Summary
Usar culturas queratinócitos tridimensionais para visualizar a morfologia e os marcadores funcionais de glândulas salivares pode fornecer introspecções novas nos mecanismos de dano de tecido depois da radiação. Descrito aqui é um protocolo para secção, cultura, irradiar, mancha, e imagem 50 – 90 μm de espessura secções salivares antes e após a exposição à radiação ionizante.
Abstract
A hiposalivação e xerostomia criam complicações orais crônicas que diminuem a qualidade de vida em pacientes com câncer de cabeça e pescoço que são tratados com radioterapia. Abordagens experimentais para a compreensão de mecanismos de disfunção da glândula salivar e restauração têm focado em modelos in vivo, que são deficientes por uma incapacidade de sistematicamente tela candidatos terapêuticos e eficiências na transfecção capacidade de manipular genes específicos. A finalidade deste protocolo da cultura queratinócitos da glândula salivar é avaliar o tempo máximo da viabilidade da cultura e caracterizar mudanças celulares depois do tratamento de radiação ex vivo. Nós utilizamos a mancha imunofluorescente e a microscopia confocal para determinar quando as populações e os marcadores específicos da pilha estão atuais durante um período da cultura de 30 dias. Além disso, marcadores celulares previamente relatados em modelos de radiação in vivo são avaliados em culturas que são irradiadas ex vivo. Avançando, este método é uma plataforma atrativa para a avaliação ex vivo rápida de respostas murino e humanas do tecido da glândula salivar aos agentes terapêuticos que melhoram a função salivar.
Introduction
A função apropriada da glândula salivar é essencial à saúde oral e é alterada depois do tratamento do cancro da cabeça e da garganta com radioterapia1. Em 2017, quase 50.000 casos novos do cancro da cabeça e da garganta foram relatados nos Estados Unidos2. Devido aos efeitos tecido-prejudiciais e freqüentemente irreversíveis da terapia de radiação em tecidos normais circunvizinhos tais como as glândulas salivares, os pacientes são deixados frequentemente com efeitos secundários severos e a qualidade de vida diminuída2,3, a 4. Complicações comuns causadas por danos causados por radiação manifestam-se em sintomas como xerostomia (sensação subjetiva de boca seca), cárie dentária, capacidade prejudicada de mastigar e engolir, comprometimentos de fala e Ademir orais comprometidos2, 3. º , 4. estes sintomas coletivamente podem levar à desnutrição e à sobrevida prejudicada em indivíduos afetados5. Enquanto a disfunção da glândula salivar nesta população tem sido bem documentada, os mecanismos subjacentes de danos às células acinares têm sido disputados, e há pouca integração entre diferentes modelos animais6,7.
Os métodos atuais de estudar a função da glândula salivar e os danos radiação-induzidos incluem o uso de in vivo modela, linhas de pilha imortalized, culturas de pilha preliminares bidimensionais (2-D), e culturas tridimensionais (3-D) do salisphere8, 9,10,11,12. Tradicionalmente, os modelos de cultura celular de linhas celulares imortalizadas e culturas 2-D envolvem células únicas em camadas cultivadas em superfícies planas e são valiosas para uma experimentação rápida, fácil e econômica. No entanto, as condições de cultura de células artificiais podem alterar o status de diferenciação e as respostas fisiológicas das células expostas a várias condições, e os resultados muitas vezes não conseguem traduzir para modelos de organismos inteiros14,15. Além, as culturas de pilha imortalizado exigem a modulação da atividade p53, que é crítica para a resposta da glândula salivar aos danos do ADN16,17.
as culturas 3-D do salisphere são enriquecidas para pilhas da haste e do progenitor em pontos do tempo adiantado na cultura e têm sido úteis para compreender a radiosensibilidade deste subconjunto de pilhas da glândula salivar9,18. Uma limitação crítica de todos estes modelos da cultura é que são ineficazes em Visualizar a estrutura 3-D da glândula salivar, incluindo a matriz extracelular (ECM) e as interações da pilha-pilha sobre várias camadas, que são cruciais em modulando salivar secreção de15. A necessidade de um método que engloba o comportamento do tecido como um todo, mas também pode ser manipulado em condições laboratoriais para estudar os efeitos do tratamento é necessário para descobrir ainda mais os mecanismos subjacentes da glândula salivar induzida por radiação Disfunção.
O seccionamento e a cultura vivos do tecido foram documentados previamente19,20 e são usados frequentemente para estudar interações do cérebro-tecido21. Em estudos prévios, o tecido da glândula salivar do parotid (PAR) dos ratos foi seccionado em aproximadamente 50 μm e cultivado para até 48 h, e a análise da viabilidade, da morte de pilha, e da função foi executada Depois disso19. Su et al. (2016) expandiu-se sobre esta metodologia, cultivando glândulas submandibulares humanas (SMGs) seccionadas a 35 μm ou 50 μm por 14 dias20. O método proposto é um avanço em que inclui ambas as glândulas salivares parótidas e submandibulares seccionadas em 50 μm e 90 μm e avaliação das culturas por 30 dias. A habilidade de cortar uma escala da espessura do tecido é importante em avaliar as interações da pilha-pilha e do Cell-ECM que são relevantes para os processos celulares que incluem a polaridade apical-basolateral e a inervação para a secreção. Além disso, as fatias da glândula salivar foram irradiadas quando na cultura para determinar a viabilidade deste modelo da cultura para estudar dano radiação-induzido da glândula salivar.
