Summary
פרוטוקול כדי ליצור גנים שונה האדם מדומה מפוזרים תאים איון האדם התפזרו על ידי וירוס לנשיאת RNA קצר (מרין) מוצג. פרוטוקול זה מנצל את כלי האנזים והתרבות הזמינים, ניתן לבצע בקלות, והוא מייצר מדומה מבחינה גנטית מדומה המתאים ללימודים פונקציונליים ומורפולוגיים.
Abstract
כלים גנטיים שונים זמינים לווסת גנים באיים הלבלב של מכרסמים כדי לנתח פונקציה של גנים איון למחקר סוכרת. עם זאת, הנתונים שהושגו מתוך איולי מכרסמים הם לעתים קרובות לא לשכפל במלואו או ישים לאיים האנושיים בשל הבדלים ידועים במבנה איון ותפקוד בין המינים. כיום, טכניקות הזמינות כדי לתמרן ביטוי הגנים של האיים האנושיים מוגבלים מאוד. מבוא של הטרנסגנים אל איונים שלמים על ידי אדנווירוס, פלסמיד, ו פורוזימטר לעתים קרובות סובל מיעילות נמוכה רעילות גבוהה. יעילות נמוכה היא בעייתית במיוחד במחקרים להוריד גנים באיונים שלמים, אשר דורשים יעילות גבוהה. ידוע כי התאים הפזורים בתוך הפיזור מחדש התפזרו בתרבות היוצרים הספרואידים שנקרא פסבדו. גודל מבוקר צבירה מחדש של תאים איון האדם יוצר מדומה כי לשמור על הפרשה דינמית בשלב הראשון אינסולין לאחר תרבות ממושכת ולספק חלון כדי להציג ביעילות את ה-RNA הקצר ויראלי (שרין) עם רעילות נמוכה. כאן, פרוטוקול מפורט ליצירת הפסבדו האנושי לאחר התמרה ויראלית באמצעות שתי צלחות מסחריות הזמינות בשני הלוחות מתוארות. הפרוטוקול ניתן לבצע בקלות ומאפשר להוריד יעיל של גנים והערכה של דינמיות של הפרשת אינסולין באמצעות תאים איון האדם. כך, מדומה אנושי עם אפנון גנטית מתווכת בתיווך לספק מודל רב עוצמה ורב תכליתי כדי להעריך את תפקוד הגנים בתוך תאי איון האדם.
Introduction
ההפסד של מסה תא ביתא פונקציונלי הוא הפתולוגיה המרכזית עבור שני סוג 1 וסוכרת סוג 21. בעוד תאי ביתא הם המפיקים של האינסולין באיים הלבלב, תקשורת בין תאי ביתא ותאים שאינם ביתא ממלא תפקיד קריטי בוויסות הפרשת האינסולין2. בנוסף, דיסתקנה של הפרשת גלוקגון תורמת להירגליקמיה בסוכרת3. כך, יש עניין חזק לווסת את הביטוי הגנטי של תאים בתוך איונים הלבלב כדי לטפל במנגנון מאחורי התפתחות של התפקוד של איון בסוכרת. מגוון רחב של גישות כולל עכברים טרנסגניים זמינים כדי לווסת את הביטוי הגנטי של איונים של העכבר. עם זאת, איונים אנושיים ועכברים להראות אינבציה שונה, התפלגות התא, היחס של ביתא לתאי אלפא, ואת התגובה הסוד4. לכן, הערכה ישירה של הפונקציה גנטי באיים האנושיים הוא חשוב מאוד להבנת הפתופסולוגיה של איולי הלבלב האנושי.
וקטור אדנונגיפי הוא וקטור ויראלי הנפוץ ביותר כדי לשנות את איולי הלבלב בחוץ בגלל היעילות הגבוהה של התמרה בתאים שאינם מפרידים. עם זאת, אדנווירוס לא לחדור לליבה של איונים ביעילות, במיוחד באיים האנושיים5, ו ציטוטוקסינים במינון גבוה6. יחסית, וקטור לנטינגיל הוא פחות ציטוטוקסיני ומספק גנים אקסוגניים לצמיתות לתוך כרומוזום של התאים post-mitotic, מה שהופך אותו רכב נבדק נרחב עבור טיפול גנטי7. עם זאת, את היכולת של הנגיף כדי לחדור את הליבה של איים אנושיים שלמים הוא גם מוגבל, ובכך דורשים פיזור חלקי על ידי העיכול אנזימטי כדי להגביר את יעילות התמרה8. האזהרה עם הפיזור של איים אנושיים שלמים היא ההפרעה של תא תא ותקשורת תא מטריקס, אשר מתפשר על הרגולציה הדינמית של הפרשת אינסולין קריטית לתחזוקת הומאוסטזיס גלוקוז בבני אדם9. לכן, זה כבר מאתגר להעריך את ההשפעה של אפנון גנטי על הרגולציה הדינמית של הפונקציה איון במודל של איונים אנושיים.
