Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bedömning av Zebrafish lins Nucleus lokalisering och Suturural integritet

Published: May 6, 2019 doi: 10.3791/59528
Automatic Translation
1,2, 1, 2
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

Summary

Dessa protokoll utvecklades för att analysera kortikal lins morfologi, strukturell integritet av zebra fiskar lins suturer i fasta och levande linser och för att mäta positionen av zebra fiskar lins kärnan längs den främre-bakre axeln.

Abstract

Zebra fisken är unikt lämpad för genetisk manipulation och in vivo Imaging, vilket gör den till en alltmer populär modell för omvända genetiska studier och för generering av transgena för in vivo Imaging. Dessa unika funktioner gör zebra fiskar en idealisk plattform för att studera okulär lins utveckling och fysiologi. Våra senaste rön att en Aquaporin-0, Aqp0a, krävs för stabiliteten i främre linsen sutur, liksom för förskjutning av linsen kärnan till linsen centrum med åldern ledde oss att utveckla verktyg som är särskilt lämpade för att analysera egenskaperna hos zebra fisk linser. Här beskriver vi detaljerade metoder för lins dissektion som kan appliceras på både larv och vuxna linser, för att förbereda dem för histologisk analys, immunhistokemi och Imaging. Vi fokuserar på analys av lins sutur integritet och kortikal cell morfologi och jämföra data som genereras från dissekerade linser med data från in vivo Imaging av lins morfologi möjliggjorts genom en ny transgena zebra fiskar linje med en genetiskt kodad fluorescerande markör. Analys av dissekeras linser vinkel rätt mot sin optiska axel möjliggör kvantifiering av den relativa positionen av linsen kärnan längs den främre-bakre axeln. Förflyttning av linsen kärnan från en initial främre position till centrum krävs för normal lins optik i vuxen Zebrafish. Således, ett kvantitativt mått på linsen kärn kraft position direkt korrelerar med dess optiska egenskaper.

Introduction

Den zebra fiskar är en utmärkt modell för att studera lins utveckling och fysiologi på grund av de anatomiska likheter med däggdjurs linser, relativ lätthet av genetisk och farmakologisk manipulation, snabbhet i embryonala ögat utveckling, liten storlek och transparens i tidiga skeden som möjliggör in vivo Imaging. De metoder som beskrivs här har utvecklats för att analysera zebra fiskar lins morfologi på embryonala och vuxna stadier med fokus på suturala integritet, kortikal membran morfologi in vitro och in vivo, och placeringen av linsen kärn kraft position längs främre-bakre axeln ex vivo. Dessa metoder fungerar som en utgångs punkt för funktionella studier av lins utveckling och fysiologi, samt omvänd genetiska skärmar för lins fenotyper i Zebrafish.

Avbildning zebra fiskar lins morfologi

Aquaporin 0 (AQP0) är det mest förekommande lins membran proteinet och är kritiskt för både lins utveckling och klarhet, på grund av flera viktiga funktioner hos däggdjur. Zebrafish har två Aqp0s (Aqp0a och Aqp0b) och vi har utvecklat metoder för att analysera förlust av deras funktioner i både embryonala och vuxna linser. Våra studier visar att aqp0a-/-mutanter utveckla främre polära opacitet på grund av instabilitet i främre suturen, och aqp0a/b dubbla mutanter utveckla nukleär opacitet1. AQP0 har visats spela roller i vatten transport2, adhesion3,4, cytoskeletanförankring5 och generering av brytnings index gradient6, men dessa studier har till stor del utförts i för in vitro. Den zebra fiskar ger en unik möjlighet att studera hur förlust av funktion, eller orolig funktion av Aqp0a eller Aqp0b skulle påverka morfologi och funktion i en levande lins. För att bedöma objektivets cell morfologi och suturural integritet under utveckling, modifierade vi befintliga in vitro immunhistokemiska metoder7 för användning i embryonala och vuxna linser, och genererade transgena att övervaka denna process in vivo .

Immunohistokemisk analys av plasma membran struktur och suturural integritet utfördes i hela fasta embryon och vuxna linser. Zebrafish linser är extremt små (lins diametern är ~ 100 μm i embryon och upp till 1 mm hos vuxna) jämfört med deras däggdjur motsvarigheter och har punkt suturer8, som sällan fångas i kryosnitt. Således, hela linser är viktiga för att analysera suturural integritet. För in vivo analys av främre sutur formation, och avbildning av exakt lins cell arkitektur, genererade vi transgena uttrycker Mapple specifikt märkning lins membran.

Fördelar med Live Imaging av lins membran transgena inkluderar: 1) att undvika fixering artefakter, 2) studerar dynamiska morfologiska förändringar i Time-lapse filmer, och 3) möjliggör longitudinella studier där tidigare händelser kan korreleras med senare Fenotyper. Pigmentering av Iris förhindrar normalt klar avbildning av objektivets periferi. Tillsats av 1-fenyl 2-Tiourea (PTU) före primordia-5 (Prim-5) Stage9 förhindrar melanogenes och ögonpigmentering upp till cirka 4 dagar postfertilisering (DPF). Men efter 4 DPF, linsen periferin är skymda in vivo, särskilt i äldre stadier. Dessutom, tätheten av linsen själv skymmer avbildning av sin bakre stolpe. Därför, för att studera morfologi av linsen periferi, eller den bakre suturen, efter 4 DPF, linser måste censurerade och fast.

