Teknisk aspekt av den automatiserade syntesen och real tids kinetisk utvärdering av [¹¹C] SNAP-7941

Summary

Här representerar vi ett protokoll för den helautomatiserade radiomärkningen av [¹¹C] SNAP-7941 och analysen av realtids kinetiken hos detta PET-Tracer på P-gp-uttryck och icke-uttryckande celler.

Abstract

Positron emissions tomografi (PET) är en viktig molekylär avbildning teknik som ger insikter i vägar och använda specifika riktade radioligander för in vivo utredningar. Inom detta protokoll beskrivs en robust och tillförlitlig fjärrstyrd radiosyntes av [¹¹C] SNAP-7941, en antagonist till melanin-koncentrationsinreceptorn 1. Radiosyntesen börjar med cyklotron produceras [¹¹c] Co₂ som därefter ytterligare reagerat via en gas-fasövergång till [¹¹c] CH₃OTf. Därefter introduceras denna reaktiva intermediär till föregångaren lösningen och bildar respektive radiotracer. Kemisk såväl som den radiokemiska renhet bestäms med hjälp av RP-HPLC, rutinmässigt genomförs i den radioaktiva läkemedel kvalitetskontrollprocessen. Dessutom är molar aktiviteten beräknas eftersom det är en nödvändighet för följande realtids kinetiska undersökningar. Dessutom, [¹¹C] SNAP-7941 appliceras på MDCKII-WT och Mdckii-hMDR1 celler för att utvärdera effekten av p-glykoprotein (p-GP) uttryck på cellackumulering. Av denna anledning, p-GP uttrycker cellinjer (mdckii-hMDR1) används antingen utan eller med blockering före experiment med hjälp av p-gp substrat (±)-verapamil och resultaten jämförs med de som observerats för vildtyp celler. Den övergripande experimentella metoden visar vikten av en exakt Tidshantering som är nödvändig för varje preklinisk och klinisk studie med hjälp av PET-spår som radiomärkts med kortlivade nuklider, såsom kol-11 (halveringstid: 20 min).

Introduction

[¹¹C] SNAP-7941 utvecklades som den första positron emissions tomografi (PET)-Tracer inriktning melanin-koncentration hormonreceptor 1 (MCHR1)-en receptor huvudsakligen involverad i den centrala regleringen av aptit och födointag¹. Carbon-11 märkning av Snap-7941, en väl karaktäriserad MCHR1 antagonist, gav den autentiska PET-Tracer^2,3,4,5. Men helt automatiserad radio syntes är mycket utmanande när det gäller tid effektivitet och reproducerbarhet med den kortlivade radionukliden Carbon-11 erbjuder en halveringstid på 20 min⁶. Den totala syntes tiden bör hållas till ett minimum, och som en tumregel bör inte överstiga 2-3 halveringstider (dvs., cirka 40-60 min för kol-11)⁷. I synnerhet måste syntes procedurer för radiotracers riktade mot receptorsystem med låg uttrycks täthet i stor utsträckning optimeras för att erhålla tillräcklig avkastning och därmed hög molar aktivitet⁸. Den syntetiska strategin följer ofta radionuklidproduktionen inom en cyklotron och frisättningen av [¹¹C] Co₂ till syntet. Där, [¹¹c] Co₂ reduceras först till [¹¹c] CH₄ och därefter reagerade med jod för att ge [¹¹c] CH₃i via gas-fas metod^9,10. Ytterligare behandling med silver triflate avkastning [¹¹C] CH₃OTf direkt on-line. Efteråt introduceras denna reaktiva kol-11-märkta intermediär i en lösning som innehåller föregångaren molekylen. En automatiserad radiosyntes innebär dessutom en reningsprocess med semi-Preparative RP-HPLC inklusive efterföljande formulering av produkten lämpar sig för prekliniska och kliniska studier.

Oberoende av halveringstiden för radionukliden och tidsinsatsen för radiosyntesen, är farmakokinetiken för ett radioaktivt läkemedel den mest kritiska delen som ska utvärderas under utvecklingen av PET-Tracer. När det gäller neuroimaging, hjärnan inträde av PET-Tracer är den viktigaste förutsättningen. Emellertid, blod-hjärnbarriären (BBB), en "säkerhet gränsen" av hjärnan, uttrycker mycket effluxtransportörer som kan lasta små molekyler (t. ex., PET-tracers) och effektivt hämma deras tillämplighet.

En stor nackdel under preklinisk utvärdering är oväntade interaktioner mot dessa effluxtransportörer, som ofta är okända i in vitro-experiment och leder till fel på PET-Tracer in vivo, som observerats för [¹¹C] SNAP-7941. μPET Imaging hos råttor visade låg hjärn ansamling, vilket ökade dramatiskt efter administrering av P-gp-hämmare tariquidar¹¹. Dessa data föreslog att [¹¹C] SNAP-7941 är ett substrat för detta effluxtransportörsystem som hindrar ligand-bindning till centrala MCHR1. Tyvärr finns det fortfarande en brist på adekvata in vitro-modeller som möjliggör förutsägelse av BBB penetration i ett tidigt skede av spår utveckling.