זה כבר ידוע כי מפוזרים תאים איון מ בני אדם מכרסמים באופן עצמאי מחדש לתוך מבנים כמו איון שנקרא "פסבדו". פסאודו איים להראות ביתא ולא התפלגות תא ביתא דומה הילידים10,11. בנוסף, לאחר תרבות ארוכת טווח, האיים המקומיים מאבדים בהדרגה את הפרשת האינסולין הראשונית בשלב הראשון5,10,11,12. עם זאת, פסבדו-מוח הפגינו שימור טוב יותר של הפרשת האינסולין בשלב הראשון בתגובה לגלוקוז לעומת איונים מקומיים לאחר אותה תקופה של תרבות5. בנוסף לשימור טוב יותר של הפרשת אינסולין, לצבור מבוקר גודל של תאים איון האדם בלוחות מצורף נמוך11 מספק חלון של הזדמנות להציג וקטורים וירוס לפני הצבירה שלהם לתוך . מאוד מאיים מספר מחקרים הוכיחו את כלי השירות של הפסבדו בשילוב עם התמרה מתווכת. Caton ואח '13 דיווחו כי המבוא של חלבון פלורסנט ירוק (gfp) הביעה הבעה וירוס היתה השפעה קטנה על הפרשת אינסולין תוך השגת ביטוי הומוגנית של gfp ב מדומה לחולדה לעומת שליטה לא נגוע. הם גם הפגינו את ההשפעה הספציפית של connexins שונים על הפרשת אינסולין על ידי הבעת היתר connexins 32, 36, ו 43 באמצעות הנגיף13. מדומה האנושי הכין עם מסחרית זמין 96-ובכן אולטרה נמוך מצורף צלחת הראו כי הבעה ויראלי-מתווכת הביטוי של שעתוק גורם SIX3 משפר את הפרשת האינסולין המוערך על ידי דגירה סטטי14. לאחרונה, מדומה של האדם שהוכן בלוח ההחזקות ה96-והטוב אולטרה-נמוך, שימשו לצמצום השימוש בגלוקינאז דרך רנ א קצר ויראלי (שרין) כהוכחה לעיקרון כדי להראות כי הפרשת אינסולין מגורה מופחתת, בעוד הפרשת אינסולין מאולצת נשמרה ב-5. המחקר הראה גם כי מדומה האנושי דומים לאיונים מקומיים בביטוי גנים ופרופילי הפרשה, תמיכה נוספת של השירות של פסאודו האדם כדי לנתח את הרגולציה של הפונקציה איון5. למרות הפריזיה לא בוצעה, צלחת תרבות המיקרוגל ביולוגי שלאחרונה הפך להיות זמין מסחרית, דווח גם להיות תואם התמרה ויראלית והפיק מדומה ומיוצר האנושי הציג אינסולין מעולה הפרשה במבחנה ובvivo לאחר השתלת11. באופן קולקטיבי, היווצרות מדומה האדם בשילוב עם התמרה ויראלית היא גישה פשוטה ויעילה כדי לחקור את האי האנושי פתופסולוגיה, מתן כלי רב ערך לבצע מחקרים מכניסטיים באיונים אנושיים.
בדוח הנוכחי, פרוטוקול ליצירת מגוון מדומה של האדם עם וירוס באמצעות שתי פלטפורמות זמינות מסחרית, a 96-היטב אולטרה מצורף לוחית החיבור ולוח תרבות המיקרוגל מוצג. שניהם להשיג אפנון יעיל של ביטוי גנים וליצור מדומה אנושי התואמים הערכות במורד הזרם כולל דגירה סטטי הפריזיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
לפני תחילת הלימודים, מחקר של נושאים אנושיים נקבע על ידי מועצת המחקר המוסדי של אוניברסיטת איווה, אשר קבע כי המחקר לא עמד בקריטריונים למחקר הנבדקים האנושיים. עיין בלוח הסקירה המקומי לפני החניכה של המחקר כדי לקבוע אם מקור האיים והמחקר המתוכנן דורשים אישור מראש.
הערה: בדרך כלל, 1200 עד 1400 איון שווה ערך (ieq) של איונים אנושיים נדרשים עבור היווצרות של 192 מדומה בגודל של 3,000 תאים/מדומות בלוח מצורף של 96-ובכן אולטרה נמוך או 1,200 מדומה בגודל של 500 תאים/פסבדו ב . לוחית התרבות של המיקרוגל IEQ של איונים הנדרש משתנה בין ההכנות השונות של איונים אנושיים כגורמי תורם (גיל, בריאות, משקל), יעילות בידוד, ומצבי תרבות משפיעים על התשואה של השעיית התא היחיד. בפרוטוקול זה, שימוש בווירוס המכיל את המיקוד של שרין מיקוד גן של עניין. Cytomegalovirus (cmv) והאדם פוספפוגליפיאט קינאז (hpgk) יזם המבוסס על וקטורים המבוססים על למטה-לווסת את הגנים ביעילות באופן מדומה אנושי5,15. השימוש בנגיף דורש זהירות. בתור16בידוד פנה לוועדת הביובטיחות המקומית לפני החניכה של השימוש בנגיף.
1. לילה תרבות של איונים אנושיים להתאוששות לאחר משלוח
- הכנת קונוט מחקר רפואי מעבדות 1066 (CMRL-1066) בינונית עם 1% סרום האנושית (HSA) על ידי שילוב של 50 mL של CMRL-1066, 0.5 g של HSA, 0.5 mL של פניצילין-סטרפטומיצין, ו 0.5 mL של 100 mg/mL גלוטמין (1% HSA CMRL) ביולוגי קבינט בטיחות (תואר ראשון) ועובר דרך מסנן יקרומטר 0.2 עבור עיקור.
- מערבולת בעדינות את בקבוק המשלוח כדי לשמור איים בהשעיה. העברת מדיום המשלוח המכיל איונים לשפופרת צנטריפוגה 50 mL. תנו לצינור לשבת בתואר ראשון במשך 15 דקות, כך שאיונים מתפשרים בתחתית הצינורית.
- הסרת בינוני המשלוח בעדינות מבלי להפריע את הגלולה איון באמצעות הצינורות 10 מ"ל. להשעות מחדש את הגלולה איון ב 1% HSA CMRL לריכוז של 400 IEQ/mL.
