Summary
ここでは、[11 C]SNAP-7941の完全に自動化された放射線標識と、P-gp発現および非発現細胞に対するこのPETトレーサーのリアルタイム運動学の分析のためのプロトコルを表す。
Abstract
陽電子放射断層撮影(PET)は、経路に関する洞察を提供し、生体内調査のために特定の標的放射性リガンドを使用する重要な分子イメージング技術です。このプロトコルの中で、メラニン濃縮ホルモン受容体1に対するアンタゴニストである[11 C]SNAP-7941の堅牢で信頼性の高い遠隔制御放射合成が記載されている。放射合成は、[11 C]CO2を産生したサイクロトロンから始まり、その後[11 C]CH3OTfへのガス相転移を介してさらに反応する。そして、この反応性中間体は、前駆体溶液に導入され、それぞれの放射トレータを形成する。化学的および放射性化学的純度はRP-HPLCによって決定され、放射性医薬品の品質管理プロセスで日常的に実施される。さらに、モル活性は、次のリアルタイム運動的調査の必要性として計算されます。さらに、[11 C]SNAP-7941は、細胞蓄積に対するP-糖タンパク質(P-gp)発現の影響を評価するためにMDCKII-WTおよびMDCKII-hMDR1細胞に適用される。このため、P-gp発現細胞株(MDCKII-hMDR1)は、P-gp基板(±)-ベラパミルを用いて実験前に遮断することなく使用され、その結果は野生型細胞に対して観察されたものと比較される。全体的な実験アプローチは、カーボン-11(半減期:20分)のような短命の核種で標識されたPETトレーサーを使用して、すべての前臨床および臨床研究に不可欠な正確な時間管理の重要性を示しています。
Introduction
[11C ]SNAP-7941は、メラニン濃縮ホルモン受容体1(MCHR1)を標的とする最初の陽電子放射断層撮影(PET)トレーサーとして進化した- 主に食欲と食物摂取1の中心調節に関与する受容体。よく特徴付けられたMCHR1アンタゴニストであるSNAP-7941のカーボン-11ラベリングは、本物のPETトレーサー2、3、4、5を生み出した。しかし、完全に自動化された放射線合成は、20分6の半減期を提供する短命放射性核種炭素-11との時間の有効性および再現性の点で非常に挑戦的である。全体的な合成時間は最小限に抑えるべきであり、経験則として、2-3の半減期(すなわち、炭素-11の約40-60分)7を超えてはなりません。特に、発現密度の低い受容体系を標的とする放射線トレーサーの合成手順は、十分な収率を得るために広範囲に最適化されなければならず、その結果、高いモル活性8を得る必要がある。合成戦略は、多くの場合、サイクロトロン内の放射性核種の生産に続き、[11 C]CO2をシンセサイザーに放出する。そこで、[11C]CO2は、まず[11C]CH4に還元され、その後ヨウ素と反応して[11C]CH3Iをガス相法9、10を介して収量する。さらに、銀のトリフレトリレートでの処理は、直接オンラインで[11 C]CH3OTfを得る。その後、この反応性炭素-11標識中間体は、前駆体分子を含む溶液に導入される。自動化された放射線合成は、さらに前臨床および臨床研究に適した製品のその後の製剤を含む半準備RP-HPLCによる精製プロセスを含む。
放射性核種の半減期と放射線合成の時間の労力にかかわらず、放射性医薬品の薬物動態はPETトレーサー開発中に評価されるべき最も重要な部分である。神経イメージングの面では、PETトレーサーの脳のエントリが主な前提条件です。しかし、脳の「セキュリティ境界」である血液脳関門(BBB)は、低分子(PETトレーサーなど)をアンロードし、その適用性を効率的に妨げる流出トランスポーターを高く発現します。
前臨床評価中の大きな欠点は、インビトロ実験でしばしば認識されず、[11 C]SNAP-7941で観察されるように、生体内のPETトレーサーの障害につながるこれらの流出トランスポーターに対する予期しない相互作用です。ラットにおけるμPETイメージングは、低脳蓄積を実証し、これはP-gp阻害剤タリキダー11の投与後に劇的に増加した。これらのデータは[11C]SNAP-7941が中央MCHR1へのリガンド結合を妨げるこの流出トランスポーターシステムの基板であることを示唆した。残念ながら、トレーサー開発の初期段階でBBB浸透の予測を可能にする十分なインビトロモデルがまだ不足しています。
ここでは、炭素11メチル化のためのシンセサイザーを用いて[11 C]SNAP-7941の自動合成について説明する。本研究の重点は、自動合成、品質管理、および非常に短命な核種炭素11を用いた連続したインビトロ評価を含む連続的な実験的アプローチを整理する方法の概要を提供することです。
まず、最小限の時間の支出と最大収率で放射線合成を成功させるための重要なステップについて説明する。次に、信頼性の高い品質管理手順が設定され、放射線トレーサーを潜在的な臨床研究に利用できるようにし、欧州薬局方12の基準を満たす。それぞれのモル活性のモル濃度および計算の定量化は、連続する運動測定に不可欠な要件である。
最後に、流出トランスポーターP-gp(hMDR1)に対する[11C]SNAP-7941の相互作用を評価する新しい簡単なインビトロ法が提示される。提案された運動モデルは、即時のデータ解釈を可能にし、最小限の細胞培養努力を必要とする扱いやすいデバイスを使用しています 13.