Här beskriver vi den automatiserade syntesen av [¹¹C] SNAP-7941 med hjälp av en synthesizer för kol-11-metyleringar. Tyngdpunkten i detta arbete är att ge en överblick över hur man organiserar en på varandra följande experimentella tillvägagångssätt, inklusive automatiserad syntes, kvalitetskontroll samt successiva in vitro-utvärdering med mycket kortlivade nuklid Carbon-11.

Först beskrivs de viktigaste stegen för en lyckad radiosyntes med minimal tidsförbrukning och maximal avkastning. Därefter inrättas ett tillförlitligt kvalitetskontroll förfarande som gör radiotracer tillgänglig för potentiella kliniska studier och som uppfyller kriterierna i Europeiska farmakopén¹². Kvantifiering av molar koncentrationen och beräkning av respektive molar aktivitet är ett väsentligt krav för de successiva kinetiska mätningarna.

Slutligen presenteras en ny och enkel in vitro-metod som utvärderar [¹¹C] Snap-7941s interaktioner mot effluxtransportören, P-gp (hMDR1). Den föreslagna kinetiska modellen använder en lätt att hantera enhet som möjliggör en omedelbar data tolkning och kräver minimal cellkultur ansträngning¹³.

Protocol

FÖRSIKTIGHET: i följande protokoll är flera steg inblandade som kräver hantering och manipulation av radioaktivitet. Det är viktigt att varje steg är i samförstånd med Strålsäkerhets avdelningen vid Institutet och respektive nationell lagstiftande församling. Det är obligatoriskt att minimera exponeringen för joniserande strålning för de aktörer som berörs efter ALARA-principen ("så låg som rimligen möjligt").

1. tid förvaltning och planering av experimentet

Obs: den korta halveringstiden för Carbon-11 kräver en noggrann Tidshantering för att minimera förlust av radioaktivitet (figur 1). Det är viktigt att varje person som berörs känner till deras ansvarsområde och tidspunkten för respektive åtgärd. För att skapa ett realtids kinetiska experiment på [¹¹C] SNAP-7941 är cirka fyra personer nödvändiga för en smidig process.

1. Organisera en producent för [¹¹C] SNAP-7941.
2. Informera den kvalitetskontroll operatör som utför specifikationen utvärdering, beräkning av masskoncentration och molar aktivitet av syntes starttiden.
3. Håll realtid Kinetic försöksledaren redo för utspädning beräkning och utföra experimentet.
4. Instruera löparen att överföra radioaktiviteten till respektive plats vid respektive tidpunkt.