- העבירו איונים לצלחת. שאינה מטופלת בתרבות אם האיים מתחלקים למספר מנות, לשמור על איונים באופן שווה השעיה בינונית על ידי מתערבל בעדינות לפני פיצול. תרבות איי ב 37 ° c בחממה 5% CO2 הלילה.
הערה: השימוש בצלחת תרבות שאינה רקמה מטופלת נדרש כדי למנוע את ההחזקה של איונים לצלחת.
2. הכנת תא בודד השעיה מן האיים האנושיים
- הכינו את הפרטים הבאים: cmrl-1066 בינוני עם 10% חום-מופעל סרום של שור (hifbs), פניצילין-סטרפטומיצין, גלוטמין (10% hifbs crml) בטמפרטורת החדר (RT), מסננת 40 יקרומטר, a 35 הצלחת פטרי, a 1 מ"ל מזרק, ו-הומוציטוטומטר.
- להעביר איונים אנושיים לאחר התרבות הלילה לתוך השפופרת צנטריפוגה 5 מ"ל. צנטריפוגה ב 190 x g עבור 5 דקות ברוטור מתנדנד דלי. מבינוני עם פיפטה בגודל 5 מ ל מבלי להפריע לגלולה איון.
- לשטוף את הגלולה על ידי הוספת 10 מ ל של פוספט באגירה מלוחים (PBS) לתוך הצינור, לערבב בעדינות, ואת צנטריפוגה ב 190 x g עבור 5 דקות.... מבלי להפריע את הגלולה איון.
- מחדש להשעות את הגלולה איון ב 0.5 מ ל של טרום מחומם מראש וכלי קולגן תערובת האנזים ופיילט 5x באמצעות מP1000 הצינורות לערבב איונים. מודקון ב 37 ° c עבור 5 דקות. מערבבים על ידי ליטוף למעלה ולמטה בעדינות 1-5 פעמים.
הערה: ליטוף אגרסיבי יגדיל את אובדן התאים. - בדיקת העכירות (תאים בודדים) ומספר הפתיתים (מעואיים). הוסיפו 2 עד 3 דקות לדגירה של 37 ° c בהתאם למידת העיכול הנמדדת בעכירות ובמספר הפתיתים. הפסיקו את העיכול כאשר הפתיתים מופחתים ל-~ 10% מהעיכול והתמיסה מעוננים.
הערה: הזמן הנדרש לעיכול משתנה בהתאם להתפלגות הגודל איון של כל הכנה של איון אנושי. - מניחים מסננת 40 יקרומטר בצלחת פטרי 35 מ"מ ולהרטיב את מסננת על ידי הוספת 1 מ ל 10% hifbs cmrl ולחיצה עם מזרק 1 ml. להעביר את כל ההשעיה התא על גבי המסננת ולאסוף את המעבר בצינור חדש 15 מ ל.
- לשטוף את הצינור המשמש לעיכול איון עם 0.5 mL של בינוני CMRL טרי לאסוף תאים שאריות ולהעביר את הכביסה דרך מסננת. שלבו את המעבר בשפופרת של 15 מ ל. . חזור על זה פעם אחת
- בשלב הבא, ביטול מעואיים לא מתעכלים שנותרו על מסננת ידי לחיצה על מסננת ממוקם בצלחת 35 מ"מ עם מזרק 1 mL. לאסוף את המעבר שוב ולשטוף את מסננת עם CMRL טרי-1066 כדי להסיר את כל האיים מעובים הנותרים מן הסננת ואת המנה. סך של ~ 3 מ ל של השעיית תא בודד כעת יהיה בתוך שפופרת 15 mL.
- הקלט את הנפח הכולל של ההשעיה של התא ולקחת 10 μl סדרת מחלקים של תאים כדי לספור את מספר התא על הומוציטומטר.
- צנטריפוגה את ההשעיה התא עבור 5 דקות ב 200 x g. להסיר את המדיום מבלי להפריע את הגלולה. המשך לשלב 3.1.1 אם אתה משתמש בלוח קבצים מצורף מ96-ובכן 3.2.1-נמוך במיוחד, אם אתה משתמש בלוח התרבות 24 שעות של המיקרוגל כדי לצבור מחדש את התאים.
3. פסבדו-צורה והתמרה על ידי הנגיף
- פרוטוקול המשתמש בלוח המצורף ל96-ובכן אולטרה-נמוך
- קבע את מספר התאים הרצוי לפסבדו ומספר הכדוריות המדומה שיש ליצור. בדרך כלל, 1000 לל3000 תאים משמשים עבור כל מדומה עבור לוחית הצמדה 96-ובכן אולטרה נמוך. עבור 3,000 תאים לפסבדו, להתאים את ההשעיה התא כדי 1 x 105 תאים/mL על ידי השעיית הגלולה איון משלב 2.10 בתוך 10% HiFBS cmrl כך 30 μl של השעיית התא יש 3,000 תאים. חשב את הנפח הכולל של 1 x 10 תאים/ml של השעיית תא בודד (mL) הדרושה באמצעות המשוואה הבאה:
הנפח הכולל של 1 x 105 תאים/mL של השעיית תא בודד (mL) = (מספר התאים לפסבדו) x (מספר מדומה שנעשה)/1 x 105.
הערה: להתאים את הריכוז של ההשעיה התא מבוסס על המספר הרצוי של תאים לפסבדו, כך 30 μL של התא ההשעיה עושה מדומה אחד. - העבר את אמצעי האחסון הנדרש (30 μL x מספר מדומה של שנעשו) של תא יחיד הבולם לצינור חדש של 15 מ ל. הוסף 250 התמרה יחידות (TU)/תא של הנגיף המכיל שרין מיקוד גן של ריבית או שליטה.
זהירות: הנגיף מסווג כרמת אבטחה טיחות 2 ניתן לשלב ב-DNA של תאים נגועים.