Protocol
注意: 次のプロトコルでは、放射能の処理と操作を必要とする複数の手順が含まれます。すべてのステップは、研究所の放射線安全部とそれぞれの国の立法府と一致することが重要です。ALARA(「合理的に達成可能なほど低い」)の原則に従って関与するオペレータのための電化放射線への露出を最小限に抑えることが義務付けられています。
1. 時間管理と実験の計画
注:カーボン-11の短い半減期は、放射能の損失を最小限に抑えるために正確な時間管理を必要とします(図1)。関係者は、責任の領域とそれぞれの行動の時点を知ることが重要です。[11C]SNAP-7941のリアルタイム運動実験のセットアップには、スムーズなプロセスのために約4人が必要です。
- [11C]SNAP-7941のプロデューサーを編成します。
- 仕様評価を行う品質管理事業者に、合成開始時間の質量濃度及びモル活性の算出を行う。
- 希釈計算の準備ができて、リアルタイムの運動実験者を保持し、実験を実行します。
- 各時点でそれぞれの場所に放射能を転送するようにランナーに指示する。
2. 前臨床用[11C]SNAP-7941の自動合成
- シンセサイザーの調製(図2)。
- シンセサイザー、必要な技術的ガス(ヘリウムと水素)とシンセサイザー制御ソフトウェアトレーサーラボをオンにします。それぞれの合成シーケンススナップを選択します。
- V1-V3を水で1回、アセトンを介してアセトンで2回、ロードまたはループ廃棄物ボトルに位置を注入します。
- V18を介して活性化された連続ヘリウムの流れと注入弁を介して反応器の出入りのすべての関連するラインを乾燥させる。
- [11 C]CH3I トラップと同様に、100mL·min-1のヘリウムストリーム下でトラップを V24、V25、V29、V15、V9、V17、V32/V33 を切り離した原子炉で加熱します。
- 100 mL·min-1のヘリウム流れで(付属の原子炉で)漏れのための同じ経路を確認してください。流れが4 mL・分-1を下回るとき締め付けは保証される。
- HPLCポンプ(5-10 mL·min-1)をオンにし、HPLCラインと注入弁をアセトニトリル/水(50/50、v/v)で洗浄し、V14を介してHPLC溶媒を使用したHPLCラインを電球に入れます。
- V11とV12を介して電球をV19経由でヘリウムストリームで廃棄物ボトルに空にします。V11とV12を介してV6からの水でそれぞれのラインをV18経由でヘリウムストリームで再び洗浄します。
- V11とV12を介してエタノールとV4でV5を洗浄し、V18経由でヘリウムストリームを使用して製品コレクションバイアル(PCV)にPCVを使用して、V20経由でヘリウムストリームで廃棄物ボトルにV13を介してPCVを空にします。
- HPLCポンプをオフにし、合成用溶媒に切り替える(アセテート(2.5g·L-1)/酢酸 97.5/2.5 v/v;pH 3.5)/アセトニトリル75/25v/v)を、半準備HPLCカラムを取り付け、カラムを平衡化する(5 mL·min-1の流れ)。
- 合成精製用試薬を充填する:水1.5mL(V2)、4.5mLの0.9%NaCl(V4)、96%エタノール(V5)の0.5mL、10mLの水(V6)、90mLの水(球根)を充填します。
- 新しいループ廃棄物バイアルを取り付けます。V13および液体窒素への製品バイアル(標識され、通気針が装備されている)。
- 96%エタノールと20 mLの水の10 mLのSPE(固相抽出)カートリッジを予め条件付けし、V11とV12の間に取り付けます。
- 合成を開始する前に20分前に実行シーケンスを開始し、[11C]CO2トラップを400°Cに加熱し、V27(2分)を介して50 mL·min-1のヘリウムストリームでトラップを洗い流します。 その後、水素ガス(120mL·min-1)で3分間[11C]CO2トラップを予水し、最後に40°C以下まで冷却します。
- アセトニトリルの400μLで前駆体の1mgを溶解し(DNA合成、<10H2O)、溶液を反応に移し、TBAHの5.5μLを加える(メタノールに264mg·mL-1)。原子炉をそれぞれの位置に取り付けます。
- ホットセルを閉じ、ホットセルの下圧をオンにします。
- 液体窒素でCH4トラップの冷却プロセスの開始を-75°Cに確認します。
- 温度に達したら放射能を放出します。
- [11C]CO2のサイクロトロン生産
注: 手順 2.2.1-2.2.4 は、放射合成モジュールの調製に同時に行われます (図 1も参照)。- サイクロトロンの磁石をオンにします。
- ターゲット11C-CO2を選択し、ビーム65 μAを開始します。
- ボタンを押して照射開始を確認する
- ビームを停止し、ボタンを押してシンセサイザーに放射能の放出を確認します,望ましい放射能量に達した後(約120 GBqは30分後)。
- 全自動放射線合成の実行
- システムが放射能を受信する準備ができていることを確認し、自動化されたプロセスを開始する
- 次の自動化プロセスを監視します。
- [11C]CO2がV26(約4分)を介してサイクロトロンから合成ユニットに自動的に転送され、[11C]CO2が触媒としてニッケルを含浸させた分子篩に閉じ込められているかどうかを確認してください(11歳C]CO2トラップ)を室温で使用する。
