. (2006).
- Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
- Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417 (2010).
- Chibly, A. M., et al. aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1. Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).
- Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).
- Emmerson, E., et al. SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland. eLife. 6, (2017).
- Nedvetsky, P. I., et al. Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland. Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).
- Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning. Development. 144 (2), 211-220 (2017).
- Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome. Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).
- Daley, W. P., et al. Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo. Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).
- Nam, K., et al. Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).