הערה: השתמש בווירוס מרוכז כך שעוצמת הקול של הנגיף הנוסף תהיה מינימלית. Titer נדרש לתא עבור השתקה הגן יעיל עשוי להיות שונה בהתאם למבנה העדשה. - מערבבים תא הבולם עם וירוס על ידי ליטוף 5x בעדינות עם P1000. העבר תאים מעורבים לתוך מאגר מגיב סטרילי 50 mL אם באמצעות הצינורות 8 ערוצים.
- לחלק 30 μL לכל טוב של השעיית תא בודד מעורבב עם הנגיף לתוך כל טוב באמצעות מP200 8-ערוץ או בצינור הצינורות בהתאם למספר הבארות.
- צנטריפוגה את הצלחת 96-באר בצנטריפוגה צלחת מנופף צלחות ב 270 x g ב RT עבור 7 דקות. בדוק אם התאים נאספים במרכז כל באר. אם לא, צנטריפוגה שוב כאיסוף של כל התאים במרכז הבאר הוא קריטי עבור היווצרות פסבדו. תרבות ב-37 ° c בתוך מחולל לחות 5%2 חממה במשך הלילה.
- הוסף 100 μL של טרום מחומם 10% HiFBS CMRL לבאר למחרת בבוקר כדי למנוע ייבוש של תאים במהלך התרבות העוקבת. צנטריפוגה ב 270 x g, RT עבור 7 דקות. תרבות ב 37 ° צ' ב 5% CO2 חממה. פסאודו-איואיים ישלים את המערך ב-5-7 ימים.
- כאשר לקצור מדומה, מראש לחמם את הנפח הרצוי של 10% HiFBS CMRL (100 μL לאיון), להכין 1 50 mL מאגר סטרילי, אחד סטרילי 10 ס מ צלחת פטרי, ו אחד 8 ערוץ הפיפטה בתואר ראשון.
- הסר את הצלחת 96-היטב מהאינקובטור והמקום בתואר ראשון. פיפטה 100 μL לכל איון של 10% HiFBS CMRL לתוך מאגר.
- פיפטה 100 μL לכל היותר מ -10% HiFBS CMRL ממאגר לפסאודו ומפאיים למעלה ולמטה 2-3 פעמים בעדינות בבאר כדי להרים את האיים. לאחר מכן, מרוב בינוני בבאר המכיל מדומה ומוצא לתוך צלחת פטרי בגודל 10 ס מ. שימוש בפיפטה בן 8 ערוצים מאפשר העברה של 8 מצבאיים בבת אחת.
- בדוק את הצלחת תחת מיקרוסקופ קל כדי להבטיח את ההסרה המלאה של כל הפסבדו. פסבדו-עצמי יוצרות אגרגטים מוצקים ונשארים מצטברים לאחר הסרתו. הפסאודו מוכנים כעת. לניסויי במורד הזרם
- קבע את מספר התאים הרצוי לפסבדו ומספר הכדוריות המדומה שיש ליצור. בדרך כלל, 1000 לל3000 תאים משמשים עבור כל מדומה עבור לוחית הצמדה 96-ובכן אולטרה נמוך. עבור 3,000 תאים לפסבדו, להתאים את ההשעיה התא כדי 1 x 105 תאים/mL על ידי השעיית הגלולה איון משלב 2.10 בתוך 10% HiFBS cmrl כך 30 μl של השעיית התא יש 3,000 תאים. חשב את הנפח הכולל של 1 x 10 תאים/ml של השעיית תא בודד (mL) הדרושה באמצעות המשוואה הבאה:
- פרוטוקול באמצעות לוח התרבות של המיקרוגל הפועל 24 שעות ביממה
- לחמם את הפתרון נגד הדבקות לשטוף (טבלת חומרים) כדי RT עבור מבנה ספרואיד יעיל. כמו כן, לפני חם רגיל CMRL-1066 ו 10% HiFBS CMRL.
- הוסף 500 μL לכל טוב של פתרון שטיפה נגד הדבקות לכל הטוב של לוח התרבות 24 היטב למיקרוגל לשמש לפסבדו. צנטריפוגה ב 1,300 x g עבור 5 דקות בצנטריפוגה צלחת מנופף לוחית.
- שימו לב ללוחית שמתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שבועות האוויר יוסרו ממיקרוגל. אם בועות אוויר לכודים במיקרוגל, צנטריפוגה ב 1,300 x g עבור 5 דקות שוב.
- מנושף את פתרון השטיפה האנטי-הדבקות מבארות בתואר ראשון. לשטוף כל טוב עם 2 מ ל של חם רגיל CMRL-1066 פעם אחת. . מאספירין ל1066 הוסף 0.5 mL/באר של חם 10% HiFBS CMRL לכל מתוכנן היטב לשימוש. וולס מוכנים כעת לטעינת תאים מפוזרים האדם איון מוכן בשלב 2.10.
- קבע את המספר הכולל של התאים הדרושים עבור כל באר. אחד היטב של לוחית התרבות של המיקרוגל 24 שעות ביממה מכיל 1,200 במיקרוגל וטפסים 1,200 פסבדו. 500 תאים לכל מדומה x 1200 המיקרוגל = 6 x 105 תאים. השהה מחדש תאים בודדים משלב 2.10 עד 6 x 105 תאים ב-0.8 מ ל של 10% HiFBS cmrl בצינור שפופרת סטרילי מבית 1.5 mL.