- [11C]CO2トラップが最初にヘリウム(50 mL·min-1)で自動的にフラッシュされ、次に水素ガス(120 mL·min-1)でフラッシュされた場合に追跡します。次に、V27とV25が閉じられ、水素ガスを含む[11C]CO2が400°Cに加熱され、形成された[11 C]CH4がさらに予冷冷却された[11 C]CH4に輸送されていることを観察します。 トラップし、そこに閉じ込められました。
- V10が閉じているモニター、V9が開いた(ヨウ素柱に向かって)と[11 C]CH 4は[11 C]CH 4トラップを80°Cにゆっくりと加熱することによって再び解放され、ヘリウム流を介して循環ユニットに運ばれるV10(排気口)。さらに[11 C]CH4が循環部内で[11 C]CH3Iに変換され、約3分間続き、形成された[11 C]CH3 Iが[11C]に連続的に閉じ込められているかどうかをさらに確認します。CH3私はトラップします。
- 排気弁V16が開き、[11 C]CH3IトラップがV24を介してヘリウム(20 mL·min-1)の流れで90°Cに加熱されていることを確認してください。ここで、可能な副産物が除去され、V16が閉じられる。
- [11C]CH3Iが原子炉に放出される準備ができていることを確認する。
- 次の自動化プロセスを監視する:[11 C]CH3Iトラップが190°Cに加熱され、形成された[11 C]CH3Iが[11 C]CH3OTfトラップ(V32およびV33、まだ200° ) を介して反応器に放出されているかどうかを確認します。C)、連続ヘリウム流下のV7、およびV8(10〜25 mL·min-1、V24)。このプロセス中に、V21 と V23 (排気出口) を開く必要があります。
- 原子炉内の放射能量がもう上がっていないと、原子炉に放射能が到着したことを確認します。
- 次の自動化プロセスを監視し、必要に応じて手動による介入の準備を行う
- V23、V21、V8が自動的に閉じられ、反応混合物が75°Cに加熱されているかどうかを確認します。3分後、温度が35°C以下になるまで液体窒素で反応器が冷却されているかどうかを観察します。その後、反応混合物がV2を介して水の1.5 mLで消水されていることを確認してください。このプロセス中に、V21 と V23 (排気出口) を開く必要があります。
- V21とV23が閉じられ、反応混合物がHPLCループ(5 mL)に流体検出器を通過してHPLC注入弁に移されるかどうかを追跡します。反応混合物が自動的にHPLCカラムに注入されるかどうかを追跡します。
- クロマトグラムを観察し、ボタンピークスタートを介して手動で製品のピークをカット.製品のピーク信号が約8-10分の保持時間の後に約400 cpsを下回ったときにピーク終了を押します(流れ:5 mL·分-1、図3)。
- 追加のヘリウムストリームをオンにして、電球の空を加速します。
- 電球が空いているかどうかを監視し、廃棄物ボトルを観察する:V11、SPEカートリッジ、V12を介して廃棄物に電球が空にされているかどうかを確認し、V19と追加のヘリウムラインを介してヘリウムラインを使用して廃棄物に、製品がSPEカートリッジに保持されているかどうかを確認します。
- 電球が完全に空であることを確認します。
- SPE精製と製品転送の自動化プロセスの監視
- SPEカートリッジがV6、V11、V12を介して10 mLの水で洗浄されているかどうか、エタノールがV5、V11、V12を介して製品をPCVに溶出するかどうかを確認します。最後に、製品を希釈するためにV4、V11、V12を介してPCVに0.9%のNaClが追加されているかどうかを観察します。
- 製品溶液がV13と無菌フィルターを介してV20経由でヘリウムストリームで最終製品バイアルに転送されることを確認してください。
- 製品が完全に転送されたことを確認します。
3. 品質管理(QC)
注:放射性医薬品の品質管理には、以下のパラメータの測定が含まれます。
- 放射化学的純度とモル活性(RP-HPLC)
- 残留溶媒(ガスクロマトグラフィー、GC)
- オスモラリティ(蒸気圧浸透計)
- pH (pH メーター)
- γスペクトル/放射性核種純度(γ分光計)
- 半減期/放射性核種純度(用量キャリブレーター)
すべての物理化学パラメータは、製品のリリース前に決定され、値は定義された品質パラメータ範囲内である必要があります。
- 品質管理装置の準備
- 合成終了の30分前に調製を開始する。
- リードシールド容器に円錐状のバイアルを準備し、付属の針でシールドされた1 mLシリンジを準備します。
- HPLC用の水中SNAP-7941(10 μg·mL-1)の基準標準溶液を調製します。
- pHメーター、ガスクロマトグラフ、使用ガス、浸透度計、HPLCのすべてのコンポーネントをオンにします。
- HPLC制御ソフトウェアをオンにし、専用カラムと[11C]SNAP-7941のそれぞれの方法を選択します(移動相:(水/酢酸97.5/2.5 v/v;2.5 g.L-1酢酸アンモニウム;pH 3.5)/アセトニトリル70/30v;フロー:1mL-1)2つの測定値(標準および製品)を含むサンプルリストを書きます。列の条件付け方法を開始します。
- 10分のコンディショニング後にハミルトンシリンジでSNAP-7941リファレンス溶液の20 μLを注入し、分析実行を開始します。
- 注射後にアセトニトリルと水でハミルトン注射器を2回洗います。
- GC 制御ソフトウェアを起動し、サンプル リストを作成します。
- 品質管理の実行
- 合成終了後の製品の絶対放射性収量を測定し、品質管理のために準備された鉛シールドシリンジを使用して反応バイアルに製品の100 μLを転送します。