2. automatiserad syntes av [¹¹C] SNAP-7941 för preklinisk användning

1. Beredning av syntet (figur 2).
   1. Slå på syntet, nödvändiga tekniska gaser (helium och väte) och synthesizer kontrollprogramvara Tracerlab. Välj respektive syntes sekvens Snap.
   2. Tvätta v1-v3 en gång med vatten och två gånger med aceton via reaktorn och HPLC ventilen antingen på Last eller injicera position i slingan avfallsflaska.
   3. Torka alla tillhörande ledningar in i och ut ur reaktorn via insprutnings ventilen med ett kontinuerligt helium flöde aktiverat via V18.
   4. Värm [¹¹c] CH₃jag fälla samt [¹¹c] CH₃OTf-fällan under en helium ström av 100 ml · min^-1 upp till 200 ° c via v24, v25, v29, v15, v9, V17 och V32/v33 med fristående reaktor.
   5. Kontrollera samma väg för läckage (med ansluten reaktor) med ett helium flöde på 100 mL · min^-1. Täthet garanteras när flödet sjunker under 4 mL · min^-1.
   6. Slå på HPLC-pumpen (5-10 mL · min^-1) och tvätta HPLC-ledningarna och insprutnings ventilen med acetonitril/water (50/50, v/v) samt HPLC-ledningarna med HPLC-vätskan via v14 in i glödlampan.
   7. Töm glödlampan via V11 och V12 i avfallsflaskan med helium ström via v19. Tvätta respektive linje med vatten från V6 igen via V11 och V12 med en helium ström via V18.
   8. Tvätta V5 med etanol och v4 med vatten via V11 och V12 i produkt samlings flaskan (PCV) med hjälp av en helium ström via V18, töm sedan PCV via V13 in i avfallsflaskan med en helium ström via v20.
   9. Stäng av HPLC-pumpen, Byt till vätskan för syntesen ((vattenhaltigt ammoniumacetat (2,5 g · L^-1)/ättiksyra 97,5/2.5 v/v; pH 3.5)/acetonitril 75/25 v/v), fäst den semi-Preparative HPLC kolonn och jämvikt kolonnen (flöde av 5 ml · min^-1).
   10. Fyll i reagenser för syntes och rening: 1,5 mL vatten (v2), 4,5 mL av 0,9% NaCl (v4), 0,5 mL av 96% etanol (V5), 10 mL vatten (V6), och 90 mL vatten (glödlampa).
   11. Anslut en ny slinga avfallsflaska; en produkt injektionsflaska (märkt och försedd med luftnings nål) till V13 och flytande kväve.
   12. Förutsättning en SPE (solid Phase extraktion) patron med 10 mL 96% etanol och 20 mL vatten och bifoga den mellan V11 och V12.
   13. Starta Pre-Run sekvens 20 min innan syntesen, bestående av upphettning av [¹¹C] Co₂ fälla till 400 ° c och spola fällan med en helium ström av 50 ml · min^-1via V27 (2 min). Sedan, pre-spola [¹¹C] Co₂ fällan för 3 min med vätegas (120 ml · min^-1) och slutligen svalna till under 40 ° c.
   14. Lös 1 mg föregångare i 400 μL acetonitril (för DNA-syntes, < 10 H₂O), överför lösningen till reaktionen och tillsätt 5,5 μl tbah (264 mg · ml^-1 i metanol). Montera reaktorn i sin respektive position.
   15. Stäng den heta cellen och slå på under trycket av hot cell.
   16. Bekräfta starten av kylprocessen av CH₄ fällan med flytande kväve till-75 ° c.
   17. Frigör radioaktiviteten när temperaturen är nådd.
2. Cyclotron produktion av [¹¹C] Co₂
   Anmärkning: steg 2.2.1-2.2.4 utförs samtidigt med beredningen av radiosyntes-modulen (se även figur 1).
   1. Slå på magneten av Cyclotron.
   2. Välj mål ¹¹C-Co₂ och starta strålen 65 μA.
   3. Bekräfta början av bestrålningen genom att trycka på knappen Starta bestrålning
   4. Stoppa strålen och bekräfta frisläppandet av radioaktivitet i syntet genom att trycka på knappen leverans, efter önskad mängd radioaktivitet uppnås (ca. 120 GBq efter 30 min).
3. Utförandet av den fullständigt automatiserade radiosyntesen
   1. Bekräfta att systemet är redo att ta emot radioaktiviteten och starta den automatiserade processen
   2. Övervaka följande automatiserade process.
      1. Kontrollera om [¹¹c] Co₂ automatiskt överförs från cyklotron till syntes enheten via V26 (ca 4 min) och att [¹¹c] Co₂ fastnar på den molekylsikt som impregnerats med nickel som katalysator ([ ^elva C] CO₂ trap) vid rumstemperatur.
      2. Spår om [¹¹C] Co₂ fällan automatiskt spolas först med helium (50 ml · min^-1) och sedan med vätegas (120 ml · min^-1). Observera sedan att V27 och v25 är stängda och fångade [¹¹c] Co₂ inklusive vätgasen värms till 400 ° c och att den bildade [¹¹c] CH₄ ytterligare transporteras till den förkylda [¹¹c] CH₄ fälla och fastna där.
      3. Övervaka att v10 är stängd, v9 öppnas (mot jodkolonnen) och [¹¹c] CH₄ släpps igen genom upphettning av [¹¹c] CH₄ fälla sakta till 80 ° c och transporteras till cirkulations enheten med en helium ström via V10 (avgas utgång). Och ytterligare kontrollera om [¹¹c] CH₄ omvandlas till [¹¹c] CH₃i inom cirkulations enheten, som varar ca 3 min och bildade [¹¹c] CH₃jag är ständigt fångade på [¹¹c] CH₃jag fälla.
      4. Se till att avgas ventilen v16 öppnas och [¹¹C] CH₃i fällan värms till 90 ° c med en ström av helium (20 ml · min^-1) via v24. Härmed, eventuella biprodukter tas bort och sedan v16 är stängd.
   3. Bekräfta att [¹¹C] CH₃i är redo att släppas ut i reaktorn.
   4. Övervaka följande automatiserade process: Kontrollera om [¹¹c] CH₃i-fällan värms upp till 190 ° c och den bildade [¹¹c] CH₃i släpps ut i reaktorn via [¹¹c] ch₃OTf-fällan (V32 och v33, fortfarande på 200 ° C), v7 och V8 under en kontinuerlig helium ström (10-25 mL · min^-1, v24). Under denna process måste v21 och v23 (avgas utgång) vara öppna.
   5. Bekräfta att radioaktiviteten anlände till reaktorn, när mängden radioaktivitet i reaktorn inte höjs längre.
   6. Övervaka följande automatiserade process och förbereda för manuella ingrepp, om nödvändigt
      1. Kontrollera om V23, v21, och V8 stängs automatiskt och reaktionsblandningen värms till 75 ° c. Efter 3 min, observera om reaktorn kyls med flytande kväve tills temperaturen är under 35 ° c. Därefter, se till att reaktionsblandningen är släckt med 1,5 mL vatten via v2. Under denna process måste v21 och v23 (avgas utgång) vara öppna.
      2. Låt om v21 och V23 är stängda och reaktionsblandningen överförs till HPLC-injektionsventilen genom att passera genom en vätske detektor i HPLC-slingan (5 mL). Om reaktionsblandningen automatiskt injiceras på HPLC-kolonnen.
   7. Observera kromatogrammet och klipp ut produkt toppen manuellt via knappens topp start. Tryck på Peak end när produktens topp signal sjunker under cirka 400 CPS efter en retentionstid på cirka 8-10 min (flöde: 5 ml · min^-1, figur 3).
   8. Slå på en extra helium ström för att påskynda lampans tömning.
   9. Övervaka om glödlampan tömmer och observera avfallsflaskan: Kontrollera om glödlampan töms via V11, spe-kassetten och V12 i avfallet med en helium ström via v19 och en extra helium linje och om produkten behåller på spe-kassetten.
   10. Kontrollera att lampan är helt tom.
   11. Övervakning av den automatiserade processen för SPE-rening och produkt överföring
       1. Kontrollera om SPE-kassetten tvättas med 10 mL vatten via V6, V11 och V12 i avfallet och om etanol eluter produkten till PCV via V5, V11 och V12. Slutligen, observera om 0,9% NaCl läggs till i PCV via v4, V11 och V12 för att späda ut produkten.
       2. Se till att produkten lösningen överförs via V13 och ett sterilt filter i den slutliga produkten injektionsflaska med en helium ström via v20.
   12. Kontrollera att produkten har överförts helt.