הערה: אמצעי האחסון המרבי הוא 2 mL. נפח של ההשעיה התא לא יעלה על 1.5 mL. הפרוטוקול מתאר שלבים ליצירת היטב של התמרה מדומה על ידי הנגיף. הקנה מידה בהתאם למספר הבארות שניתן לעשות עבור כל וירוס. - לצורך התמרה נגיפית, הוסיפו 125 TU/cell להשעיה של התא היחיד. שמור על נפח של וירוס מתחת 0.2 mL. מודטה את התא ואת תערובת וירוס ב 37 ° c עם ערבוב עדין מדי עבור 1 h כדי לאפשר מגע של תאים עם וירוס לפני עיבוי של תאים בשלב 3.2.8.
הערה: השתמש בווירוס מרוכז כדי שעוצמת הקול של הנגיף הנוסף תהיה מינימלית. מספר נמוך יותר של TU עבור תא משמש עבור פרוטוקול 2 בהשוואה ל-פרוטוקול 1 כאמצעי האחסון הכולל של המדיום לכל מספר התא הוא פחות. עם זאת, סיכוייו נדרש לכל תא עבור השתקה הגן יעיל עשוי להשתנות בהתאם למבנה הזנגילי והצורך אופטימיזציה.
זהירות: הנגיף מסווג כרמת אבטחה טיחות 2 ניתן לשלב ב-DNA של תאים נגועים. - אחרי 1 h, להתאים את הנפח הכולל של תא איון ואת תערובת וירוס 1 mL על ידי הוספת 10% HiFBS CMRL. אם התאים הטופס הופך לאחר הדגירה של 1 h, להתפזר לתוך השעיה תא אחד בעדינות ומהירה 2-3 פעמים. ליטוף חשוב מאוד אפילו לחלוקת תאים במיקרוגל. העבר תא השעיה לבאר אחת של לוחית התרבות 24 היטב למיקרוגל.
- מיד לאחר pipetting יטוף, צנטריפוגה ב 100 x g עבור 3 דקות ב-RT כדי ללכוד תאים לתוך כל המיקרוגל. התבוננו במיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים מפוזרים באופן שווה בכל המיקרוגל.
- תרבות לוחית התרבות של המיקרוגל ב-37 ° c בחממה של 5% CO2 . פסאודו-איואיים יופיעו 24 שעות ביממה. פסאודו-שנים יכולים להיות מתורבתים ללא שינוי בינוני עד 7 ימים.
- כאשר משנים את המדיום לתרבות מעבר ל -7 ימים, החליפו 50%-75% מהמדיום עבור כל שינוי בינוני כדלקמן. הסירו לאט את 0.5 ל-1 מ ל של בינוני בעזרת פיפטה P1000. הוספת 0.5-1 מ ל של טרי 10% HiFBS CMRL באיטיות על ידי הצבת עצה על הקיר של הבאר כדי למנוע היפואיים למגורים מלוח התרבות של המיקרוגל.
- כדי להתכונן לקציר מדומה, לחמם את 10% HiFBS CMRL מדיום. פסאודו איים נוטים לרחף סרום חינם CMRL-1066 להקשות לבחור אותם.
- משוף 0.5 מ ל של בינוני מתוך שימוש בפיפטה 1 מ ל ומדבקות בכוח בחזרה למשטח הצלחת כדי להרים מדומה מלוחית התרבות של המיקרוגל.
- בעדינות מוחדרים מדומה בעזרת הפיפטה מתוצרת 1 mL ומעבירים איונים לתרבות שאינה רקמה שטופלה בצלחת 6. לעבור דרך מסננת קטן 37 יקרומטר הפיך ממוקם על צינור 15 מ ל חרוט. פסבדו-איים יישארו על המסנן; כל תא בודד לא משולב יזרום דרך.
הערה: כדי למנוע אובדן של מדומה בגודל קטן דרך מסננת, מסננת יכול להיות מושמט. - לחלק 1 מ ל של 10% HiFBS CMRL על פני כל פני השטח של הבאר כדי להוציא את כל הפסבדו הנותרים, מרוב העור משוכן, ולעבור דרך מסננת. חזור על 3x כדי להבטיח אוסף מלא של כל הפסבדו מבארות.
- צפו בלוח התרבות של המיקרוגל תחת מיקרוסקופ היפוך כדי להבטיח כי כל הפסבדו נאספים. חזור על השטיפה כמו בשלב 3.2.14 אם הפסבדו נשאר.
4. רנ א הפקת הערכה גנטית יעילות השתקה
- לבחור מדומה ל-PBS RNase בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 3 דקות ב 4 ° c. הסרת PBS מבלי להפריע את הגלולה איון ולשטוף פעם אחת עם PBS ואחריו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 3 דקות ב 4 ° c.
- מחלק את רוב הערוץ. בעזרת פיפטה P1000 ואז, לשנות את הצינורות P10 כדי להסיר את שאר ה-PBS מבלי להפריע את הגלולה איון.
- הוסף 0.5 mL של guanidinium הפקת RNA מגיב (טבלת חומרים) לכל צינור. המגון המדומה באמצעות מנוע מונע במשך 2-3 פעמים. הגון המאכלת בגואנידיניום thiocyanate RNA החילוץ מגיב יכול עכשיו להיות מאוחסן ב-80 ° c או מעובד לטיהור RNA.