注:品質管理から取得したすべてのデータは、国の規制に従って文書化する必要があります。 - 分析HPLC:放射化学的純度と化学純度を測定し、その結果を直ちに細胞培養実験担当者に通知します。
- QCサンプルの40 μLを引き出し、HPLCに注入します。インジェクションバルブのアームを負荷から注入に移動して実行を開始します (図3)。
注:実行中(8分)、プロトコルの他の測定は、可能な限り多くの崩壊を避けるために行うことができます。 - クロマトグラムを開き、放射能チャネルのすべてのピークを統合します。製品の保持時間(5.0~7.0分)とリファレンス規格の保持時間を比較します。すべての統合ピークのパーセントで曲線の下の面積を比較します。製品のピークは、全統合領域(無線チャンネル)の95%以上(放射化学純度)でなければなりません。
- UVチャネルに信号を統合して、化学的純度を決定します。主な不純物は、通常、2.8〜3.5分の前駆体SNAP酸です。[natC]SNAP-7941の濃度は、積分後の較正曲線から算出される。μmol·mL-1でのSNAP-7941の濃度を計算し、次の式によってモル活性を決定します。
- QCサンプルの40 μLを引き出し、HPLCに注入します。インジェクションバルブのアームを負荷から注入に移動して実行を開始します (図3)。
- ガスクロマトグラフィーの場合は、専用ガラスバイアルに品質管理サンプルの20 μLを転送します。オートサンプラーに入れ、測定を開始します。測定が終了したら、クロマトグラムを開き、自動的に統合されたピークの数を書き留めます。サンプルには、410 ppm以上のアセトニトリルと10%エタノールを含んではならない。
- オスモラリティ:専用の中空に紙サンプルディスクを置き、サンプルの10 μLを適用します。浸透度を測定するには、閉じるボタンを押します。3分後、デバイスは190-500 mosm·kg-1の範囲でなければならない浸透性を表示します。
- pH: 電極を水で洗います。試料に電極を入れてpHを測定します。pH は 5.0 ~ 8.5 の範囲である必要があります。測定後に電極を再度洗浄し、基準pH溶液に電極を入れなさい。
- γスペクトル:QCサンプルをγ分光計に入れ、制御ソフトウェアを開き、測定を開始します。測定を停止し、511 keV (範囲 420 - 520 keV) である必要がある測定されたエネルギーを書き留める.ファイルメニューを開き、それぞれのバッチ番号でファイルを安全にします。専用ソフトウェアで保存されたスペクトルを思い出し、スペクトルを印刷します。
- 半減期:用量キャリブレーターを使用して、QCサンプルの活性を2回測定します。それぞれの時間を書き留め、指数の半減期を計算します。
- 合成終了後の製品の絶対放射性収量を測定し、品質管理のために準備された鉛シールドシリンジを使用して反応バイアルに製品の100 μLを転送します。
- リリース
- すべてのパラメータがテストされ、結果がオーストリア当局のガイドラインに従っている後、放射光放射レーサーを解放します。演算子は、データの正確性に署名する必要があります。
4. P-gpトランスポーターに対する相互作用の評価
- 細胞培養
- ワークベンチの層積層空気流(LAF)を開始し、作業を開始する前に少なくとも15分ベンチをきれいにします。
- LAFの無菌条件下で細胞培養培地をFCS(50 mL)の10%、抗生物質の0.5%(2.5mL)と、自動ピペッティング補助を使用して無菌容積ピペットと混合します。
- MDCKII-hMDR1およびMDCKII-WT細胞を解凍し、無菌条件(LAF)下での実験の10〜14日前にT75またはT175細胞培養フラスコで培養する。
- 翌日に培地を変更して、付着細胞やアポトーシス細胞をすべて除去します。
- 3日おきに培地を新鮮なもの(T75の場合は12mL、T175細胞培養フラスコでは23mL)に置き換える。
- 実験の時間スケジュールに従って細胞を新鮮なフラスコまたは細胞培養皿に80%の合流時に分割し、二重層の成長を避ける。
- 実験用細胞製剤
- 実験の2日前に細胞を分割し、細胞培養皿の斜め平面で2mL当たり2.5 x 105細胞の濃度で播種する(図4)。自動セルカウンター装置またはノイバウアー計数室を使用して、細胞をカウントし、適切な分割比を計算します。
- 実験の1日前に培地を取り出し、DPBSの4mLで培養皿上の細胞を洗浄し、新鮮な5mLの細胞培養培地を添加する。皿をインキュベーターに水平に置きます。
- 実験の前に少なくとも0.5hのDPBSで細胞を洗浄し、FBSフリー培地の2 mLで置き換えます。合流と細胞形態を顕微鏡で調べます。
- 3つの異なるセットアップで実験を行います。
- 4.2.3 で説明されているように、実験にはペトリ皿を使用します。
- 10 μM(±)-ベラパミル塩酸塩を用いた実験の前に0.5時間細胞を処理します。
- ベラパミルストック溶液の0.98 μL(DMSOで20.4 mM(±)-ベラパミル塩酸塩)を追加します。最終的なDMSO含有量は、治療中に≤0.05%である。
- 車両制御(DMSO)で0.5時間セルをインキュベートします。薬物治療に使用されるのと同じボリュームを使用してください。
- リアルタイムアッセイの実験(3つのセットアップすべてについて)
- デバイス、コンピュータの電源を入れ、正しく接続されていることを確認してから、制御ソフトウェアを開きます。