A finalidade deste protocolo da cultura queratinócitos da glândula salivar é avaliar o tempo máximo da viabilidade da cultura e caracterizar mudanças celulares depois do tratamento de radiação ex vivo. Para determinar as seções do tempo máximo que são borne-dissecção viável, a mancha azul do Tripan, a mancha viva da pilha, e a mancha immunohistochemical para a morte da pilha foram executadas. Microscopia confocal e coloração imunofluorescente foram utilizadas para avaliar populações específicas de células, estruturas morfológicas e níveis de proliferação. As culturas da seção do tecido foram expostas igualmente à radiação ionizante para determinar os efeitos da radiação em vários marcadores neste modelo 3-D. A indução de morte celular, ruptura do citoesqueleto, perda de marcadores de diferenciação e proliferação compensatória em culturas ex vivo irradiadas foram comparadas com estudos prévios de modelos in vivo. Esta metodologia fornece um meio para investigar o papel das interações célula-célula após dano de radiação e fornece um modelo experimental para avaliar eficientemente a eficácia de intervenções terapêuticas (manipulações genéticas ou agentes farmacológicos ) que podem ser menos adequados para modelos in vivo.
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Protocol
1. preparação do do
- Pulverize componentes destacáveis do do que inclui a bandeja do amortecedor, o acessório da lâmina, o molde do bloco do agarose, e a película do laboratório com etanol 70%, a seguir UV-sterilize por pelo menos 30 minutos.
- Coloc e prenda uma folha adicional de película do laboratório sobre a bandeja do amortecedor para impedir que o gelo caia dentro.
- Encha a câmara de gelo com gelo esmagado, retire a película do laboratório da bandeja do amortecedor, e encha a bandeja do amortecedor com 100 mL da solução salina tampão do fosfato do gelo-frio 1x (PBS) suplementada com a penicilina-estreptomicina-ampicilina de 1% (PSA).
- Coloque uma lâmina de barbear em aço inoxidável no suporte da lâmina. Use a chave de fenda para apertar/afrouxar e mudar o ângulo da lâmina.
2. preparação da amostra de tecido em bloco de agarose e seccionamento usando o do
- Autoclave todas as ferramentas de dissecção e corte necessárias, incluindo fórceps, tesouras e pincéis.
- Prepare 3% de baixo agarose ponto de fusão em estéril 1X PBS e microondas até que o agarose se dissolve em solução. Assegure-se de que a solução não ferva e gire a garrafa periodicamente para misturar.
Nota: impeça o agarose da baixo-derretimento de solidificar mantendo o em um banho de água morno. O agarose do baixo-derretimento é fluido em 37 ° c e ajusta-se em 25 ° c. Entretanto, o banho de água deve estar abaixo de 40 ° c a fim derramar o agarose em torno do tecido na temperatura fisiológica. - Isole as glândulas salivares e coloc o tecido dissecado em 2 mL gelo-frio 1X PBS suplementado com o PSA de 1% em um prato estéril, da cultura de 30 milímetros.
- Usando fórceps autoclavado, remova as glândulas salivares de 1X PBS + 1% PSA solução e posição na parte inferior de um molde de incorporação. Encha o molde com o agarose baixo do ponto de derretimento do líquido 3% para cobrir o tecido.
- Usando o fórceps, ajuste o tecido ao meio do bloco e posicione a glândula salivar no plano apropriado. As melhores secções transversais para as glândulas submandibulares e parótidas estão no plano vertical.
- Coloc o bloco do agarose no gelo por 10 minutos para endurecer.
- Execute com cuidado uma lâmina de barbear em torno da borda exterior do agarose para afrouxar e deixe o bloco deslizar para fora na película UV-sterilized do laboratório da etapa 1,1.
- Use uma lâmina de barbear para cortar uma caixa de agarose contendo a glândula salivar. Assegure-se de que o plano da seção é reto e paralelo ao lado oposto do bloco (a superfície que será colada para baixo). Desde que o agarose não se infiltra o tecido, não apare fora demasiado agarose em torno do tecido assim que o tecido será apoiado bem.
- Use a supercola para fixar o bloco na superfície de corte.
- Seção em 50 μm ou 90 μm de espessura por do a uma velocidade de 0, 75 mm/s e freqüência de 100 Hz.
Nota: a definição do do na frequência mais alta e a velocidade mais baixa da lâmina proporcionam as fatias mais ideais. - Colete seções em um 24-bem tecido cultura prato contendo ~ 1 mL gelo-frio PBS por bem usando um autoclavado, pincel de cabelo natural, colocando a escova em 70% etanol entre coleções fatia para manter a esterilidade.
3. seções de cultivo
- Autoclave uma microespátula e fórceps.
- Fazer estoque meios de cultura vibratoma com ou sem soro bovino fetal (FBS): DMEM/F12 mídia suplementada com 1% PSA,5 μg/mL transferrina, 1,1 μM de hidrocortisona, 0,1 μM de ácido retinóico, 5 μg/mL de insulina, 80 ng/mL fator de crescimento epidérmico, 5 mM L-glutamina, 50 μg sulfato de gentamicina e 10 μL/mL de mistura de oligoelementos. Adicione uma quantidade apropriada de FBS para fazer soluções de 0%, 2,5%, 5,0% ou 10%.
- Antes de seccionamento, adicione 300 μL de meios pré-aquecidos e coloque um diâmetro de 12 mm, uma pastilha de membrana de tamanho de poros de 0,4 μm em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 24 poços. A mídia deve chegar à parte inferior da membrana para criar uma interface de ar líquido para a cultura.
- Coloque delicadamente as seções salivares sobre a inserção da membrana usando o micro espátula e a cultura em 37 ° c na incubadora humidificada da atmosfera de 5% co2 e 95% Air.