3. kvalitetskontroll (QC)

Anmärkning: kvalitetskontroll av radiofarmaka inkluderar mätning av följande parametrar:

• Radiokemisk renhet och molar aktivitet (RP-HPLC)
• Övriga lösningsmedel (gaskromatografi, GC)
• Osmolalitet (ångtryck Osmometer)
• pH (pH-mätare)
• γ-spektrum/radionuklidrenhet (γ-spektrometer)
• Halveringstid/radionuklidrenhet (doskalibrator)

Alla fysikalisk-kemiska parametrar bestäms före frisläppandet av produkten och värdena måste vara i det definierade intervallet för kvalitets parameter.

1. Beredning av utrustning för kvalitetskontroll
   1. Starta beredningen 30 min före slutet av syntesen.
   2. Förbered en konisk injektionsflaska i en bly-skärmad behållare och en avskärmad 1 mL spruta med en fastsatt nål.
   3. Bered en referensstandard lösning av SNAP-7941 (10 μg · mL^-1) i vatten för HPLC.
   4. Slå på pH-mätaren, gaskromatografen och de använda gaserna, osmometern och alla komponenter i HPLC.
   5. Slå på HPLC-kontrollprogramvaran och välj den dedikerade kolumnen och respektive metod för [¹¹C] SNAP-7941 (mobil fas: (vatten/ättiksyra 97,5/2,5 v/v; 2,5 g. L^-1 ammoniumacetat; pH 3.5)/acetonitril 70/30 v/v; flöde: 1 ml · min ^-1) och skriva en prov lista med två mätningar (standard och produkt). Starta metoden för konditionering av kolumnen.
   6. Injicera 20 μL av referenslösningen SNAP-7941 med en Hamilton-spruta efter 10 min konditionering och starta analys körningen.
   7. Tvätta Hamilton sprutan två gånger med acetonitril och vatten efter injektion.
   8. Starta GC-kontrollprogramvaran och skriv exempel listan.
2. Utföra kvalitetskontroll
   1. Mät den absoluta radioaktiva avkastningen av produkten efter syntes slutet och överför 100 μL av produkten till en reaktions flaska med den beredda blyavskärmade sprutan för kvalitetskontroll.
      Obs: alla data som erhålls från kvalitetskontrollen måste dokumenteras i enlighet med de nationella föreskrifterna.
   2. Analytisk HPLC: Mät den radiokemiska renhet och kemisk renhet och informera den person som ansvarar för cellodling experiment omedelbart av resultaten.
      1. Dra 40 μL av QC-provet och injicera till HPLC. Starta körningen genom att flytta injektions ventilens arm från lasten till injektionen ( figur 3).
         Obs: under loppet (8 min), andra mätningar av protokollet kan utföras för att undvika så mycket förfall som möjligt.
      2. Öppna kromatogrammet och integrera alla toppar i radio aktivitets kanalen. Jämför retentionstiden för produkten (5.0-7.0 min) med retentionstiden för referensstandarden. Jämför arean under kurvan i procent av alla integrerade toppar. Produkt toppen måste vara mer än 95% (radiokemisk renhet) av de totala integrerade områdena (radiokanal).
      3. Integrera signalen i UV-kanalen för att avgöra kemisk renhet. Den huvudsakliga förorening är vanligtvis föregångaren SNAP Acid på 2,8-3.5 min. Koncentrationen av [^NATC] SNAP-7941 beräknas utifrån kalibreringskurvan efter integrationen. Beräkna koncentrationen av SNAP-7941 i μmol · mL^-1 och bestäm molar aktiviteten med hjälp av följande ekvation:
         