- [1 つのターゲット]オプションを選択し、テンプレートのロックを解除し、次の設定を調整します。
役職数: 2 (2)
検出時間(秒):3(3)
検出遅延時間 (2)
最初のフェーズの名前: ベースライン - 細胞培養皿を装置の傾斜支持部に挿入し、セルポールが底面にあり、細胞培養培地で覆っていることを確認する。
- [スタート]ボタンから実行を開始します。システムがファイルの保存を要求しています。ファイル名と保存パスを選択します。コントロールセンターがポップアップし、ベースライン測定が開始されます(細胞培養皿サポートが回転し始めます)。
- [その他のオプション]で選択します。
時間スケール: 分
核化物補正:カーボン-11 - グラフ(背景(背景)、ターゲット(青)、ターゲットマイナス背景(黒)のカーブの下にあるすべてのボックスをチェックします。
- 品質管理パラメータを取得する:合成終了時のモル活性[GBq.μmol-1]および活性濃度[MBq.mL-1]。
- 2 mLのアッセイ容積で[natC]SNAP-7941の15 nMのそれぞれのトレーサー容積を計算する。
- ピペットをそれぞれのボリュームに用意し、リードシールドで[11C]SNAP-7941製品のアリコートを用意します。
- コントロール センター ウィンドウで[実行を一時停止]をクリックします。皿の回転が止まり、タイトルが一時停止して次のフェーズが発生するまで待ちます。
- リアルタイムキネティックデバイスの蓋を開きます。カルチャーディッシュサポートを90°左に回します。計算されたトレーサーのボリュームを追加し、初期位置に戻します。次に、デバイスの蓋を閉じます。すぐに[続行]ボタンを押して実験を開始します。
- 一時停止を選択して 20 分後に実験を終了し、その後実行を終了します (サイド バーの[終了] を押します)。
- 統計ソフトウェアを用いてのデータ分析と処理
- リアルタイム制御ソフトウェアを開きます。[ファイルを開く]をクリックして、必要な運動学を呼び出します。動態はコントロールセンターウィンドウに示されています。
- キネティクスのエクスポート カーブを右クリックして選択します。生データを含むテキスト ファイルを保存します。統計プログラムを開き、リアルタイム実験の生データファイルを貼り付けます。
- 放射トレーサの追加時(x軸)から開始し(バックグラウンド測定を除く)、最大CPSのパーセント信号(毎秒カウント)に正規化します。
- すべての正規化されたデータを新しい GraphPad プリズム ファイルに読み込みます。
- 平均値と標準偏差を計算します。
- 得られたデータを、3つのセットアップすべてのトレーサー取り込みの偏差(増加率)を示すグラフとして図示する。
Representative Results
[11 C]SNAP-7941の完全に自動化された無線合成は、配合された製品の5.7 ±2.5 GBq(EOBで4.6±2.0%、14.9±5.9%、配合された製品のn=10)を得た。全体的な合成は約40分続き、ガス相法による[11 C]CH3OTfの調製に15分が必要であり、前駆体の放射線標識にはさらに5分が必要であり、続いて半準備の10分が続いた。Rp-HPLC精製およびC18カートリッジの固相抽出および製剤のための10分。その後、品質管理の責任者に小さなアリコート(約100~200μL)を納入し、すぐに使用可能なトレーサーを含む元の製品バイアルをリアルタイムキネティック解析の実験者に渡しました。
合成終了後10分以内に品質管理が完了した。モル活性は72±41 GBq/μmol(n= 10)の範囲にあり、放射化学的純度は常に> 95%であった。他のすべてのパラメータ(pH、浸透性、残留溶媒)は、放出基準を満たした。リアルタイム運動アッセイでは、(A)処理および非処理(車両)MDCKII-WT細胞、(B)非処理または処理された車両MDCKII-hMDR1細胞および(C)リアルタイム前にブロッキングを伴う後者の細胞株の3つの異なる実験セットアップが選択された。(±)-ベラパミルを用いたトランスポーターの運動アッセイ。ワイルドタイプ細胞株MDCKII-WT(P-gp非発現)とMDCKII-hMDR1(P-gp発現)に適用すると、野生型細胞株への蓄積が速いのに対し、蓄積は認められなかったため、異なる運動挙動を示す。MDCKII-hMDR1 セル用。しかし、MDCKII-hMDR1細胞のP-gp流出トランスポーターを(±)-ベラパミルで遮断すると、野生型細胞株に対して既に見られるのと同等のリアルタイム運動性が生み出された(図5)。
図 1: 作業フローの概要。[11C]SNAP-7941のリアルタイム運動測定の放射線合成、品質管理、および性能の作業フロー。黒い矢印は、放射能の輸送方法を示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:自動シンセサイザーの放射合成スキーム。自動シンセサイザーのスイッチング回路は、[11 C]CH3 I/[11C]CH3OTf産生のための循環ユニットから始まり、前駆体溶液およびSPE精製に活性を導入するための反応器(SPE=固体位相抽出;PCV = 製品コレクションバイアル)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:[11C]SNAP-7841の完全自動放射合成の代表的なクロマトグラム。