- Adicione aproximadamente 300 μL de meios de cultura primários no poço e algumas gotas nas pastilhas de membrana (aproximadamente 40 μL) a cada outro dia ou conforme necessário. A cultura adequada mostrou que as células são capazes de sobreviver e ser mantido por até 30 dias ex vivo.
4. irradiação das secções da glândula salivar
- Trate seções com uma única dose de radiação (5 GY) usando cobalto-60 (ou equivalente) irradiador.
- Seções do transporte à facilidade do irradiador usando um recipiente coberto do isopor para evitar flutuações na temperatura. Além, o cuidado precisa de ser tomado durante o transporte de volta à incubadora do laboratório para assegurar-se de que os meios não espirrem na tampa da cultura e induzem a contaminação.
- Coloque a placa de 24 poços contendo seções da glândula salivar 80 cm da fonte de radiação, no centro de um campo de radiação 32 "x 32". Os cálculos da dose de radiação e o tempo correspondente no irradiador variarão pelo instrumento e pela deterioração de Cobalt-60.
- Continue monitorando e cultivando essas seções conforme descrito na seção 3.
5. coloração da viabilidade
- Aspirar meios velhos e lavar fatias duas vezes com estéril, pre-aquecido 1X PBS.
- Seções da mancha com tintura azul do Tripan.
- Use uma microespátula para mover a fatia da cultura para um slide de vidro.
- Adicione 0,4% de solução azul de Tripan à fatia de vibratoma com volume suficiente para cobrir o tecido (10 – 20 μL).
- Incubar fatias em temperatura ambiente (RT) no azul de Tripan por 1 – 2 min para que o corante penetre no tecido. Células não viáveis serão manchadas de azul, e células viáveis serão desmanchadas.
- Seções da mancha com calcein, tintura da vivo-pilha do AM.
- Adicione volume suficiente de mancha para cobrir a seção em um poço de uma placa de 24 poços (200 – 300 μL).
- Incubar fatias em RT por 15 min para permitir a penetração da tintura.
- Retire cuidadosamente a secção do poço e coloque-a numa lâmina de vidro. Montar fatias com 1 gota de suportes de montagem.
- Seções da imagem em um microscópio fluorescente em comprimentos de onda da excitação/emissão de 488 nanômetro e de 515 nanômetro.
6. anticorpo que mancha seções do do
Nota: o seguinte fornece um anticorpo geral que mancha o protocolo específico para Ki-67; no entanto, este protocolo pode ser usado com qualquer anticorpo. Todas as lavas são conduzidas na RT, salvo indicação em contrário.
- No prato da cultura do tecido do multi-poço, aspirar fora dos meios e lavar pelo menos 2x com o PBS 1x estéril.
- Fixar secções com 4% de paraformaldeído (PFA) durante a noite a 4 ° c.
- Aspirar fora de 4% PFA e lavar 3x com PBT [1X PBS, 1% albumina sérica bovina (BSA), 0,1% Triton X-100].
Nota: as secções podem ser armazenadas em 1X PBS a 4 ° c e manchadas num momento posterior. O tempo máximo de armazenamento testado neste manuscrito foi de 3 semanas. O tempo de armazenamento mais longo precisará ser otimizado pelo usuário individual, se isso for desejado. - Seções de permeabilização usando 0,3% Triton X-100 em 1X PBS por 30 min.
Nota: esta etapa pode ser modificada e otimizada para coloração e permeabilização de anticorpos específicos. - Pipet fora da solução da permeabilização.
- Lave as fatias 3x por 5 min com 1X PBS, 1% BSA e 0,1% Triton X-100 (PBT).
- Bloqueie as fatias com o agente de bloqueio com 1% de soro de cabra normal por 1 h.
- Lave as fatias 3x por 5 min com PBT.
- Incubar as fatias durante a noite a 4 ° c com 500 μL de anticorpo monoclonal de coelho anti-67 diluído em 1% de BSA em 1X PBS.
Nota: para a coloração de faloidina, pule a etapa 6,9 e prossiga usando o protocolo para o faloidina específico usado. Para a contratura do ADN, avance para o passo 6,15. - Aspirar anti-67 anticorpo monoclonal de coelho.
- Lave as fatias de 6x por 5 min em 1X PBS.
- Incubar as fatias em 500 μL de anticorpo secundário conjugado fluorescentamente compatível com o anticorpo anti-67 diluído em 1% BSA em 1X PBS em RT por 1,5 h coberto de luz.
Nota: com base no anticorpo secundário utilizado, o tempo de incubação com o anticorpo secundário pode ser optimizado pelo utilizador individual. Além disso, o anticorpo secundário é sensível à luz. Todas as lavas subsequentes devem ser executadas no escuro. - Aspirar anticorpo secundário.
- Lave as fatias por 3x por 5 min com 1X PBS.
- Lave as fatias por 5 min em água desionizada.
- Fatias de contracoloração com DAPI (1μg/mL) por 20 min em RT.
- Lave as fatias (uma vez) durante 5 min em água desionizada.
- Montar fatias com uma gota (~ 40 μL) de suportes de montagem. Para evitar bolhas em excesso, coloque lentamente a lamínula na mídia de montagem no slide, começando com um ângulo de 45 °.
- Para evitar esmagar as secções grossas com a lamínula, monte cada fatia com um espaçador. Um espaçador pode ser criado coloc uma borda da graxa do vácuo em um quadrado em torno da seção do tecido.
- Ao colocar a lamínula, as bordas da lamínula podem ser seladas com graxa a vácuo. Pressione para baixo nas bordas da lamínula com o polegar para aderir firmemente a ele no slide. Alternativamente, sele a lamínula na corrediça do microscópio usando o lustrador de prego desobstruído.