Transgena zebrafisk linjer har använts för att analysera embryonal lins membran struktur in vivo10. Den Q01 transgena uttrycker en cyan fluorescerande protein smält till ett membran inriktning sekvens, Gap43, driven av EF1α Promotorn och en HEXAMER av DF4 pax6 Enhancer elementet ubiquitously i lins fiber celler11. Q01 har extra-lentikulär uttryck, inklusive amakrina celler i näthinnan, vilket ger bakgrunds signal om det primära intresset är linsen. Vi utvecklade en ny transgen linje som uttrycker en membran-tjudrad mApple specifikt i linsen, i syfte att undvika eventuella extra-lentikulär signal.

Lokalisering av objektiv kärnan

Vi upptäckte att linsen kärnan rör sig från en initial främre plats i larv zebra fiskar till en central plats i främre-bakre axeln i vuxna linser. Denna förskjutning i positionen av den höga brytnings index lins kärnan tros vara ett krav för normal utveckling av zebra fiskar lins optik1. Våra metoder möjliggör kvantifiering av objektivets kärn centralisering i förhållande till objektivets radie. Med hjälp av denna metod, visade vi att Aqp0a krävs för lins nukleär centralisering1, och denna enkla metod kan tillämpas på andra studier av utvecklingen och fysiologi linsen och dess optiska egenskaper i zebra fiskar modellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De djur protokoll som används i denna studie följa ARVO uttalande för användning av djur i oftalmisk och vision Research och har godkänts av den institutionella djur omsorg och användning kommittén (IACUC) vid University of California, Irvine.

1. Zebrafish hållning och döds hjälp

  1. Höj och Behåll zebra fiskar (AB-stam) under standard laboratorie förhållanden12. Uppfostra embryon i embryo medium (EM)12. Lägg till 0,003% PTU till EM från 20-24 h postfertilisering (före Prim-5 steg) för att förhindra pigment bildning i embryon12 som används för avbildning på embryonala stadier9. Höj larver från 6-30 dagar postfertilisering (DPF) på en diet av levande atmosfärfysiskt tills 14 DPF, och levande Artemia efter 14 DPF12.
    Var försiktig: PTU är mycket giftigt
  2. Anesthetize fisk använder trikainmesilat tills icke-lyhörd för beröring.
    1. Förbered trikainmesilat lager genom att kombinera 400 mg 3-amino bensoesyra acidethylester, med 2,1 ml 1 M tris (pH 9), i 100 ml DDH2O. Justera till pH 7,0 och förvara vid-20 ° c.
      Var försiktig: Tricaine är giftigt.
    2. Späd 4,2 ml trikain lager i 100 ml tank vatten till anestetize larver/vuxna eller i EM att bedöva embryon (slutlig koncentration av trikainmesilat vid 0,0165% w/v).

2. fixering av embryon och larver

Anmärkning: Immunhistokemiska protokoll anpassades från tidigare publicerade material7.

  1. Fixera dekorionerade embryon eller larver upp till 2 veckor efter gödsling i 4% (v/v) paraformaldehyd (PFA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) över natten vid 4 ° c på en rocker.
    Var försiktig: PFA är brännbart och cancerframkallande.
  2. Tvätta embryon tre gånger i 10 min i PBS, och permeabilize i PBS med 10% Triton och 1% DMSO (PBS-T) över natten vid 4 ° c.
    Var försiktig: DMSO är giftigt, är skadligt genom förtäring eller hudabsorption, transporterar farliga material genom huden, och är brännbart. Triton är giftigt, frätande och är farligt för vatten miljöer.

3. dissektion av larval och vuxna Zebrafish linser

  1. Anesthetize fisk från 6 DPF larver till vuxen ålder med trikainmesilat tills icke-lyhörd för beröring men ändå visar en stark hjärt rytm. Mät fisk standard längd per schilling (2002) för iscensättning13.
  2. Omedelbart punkt skattepliktiga ögon med mikro-dissektion sax och placera i en dissektion skålen i PBS (figur 2 visas för vuxna ögon).
    1. Gör en anpassad 35 mm mat rätt fylld med silikon för lins dissektioner. När silikon har fastställts, punkts katter en divot runt 2-3 mm i diameter och 0,5 mm djup för immobilisera vuxna ögon/linser under dissektion.
  3. Dissektion av vuxna zebra fiskar linser
    1. Placera en vuxen öga i skålen divot bakre sidan upp fylld med PBS. Immobilisera ögat genom att föra in pincett vid < 45 ° vinkel genom optisk skiva. Var noga med att inte Nick eller komprimera linsen. Gör två eller tre radiella snitt genom näthinnan och sklera från den optiska skivan till ciliarzonen med dissektion sax.
    2. Skala tillbaka näthinnan och sklera som blomblad och Invertera ögat, horn hinnan sida upp. Immobilisera linsen indirekt via manipulation av sklera och horn hinnan med den plana sidan av saxen, samtidigt dra bort näthinnan och bifogade vävnader med pincett. Trimma försiktigt överflödig vävnad från linsen.
      Anmärkning: Det är viktigt att dissekera noggrant för att få konsekvent hälsosamma linser.
  4. Dissektion av larv zebra fiskar linser
    1. Placera en larv öga bakre sidan upp på den platta delen av silikon skålen fylld med PBS och använda en vass volfram nål för att göra radiella nedskärningar genom näthinnan och sklera medan immobilisera ögat med en annan volfram nål eller pincett.
      Anmärkning: Var noga med att inte skada linsen.
      1. Slipa spetsen på en 2 cm längd av 0,1 mm volfram tråd elektrolytiskt genom att avbryta tråden spetsen i 10% (w/v) NaOH och tillämpa en låg spänning växel ström14. Fäst nålen i en Pasteur pipett genom att smälta glas änden med en bunsenbrännare.
        Anmärkning: Alternativa fina dissektion verktyg kan också användas.
        Var försiktig: NaOH är frätande.
    2. Försiktigt ösa ut linsen från dissocierade ögat med en trubbig sida av nålen, och försiktigt dra bort bifogade vävnad.