半準備RP-HPLCクロマトグラムは、下部に精製した後の上部と分析用に示されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:リアルタイム実験のための細胞培養皿調製ステップ1は、細胞タイプおよびその増殖速度に応じて2.5 x 105から1 x 106の播種を含む。続いて、培養皿は斜め平面(約30〜45°)に配置される。従って、供給された金属装置または細胞培養皿の蓋は、皿の傾斜位置を安定させるためにインキュベーターに使用することができる。翌日(24時間)に皿を水平に調整し、細胞表面を完全に覆う新鮮な細胞培養培地を添加する。実験当日、細胞生存率と合流性を調べる。実験プロトコルによれば、細胞をDPBSで洗浄し、培地を無血清培地(2mL)に置き換え、培養皿を実験開始まで斜め位置に再配置する。今後、細胞は阻害剤または車両で処理することができる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:[11 C]SNAP-7941のリアルタイム運動測定。[11C]SNAP-7941の代表的なリアルタイム運動学は、MDCKII-WT細胞を使用して3つの異なるセットアップで示されています。MDCKII-hMDR1細胞は、閉塞のないP-gp阻害剤およびMDCKII-hMDR1細胞として(±)-ベラパミルを前止しした。Y軸は、未処理または車両処理MDCKII-MDR1細胞の結果と比較して、前ブロックされたMDCKII-hMDR1およびWT細胞の増加率を示す(取り込みなし、0%)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
[11C]SNAP-7941の無線合成は、市販の合成モジュール上に確立された。準備手順を完全に自動化する可能性があるため、放射線合成は信頼性が高く、オペレータの放射線保護に関する改善が実現しました。シンセサイザーの調製は、特にモル活性の面で、放射線トレーサーの品質に大きな影響を与えます。したがって、常に不活性条件下(例えば、ヘリウム雰囲気)下で作業し、反応容器の前に位置するすべてのラインをフラッシュすることが不可欠である(標的線、[11C]CH3 I I生産サイクルおよび反応器)。また、合成開始前にそれぞれのトラップやオーブンを加熱して水分や大気中の炭素を除去すると、モル活性が有利に増加する。特にAgOTfカラムは、黒鉛炭素を含浸させ、湿度に非常に敏感です。水分の任意の任意の量であっても[11 C]CH3Iから[11 C]CH3OTfへの変換を妨げる。合成を開始する前に、[11 C]CO2トラップと[11 C]CH3Iトラップは、その後のトラップを可能にするために再び室温まで冷却する必要があります。 さらに、合成を開始する直前に前駆体を溶解し、前駆体溶液に直接塩基を加えるのが推奨される。
カーボン11放射レーサーの品質管理は、連続的かつ高速なワークフローのために合理的に設計する必要があります。しかし、細胞培養研究の最も重要なパラメータは、有効な結果を得るために放射化学的純度とモル活性です。モル活性の正しい評価は、堅牢な分析HPLC法を必要とし、較正曲線は最終製品の濃度範囲をカバーする必要があります。放射線トレーサーにとって難しいのは、放射線合成時に生成される少量の定量(LOQ)の限界を超える濃度を達成することです。したがって、当技術技術は、受容体飽和を回避するための高いモル活性と非放射性信号を定量することができる十分な濃度との間のバランスを見出す。
[11C ]SNAP-7941は、急速な流出による未処理または車両処理MDCKII-hMDR1細胞に蓄積が認められなかったため、ヒトP-gpトランスポーターの強力な基板であることが確認された。対照的に、両方の実験セットアップ(MDCKII-WTまたは前ブロックMDCKII-hMDR1細胞)は、同様の結果([11C]SNAP-7941の蓄積)を提供し、このインビトロアッセイの汎用性を支持した。MDCKII-hMDR1細胞は、回転細胞培養皿によって引き起こされるせん断ストレスに対する安定したトランスフェクション、急速な成長および持続性のためにリガンドトレーサー実験に非常に適しています。したがって、ラットおよびマウス脳における[11 C]SNAP-7941の取り込みの欠如は、P-gpトランスポーターを介した流出によって引き起こされる可能性がある。ヒト多剤耐性タンパク質1(hMDR-1、P-gp)を有するイヌ腎細胞のトランスフェクションにより、ヒトにおける流出トランスポーター結合に対するこの方法の予測値は高く、将来の臨床応用の観点から有利である。しかし、これまでのところ、他の流出トランスポーターに対する選択性は検証されなかった。したがって、他の細胞株を使用することができ、乳癌耐性タンパク質(BCRP)または多重耐性タンパク質-1(MRP-1)として異なる顕著な流出トランスポーターを発現し、これらのトランスポーターに対する相互作用を研究する。この方法は、古典的な蓄積または輸送アッセイと比較して非常に簡単であり、即座に定性的な結果を与える。また、この技術は、間接定量(主に変位)を用いた従来の実験とは対照的に、PETトレーサーとターゲットとの直接的な相互作用をリアルタイムで評価できるという最大の利点があります。さらに、リアルタイムの放射性アッセイソフトウェアは、実験的な柔軟性(例えば、核化崩壊補正、測定時間と位置など)を提供し、したがって、ユーザーのための高い自由度を提供します。一方、この方法の制限には、一度に1つのセル皿しか測定できないため、サンプルスループットが低い。さらに、いくつかの他の技術的および運用上の問題を考慮する必要があります:記載された技術は、バックグラウンド放射線に非常に敏感です。したがって、放射線源は距離を保ち、実験の前に背景測定に重点を置くべきである。室温よりも高い温度での実験に関するもう一つの問題は、傾斜支持体の加熱である:細胞培養培地の蒸発が検出器に影響を与える可能性がある。加熱の代わりに、装置全体がインキュベーターに入れられるのが好ましい。また、この方法は付着細胞株に限定される。細胞培養皿の回転を通じて、せん断ストレス感受性細胞が皿から剥離し、無効な結果を引き起こす可能性があります。