7. seções do do da imagem latente
- Imagem as lâminas manchadas dentro de 5 dias de coloração.
- Obtenha seções ópticas das fatias do manchadas usando um microscópio confocal. Com um microscópio confocal, obtenha uma pilha z em um tamanho de etapa definido ou faça exame de imagens individuais dependendo do projeto experimental do usuário. As imagens podem ser examinadas em qualquer tela do computador após a coleta confocal.
Nota: devido à espessura das fatias do do, recomenda-se que um microscópio confocal ou um espaço com capacidade da z-pilha esteja usado para visualizar detalhes dentro das amostras. Para as imagens utilizadas neste manuscrito, utilizou-se um objetivo de óleo de 63x; no entanto, isso pode ser adaptado e modificado pelo usuário individual e pelo escopo específico usado. A resolução de pixel recomendada para cada objetivo e fator de zoom com a amostragem de Nyquist presumido de 2,5 pixels em X e Y para a menor estrutura opticamente resolvível foi usada. No entanto, alguns comentaristas sugerem 2,3 pixels, enquanto outros sugerem 2,8 pixels. Refira por favor o manual da microscopia confocal biológica22 para mais detalhes em como fazer estes cálculos.
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Representative Results
As culturas 2-D preliminares são crescidas em meios suplementados do soro bovino fetal (FBS) quando a cultura 3-D preliminar de salisphere for cultivada tipicamente em condições soro-livres10,11. Além disso, os dois estudos prévios utilizando culturas do de glândulas salivares cultivou suas seções em 0% ou 10% FBS suplementados Media19,20. As fatias submandibulares do camundongo foram seccionadas a uma espessura de 50 μm, utilizando-se um vibratoma e condições ideais de cultura foram determinadas por meio de uma série de concentrações de FBS (0%, 2,5%, 5,0% e 10%). Para determinar as características de sobrevida, as imagens de microscópio de campo brilhante foram realizadas nos dias de cultura 1, 4, 7, 14 e 30 pós-corte (Figura 1). Adicionalmente, as seções da glândula foram manchadas com o corante azul do Tripan 0,4% e imaged com um microscópio do brilhante-campo em 40x nos pontos de tempo indicados (Figura 2a). As pilhas não viáveis eram manchadas azuis e as pilhas viáveis permaneceram desobstruídas.
Da mesma forma, para determinar as características de sobrevivência de fatias mais grossas seccionadas em 90 μm, imagens de microscópio de campo brilhante com e sem coloração azul de Tripan foram tiradas no dia 30 em culturas suplementadas com 2,5% FBS (Figura 2b). Devido à espessura da fatia, as seções de 90 μm manchadas com o corante azul do Tripan foram imaged inteiras então cortadas na metade a fim avaliar o centro da fatia (Figura 2b). Como confirmação, utilizou-se corante de células ao vivo para avaliar a sobrevida celular em diferentes condições de cultivo da FBS (Figura 2C). Em imagens de campo brilhante, observaram-se altos níveis de células translúcidas, sobreviventes em tecidos seccionados a 50 μm e 90 μm. Curiosamente, as seções tornaram-se mais escuras e a área tecidual geral se condensa ao longo do tempo na cultura, mas uma parcela significativa da seção parece sobreviver ao período de cultura de 30 dias (Figura 1, Figura 2). Esta condensação foi mais evidente nas condições de cultivo de 0% e 10% de FBS. As células positivas de Tripan foram observadas no perímetro de todas as seções, independentemente das condições de cultivo, e houve aumento na área de células positivas de Tripan Blue em condições de cultura de 0% FBS quando comparadas às maiores condições de cultivo de FBS (Figura 2a , 2B).
Usando a mancha da pilha viva, as seções cultivadas em 0% mostraram a mais baixa quantidade de mancha, e a adição de FBS aos meios de cultura melhorou a quantidade de pilhas vivos. Tomados junto, as seções cultivadas em 0% FBS mostraram a condensação visível do tecido, áreas manchadas azuis do Tripan elevado, e os mais baixos níveis de mancha viva da pilha. A adição de 2,5% de FBS às culturas melhorou a quantidade de tecido translúcido, diminuiu a área positiva do azul do Tripan, e aumentou os níveis de mancha viva da pilha. Os aumentos adicionais na concentração de FBS não pareceram melhorar o sobrevivência do tecido; Conseqüentemente, 2,5% FBS no meio do do era a concentração óptima de FBS e utilizado como a condição da cultura para todos os experimentos subseqüentes.
Para determinar a viabilidade das fatias de tecidos ex vivo submandibulares pós-dissecção, foram avaliados marcadores proliferativos e apoptóticos nos dias 1, 3, 7, 14 e 30 em cultura. A atividade proliferativa foi avaliada pela imunocoloração de 67 em um subconjunto de fatias de cultura (Figura 3a). As células 67 positivas foram observadas em todos os pontos de tempo avaliados e continuaram presentes no dia 30 na cultura, com diferenças mínimas entre os pontos temporais. Da mesma forma, o grau de apoptose foi avaliado por imunocoloração de caspase-3 clivada em um subconjunto separado de seções (Figura 3B). Um baixo nível de células positivas de caspase-3 clivadas foi observado em todos os pontos do tempo até o dia 14 na cultura, quando as circunstâncias do dia 30 pareceram ter um aumento pequeno no número de pilhas de caspase-3 positivas clivada em algumas áreas. A avaliação das bordas teciduais não revelou níveis mais elevados de caspase-3 clivada, o que não recapitulou a coloração azul do Tripan (Figura 2). No geral, esses resultados sugerem que as pistas de proliferação e viabilidade permaneceram presentes nas culturas vibratoma durante o período de avaliação de 30 dias.