   3. För gaskromatografi, överför 20 μL av kvalitetskontroll provet i en särskild injektionsflaska av glas. Placera den i autosampler och starta mätningen. När mätningen är klar, öppna kromatogrammet och anteckna antalet automatiskt integrerade toppar. Provet får inte innehålla mer än 410 ppm acetonitril och 10% etanol.
   4. Osmolalitet: Lägg en pappersprov skiva på den dedikerade fördjupningen och applicera 10 μL av provet. Tryck på stängnings knappen för att mäta osmolalitet. Efter 3 min, enheten visar osmolalitet som måste vara i en rad 190-500 mOsm · kg^-1.
   5. pH: tvätta elektroden med vatten. Mät pH-värdet genom att placera elektroden i provet. PH måste vara i en räckvidd på 5.0-8.5. Tvätta elektroden igen efter mätningen och placera elektroden i referens pH-lösningen.
   6. γ-spektrum: sätt QC-provet i γ-spektrometern, öppna den kontrollerande programvaran och starta mätningen. Stoppa mätningen och anteckna uppmätt energi som måste vara 511 keV (Range 420-520 keV). Öppna Arkiv-menyn och säkra filen med respektive batchnummer. Återkalla det sparade spektrumet i den dedikerade programvaran och skriv ut spektrumet.
   7. Halveringstid: Mät aktiviteten hos QC-provet två gånger med hjälp av doskalibratorn. Anteckna respektive tider och beräkna halveringstiden för exponentiell.
3. Släppa
   1. När alla parametrar har testats och resultaten är förenliga med de österrikiska myndigheternas riktlinjer, släpp radiotracer. Operatören måste underteckna uppgifternas riktighet.

4. utvärdering av interaktioner mot P-gp-transportören

1. Cell kultur
   1. Starta arbetsbänkens laminärt luftflöde (LAF) och rengör bänken minst 15 min innan du börjar arbeta.
   2. Blanda cell odlingsmediet under sterila förhållanden i LAF med 10% av FCS (50 mL) och 0,5% av antibiotika (2,5 mL) med en steril volumetrisk pipett med hjälp av ett automatiserat pipettstöd.
   3. Tina MDCKII-hMDR1 och MDCKII-WT-celler och odla i en T75 eller T175 cell odlings kolv 10-14 dagar före experiment under aseptiska förhållanden (LAF).
   4. Ändra mediet på nästa dag för att ta bort alla inte anhängare och apoptotiska celler.
   5. Ersätt var tredje dag mediet med färskt (12 mL för T75 och 23 mL för T175 cell odlings kol ven).
   6. Dela upp cellerna enligt tidsschemat för experiment till färska kolvar eller till cellkultur rätter på ett sammanflödet av 80% för att undvika att lipidens växer.
2. Cell förberedelse för experiment
   1. Dela upp cellerna två dagar före experiment och utsäde i en koncentration av 2,5 x 10⁵ celler per 2 ml i ett sned plan av en cellkultur maträtt (figur 4). Använd en automatisk cell räknare eller en Neubauer-räknekammare för att räkna cellerna och beräkna lämpligt klyvförhållande.
   2. Ta bort mediet en dag före experiment, tvätta cellerna på odlings skålen med 4 mL DPBS och tillsätt färsk 5 mL cellodlingsmedium. Placera skålen horisontellt i inkubatorn.
   3. Tvätta cellerna med DPBS minst 0,5 h före experiment och Ersätt med 2 mL FBS fritt medium. Undersök sammanflödet och cellmorfologin med ett mikroskop.
3. Utföra experimenten i tre olika uppställningar.
   1. Använd petriskål för experimenten som beskrivs i 4.2.3.
   2. Behandla cellerna för 0,5 h före experiment med 10 μM (±)-verapamil hydroklorid.
   3. Tillsätt 0,98 μL verapamil stamlösning (20,4 mM (±)-verapamil hydroklorid i DMSO). Slutliga DMSO-halten är ≤ 0,05% under behandlingen.
   4. Inkubera cellerna för 0,5 h med fordonets kontroll (DMSO). Använd samma volym som används för läkemedelsbehandling.
4. Experiment av realtids analysen (för alla tre uppställningar)
   1. Slå på enheten, datorn och kontrollera att de är korrekt anslutna och öppna sedan kontrollprogram varan.
   2. Välj alternativet ett mål , Lås upp mallen och justera följande inställning:
      Antal positioner: 2 (två)
      Detekteringstid (SEK): 3 (tre)
      Fördröjningstid (er) för detektering: 2 (två)
      Den första fasens namn: baslinje
   3. Sätt in cellkultur skålen i lutande stöd av anordningen, att se till att cell Polen är på undersidan och täckt med cell odlingssubstrat.
   4. Starta knappen Kör via Start . Systemet ber att spara filen. Välj ett filnamn och en sparväg. Kontrollcenter dyker upp och baslinjen mätningen börjar (cellkultur skålen stöd börjar rotera).
   5. Välj under övriga alternativ:
      Tidsskala: minuter
      Nuclide korrigering: Carbon-11
   6. Markera alla rutor under kurvor i diagram (bakgrund (röd), mål (blått) och mål minus bakgrund (svart)).
   7. Få kvalitetskontroll parametrar: molar Activity [GBq. μmol^-1] och aktivitetskoncentration [MBq.ml^-1] i slutet av syntesen.
   8. Beräkna respektive spår volym för 15 nM i [^NATC] SNAP-7941 i testvolymen på 2 ml.
      