それにもかかわらず、実験者がこれらのマイナーな欠点に注意を払う場合、この方法は前臨床PET-トレーサーの運動挙動の分析のための迅速かつ信頼性の高い結果を提供する。
Disclosures
何も開示することはない
Acknowledgments
この研究は、オーストリア科学基金(FWF P26502-B24、M.ミッターハウザー)によって支援されました。T.ゼンツとA.クルカルの技術サポートに感謝しています。さらに、我々は、前駆体を配布するためのAgOTfとH.スプレイツァーの準備のためにK.Pallitchに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941 | |||
| Ni catalyst | Shimadzu, Kyoto, Japan | Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh | |
| Iodine | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04761.0100 | |
| Acetonitrile | Merck, Darmstadt, Germany | for DNA synthesis, < 10 ppm H2O | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
| Ammonium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | ||
| Acetic acid | Merck, Darmstadt, Germany | glacial | |
| Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 96% | |
| NaCl | B. Braun, Melsungen, Germany | 0.9% | |
| Tetrabutylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
| SPE cartridge | Waters, Milford, MA, USA | SepPak C18plus | |
| Semi-preparative RP-HPLC column | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm | |
| Precolumn | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm | |
| Precursor | University of Vienna, Austria | SNAP-acid | |
| Reference compound | University of Vienna, Austria | SNAP-7941 | |
| Silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
| Graphpa GC | Alltech, Deerfield, IL, USA | 80/100 mesh | |
| PET trace 860 cyclotron | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
| [11C]CO2 high pressure target | Air Liquide, Vienna, Austria | ||
| TRACERlabFX2 C | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
| N2 + 1% O2 | Air Liquide, Vienna, Austria | Target gas | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941. | |||
| Merck Hitachi LaChrom, L-7100 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria) | HPLC pump | |
| Merck Hitachi, L7400 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan) | UV-detector | |
| NaI-radiodetector | Raytest (Straubenhardt, Germany) | NaI-radiodetector | |
| Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm | Merck (Darmstadt, Germany) | HPLC column | |