Culturas de vibratoma de seção grossa permitem a oportunidade de avaliar as interações entre constituintes celulares de um determinado tecido em uma profundidade que inclui mais de uma espessura de células epiteliais em cada direção. Além disso, é importante ser capaz de cultura ambas as glândulas salivares principais, como eles diferem na composição de proteínas salivares produzidas, arquitetura histológica, radiosensibilidade, e outras características críticas. Para determinar populações celulares diferentes em culturas da glândula submandibular, as seções submandibulares foram manchadas com E-cadherin (E-CAD) para detectar pilhas epithelial, o actínio do músculo liso (SMA) para detectar pilhas myoepithelial, e filamentos do actina (Phalloidin) a detectar estruturas citoesqueléticas durante os 30 dias de cultivo (figura 4a).
A coloração da e-caderina foi observada nas membranas de uma maioria de pilhas e detectada durante todo o período da cultura de 30 dias. As pilhas de SMA + foram detectadas durante todo o período da cultura, com níveis similares em cada ponto de tempo. A organização citoesquelética de filamentos de actina também pareceu ser mantida em cada ponto de tempo avaliado. Em contrapartida, houve marcadores celulares que não foram mantidos de forma consistente durante todo o período de avaliação e estes incluíram CD31 (vasculatura), TUBB3 (neurônios) e aquaporina-5 (AQP-5, marcador acininar) (Figura 4B). As estruturas vasculares através das pilhas confocal foram observadas claramente nos dias 1 e 3 borne-cultura; no entanto, essas estruturas apareceram fragmentadas no 7º dia. Similarmente, os processos neuronal estavam intactos durante o primeiro dia da cultura, apareceram diminuídos no dia 3, e foram perdidos subseqüentemente no dia 7 na cultura. As células Aqp5 + foram observadas nos dias 1, 3, 7 e 14 em cultura; embora, no dia 14, o nível de coloração geral parecesse ser reduzido, com uma semelhança mais granular nas células positivas remanescentes. Estes dados sugerem que as culturas submandibulares contem a diversidade de constituintes do tecido com manutenção dos tipos vasculares e neuronal da pilha para uns períodos mais curtos da cultura, e tipos epithelial e myoepithelial da pilha para uns períodos mais longos da cultura.
Quando as culturas vibratome-seccionadas têm sido relatadas previamente para a glândula salivar do parotid, as culturas foram mantidas para 48 h, limitando o período de tempo durante que poderiam ser estudados. A fim determinar se as glândulas de parotid podem ser mantidas por mais por muito tempo, as glândulas de parotid murino foram seccionadas e cultivadas para 1, 3, 7, ou 14 dias. Menos secções foram obtidas da glândula parótida devido ao seu tamanho menor em camundongos; Conseqüentemente, um período da cultura de 30 dias não foi tentado. As fatias foram avaliadas quanto à proliferação por coloração imunofluorescente com anticorpo contra o 67. Semelhante às culturas submandibulares, as células positivas de 67 foram observadas em todos os pontos temporais, indicando que as células estão mantendo um grau de proliferação na cultura (Figura 5a).
Além disso, avaliaram-se a manutenção de marcadores funcionais acinar (α-amilase e Aqp5), um marcador epitelial (e-CAD) e populações de células vasculares (CD31) e neuronais (TUBB3). A amilase é uma das proteínas mais abundantes produzidas por células epiteliais parotídeas diferenciadas e freqüentemente perdidas durante a cultura 2-D de células parótidas primárias. Nas culturas vibratoma, a amilase foi observada nas células acinares e excluída das células Ductais ao longo do período de cultura de 14 dias (Figura 5b). Semelhante às culturas submandibulares, as células Aqp5 + estiveram presentes nas culturas parótidas em cada momento, com o dia 14 culturas exibindo níveis reduzidos comparados aos pontos temporais anteriores (Figura 5C). Os níveis de E-caderina também foram mantidos nas membranas de uma maioria das células durante o período de cultura de 14 dias (Figura 5D). Estruturas neuronais pareciam ser mantidas durante o período de 7 dias de cultivo e não foram avaliadas em pontos de tempo posteriores (Figura 5E). Ao contrário, as estruturas vasculares apareceram intactas durante o primeiro dia na cultura, e somente as estruturas menores estavam atuais nos dias 3 e 7 na cultura (Figura 5F). Estes dados sugerem que as culturas do parotid mantenham suas capacidades proliferative e a maioria de capacidades funcionais para 7-14 dias na cultura e apresentem potencial uma estrutura mais intacta do tecido para um período de tempo mais longo.
A utilidade funcional do modelo de cultura do vibratoma foi abordada tratando-se de culturas parótidas ou submandibulares com uma dose única de radiação (figura6, figura 7, Figura 8). O trabalho prévio em modelos de camundongo irradiado tem se centrado na glândula parótida e demonstrou a indução de apoptose que atinge os picos de 24 h, indução de proliferação compensatória a partir do dia 5, rompimento de filamentos de actina a partir do dia 5, e perda de marcadores de diferenciação (por exemplo, amilase) por dia 1423,24,26. A irradiação das culturas do do do parotid conduziu aos aumentos no apoptose no dia 1, aumentos na proliferação no dia 7, rompimento de filamentos do actina no dia 7, e reduções na amilase no dia 7 (Figura 6). A irradiação das culturas de vibratoma submandibular levou ao aumento da apoptose nos dias 1 e 3, aumento da proliferação no 7º dia e rompimento dos filamentos de actina no 7º dia (Figura 7). Os níveis do e-cadherin pareceram relativamente intact nas culturas do parotid e submandibular, que era similar às observações in vivo26. Os marcadores funcionais de células acinares AQP-5 em secções da glândula submandibular e amilase em secções da glândula parótida diminuíram no dia 14, em comparação com os pontos de tempo não tratados correspondentes (Figura 8). Estes dados sugerem que as mudanças radiação-induzidas do tecido que foram observadas in vivo foram observadas igualmente em culturas do irradiadas.