4. fixering av Dissekerad linser

  1. Omedelbart fixa dissekerad linser i 1,5% (v/v) PFA i PBS för 24 h vid rums temperatur (RT). Tvätta linser tre gånger i PBS i 10 min vardera.
  2. Permeabilize linser för hela Mount analys eller kryoskydd för kryosnittning (se avsnitt 8).
    1. Permeabilize-linser i PBS-T över natten vid 4 ° c.

5. Lens immunohistokemi

  1. Etikett membran av fasta embryo/larval eller vuxna linser genom inkubation i Phalloidin-Alexa fluor 546 (1:200) och cell kärnor med DAPI (1:1000 av 5 mg/ml lager) i PBS-T över natten vid 4 ° c.
    Var försiktig: DAPI är ett hud-och ögonirriterande ämne.
  2. Tvätta tre gånger med PBS-T i 10 min vardera. Klar vävnad genom inkubation i 30%, 50% och 70% glycerol i PBS-T (v/v) under minst 1 timme vid RT vardera, eller över natten vid 4 ° c.
  3. Montera fisk i 70% glycerol i PBS-T (v/v) på glas botten 35 mm mikrobrunn avläses rätter med ögon som platt och rakt mot täckglaset som möjligt. För yngre fiskar, kan en liten främre-lateral lutning hjälpa till att orientera linsen sutur att vara parallell med täckglasen.

6. analys av Zebrafish främre lins suturer använda en transgen linje in vivo

  1. Generera TG (βB1cry: mAppleCAAX) linjer med Tol2 kit15. Den Tol2 överföras element system15 möjliggör en stabil integration av konstruktionen där Mapple drivs av 300 BP av den mänskliga βb1-crystallin Promotorn16 bundna till membranet genom caax sekvens resulterar i uttryck speciellt i lins fiber cell membran.
    Anmärkning: Denna konstruktion (ID: 122451) finns att köpa.
    1. Förbered injektions blandningen på morgonen för injektionen och fortsätt på isen. För att nå en slutlig volym på 10 μL innehåll ande RNase-och DNase-fri H2O, tillsätt: 1,5 μl av huβb1Cry: MAPPLECAAX DNA-konstruktion vid 50 ng/μl-[0.375-0,75 PG/slutlig injektion], 1,5 μl av Tol2 Transposase mRNA vid 300 ng/μl (Tol2 kit)15 [15-30 PG slutlig injektion] och 1 μL fenolröd indikator vid 1% w/v [1 x10-5% (vikt/volym)/slutlig injektion].
    2. Injicera 50-100 pL injektions blandning i 1-cells Stadium embryon12.
  2. Mät genmodifiering effektivitet i F0 injiceras embryon genom att mäta frekvensen av embryon med Mapple positiva linser vid 3 DPF.
    Anmärkning: Räkna med att ha > 80% genmodifiering effektivitet med denna metod. F0 mosaiker möjliggör en detaljerad analys av membranmorfologier i enskilda celler. Varierande nivåer av mosaik gör att man kan avbilda morfologier av enstaka eller små grupper av celler, medan mer global lins uttryck tillåter analys av flercelliga strukturer som lins suturer in vivo.
  3. Outcross F0 mosaik fisk att generera stabila linjer, som etikett alla fiber cell membran. F0 grundare med transgenen integreras i köns celler kommer att generera avkomma med stabila integrationer som kan upprätthållas som transgena linjer.

7. analys av Zebrafish främre lins suturer använda en transgen linje in vivo

  1. Anesthetize 3 DPF eller vuxen mosaik eller stabil transgena fisk och montera i 1% låg smälta AGA Ros (LMA) med trikainmesilat med ögat platt mot täckglasen av glas botten mikrobrunn avläses rätter.
    1. Lös upp 1 g LMA i 100 mL av EM (utan metylenblått) för att göra 1% LMA. Förvara på lång sikt som 15 mL lager vid 4 ° c. Mikrovågsugn för att lösa upp lager och förvara vid 42 ° c tills varje tub används.
  2. Täck fisk upp till 6 DPF med EM med trikain, eller med tank vatten med trikain för vuxna när LMA är inställd.
    1. Blanda 5 ml EM utan metylenblått eller tank vatten med 250 μl trikainmesilat-lager och 7 μl PTU om avbildning av PTU-behandlad fisk.