הערה: 24 מתוך 3,000 תא-מדומה שנוצר בצלחת הבאר 96 או 48 של התאים מדומה שנוצרו בלוח התרבות של 500 המיקרוגל מספיק כדי להשיג 0.5 על 1 μg של RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 ממחיש את צעדי המפתח בייצור מדומה באמצעות לוחית הצמדה 96-ובכן-נמוך במיוחד ולוחית התרבות של המיקרוגל. איור 2a מראה שינויים רציפים במבנה מורפולוגיה במהלך היווצרות של מדומה 3 x 103 תאים איון האדם ב 96-ובכן אולטרה נמוך מצורף לוחית. מונאולייר או גושים משוחררים של תאים שנצפו ביום 1 השתנו לאגרגטים מוצקים בעלי גבול חלק ועגול ביום 5 עד 7 (איור 2a). בלוח התרבות של המיקרוגל, היווצרות של מפסאודו מוצק מוצג בדרך כלל בתוך 4 ימים (איור 2b). כאשר 600 תאים/המיקרוגל היו מצופים בלוח התרבות של המיקרוגל, תאים איון האדם היו מרוכז לתוך spheroids של גודל אחיד. הוא ציין כי לוחית התרבות של המיקרוגל מאפשר היווצרות מוצלחת של פסבדו ממספר קטן של תאים לעומת 96-ובכן אולטרה נמוך מצורף צלחת. בדרך כלל, מעל 1,500 תאים/מדומה נחוצים לצלחת מצורף 96-טוב אולטרה-נמוך, בעוד 500 תאים/פסבדו מספיקים עבור לוחית התרבות 24 היטב למיקרוגל. מדומה שנוצר בהצלחה להישאר כספרואידים לאחר ההתאוששות מ 96 מצורף אולטרה נמוך לוחית או לוחית התרבות המיקרוגל והם תואמים ליישומי במורד הזרם כולל דגירה סטטי (איור 3a) ו הפריזיה (איור 3 ב). הגודל האחיד של הפסבדו מפחית את הווריאציה בתוך קבוצת מבחנים ומאפשר דגירה סטטית של פחות מ-5 כתובות למדידה (איור 3b). כמו כן, מפסאודו האדם המשיך חזק הפרשת אינסולין השלב הראשון בתגובה לגלוקוז לאחר 7 ימים של תרבות כאשר האיים האנושיים המקוריים מתורבתים לתקופה דומה של זמן הראו בפעם הראשונה בשנת גלוקוז הפרשת אינסולין מגורה ( איור 3 ב)5. המבוא של וירוס לתוך ההשעיה תא אחד מבטיח את התמרה יעילה הומוגנית של תאים איון משיגה יעיל מאוד למטה ברגולציה של גנים כפי שמוצג באיור 3 ג. כל התוצאות מוצגות הושגו באמצעות איונים אנושיים מתורמים שאינם סוכרתיים.
איור 1: תהליך ההכנה המדומה האנושית. (א) ההשעיה המכילה 4,000 ieq של האיים האנושיים הופך מעונן לאחר העיכול על ידי פרוטחרדה ו קולגן בתערובת האנזים ומלטף מתון. (ב) איונים אנושיים לאחר הפיזור עוברים מסננת. איונים לא מעוכלים שנותרו על גבי מסננת מפוזרים באמצעות מזרק 1 mL. (ג, ד) תמונות מיקרוסקופ של הבולם התא היחיד המכיל 3,000 תאים/גם ב 96-ובכן מצורף אולטרה נמוך הלוח לפני (ג) ואחרי (ד) צנטריפוגה. (e, f) תמונות מיקרוסקופ של הבולם התא היחיד המכיל 500 תאים/במיקרוגל בלוח התרבות 24-היטב למיקרוגל לפני (e) ואחרי (f) צנטריפוגה. סרגל קנה מידה = 250 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: המבנה המדומה האנושית. שינויים רציפים במבנה של הפסבדו האנושי שנוצר (א) ב 96-ובכן אולטרה נמוך לוחית מצורף מ 3,000 תאים ו (ב) בלוח התרבות 24 הטוב של המיקרוגל מתאים 500. סרגל קנה מידה = 100 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: דוגמאות ל בעלי מראה פונקציונלי. בעזרת פסאודו-אדם (א) אינקובציה סטטית ייצוגית שבוצעה באמצעות מדומה אנושי שנוצר בצלחת תרבות של המיקרוגל מתורם יחיד בגודל של 500 תאים איון האדם לפסבדו. ארבע סטים של 5 מדומה היו מודבטים עבור 1 h ב Krebs-ביקרבונט מאגר בתוספת עם שני מ"מ או סוכר 16.8 מ"מ. כל סמל מייצג הפרשת אינסולין מסדרה אחת של 5 פסבדו. ממוצע ± שגיאה סטנדרטית של הממוצע (SEM) מוצג. *, p < 0.05 על ידי מבחן t של הסטודנט. . תוצאות הנציג משלושה תורמים (ב) הנציג הפריזיה בדיקת הפרשת האינסולין מהאיים האנושיים שנוצרו בלוח התרבות של המיקרוגל בתגובה לגלוקוז 16.7 מ"מ ו -30 מ"מ kcl. שיטת הפריזיה פורסמה בעבר5. המשמעות ± SEM של הפרשת אינסולין משתי קבוצות של 40 מדומה שנוצרו בצלחת תרבות של המיקרוגל מתורם יחיד בגודלה של 500 תאים איון האדם לצלחת מדומה מוצג. . נתונים מייצגים משישה תורמים (ג) פסאודו-וירוס שנוצרו באמצעות מצבנה מיקוד אנושי (כיוון המטרה) או PLIN5 (מיקוד GACAAGCTT), מימין לשמאל). שליטה מדומה היתה התמרה עם וירוס לבטא רצף מעורבל (Scr) שפורסמו בעבר5. הביטוי mRNA של כל גן נקבע על ידי תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (PCR) כפי שפורסם בעבר5. הנתונים בוביעו באמצעות 2-ddct לקיחת peptidylprolyl לפני איזוראז B (ppib) כפקד פנימי17. כל נקודה מייצגת נתונים מכל תורם לצבע שצוין, וערכת נתונים מאותו תורם מקושרת על-ידי קו. N = 3 תורמים. *; p < 0.05 על ידי מבחן t של הסטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, פרוטוקול מפורט כדי ליצור מדומה האנושי כי הם התמרה על ידי וירוס באמצעות מ96-ובכן אולטרה נמוך מצורף צלחת או לוחית התרבות מוצג. פסאודו איים דיווחו להפגין מורפולוגיה ופונקציות הפרשה דומה האיים האנושיים הילידים יכולים להיות מתורבתים לזמן ממושך בתוך מבחנה5,11,18. בניגוד לאיונים אנושיים מקומיים המציגות וריאציה רחבה בגודלה, ממדים הם בעלי גודל אחיד יחסית, ומפחיתה את הווריאציה בין התורמים לבין משכפל ניסיוני5,11. הפחתת רגולציה של גנים הדורשים יעילות גבוהה של התמרה ניתן לבצע בקלות לפני היווצרות של מדומה בהשעיה תא יחיד. שיטה זו מונעת את הקושי של חדירה ויראלית דרך שכבות של תאים באיים שלמים. לפיכך, הפרוטוקול הפשוט, היעיל והמאפשר להיווצרות המין האנושי, מכיל יישומים רחבים.