| 430-GC | Bruker (Bremen, Germany) | Gas chromatograph | |
| Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm | SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia) | Gas capillary | |
| Wesco, osmometer Vapro 5600 | Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria) | Osmometer | |
| g-spectrometer | g-spectrometer | ||
| Gas chromatography controlling software | VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A) | Galaxie Version 1.9.302.952 | |
| Gamma spectrometer controlling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Maestro for windows Version 6.06 | |
| Gamma spectrum recalling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Winplots version 3.21 | |
| HPLC controlling software | Raytest (Straubenhardt, Germany) | Gina Star Version 5.9 | |
| inolab 740 | WTW (Weilheim, Germany) | pH meter | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941. | |||
| Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1) | |
| Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Wildtype (WT) | |
| DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 15140 | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
| In vitro experiments | |||
| DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
| (±)-Verapamil hydrochloride | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | ||
| DMSO | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | 276855-100 mL | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
| Sterile disposable plastic pipettes | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Sterilin, 5 mL – 25 mL | |
| Sterile pipette tips | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL | |
| Cell culture flasks | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175 | |
| LigandTracer control Version 2.2.2 | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
| LigandTracer Yellow | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
| LigandTracer White | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
| GraphPad Prism 6.0 | GraphPad Software, Inc. | ||
| Handheld automated Cell Counter | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter (Cat.No. PHC00000) | |
| Cell Counter Sensors | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050) |
References
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![<sup>[11</sup>C]SNAP-7941の自動合成とリアルタイム運動評価の技術的側面](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/59557.jpg)