8. Lens Kryssnittning och immunhistokemi

  1. Frys skydd fasta embryon eller vuxna linser genom att placera i 10% sackaros i PBS (w/v), 20% sackaros för 1 h vid RT vardera (eller över natten vid 4 ° c) och över natten i 30% sackaros vid 4 ° c.
  2. Bädda in vävnad i ULT i bas formar, och sedan frysa på chuckar med OCT. Kryosektion vid 12-14 μm och samla på en Superfrost/plus mikroskop dia bilder. Varma sektioner på bild för 10 min på en slide varmare föruppvärmd till ~ 35 ° c.
  3. Tvätta sektioner tre gånger med PBS i 10 min vardera. Etikett sektioner med Phalloidin-Alexa mjöl 546 (1:200) med DAPI (1:1000) eller WGA-Alexa mjöl 594 (1:200), följt av tre PBS tvättar. Montera med anti-Fade monterings medium, och tätning täckglasen med nagellack.

9. avbildning

  1. Hämta bilder med ett konfokal Mikroskop. Förvärva z-stackar eller optiska skivor med hjälp av en 60x N/A 1,2 vatten-Immersion mål, eller liknande, på specifika regioner från främre till bakre lins Polen. Använd följande anskaffnings inställningar: 1,2 luftig skiva med 561 nm Laser, Texas röd filter för phalloidin-Alexa mjöl 546 eller mApple, eller 405 laser med UV-filter för DAPI.
  2. Korrekt z-intensitet laser effekt för att motverka signal förlust med djup i linsen. Detta möjliggör en stark signal vid den bakre Polen av fasta och levande 3 DPF embryon, och stark signal i ekvatoriella optiska skivor i vuxen fisk linser.
  3. Kompilera och Visa bilder med hjälp av bildbehandlings program.

10. mätning av lins Nucleus lokalisering i främre-bakre axel

  1. Orientera nyligen censurerade linser axiellt i PBS i en 35 mm mat rätt med en täckglas botten, med stolpar och suturer orienterade parallellt med planet av fokus. Leta efter en skillnad i brytnings index, som vanligt vis sker vid gränssnittet i linsen cortex och lins kärnan för att identifiera linsen kärnan.
    Anmärkning: Friska vilda typ vuxna linser är extremt transparent vilket gör det svårt att se linsen suturer och kärna, eller för att bestämma lins orientering. I detta fall, en liten nick med pincett till linsen kapseln orsakar smärre skador, vilket gör suturer och lins kärnan framgår i ca 10 min hjälper till att orientera linsen för denna mätning. Emellertid, linserna blir oanvändbara för nedströms applikationer som de är nu skadade.
  2. Ta bilder av linser med lins kärnan i fokus under ljus fält belysning med eller utan DIC optik med hjälp av en dissektion Mikroskop med en kamera ansluten. Bild en mikrometer under samma förstoring för kalibrering.
    1. Klicka på Live View-knappen, justera exponerings inställningarna för att visualisera lins kärnan och objektivets periferi, och ta en bild genom att klicka på snap shot-knappen. Spara som en TIF-fil.
    2. Använd bild behandlings program för att kalibrera de förvärvade objektiv bilderna. Välj det raka verktyget och rita en linje av känd längd på Mikrometern bilden, klicka analysera | ställa in skalan. Ange kända avstånd, enheter och välj "global" kalibrering och klicka på OK.
  3. Mät avståndet till centrum av lins kärnan till främre stolpen (a-r).
    1. Använd det raka verktyget i bild behandlings program för att rita en linje över den inålade mitten av lins kärnan i en axiell orientering. Ta centrum av denna linje som centrum av linsen kärnan.
    2. Rita en annan linje från denna punkt till den främre Polen på linsen och välj "åtgärd" i "analysera"-menyn för att mäta avståndet (a-r), där a är radien på linsen och r är avståndet från mitten av linsen till mitten av Kärnan.
    3. Rita en annan linje från den främre till den bakre stolpar och mäta detta avstånd som linsen diameter (2a). Kopiera dessa längder från "resultat" fönstret och överföra till ett kalkyl blad eller statistik program.
      Anmärkning: Det är lättare att exakt mäta från centrum av kärnan till den främre Polen, än att mäta från mitten av linsen kärnan till mitten av linsen. Denna mätning omvandlas av formeln i steg 10.3.5 att rapportera avståndet i mitten av linsen kärnan till mitten av linsen. Använd alltid den vuxna kärnan för mätningar, även om den embryonala kärnan är uppenbar.
    4. Dividera diametern med 2, för att beräkna objektivets radie, a.
    5. Beräkna r/a, som Equation 1 , vilket är den normaliserade lokalisering av linsen kärnan med avseende på objektivets radie.
      Anmärkning: för en kärna placerad närmare främre stolpen, r/a kommer att > 0,0, medan en centralt lokaliserad kärna kommer att ha en r/a av 0,0.
  4. Diagram loggen av normaliserade axiella Nucleus mätning som en funktion av standard längd för att avgöra förändringar i linsen Nucleus lokalisering under zebra fiskar utveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vuxen zebra fiskar öga anatomi liknar mycket av däggdjur (figur 1a). Trots vissa skillnader mellan zebra fiskar och däggdjur ögon, såsom att ha en ciliär zon i stället för en ciliär kropp17, skillnader i optiska egenskaper18, och skillnader i morfogenes under embryonal utveckling19, den Zebra fiskar Eye är en utmärkt modell för att studera ögonutveckling och förstå oftalmisk sjukdom20,21,22. En enkel epitel linjer främre Polen av linsen, som vid ekvatorn genomgår en livslång process av spridning, töjning, och differentiering i fiber celler, som utgör huvud delen av linsen. Mogna fiber celler (figur 1b, ljusblå) först differentiera i embryot, saknar organeller och ersätts aldrig. Differentiera fiber cell tips träffas på polerna för att bilda den främre och bakre suturer. Dessa celler internaliseras sedan av nyligen differentierade fiber celler. Liksom alla ryggradsdjur linser har zebra fiskar objektivet därmed en gradient av utveckling med de äldsta cellerna ligger i mitten av linsen kärnan. Den zebra fiskar objektivet placode former på 16 h postfertilisering (hpf), som förlänger för att bilda den primära linsen fibrer vid 18 hpf, och sekundära fibrer bildar över gångs zonen på 28-36 hpf. Den bakre suturen är synlig på 48 hpf, som är innan den främre suturen blir synlig10.