Figura 1: Imagens de microscópio de campo brilhante de 50 μm submandibular secções. As glândulas submandibulares de camundongos FVB fêmeas (4-8 semanas de idade) foram dissecadas, seccionadas para 50 μm de espessura, e cultivadas em inserções de cultura de células organotípicas para 1, 4, 7, 14 e 30 dias após a dissecção em 0%, 2,5%, 5,0% e 10% de soro bovino fetal (FBS) em mídia para determinar as características de cultura e otimizar as condições de cultura. Barras de escala = 200 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: coloração de viabilidade de submandibular secções. (A) imagens de microscópio de campo brilhante de 50 μm submandibulares dissecadas de camundongos FBV fêmeas de 4 a 8 semanas de idade e corados com azul de Tripan (0,4%) aos 1, 3, 7, 14 e 30 dias em cultura com meios contendo 2,5% de soro bovino fetal (FBS). (B) imagens de microscópio de campo brilhante de 90 μm de secções submandibulares (painel esquerdo), coradas com azul de Tripan (painel médio), cortadas ao meio e coradas com azul de Tripan (painel direito), depois cultivadas a 30 dias após a dissecção em meios contendo 2,5% de FBS. (C) imagens fluorescentes de 50 μm de secções submandibulares cultivadas em várias concentrações de FBS (0%, 2,5%, 5%, 10%) corados com calceina AM para indicar células ao vivo (verde) no dia da cultura 7. Barras de escala = 200 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliação de marcadores proliferativos e apoptóticos em submandibular fatias queratinócitos do tecido. As glândulas submandibulares de camundongos FVB fêmeas (4-8 semanas de idade) foram dissecadas, cortadas a 50 μm de espessura e cultivadas em meios suplementados com 2,5% de FBS em inserções de cultura de células organootípicas para 1, 3, 7, 14 e 30 dias após a dissecção. Nos pontos de tempo indicados, as fatias foram fixadas e coradas para marcadores proliferativos (67) e apoptóticos (caspase-3). (A) coloração imunofluorescente das células 67 positivas (verde) e do núcleo (azul). (B) coloração imunofluorescente das células caspase-3-postivas clivadas (vermelho) e do núcleo (azul) de dois pontos de vista de uma fatia. O painel de linha superior exibe as células caspase-3-positive clivadas na borda de uma fatia, e o painel de linha inferior exibe células caspase-3-positivas com clivagem a partir do meio de uma fatia. As imagens confocais representativas foram selecionadas de várias pilhas z por ponto de tempo. Barras de escala = 30 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Presença de estruturas celulares no submandibular fatias queratinócitos do tecido . As glândulas submandibulares de camundongos FVB fêmeas (4-8 semanas de idade) foram dissecadas, cortadas a 50 μm de espessura e cultivadas em meios suplementados com 2,5% de FBS em inserções de cultura de células organootípicas para 1, 3, 7, 14 ou 30 dias após a dissecção. Nos pontos de tempo indicados, as fatias foram fixadas e manchadas por seus marcadores correspondentes com o núcleo (azul). (A) os cortes submandibulares foram avaliados nos dias 1, 7, 14 e 30 pós-dissecção para os níveis de E-caderina, actina de músculo liso (SMA) e F-Actina (Phalloidin). (B) os cortes submandibulares foram avaliados nos dias 1, 3 e 7 para os níveis de CD31 (vasculatura) e TUBB3 (neurônios). Aquaporin-5 (Aqp5) foi avaliado nos dias 1, 3, 7 e 14. As imagens confocais representativas foram selecionadas de várias pilhas z por ponto de tempo. Barras de escala = 30 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Avaliação de marcadores proliferativos e funcionais em fatias de tecido queratinócitos par. As glândulas de parotid dos ratos fêmeas de FVB (4-8 semanas velhas) foram dissecadas, cortadas à espessura de 50 μm, e cultivadas nos meios suplementados com 2,5% FBS em inserções queratinócitos da cultura da pilha para 1, 3, 7, ou 14 dias após-dissecção. Nos pontos de tempo indicados, as fatias foram fixadas e manchadas por seus marcadores correspondentes com o núcleo (azul). (A) coloração imunofluorescente das células 67 positivas (verde). (B) coloração imunofluorescente de células positivas para amilase (vermelho). (C) coloração imunofluorescente de células positivas de aquaporina-5 (Aqp5) (verde). (D) coloração imunofluorescente de células positivas de E-caderina (vermelho). (E) coloração imunofluorescente dos neurônios indicados por células positivas de TUBB3 (Magneta). (F) coloração imunofluorescente da vasculatura indicada por células positivas de CD31 (vermelho). As imagens confocais representativas foram selecionadas de várias pilhas z por ponto de tempo. Barras de escala = 30 μm; d = células Ductais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: alterações celulares após irradiação de fatias de tecido organotípico da parótida. As glândulas de parotid dos ratos fêmeas de FVB (4-8 semanas velhas) foram dissecadas, cortadas à espessura de 50 μm, e cultivadas em suplementado com 2,5% FBS em inserções queratinócitos da cultura de pilha. No dia 1 pós-dissecção, um subconjunto de fatias foi exposto à radiação de 5 GY e mantido por 2, 4 ou 8 dias após a dissecção (corresponde aos dias 1, 3 e 7 pós-radiação). Coloração imunofluorescente de secções de parótidas não tratadas e irradiadas para determinar os níveis de (a) células positivas de 67 (verde), (B) células de caspase 3 (vermelhas)-positivas, ( C) faloidina (ciano)-células positivas, (D) células positivas de amilase (vermelho), e (e) e-caderina (vermelho) células positivas. Todas as manchas nucleares utilizadas DAPI (azul). As imagens confocais representativas foram selecionadas