      
   9. Bered pipetten till respektive volym och en alikvot av [¹¹C] SNAP-7941 produkten i en bly avskärmning.
   10. Klicka på pausa körning i fönstret Kontrollcenter. Vänta tills diskrotation stoppas och sidofältet med titeln pausad och nästa fas inträffar.
   11. Öppna locket på realtids kinetisk enhet. Vrid stöd för kultur skålen 90 ° till vänster. Lägg till den beräknade volymen spårämne och Vrid tillbaka till initial position. Stäng sedan locket på enheten. Tryck omedelbart på knappen Fortsätt för att starta experimentet.
   12. Avsluta experimentet efter 20 minuter genom att välja pausa och därefter avsluta körningen (tryck på End Run i sidofältet).
5. Data analys och bearbetning med hjälp av en statistisk programvara
   1. Öppna programvaran för realtidskontroll. Klicka på öppna filer för att återkalla den nödvändiga Kinetics. Kinetikerna illustreras i fönstret Kontrollcenter.
   2. Välj genom att högerklicka direkt på kinetik export kurvor. Spara textfilen som innehåller rådata. Öppna statistik programmet och klistra in rådatafilen i realtids experiment.
   3. Börja med tiden (x-axeln) vid tillägg av radiotracer (utesluta bakgrundsmätning) och normalisera till procent signalen av den maximala CPS (antal per sekund).
   4. Ladda alla normaliserade data till en ny GraphPad Prism-fil.
   5. Beräkna medelvärden och standardavvikelse.
   6. Illustrera erhållna data som diagram som visar avvikelsen (ökningstakten) av upptag av spår av alla tre uppställningar.

Representative Results

Den helautomatiska radiosyntesen av [¹¹c] SNAP-7941 gav 5,7 ± 2,5 GBq (4,6 ± 2,0% vid EOB, 14,9 ± 5,9% baserat på [¹¹c] CH₃OTf; n = 10) av formulerad produkt. Den övergripande syntesen varade runt 40 min, där 15 min krävdes för beredning av [¹¹C] CH₃OTf via gas fas metoden, ytterligare 5 min var nödvändiga för radioaktiv märkning av föregångaren, följt av 10 min av semi-Preparative RP-HPLC rening och 10 min för C18 patron fast fas extraktion och formulering. Sedan, en liten alikvot (ca. 100-200 μL) levererades till den person som ansvarar för kvalitetskontroll, medan den ursprungliga produkten injektionsflaska med färdiga att använda Tracer skickades till försöksledaren i realtid kinetisk analys.

Kvalitetskontrollen slutfördes inom 10 min efter syntes slutet. Molar aktiviteten var i en spänna av 72 ± 41 GBq/μmol (n = 10), och den radiokemisk renheten var alltid > 95%. Alla andra parametrar (pH, osmolalitet, restlösnings medel) uppfyllde utgivnings kriterierna. För realtids kinetisk analys valdes tre olika experimentella uppställningar: a) behandlade och icke-behandlade (vehikel) MDCKII-WT-celler, B) som inte behandlats eller behandlats med MDCKII-hMDR1-celler och C) den senare cellinjer med blockering före realtids kinetisk analys av transportören med hjälp av (±)-verapamil. Tillämpa [¹¹C] Snap-7941 till vildtyp cell linjen mdckii-WT (p-GP icke-uttryckande) och mdckii-hMDR1 (p-GP uttrycker) visar en annan kinetisk beteende, eftersom det finns en snabb ackumulering till vildtyp cellinjer, medan ingen ackumulering observerades för MDCKII-hMDR1-cellerna. Emellertid, blockerar P-gp efflux transporter inmdckii-hMDR1 celler med (±)-verapamil ledde till en jämförbar realtid Kinetic som redan setts för vildtyp cellinjer (figur 5).