Den exakta utvecklingen och underhållet av vanlig lins arkitektur är avgörande för dess optik. Här beskriver vi metoder för analys av zebra fiskar lins cell morfologi in vitro och in vivo, inklusive både fördelar och begränsningar, som vi utvecklat för att analysera fenotyper till följd av förlust av-funktion mutanter av två zebra fiskar Aqp0s, Aqp0a och Aqp0b1. För bedömning av vuxna lins morfologi in vitro-, linser dissekeras (figur 2) och omedelbart fast. Embryonal bedömning utfördes i hela fasta embryon (figur 3) och jämfördes med levande transgena embryon (figur 4). Dissekerade och fast vuxna linser (figur 5) jämfördes med transgena vuxna linser avbildade Live (figur 6). Skillnader i detektering och visualisering av specifika delar av linsen med dessa metoder sammanfattas (tabell 1).

Phalloidin befanns vara överlägsen för märkning lins fiber cell membran i zebra fiskar jämfört med vetegroddar agglutinin (WGA). WGA är en lektin så pass binder till N-acetyl-D-Glucosamine och sialic syra, och WGA konjugerat till fluorophores är typiskt Använd till etikett linsen fiber cell membranen i mänsklig23, nötkreatur24, får25, mus26, råtta27 och Zebra fiskar28,29. Här använder vi phalloidin på hela zebra fiskar linser (figur 3, figur 5).

Embryonala och larv zebra fiskar larver upp till 7 DPF är små och permeabla nog att möjliggöra penetration av phalloidin i linsen yttre cortex. Genom 3 DPF linsen kärnan är kompakt och saknar organeller, främre suturer form vid främre stolpen (figur 3a,B), och phalloidin är undantagna från linsen kärnan i ett ekvatoriellt optiskt plan (figur 3c,D). Phalloidin är sannolikt uteslutas från kärnan på grund av den höga kompakverkan av fiber cell membran, i enlighet med tidigare studier28. Emellertid, den yttre cortex visualiseras i detalj med denna färgning (figur 3c-F). I tvärsnittet, fiber celler ta på en tillplattad sexkantiga form, med längre breda sidor, och kortare smala sidor. Phalloidin märker starkt både de smala och breda fiber cell membranen (figurera 3e-F) lyfta fram packningarna av de kortikala fiber cellerna mellan breda sidor. Denna organisation är i stort sett opåverkad i aqp0a/b dubbel mutanter (figur 3b, D, F och H).

Mosaik uttryck av transgenen (mApple bundna till cell membranet av CAAX motiv drivs av en 300 BP promotor regionen av den mänskliga βB1 crystallin Promotorn) uttrycker starkt i linser börjar på 2 DPF. Transgenen är slumpmässigt integrerad i genomet vilket leder till heterogena uttryck av mApple. Vi visar exempel på ett 3 DPF-objektiv med starkt uttryck i hjärn Barken (figur 4) och uttryck i delar av kärnan (figur 4D). Membran markören begränsas inte av genomtränglig het lik phalloidin, således märker det lins kärnan. Mosaiker (figur 4) som GENERERAS av DNA-injektioner som endast uttrycks i en liten delmängd av cellerna är användbara för att analysera enskilda cellmorfologier jämfört med stabila linjer, som märker varje cell som uttrycker βB1 crystallin (figur 6). I TG (βB1cry: mAppleCAAX) mosaiker kan morfologin för den främre suturen visualiseras i z-projektioner tagna vid främre Polen (figur 4a,B). Observera att cell membranernas morfologi skiljer sig från fasta linser som är märkta med phalloidin (figur 3a,B) och förekomst av under domäner i breda cell membran (figur 4avita pilar) som tidigare identifierats i linser från andra Art30 är synlig. Men svagare märkning av smala fiber cell membran resulterar i en oförmåga att se den slående konvergensen av celler vid den främre suturen (figur 4a,b -pil) ses i fasta linser märkta med phalloidin (figur 3a,B pilarna).

Intressant, optiska skivor tagna vid linsen ekvatorn avslöjar också ett annat märknings mönster, med uppenbara störningar till cell volym i aqp0a/b dubbel mutanter jämfört med WT (figur 4c-F). Detta beror sannolikt på att transgena etiketter breda fiber cell membran mer effektivt än phalloidin. Vi kunde få z-prognoser genom den bakre Polen för att analysera integriteten av den bakre suturen med hjälp av Z-korrigering, som ökade laser effekt med djup i vävnad. Tydlig analys av den bakre suturen (figur 4G,H) i intakt fisk begränsades till de första 5 DPF, och efter att linsen var för tät, vilket resulterar i förlust av signalen i den bakre delen av linsen.