do múltiplo z-pilha por o ponto de tempo. Barras de escala = 30 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: alterações celulares após irradiação de fatias de tecido queratinócitos submandibular. As glândulas submandibulares de camundongos FVB fêmeas (4-8 semanas de idade) foram dissecadas, cortadas a 50 μm de espessura e cultivadas em meios suplementados com 2,5% de FBS em inserções de cultura de células organootípicas. No dia 1 pós-dissecção, um subconjunto de fatias foi irradiado com 5Gy e mantido por 2, 4 ou 8 dias após a dissecção (corresponde aos dias 1, 3 e 7 pós-radiação). Coloração imunofluorescente de secções submandibulares não tratadas e irradiadas para determinar os níveis de (a) células positivas de 67 (verde), (B) células de caspase 3 (vermelhas)-positivas, ( C) faloidina (ciano)-células positivas, (D) aquaporina 5 (Aqp5) (verde)-células positivas, e (e) e-caderina (vermelho) células positivas. Todas as manchas nucleares utilizadas DAPI (azul). As imagens confocais representativas foram selecionadas do múltiplo z-pilha por o ponto de tempo. Barras de escala = 30 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: marcadores funcionais de acinar em parotídeo irradiado e fatias de tecido queratinócitos submandibular. As glândulas submandibulares e parótidas de camundongos FVB fêmeas (4-8 semanas de idade) foram dissecadas, cortadas a 50 μm de espessura e cultivadas em meios suplementados com 2,5% de FBS em inserções de cultura de células organootípicas. No dia 1 pós-dissecção, um subconjunto de fatias foi irradiado com 5Gy e mantido por 14 dias após a irradiação. A coloração imunofluorescente de seções não tratadas (UT) e irradiadas (IR) foi usada para determinar os níveis de (a) Aquaporin-5 (Aqp5) (verde)-pilhas positivas e (B) pilhas da amilase (vermelho)-positivas). Todas as manchas nucleares utilizadas DAPI (azul). As imagens confocais representativas foram selecionadas do múltiplo z-pilha por o ponto de tempo. Barras de escala = 30 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A pesquisa da glândula salivar utilizou uma série de modelos de cultura, incluindo culturas 2-D imortalizadas, culturas 2-D primárias, culturas de salisphere 3-D e culturas de órgãos 3-D de explantes embrionários para averiguar questões sobre Biologia e fisiologia subjacentes. Esses modelos de cultura produziram informações perspicazes em uma variedade diversificada de perguntas de pesquisa e continuarão a ser ferramentas importantes na pesquisa salivar. As limitações desses modelos de cultura incluem a modulação da atividade p53 durante a imortalização, a viabilidade transitória das culturas primárias, a perda de diferenciação e as proteínas secretoras na cultura, e a incapacidade de avaliar células celulares, células-ECM e polaridade interações em tecidos adultos. A primeira cultura de fatia organootípica 3-D (culturas seccionadas por vibratoma) para glândulas salivares foi publicada em 200818; no entanto, esta técnica tem sido largamente subutilizado neste campo, apesar do uso frequente em outros campos. O trabalho cultivou seções do parotid para 48 h, que limita a habilidade de estudar estas seções para efeitos crônicos depois do tratamento de radiação ou para utilizar protocolos do transfection ou da dução para fenótipos depois da manipulação de genes específicos. O método descrito aqui foi otimizado para permitir maior tempo na cultura, produzir imagens de alta resolução através de microscopia confocal, fornecer um método para estudar a dinâmica intra e intercelular em uma seção 3-D, e avaliar as alterações induzidas por radiação durante um período de cultura de pelo menos 14 dias.
Embora cada etapa seja necessária para a implementação da técnica, algumas etapas são cruciais para a manutenção bem-sucedida de corte e cultura. Estes incluem cortar as fatias da glândula salivar, manter as fatias na cultura, e manchar e imagem latente as fatias com microscopia confocal. O protocolo apresentado apresenta alguns desafios que exigem paciência e prática, a fim de obter fatias ideais para análise. As sugestões a seguir ajudarão na realização deste protocolo com êxito. É imperativo isolar completamente a glândula salivar do tecido conexivo circunvizinho depois da dissecção. O tecido conjuntivo residual faz com que a lâmina vibratoma arraste a glândula para fora do bloco de agarose e requer que o tecido seja re-incorporado em agarose. Esta pode ser uma limitação principal desde que a re-incorporação múltipla pode aumentar as possibilidades da contaminação e diminuir a viabilidade das fatias. Isto é especialmente crucial para a cultura das glândulas parótidas, uma vez que as glândulas parótidas são mais Lobulares na estrutura e, portanto, mais propensos a ter tecido estranho.
A adição de 1% de penicilina-estreptomicina-anfotericina B (PSA) a todos os líquidos, incluindo a bandeja tampão, o prato de coleta de fatia e a mídia vibratoma minimiza a contaminação das fatias pós-dissecção. A variação da concentração do agarose foi usada para aperfeiçoar o corte bem sucedido. Devido à densidade das glândulas salivares, o agarose de 1,9% era demasiado macio, e as glândulas foram desalojadas facilmente do bloco. O seccionamento de vibratome em outros campos utilizou 5,0% de agarose; no entanto, isso causou cortes irregulares e fatias foram suboptimal. Após testar várias condições percentuais de agarose, o agarose a 3% foi o mais ideal para suportar o peso e a firmeza do tecido. Notavelmente, a concentração de agarose utilizada em Warner et al. e su et al. também foi de 3%19,20.