Figur 1: översikt över arbetsflödet. Arbete-flöde av radiosynthesis, kvalitets-kontrollerar, och kapaciteten av Real-Time Kinetic mätningen av [¹¹C] SNAP-7941. De svarta pilarna anger transportsättet för radioaktiviteten. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Radiosyntetiskt system för automatiserad synthesizer. Kopplings krets för den automatiserade syntet, från och med cirkulations enheten för [¹¹c] CH₃I/[¹¹c] CH₃OTf-produktion, reaktor för införande av AKTIVITETEN i föregångaren lösning och SPE rening (spe = fast fas utvinning; PCV = injektionsflaska för produkt samling). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: representativa kromatogram för den helautomatiska röntgen syntesen av [¹¹C] Snap-7841. Den semi-Preparative RP-HPLC kromatogrammet illustreras på toppen och den analytiska en efter rening på botten. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: cell kultur skålen förberedelse för experiment i realtid. Steg 1 inkluderar sådd av 2,5 x 10⁵ upp till 1 x 10⁶ beroende på celltyp och deras tillväxttakt. Därefter placeras kultur skålen i ett sned plan (ca 30-45 °). Därför kan den medföljande metall apparaten eller locket på en cellkultur skålen användas i inkubatorn för att stabilisera den snedställda positionen av skålen. Dagen efter (24 h) skålen justeras horisontellt, och färskt cell odlingssubstrat tillsätts för att helt täcka cellytan. På experimentets dag undersöks cellernas genomförbarhet och sammanflödet. Enligt experiment protokollet, är cellerna tvättas med DPBS, mediet ersätts med serumfritt medium (2 mL), och kultur skålen flyttas till en sned position tills början av experiment. Hädanefter kan cellerna behandlas med inhibitor eller vehikel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: real tids kinetiska mätningar av [¹¹C] SNAP-7941. Representativ realtids kinetik på [¹¹C] Snap-7941 visas i tre olika set-ups: använda mdckii-WT-celler; MDCKII-hMDR1-celler som är förblockerade med (±)-verapamil som P-gp-hämmare och MDCKII-hMDR1-celler utan blockering. Y-axeln illustrerar ökningstakten för de förblockerade MDCKII-hMDR1-och WT-cellerna jämfört med resultaten av de obehandlade eller vehikel-behandlade MDCKII-MDR1-cellerna (inget upptag, 0%). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Radiosyntesen av [¹¹C] SNAP-7941 fastställdes på en kommersiell syntes modul. På grund av möjligheten att helt automatisera förberedelse förfarandet, röntgen syntes säkras för att vara tillförlitlig, och förbättringar avseende strålskydd av operatören uppnåddes. Beredningen av synthesizer har en enorm inverkan på kvaliteten på radiotracer, särskilt när det gäller molar aktivitet. Det är därför viktigt att hela tiden arbeta under inerta förhållanden (t. ex. helium atmosfären) och att spola alla linjer som ligger före reaktionskärlet (mållinjen, [¹¹C] CH₃I produktionscykel och reaktor (se figur 2)). Dessutom uppvärmning av respektive fällor och ugnar innan början av syntesen för att ta bort fukt och Atmosfäriskt kol ökar molar aktiviteten fördel. Speciellt den AgOTf kolumnen, impregnerad med grafitiserat kol, är extremt känslig för fukt. Även mindre mängder av någon fukt källa stör omvandlingen av [¹¹c] CH₃I till [¹¹c] CH₃OTf. Innan syntesen inleds måste [¹¹c] Co₂ -fällan och [¹¹c] CH₃I-fällan kylas ner till rumstemperatur igen för att möjliggöra efterföljande svällning. Dessutom rekommenderas att man löser upp föregångaren strax innan syntesen påbörjas och att basen läggs direkt in i prekursorlösningen.

Kvalitetskontrollen för kol-11-radiotracers måste vara rationellt utformad för ett kontinuerligt och snabbt arbetsflöde. Emellertid, de viktigaste parametrarna för cellkulturstudier är radiokemisk renhet och molar aktivitet för att få giltiga resultat. Korrekt utvärdering av molar aktiviteten kräver en robust analytisk HPLC-metod och kalibreringskurvan måste täcka koncentrationsintervallet för slutprodukten. Den utmanande delen för radiotracers är att uppnå en koncentration över kvantifieringsgränsen (LOQ) på grund av små mängder, som produceras under radio syntesen. Därför är konsten att hitta balansen mellan hög molar aktiviteter för att undvika receptor mättnad och tillräckligt höga koncentrationer för att fortfarande kunna kvantifiera icke-radioaktiva signalen.