Fast dissekerade vuxna linser märkta med phalloidin avslöjade slående detalj i den högt beställda arkitektur av fibrer cell rader konvergerande att bilda främre suturer (figur 5a, pil) och morfologi av cortex (figur 5c-H), på grund av mycket stark märkning av smala fiber cell membran av phalloidin. Maximal Z-projektioner av den främre Polen avslöjade förlust av en stram främre sutur i aqp0a/b Double Mutant linser (Figur 5b, pil), jämfört med WT (figur 5a, pil), som framgår som en massa av membran och cell kärnor i optiska skivor 30 μm från främre stolpen (figur 5D). I djupare optiska skivor, var phalloidin märkning uteslutas från den djupare linsen cortex och Nucleus (figur 5E,F). Den övergripande organisationen av fiber celler rader i den yttre cortex påverkades något av avsaknaden av en snäv främre sutur i aqp0a/b Double Mutant linser, vilket gör det omöjligt att positionera linser exakt vinkel rätt mot Imaging planet (figur 5F ) jämfört med WT-linser (figur 5e). Men hög effekt bilder av fiber celler rader tagna i det ekvatoriella planet visade att cellerna i den yttre hjärn Barken fortfarande bildade ordnade rader, synlig på grund av stark smal fiber cell märkning (figur 5G,H). Det var omöjligt att urskilja enskilda fiber cell breda membran på grund av en kombination av deras snäva packning, och svag signal. Eftersom dessa linser var dissekerade, kunde de monteras med den bakre sidan mot målet, vilket gör z-prognoser av den bakre suturer, som visade inga skillnader mellan genotyper som bakre fiber cell tips bildade snäva suturer (figur 5I,J pilar).

Z-projektioner av linser av levande sövda vuxna stabila TG (βB1cry: mAppleCAAX) fisk avslöjar kortikal membran morfologi i främre cortex (figur 6a,a '), liksom omfattningen av cell konvergens vid främre Polen ( Figur 6B). Det var svårare att montera fisken med lins suturer vinkel rätt mot avbildnings planet, jämfört med fasta dissekerade linser. Stabila linjer som transporterar transgenen Express mApple i lins kärnan (figur 6c,D). Optiska skivor på ekvatorn avslöjade en stark signal som indikerar omfattande packning av kärnan när avbildas med samma laser effekt som främre cortex (figur 6C). Intressant, ingen cellulär upplösning av den yttre hjärn Barken var uppenbar hos vuxna, till skillnad från i embryon. Detta beror sannolikt på att Iris blockerar en tydlig signal från linsen periferin. Det kan vara möjligt att få en starkare lins kortikal signal genom dilatation av eleven före avbildning. Med reducerad laser effekt var det möjligt att urskilja vissa cell lager i lins kärnan (figur 6d). Den vuxna zebra fiskar objektivet är mycket tät, och det var omöjligt att få signal från den bakre Polen in vivo.

Vi har visat att zebra fiskar lins kärnan rör sig i den optiska axeln från en initial främre position i larv linser till en central position hos vuxna1. Dessa rörelser är markerade i axiella lins sektioner, som phalloidin och WGA är undantagna från linsen kärnan (figur 7A-C). Vi har visat att Aqp0a krävs för denna centraliserings process1, men denna mekanism kommer sannolikt att påverkas av andra proteiner. Lokaliseringen av linsen kärnan i förhållande till sin position längs den främre-bakre axeln mättes genom att placera dissekera hela linser i sin axiella orientering och avbildning under DIC belysning, vilket belyser små skillnader i egenskaper (figur 7E). Suturer har vanligt vis en annan brytnings index än den omgivande cortex, så kan användas som en guide för orientering. Unga larv linser har mer uppenbara suturer (posterior suturer i mycket unga linser), och lins kärnor, som har en annan brytnings index, är uppenbarligen asymmetriska, vilket gör det lättare att orientera linser på dessa stadier. Den relativa avståndet i mitten av linsen kärnan från mitten av linsen (r) är normaliserade till objektivets radie (a). Detta är sedan graferas med anknytning till zebra fiskar utveckling, för vilken standard längd mätning används13. I WT, linsen Nucleus börjar närmare främre lins Polen Equation 2 , och sedan centraliserar Equation 3 i vuxen ålder (figur 7f).

Figure 1
Figur 1 : Zebrafish vuxen öga och lins diagram. Anterior tas som där ljuset kommer in i ögat, som i zebra fiskar är faktiskt lateral. (A) zebra fiskar-linsen tillsammans med horn hinnan fokus ljus på näthinnan. I vatten levande djur, horn hinnan spelar en mindre roll i ljus refraktion, men i stället, linsen har en högre brytnings index18. Linsen separerar den främre kammaren fylld med kammar vatten och bakre kammare fylld med glas kroppen humor. (B) zebra fiskar-linsen är mer sfärisk än däggdjurs linser. Fiber cell tips möts vid punkt-eller navel suturer8 vid främre och bakre poler. Differentiera fiber celler i linsen cortex har kärnor och organeller, medan mogna fiber celler i linsen kärnan (ljusblå) saknar organeller och kärnor. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.    