Adicionalmente, o ângulo, a frequência de vibração e a velocidade de avanço da lâmina podem ser modificados com base no tecido a ser seccionado. Para as glândulas salivares submandibulares e parótidas, um ângulo de 15 °, velocidade de 0, 75 mm/s e frequência de 100 Hz foram apropriados para o corte. Devido à suavidade das glândulas salivares, as condições ideais de corte exigiram a lâmina para avançar lentamente através do tecido em uma alta vibração. Para coloração imunofluorescente, a permeabilização, a duração das incubações e as etapas de lavagem são essenciais para as manchas ideais. Se a coloração positiva apenas aparecer nas camadas exteriores da fatia do tecido, uma permeabilização mais rigorosa com proteinase K pode ser necessária, enquanto a coloração irregular ou a coloração de fundo alta podem requerer uma coloração menos rigorosa com 0,2% Triton X-100. Os tempos de incubação foram otimizados para alto sinal e baixo fundo, o que pode precisar ser adaptado a anticorpos primários específicos. As etapas mais longas da lavagem são essenciais em reduzir o fundo elevado e esta podem ser costuradas aos anticorpos específicos usados.
Uma aplicação principal desta metodologia é a análise cinética prolongada depois da exposição de radiação de glândulas salivares. O trabalho prévio estabeleceu mudanças agudas e crônicas da fase nas glândulas salivares irradiadas6,24,25,26, e o sistema da cultura do do pode ser uma ferramenta poderosa para dissecar a crítica eventos moleculares em pontos de tempo específicos após o tratamento. Por exemplo, alterações celulares induzidas por radiação na glândula salivar que foram relatadas na literatura, incluindo reduções na amilase, apoptose de células acinares, proliferação compensatória de células acinares, perda de polaridade e interrupções em estrutura citoesquelética. Notavelmente, as culturas vibratoma irradiadas ex vivo exibem alterações semelhantes nesses marcadores.
Além disso, a resposta de fase aguda em glândulas salivares gira em torno da atividade p53; no entanto, não está claro o papel que a p53 desempenha em pontos de tempo posteriores devido à viabilidade de ~ 5 dias de culturas primárias. Este sistema permitiria o rompimento ex vivo, controlado da atividade p53 em uns pontos mais atrasados do tempo e descobriria um papel em dano crônico ou em respostas regenerativa. Além disso, a resposta da proliferação compensatória é iniciada 5 dias após o tratamento de radiação, e é difícil delinear os reguladores moleculars desta resposta em culturas preliminares transientes. A aplicação mais amplamente utilizada desta metodologia provavelmente envolverá interações célula-célula, Cell-ECM e polaridade em tecidos adultos. Estudos impactantes têm sido conduzidos em culturas de órgãos 3-D de glândulas embrionárias para descobrir a intrincada interação entre o desenvolvimento de glândulas salivares e a rede neuronal ou vascular27,28,29, 30,31.
O método descrito aqui indica que uma otimização mais adicional é precisada para o trabalho neuronal ou vascular nas culturas submandibulares e possivelmente em culturas do parotid. Dano de radiação também interrompe reguladores juncionais, induz deposição de colágeno, altera a organização F-Actina, e modula grânulos secretores26,30,32. Estudos de regeneração da glândula salivar são deficientes pela ausência de um modelo adulto para avaliar essas interações. Este método de cultura organotípica pode fornecer um sistema para aplicar técnicas moleculares avançadas e estudar mais a regulação desses mediadores em um contexto 3D e descobrir eficientemente novas terapias.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado em parte por financiamento-piloto fornecido pela Universidade do Arizona escritório de pesquisa e descoberta e institutos nacionais de saúde (R01 DE023534) para Kirsten Limesand. O treinamento de biologia do câncer Grant, T32CA009213, forneceu suporte para Wen Yu Wong. Os autores gostariam de agradecer a M. Rice por sua valiosa contribuição técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
| Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
| 24-well plate | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
| Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
| Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
| Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
| Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
| Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
| Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
| Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
| Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
| Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
| Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |
References
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review. Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer. Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).
- Nguyen, N. P., et al. Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer. Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).
- Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy. Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznań and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).
- Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies. Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).
- Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Chan, Y. -H., Huang, T. -W., Young, T. -H., Lou, P. -J. Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns. Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).
- Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands. PLoS ONE. 13 (3), e0193942 (2018).
- Limesand, K. H., et al. Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170 (2003).
- Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-κB pathways. Journal of Oral Pathology & Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).
- Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. RAGE expression and NF-κB activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line. Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis. International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).
- Mitchell, G. C., et al. IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding. of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death & Disease. 1, (2010).
- Lombaert, I. M. A., et al. Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands. PLoS ONE. 3 (4), (2008).
- Warner, J. D., et al. Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).
- Su, X., et al. Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model. Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).
- Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome. PeerJ - The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932 (2015).
- Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , 3rd ed, Springer U.S. Boston, MA. (2006).
- Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
- Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417 (2010).
- Chibly, A. M., et al. aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1. Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).
- Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).
- Emmerson, E., et al. SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland. eLife. 6, (2017).
- Nedvetsky, P. I., et al. Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland. Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).
- Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning. Development. 144 (2), 211-220 (2017).
- Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome. Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).
- Daley, W. P., et al. Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo. Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).
- Nam, K., et al. Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).