בעוד כמה פלטפורמות שונות דווחו על היווצרות של מדומה12,14,19,20, הן מ96-ובכן אולטרה מצורף במיוחד לוחית התרבות של המיקרוגל הם זמין מסחרית, המאפשר טכניקה זו להיות מאומצת על ידי כל מעבדה. למרות הירידה תלוי שיטה12 גם מאפשר היווצרות של מדומה האנושי באמצעות labware משותף, מגבלות פוטנציאליות כוללות את הקושי בשליטה גודל ומצבור מחדש של פסאודו. מגבלות אלה היו בשל נפח מוגבל לירידה של מדומה ואידוי מתמשך במהלך התרבות 5-7 ימים הדרושים למערך מדומה. בנוסף, קל יותר להכיל את הנגיף עם השימוש בלוח ההחזקות האולטרה-נמוך של 96 או בלוח התרבות של המיקרוגל בהשוואה לשיטת התלייה-שחרור.
מספר צעדים בתוך הפרוטוקול דורשים תשומת לב מקרוב. אופטימיזציה של העיכול של איונים שלמים עם הפרוטחרדה ו קולגן בתערובת האנזים הוא קריטי שכן הן תחת-ומעל העיכול תפחית את התשואה של ההשעיה תא יחיד ולאחר מכן להשפיע על הצבירה של פסאודו. במהלך העיכול, חשוב לעקוב מקרוב איונים להיעלמות הגושים ולהגברת העכירות כאיים הנכנסים לתאים בודדים. חשוב לציין כי הזמן האופטימלי לעיכול משתנה בין איונים מתורמים שונים. הזמן האופטימלי תלוי במספר גורמים כולל היסטוריה רפואית וגיל של כל תורם, אורך הזמן של איסכמיה, הליך בידוד איון בשימוש, גודל איון, טוהר איון, הכדאיות איון, ותנאי משלוח. בדרך כלל, איונים אנושיים עם יכולת הקיום והטוהר גבוהים מ-80% ובתוך 5 ימים של בידוד משמשים. ליטוף זהיר ועדין במהלך פיזור חשוב גם לשמור על הכדאיות התאים והתאוששות אשר בסופו של דבר ישפיע על צבירת תאים ואת הגודל הסופי של מדומה להיווצר. כאשר השעיית תא הבולם את התא לבארות (שלבים 3.1.4 ו 3.2.7), ערבוב עדין ויסודי של תאים חשוב להשיג הפצה אפילו של תאים בודדים לתוך המיקרוגל. אם התאים הטופס מתגבש לאחר 1 h הדגירה עם הנגיף, זה דורש ליטוף עדין כדי לשבור את הגושים להשעיה תא יחיד לפני צנטריפוגה הסופי.
הייתה לנו הצלחה דומה ביצירת מדומות לבני אדם לאחר התמרה ויראלית באמצעות הצלחת ה96 ולוחית התרבות של המיקרוגל. הבחירה בין שתי הפלטפורמות תלויה בגודל ובמספר הרצוי. לוחית התרבות של המיקרוגל יש קטן, הפירמידה בצורת תחתית המאפשר עיבוי של מספר קטן יותר של תאים לעומת 96 היטב הלוח התחתון עגול. לפיכך, מספר התאים לפסבדו יכול להיות מופחת לצלחת תרבות המיקרוגל. כמו כן, שלב צנטריפוגה יחיד יוצר את כל הפסאודו בו זמנית בלוח התרבות של המיקרוגל בעוד מספר מלטף נדרש ליצירת פסבדו בצלחת 96. לפיכך, מקנה המידה של היווצרות הפסבדו קל יותר בצלחת תרבות המיקרוגל. עם זאת, לוחית התרבות של המיקרוגל הזמינה כרגע אינה מציעה גמישות במספר היוצרים הנוצרים. כיום, המספר המינימלי של מדומה שנוצר באמצעות לוחית התרבות של המיקרוגל הוא 1,200 והוא יכול להיות מוגבר רק על ידי הפקטור של 1,200. כך, אנו בדרך כלל משתמשים בצלחת 96-באר עבור ניסויים פיילוט בקנה מידה קטן ולניסוי שבו כמות קטנה של דגימות מספיקה כגון הפרשת אינסולין והפקת RNA לביטוי גנים. השתמשנו בפסאודו מלוח תרבות של המיקרוגל עבור בחני שדורשת מספר גדול של תאים כגון אבן חשופה מערבית, קביעת שיעור צריכת החמצן באמצעות מנתח מטבולית, וחילוץ הטריגליצרידים.