Figure 2
Figur 2 : Zebrafish lins dissektion. (A) ögonen dissekeras från sövda fisk och placeras bakre sidan uppåt (B). (C) ögonen är immobiliserade av pincett via optisk skiva (OD) och två till tre radiella snitt görs i näthinnan och sklera från optiska skivan till zonules. (D) vik klaffarna ut för att avslöja linsen. (E) rotera ögat att möta horn hinnan upp, immobilisera linsen indirekt via horn hinnan och dra bort sklera-näthinnan. (F) trimma bort kvarvarande näthinnan och ciliär zon/zonules från linsen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Embryonal lins morfologi in vitro. Fasta och permeabiliserade embryon märkta med phalloidin (röd) och cell kärnor med DAPI (blå) avslöjar membranmorfologi och sutur integritet vid polerna. Z-prognoser visar att WT och aqp0/b Double Mutant linser uppvisar mycket vanlig fiber cell arrangemang som möts på en mycket snäv främre sutur (pilar) på 3 DPF (a, b). Optiska skivor tagna vid ekvatorn avslöjar täta rader av hexagonala fiber celler förpackade i den yttre cortex i båda genotyper (C-F). Båda, smala och breda sidor av fiber cell membran är märkta som visas i (E). Posteriora suturer (pilar) bildas och tätt i båda genotyperna (G, H). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Embryonal lins morfologi in vivo. Live Imaging av sövda 3 DPF mosaik F0 injiceras TG (βB1cry: mAppleCAAX) linser avslöja främre suturer (pilar) i z-projektioner (a, B). (a) Membran under domäner är uppenbara som Auktor (vita pilar) i breda fibrer cell membran. Smala fiber cell membran är också uppenbara (svarta pilar). WT linser avslöjar tätt packade lins kortikala fiber celler (C, E), jämfört med störd cortex av aqp0a/b Double mutanter- med uppenbara svullna celler (D, F). Fokusering på bakre (g, h) suturer (pilar) avslöjar ingen skillnad mellan genotyperna (g, h). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Adult lins morfologi in vitro. Excised, fasta och permeabiliserade linser från fisk över 23 mm standard längd var märkta med phalloidin (röd) och DAPI (blå). 150 μm Z-projektion på den främre stolpen avslöjar strikta arrangemang av fiber cell tips konvergerande på en stram sutur (pil) i WT (a), men inte aqp0a/b Double mutanter (Arrow), som i stället har en massa av membran och kärnor (b). En optisk skiva tagen 42 μm från den främre Polen avslöjar ordnade celler konvergerande i centrum i WT (C), men en massa kärnor där suturen bör vara i muterade linser (D). Optiska skivor genom ekvatorn på linsen, vid 130 μm från främre stolpen avslöjar tätt packade rader av fiber celler i WT (E, G) och mutanter (F, H). Posterior suturer (pilar) bildas och tätt i båda genotyper (I, J). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 Vuxna lins morfologi in vivo. Live Imaging av sövda vuxen stabil TG (βb1cry: mapplecaax) WT linser. Z-projektioner vid främre cortex avslöja kortikal morfologi (a, a '), och främre sutur (pil), med celler konvergerande till en punkt i en enda optisk skiva (B, pil). Hjärn Barken kan visualiseras vid högre laser effekt i en optisk skiva genom ekvatorn (C), jämfört med den starkare signalen bildar linsen kärnan (D). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Zebrafish lins Nucleus centralisering. Fasta och kryoskyddade embryon(a) och linser(b, C) var axiellt kryo-snittas och märkta med phalloidin-546 (röd i a, b), DAPI (blått i a, b) eller WGA-594 (röd i C). Linsen kärnan saknar cell kärnor, och placeras närmare den främre (a) objektivet på 3 DPF (a), och i 1 månad gamla linser (B), jämfört med att vara centralt placerad i vuxna linser (C). Dissekerad linser från en 1 månad gammal zebrafisk på 4,1 mm standard längd var orienterade ekvatoriellt (D), eller axiellt (E). Den relativa lokaliseringen av lins kärnan i axeln beräknades med hjälp av följande strategi: (E) avståndet mellan centrum (*) i lins kärnan (vit prickad linje) mättes till främre Polen, eftersom detta är mer praktiskt än att mäta avståndet (r) till objektivets mitt (plus). Detta normaliserades till objektivradien (a), som var intially mätt som den axiella (Ant.-POS.) lins diametern. Stocken av den normaliserade axiella kärnan lokalisering var graferad som en funktion av zebra fiskar utveckling, mätt med standard längd (F). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Funktionen IHC-embryo HFS embryo Hela IHC vuxen lins TG Adult
Live N Y N Y
Främre suturen Y Något Y Något
Bakre suturen Y Y Y N
Kortikal cellulär detalj Något Y Y Anterior något
Lins Nucleus detalj N Y (stabil) N Y (stabil)
Sekundär etikett Y-antikroppar Lev endast med endast TG Y-antikroppar Lev endast med endast TG
Bred/smal fiber etikett Både Bred Mesta dels smala Bred

Tabell 1: Sammanfattning av jämförelse av in vivo vs in vitro -metoder för analys av objektivets morfologi i zebra fiskar. Y = Ja, N = nej

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Analys av zebra fiskar lins morfologi är det första steget för att förstå fenotyper i mutanter, eller effekterna av farmakologiska interventioner som syftar till att studera biologi av okulär linsen. Vi skisserar metoder för att analysera lins suturer, kortikal fiber cell morfologi och aspekter av linsen kärnan. Dessa metoder är en kombination av in vitro och in vivo (jämfört med tabell 1). In vitro -metoder möjliggör större detaljer i den yttre kortikal cell morfologi, samt till gång till den bakre suturen i vuxna linser.