[¹¹C] SNAP-7941 bekräftades vara ett potent substrat för den humana P-gp transportör, eftersom ingen ackumulering observerades i obehandlad eller vehikel-behandlade MDCKII-hMDR1 celler på grund av snabb efflux. Däremot gav både experimentella uppställningar (MDCKII-WT eller förblockerade MDCKII-hMDR1-celler) liknande resultat (ackumulering av [¹¹C] SNAP-7941), vilket stödde mångsidigheten hos denna in vitro-analys. MDCKII-hMDR1 celler är mycket lämpliga för LigandTracer experiment på grund av deras stabila transfektion, snabb tillväxt och ihållande mot skjuvning stress orsakad av roterande cellkultur skålen. Avsaknaden av [¹¹C] SNAP-7941 upptag i råtta och möss hjärnan kan därför förekomma orsakad av efflux genom P-gp transportör. På grund av transfektion av hundarnas njurceller med humant multiresistent protein 1 (hMDR-1, P-gp), det prediktiva värdet av denna metod för efflux transporter bindning hos människor är hög, vilket är gynnsamt i form av en framtida klinisk tillämpning. Men hittills har selektiviteten mot andra effluxtransporter inte verifierats. Därför, andra cellinjer kan användas, uttrycker olika framstående effluxtransportörer som Breast Cancer resistens protein (BCRP) eller multipel resistens protein-1 (MRP-1), att studera interaktioner mot dessa transportörer. Metoden är i jämförelse med klassisk ackumulering eller transportanalyser mycket enkel och ger omedelbart kvalitativa resultat. Dessutom är den största fördelen att denna teknik möjliggör utvärdering av direkt interaktion av PET Tracer och målet i realtid, i motsats till konventionella experiment med indirekt kvantifiering (mestadels förskjutning). Dessutom ger realtid radioassay programvara experimentell flexibilitet (t. ex., nuklid förfall korrigering, mäta tid och positioner, etc.) och därför, hög frihet för användare. På andra sidan, begränsningar av metoden inkluderar en låg provgenomströmning, eftersom endast en cell skålen kan mätas i taget. Dessutom bör man ta hänsyn till några andra tekniska och operativa frågor: den beskrivna tekniken är mycket känslig för bakgrundsstrålning. strålnings källorna bör därför hållas på avstånd och tyngdpunkten bör läggas på bakgrunds mätningen före experimentet. En annan fråga som rör experiment vid högre temperaturer än rumstemperatur, är uppvärmningen av det lutande stödet: avdunstning av cell odlingsmediet kan påverka detektorn. I stället för uppvärmning placeras hela enheten företrädesvis i inkubatorn. Dessutom är metoden begränsad till adherenta cellinjer. Genom rotation av cellkultur skålen kan skjuvningskänsliga celler lossna från skålen, vilket kan leda till ogiltiga resultat.

Ändå, om försöksledaren uppmärksammar dessa mindre nackdelar metoden ger snabba och pålitliga resultat för analys av det kinetiska beteendet hos prekliniska PET-tracers.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941
Ni catalyst	Shimadzu, Kyoto, Japan		Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh
Iodine	Merck, Darmstadt, Germany		1.04761.0100
Acetonitrile	Merck, Darmstadt, Germany		for DNA synthesis, < 10 ppm H2O
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA		HPLC grade
Ammonium acetate	Merck, Darmstadt, Germany
Acetic acid	Merck, Darmstadt, Germany		glacial
Ethanol	Merck, Darmstadt, Germany		96%
NaCl	B. Braun, Melsungen, Germany		0.9%
Tetrabutylammonium hydroxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Methanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA		HPLC grade
SPE cartridge	Waters, Milford, MA, USA		SepPak C18plus
Semi-preparative RP-HPLC column	Merck, Darmstadt, Germany		Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm
Precolumn	Merck, Darmstadt, Germany		Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm
Precursor	University of Vienna, Austria		SNAP-acid
Reference compound	University of Vienna, Austria		SNAP-7941
Silver trifluoromethanesulfonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Graphpa GC	Alltech, Deerfield, IL, USA		80/100 mesh
PET trace 860 cyclotron	GE Healthcare, Uppsala, Sweden
[11C]CO2 high pressure target	Air Liquide, Vienna, Austria
TRACERlabFX2 C	GE Healthcare, Uppsala, Sweden
N2 + 1% O2	Air Liquide, Vienna, Austria		Target gas
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941.
Merck Hitachi LaChrom, L-7100	Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria)		HPLC pump
Merck Hitachi, L7400	Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan)		UV-detector
NaI-radiodetector	Raytest (Straubenhardt, Germany)		NaI-radiodetector
Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm	Merck (Darmstadt, Germany)		HPLC column
430-GC	Bruker (Bremen, Germany)		Gas chromatograph
Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm	SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia)		Gas capillary
Wesco, osmometer Vapro 5600	Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria)		Osmometer
g-spectrometer			g-spectrometer
Gas chromatography controlling software	VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A)		Galaxie Version 1.9.302.952
Gamma spectrometer controlling software	ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)		Maestro for windows Version 6.06
Gamma spectrum recalling software	ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)		Winplots version 3.21
HPLC controlling software	Raytest (Straubenhardt, Germany)		Gina Star Version 5.9
inolab 740	WTW (Weilheim, Germany)		pH meter
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941.
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1)	Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands)		Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1)
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT)	Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands)		Wildtype (WT)
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 61965-026
Fetal Calf Serum (FCS)	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 10270-106
Penicillin/Streptomycin	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 15140
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
In vitro experiments
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 61965-026
(±)-Verapamil hydrochloride	Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)
DMSO	Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)		276855-100 mL
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
Sterile disposable plastic pipettes	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Sterilin, 5 mL – 25 mL
Sterile pipette tips	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL
Cell culture flasks	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175
LigandTracer control Version 2.2.2	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
LigandTracer Yellow	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
LigandTracer White	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
GraphPad Prism 6.0	GraphPad Software, Inc.
Handheld automated Cell Counter	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter (Cat.No. PHC00000)
Cell Counter Sensors	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050)