הגורם המגביל העיקרי של הדור של המין האנושי הוא אובדן התאים במהלך הכנת השעיית תא בודד. בעוד 1 IEQ של איון האדם נחשב להכיל סביב 2,000 תאים, התאוששות של השעיית תא יחיד הוא בדרך כלל 30% או נמוך יותר בשל כביסה מרובים עובר דרך מסננת. טרוגניות של גודל איון גם מקשה לנתק את כל האיים בו זמנית. בעוד ליטוף עדין והשימוש של פרוטחרדה וכלי האנזים בתערובת האנזימים בפרוטוקול הם מאמצים לשלב כוחות מכניים ואנזימטית להתאוששות מקסימלית של תאים בודדים, עדיין יש אובדן בלתי נמנע של תאים. לפיכך, היישום של הפסבדו דורש הצדקה ברורה על לימוד איים אנושיים שלמים. כמו כן, יש להזכיר כי הפרשת האינסולין מפסבדו היא איתנה יותר מאשר איונים שאינם מתורבתים באותה תקופה של הזמן, אך נוטה להיות נמוכה יותר בהשוואה לאיים מבודדים באופן טרי5,11.
למרות המגבלות קיימות, גנים יציבים ויעילים מאוד השתקה בשילוב עם שימור טוב יותר של הפרשת אינסולין גירוי הגלוקוז עבור זמן ממושך בתרבות לאפשר הערכה של תפקוד הגנים בתאי איון האדם. בנוסף, התקשורת הבין-תאית המורכבת בין ביתא בטא לבין תאים ביתא שאינם מוצעים להיות בעלי תפקיד רגולטורי בפונקציית איון. עם זאת, יש כעת מידע מוגבל לגבי תקשורת בין-תאית בתוך איונים אנושיים. עם זמינות מוגברת של סמנים ספציפיים לתא21, זה אפשרי ליצור מדומה אנושי עם הרכב התא מוגדר, כפי שדווח לאחרונה בתאי איון העכבר22, אשר יאפשרו הבנה משופרת של תא התא תקשורת בין תאי איון אנושיים. ההתקדמות האחרונה של הדמיה של רקמות תלת ממדיות גם פוטנציאל מגביר את השירות של מדומה האדם כמודל לחשוף את הקוטביות התאית ותקשורת בין-תאית מוסדרים באיונים אנושיים. כך, מדומה האדם לספק מודל שימושי כדי לנתח את הפונקציות של גנים של עניין ושאלות אחרות בתחום הביולוגיה איון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו היתה נתמכת כספית על ידי מכוני הבריאות הלאומיים לY.I. (R01-DK090490) והאגודה האמריקנית לסוכרת Y.I. (1-17-IBS-132). דביק ja ו-Y.I. נתמכים על ידי המרכז לחקר הסוכרת של הנשרים מסדר אחווה. א יהושע נתמך על ידי המכון הלאומי של מענק הכשרה בריאות (T32NS45549). מחברים מנוצל האדם הלבלב איונים שסופקו על ידי התוכנית הפצה משולבת של איון NIDDK במימון (IIDP) בעיר של תקווה (2UC4DK098085).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-adherence rinsing solution | Stemcell technologies | 7919 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series Type A2 | |
| Cell strainer, 40 micrometer | Corning | 431750 | |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530037 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | Heracell VIOS 160i | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent | ThermoFisher | 15596026 | Trizol |
| Glutamine | ThermoFisher | 25030164 | |
| Hemocytometer | Marien Feld | Neubauer-Improved Bright line | |
| Human serum albumin | Sigma | A1653 | |
| Inverted microscope | Fisher brand | 11-350-119 | |
| Microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 20 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microwell culture plate | Stemcell technologies | 34411 | Aggrewell 400, 24 well |
| Motor-driven pestle | GAMUT | #399X644 | |
| Non-tissue culture treated dish, 10 cm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| PBS | ThermoFisher | 14190250 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Petri dish, 35 mm | Celltreat | 229638 | |
| Pipette, 5 mL | DOT Scientific, | 667205B | |
| Pipette, 8-channel | VWR | #613-5253 | |
| Pipette, 10 mL | VWR | 667210B | |
| Pipette, P10 | Denville | UEZ-P-10 | |
| Pipette, P200 | Denville | UEZ-P-200 | |
| Pipette, P1000 | Denville | UEZ-P-1000 | |
| Proteolytic and collagenolytic enzyme mixture | Sigma | A6965 | Accutase |
| Reagent reservoir, 50 mL | VWR | 89094-680 | |
| Reversible strainer, 37 micrometer | Stemcell technologies | 27251 | |
| Swing bucket plate centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14R | |
| Swing bucket rotor | Beckman Coulter | SX4750A | |
| Tuberculin syringe, 1 mL | BD | 309659 | |
| Ultra low attachment microplate, 96 well | Corning | 4515 |
References
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. Stable and flexible system for glucose homeostasis. Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).
- Cryer, P. E. Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes. Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).
- Arrojo e Drigo, R., et al. New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment. Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).
- Harata, M., et al. Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets. Physiological Reports. 6 (20), e13907 (2018).
- Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response. Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).
- Hughes, A., et al. Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus. Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).
- Jimenez-Moreno, C. M., et al. A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors. Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).
- Bonora, E., et al. Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).
- Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets. Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).
- Yu, Y., et al. Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice. Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).
- Zuellig, R. A., et al. Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).
- Caton, D., et al. Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells. Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Peiris, H., et al. Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays. Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).
- Schlimgen, R., et al. Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Li, N., et al. Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).
- Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening. British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).
- Hilderink, J., et al. Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).
- Saunders, D. C., et al. Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis. Cell Metabolism. (18), (2018).
- Reissaus, C. A., Piston, D. W. Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets. Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).