In vivo -analys är möjlig med användning av transgena markörer. Den Transgene vi introducerar här är lins membran specifika, jämfört med den befintliga Q01 zebra fiskar linje, som samtidigt märkning linsen membran också etiketter andra cell typer i ögat, inklusive amakrina celler, komplicera tolkningen11 . In vivo -signalen begränsas av det pigmenterade epitelet i ögat, som bildas under den andra dagen av embryogenes, så embryon måste PTU behandlas för analys i detta och senare stadier. Hos vuxna döljer Iris klar analys av linsen cortex, men möjliggör in vivo analys av den främre linsen cortex. Levande avbildning av fisk linser möjliggör longitudinella studier av objektivets morfologi i samma djur. Detta kan vara ett mycket användbart verktyg för att studera effekter på dynamiska processer, såsom cell volym störningar som svar på osmotiska eller farmakologiska perturbations. Ett oväntat fynd är att vi tydligt kan visualisera membranet under domäner i breda fiber cell membran i levande larv transgenics, men inte i fasta linser. Detta belyser skillnaden i märkning av transgenen och phalloidin, liksom det faktum att dessa under domäner kan påverkas av fixeringsprocessen.

Analys av de molekyl ära mekanismerna i objektivkärncentraliseringen med hjälp av de metoder vi beskriver kan avslöja mekanismer som är nödvändiga för utvecklingen av objektivets optiska egenskaper. Även om, hittills, axiell lins Nucleus asymmetri har endast rapporter ATS i zebra fisk, genom att studera denna process kommer vi sannolikt att få insikter i mekanismer som krävs för utveckling av objektivoptik i andra arter. I framtiden kan de transgena djuren användas i kombination med andra tillämpningar-såsom överuttrycks studier, med användning av en grön genmodifiering markör. Dessa kan användas för att studera effekter av överuttrycker ett specifikt protein i linsen, eller för att rädda fenotyper i befintliga mutanter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har inga avslöjanden.

Acknowledgments

Vi skulle vilja erkänna vår finansiering Källa: NIH r01 EY05661 till J. E. H, Ines Gehring för att bistå med att generera aqp0a/b dubbla mutanter och zebra fisk hållning, Dr Daniel Dranow för diskussioner som leder till generering av transgenics, Dr Bruce Blumberg och Dr Ken Cho labb för användning av deras dissekera Mikroskop, och Dr Megan Smith för hjälp med statistisk analys.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma P7629 CAUTION – very toxic
4% Paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences RT 157-4 CAUTION – health hazard, combustible
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti-E
Cryostat Leica CM3050S Objective and chamber temperature set to -21 °C
DAPI Invitrogen D1306 CAUTION – irritating to eyes and skin
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128 CAUTION – combustible, penetrates skin 
Disposable base mold VWR Scientific 15154-631
Disposable Pasteur glass pipets Fisherbrand 13-678-20A
Dumont #5 forceps Dumont & Fils Keep forceps sharpened
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040 CAUTION - toxic
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass) MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
Glycerol Sigma G2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct Addgene ID:122451
ImageJ Wayne Rasband, NIH v1.51n
Low Melt Agarose (LMA) Apex 902-36-6
NIS-Elements Nikon V 4.5
NIS-Elements AR software Nikon
Olympus  with a model 2.1.1.183 controller Olympus Corp DP70
Olympus microscope  Olympus Corp SZX12
Phalloidin-Alexa Flour 546 Thermo Fisher A22283
Phenol Red indicator (1% w/v) Ricca Chemical Company 5725-16
Phosphate buffered saline (PBS) Fisher Scientific BP399
Photoshop Adobe CS5 v12.0
Photoshop software Adobe CS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD objective Nikon
Power source Wild Heerbrugg MTr 22 Or equivalent power source 
Slide warmer model No. 26020FS Fisher Scientific 12-594
Sodium Hydroxide beads Fisher Scientific S612-3 CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals
Superfrost/Plus microscope slide Fisher Scientific 12-550-15
Sylgard 184 silicone Dow Corning World Prevision Instruments SYLG184
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek 4583
Triton X-100 BioXtra Sigma T9284 CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive
Vannas micro-dissection scissors Ted Pella Inc 1346 Sharp/sharp straight tips
Vectashield antifade mouting medium Vector laboratories H-1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 Life Technologies W11262

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
  2. Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).
  3. Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
  4. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
  5. Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
  6. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
  7. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
  8. Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
  9. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  10. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
  11. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2002).
  13. Schilling, T. F. Zebrafish. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. 261, Oxford University Press. 59-94 (2002).
  14. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  15. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  16. Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
  17. Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).
  18. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
  19. Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
  20. Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68 (2016).
  21. Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
  22. Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
  23. Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
  24. Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
  25. Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
  26. Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
  27. Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
  28. Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
  29. Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
  30. Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).

Tags

Biologi zebra fisk lins lins sutur lins kärna AQP0 MIP Live Imaging lins utveckling transgena
Bedömning av Zebrafish lins Nucleus lokalisering och Suturural integritet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vorontsova, I., Hall, J. E.,… More

Vorontsova, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity. J. Vis. Exp. (147), e59528, doi:10.3791/59528 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter