Summary
Een protocol om gengemodificeerde menselijke pseudoislets te maken van verspreide menselijke eilandjes cellen die door lentivirus met korte haarspeld RNA (shRNA) worden weergegeven. Dit protocol maakt gebruik van direct beschikbare enzym-en kweekvaten, kan gemakkelijk worden uitgevoerd en produceert genetisch gemodificeerde humane pseudoislets die geschikt zijn voor functionele en morfologische studies.
Abstract
Er zijn verschillende genetische hulpmiddelen beschikbaar om genen in pancreas eilandjes van knaagdieren te moduleren om de functie van eilandje genen voor diabetesonderzoek te ontleden. De gegevens van knaagdieren zijn echter vaak niet volledig gereproduceerd in of toepasbaar op menselijke eilandjes als gevolg van bekende verschillen in de structuur van het eiland en de functie tussen de soorten. Momenteel zijn technieken die beschikbaar zijn voor het manipuleren van genexpressie van menselijke eilandjes zeer beperkt. De introductie van transgen in intacte eilandjes door adenovirus, plasmide en oligonucleotiden lijdt vaak onder lage efficiëntie en hoge toxiciteit. Laag rendement is vooral problematisch in gendownregulatie studies in intacte eilandjes, die een hoge efficiëntie vereisen. Het is bekend dat enzymatisch verspreide eilandjes cellen reaggregate in cultuurvormende sferoïden genaamd pseudoislets. Maat gecontroleerde reaggregation van menselijke eilandjes cellen creëert pseudoislets die dynamische eerste fase insulineafscheiding na langdurige cultuur te handhaven en bieden een venster om efficiënt te introduceren lentivirale korte haarspeld RNA (shRNA) met lage toxiciteit. Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor het maken van menselijke pseudoislets na lentivirale transductie met behulp van twee in de handel verkrijgbare multi well-platen. Het protocol kan gemakkelijk worden uitgevoerd en zorgt voor een efficiënte Downregulatie van genen en de beoordeling van de dynamiek van de insuline secretie met behulp van menselijke eilandje cellen. Zo bieden menselijke pseudoislets met lentivirale gemedieerde genmodulatie een krachtig en veelzijdig model om de genfunctie binnen menselijke eilandjes cellen te beoordelen.
Introduction
Het verlies van functionele bèta celmassa is de centrale pathologie voor zowel type 1 als type 2 diabetes1. Terwijl beta-cellen zijn de producenten van insuline in alvleesklier eilandjes, communicatie tussen bètacellen en niet-bètacellen speelt een cruciale rol in de regulering van insuline secretie2. Bovendien, disregulatie van glucagonsecretie draagt bij aan hyperglycemie bij diabetes3. Er is dus sterke belangstelling om genexpressie van cellen binnen pancreas eilandjes te moduleren om het mechanisme achter de ontwikkeling van een eilandje dysfunctie bij diabetes aan te pakken. Een verscheidenheid aan benaderingen, waaronder transgene muizen, zijn beschikbaar om genexpressie van muis eilandjes te moduleren. Echter, menselijke en muis eilandjes vertonen verschillende innervatie, celverdeling, ratio van bèta aan Alfa cellen, en reactie op secretagogues4. Daarom is directe beoordeling van de genfunctie in menselijke eilandjes uitermate belangrijk voor het begrijpen van de pathofysiologie van de menselijke pancreas eilandjes.
Adenovirale vector is de meest gebruikte virale vector om pancreas eilandjes in vitro te leiden door de hoge efficiëntie van transductie in niet-scheidings cellen. Echter, adenovirus dringt niet naar de kern van de eilandjes efficiënt, vooral bij menselijke eilandjes5, en is cytotoxisch bij hoge doses6. Relatief is lentivirale vector minder cytotoxisch en levert het exogene genen permanent in het chromosoom van post-mitotische cellen, waardoor het een algemeen getest voertuig is voor gentherapie7. Het vermogen van het lentivirus om de kern van intacte menselijke eilandjes binnen te dringen is echter ook beperkt, waardoor gedeeltelijke dispersie door enzymatische spijsvertering nodig is om de transductie-efficiëntie8te verhogen. Het voorbehoud met de dispersie van intact menselijke eilandjes is de onderbreking van cel-cel en cel-matrix communicatie, die de dynamische regulering van insuline secretie kritisch voor het onderhoud van glucose homeostase bij de mens9compromitteert. Het is dus een uitdaging geweest om de impact van genmodulatie op de dynamische regulering van de eilandje-functie in een model van menselijke eilandjes te beoordelen.
Het is bekend dat verspreide eilandjes cellen van menselijke en knaagdieren autonoom reaggregate in eilandachtige structuren genaamd "pseudoislets". Pseudoislets tonen bèta-en niet-bèta-celverdeling vergelijkbaar met inheemse eilandjes10,11. Bovendien, na lange termijn cultuur, inheemse eilandjes geleidelijk verliezen robuuste eerste fase insuline secretie5,10,11,12. Toch toonden pseudo-eilandjes een beter behoud van de eerste fase insuline secretie in reactie op glucose in vergelijking met inheemse eilandjes na dezelfde cultuur periode5. Naast het hebben van een beter behoud van insuline secretie, maat gecontroleerde reaggregation van menselijke eilandje cellen in lage bijlage platen11 biedt een venster van de mogelijkheid om lentivirus vectoren voorafgaand aan hun reaggregation in te voeren pseudo-eilandjes. Verschillende studies hebben aangetoond dat het nut van pseudoislets gecombineerd met lentivirale gemedieerde transductie. Caton et al.13 meldde dat de introductie van het groene fluorescerende eiwit (GFP) dat lentivirus uitdrukt, weinig effect had op de insuline secretie, terwijl het een homogene expressie van GFP in rat pseudoislets in vergelijking met niet-geïnfecteerde controle had bereikt. Ze toonden ook het specifieke effect van verschillende connexinen op de insuline secretie door het overdrukken van connexinen 32, 36 en 43 via lentivirus13. Menselijke pseudo-eilandjes bereid met een in de handel verkrijgbare 96-well Ultra-Low-bevestigingsplaat toonden aan dat lentivirale gemedieerde overexpressie van transcriptiefactor SIX3 de insuline secretie verbetert die wordt beoordeeld door een statische incubatie14. Onlangs, menselijke pseudoislets bereid met een 96-goed ultra-lage bevestigingsplaat werden gebruikt om te downreguleren glucokinase via lentivirale korte haarspeld RNA (shRNA) als een bewijs van principe om te laten zien dat glucose-gestimuleerd insuline secretie wordt verlaagd, terwijl KCl-gestimuleerd insuline secretie werd bewaard5. De studie toonde ook aan dat menselijke pseudoislets vergelijkbaar zijn met inheemse eilandjes in genexpressie en secretoire profielen, waardoor het nut van menselijke pseudoislets om de regulering van de eilandje functie5te ontleden, verder wordt ondersteund. Hoewel de perifusie niet werd uitgevoerd, werd een biotechnologische micro well cultuur plaat die recentelijk commercieel beschikbaar werd, ook gerapporteerd als verenigbaar voor linvirale transductie en produceerde menselijke pseudoislets die uitstekende insuline vertoonden uitscheiding in vitro en in vivo na transplantatie11. Collectief, menselijke pseudo-eiland vorming gecombineerd met lentivirale transductie is een eenvoudige en efficiënte benadering om de pathofysiologie van het menselijk eilandje te onderzoeken, wat een waardevol hulpmiddel is om mechanistische studies in menselijke eilandjes uit te voeren.
In het huidige rapport wordt een protocol opgesteld om menselijke pseudoislets te vormen, met lentivirus met behulp van twee in de handel verkrijgbare platformen, een 96-well Ultra-Low-bevestigingsplaat en een micro well-kweek plaat. Beide bereiken een efficiënte modulatie van genexpressie en creëren menselijke pseudoislets die verenigbaar zijn voor downstreambeoordelingen, waaronder statische incubatie en perifusie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voorafgaand aan het begin van de studies, een menselijke onderwerpen onderzoek vastberadenheid werd gedaan door de Universiteit van Iowa institutioneel Review Board, die vastbesloten dat de studie niet voldeed aan de criteria voor menselijke onderwerpen onderzoek. Raadpleeg het lokale beoordelingsbord voordat het onderzoek is gestart om te bepalen of de bron van de eilandjes en de geplande studie vooraf moet worden goedgekeurd.
Opmerking: Typisch is 1200 − 1400 eilandje equivalent (IEQ) van menselijke eilandjes nodig voor de vorming van 192 pseudoislets op de grootte van 3.000 cellen/pseudoislets in een 96-goed ultra-lage bevestigingsplaat of 1.200 pseudoislets op de grootte van 500 cellen/pseudoislets in een Micro well cultuur plaat. IEQ van de vereiste eilandjes varieert tussen verschillende preparaten van menselijke eilandjes als donor factoren (leeftijd, gezondheid, gewicht), isolatie-efficiëntie en cultuuromstandigheden beïnvloeden de opbrengst van de eencellige suspensie. In dit protocol wordt lentivirus met shRNA gericht op een gen van belang. Het cytomegalovirus (CMV) en de humane fosfoglycerate kinase (hpgk) Promoter op basis van linviumvirale vectoren worden gerapporteerd aan down-reguleren van gen efficiënt in humane pseudoislets5,15. Het gebruik van lentivirus vereist voorzorgsmaatregel als Biohazard16. Neem voor aanvang van het gebruik van lentivirus contact op met de lokale bioveiligheidscommissie.
1. nachtelijke cultuur van menselijke eilandjes voor herstel na verzending
- Bereid Connaught Medical Research Laboratories 1066 (CMRL-1066) medium aangevuld met 1% humaan serumalbumine (HSA) door het combineren van 50 mL CMRL-1066, 0,5 g HSA, 0,5 mL penicillaire-streptomycine, en 0,5 mL 100 mg/mL glutamine (1% HSA CMRL) in biologische veiligheidskast (BSC) en passeren een 0,2 μm filter voor sterilisatie.
- Zwenk de verzend fles zachtjes om de eilandjes in suspensie te houden. Breng het verzend medium met eilandjes over in een conische centrifugebuis van 50 mL. Laat de buis te zitten in BSC voor 15 min, zodat eilandjes vestigen op de bodem van de buis.
- Verwijder het verzend medium zachtjes zonder het eilandje te storen met een pipet van 10 mL. Resuspendeer het eilandje pellet in 1% HSA CMRL tot een concentratie van 400 IEQ/mL.
- Breng eilandjes in een niet-weefselcultuur behandeld gerecht. Als eilandjes worden opgesplitst in meerdere gerechten, houd dan de eilandjes gelijkmatig in het medium opgehangen door zachtjes te zwengelen voordat u gaat splitsen. Cultuur eilandjes bij 37 °C in een 5% CO2 incubator 's nachts.
Opmerking: Het gebruik van een niet-weefselcultuur behandeld gerecht is nodig om te voorkomen dat de bevestiging van eilandjes aan de plaat.
2. bereiding van eencellige suspensie van menselijke eilandjes
- Bereid het volgende voor: CMRL-1066 medium met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (HiFBS), penicillair-streptomycine en glutamine (10% HiFBS CRML) bij kamertemperatuur (RT), een 40 μm zeef, een 35 mm Petri schaaltje, een 1 mL tuberculine spuit en een hemocytometer.
- Breng menselijke eilandjes over na een nachtelijke cultuur in een conische centrifugebuis van 15 mL. Centrifugeer bij 190 x g gedurende 5 minuten in een zwaai-emmer rotor. Aspirate medium met een 5 mL pipet zonder storende de eilandje pellet.
- Was de pellet door toevoeging van 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in de buis, meng zachtjes en centrifugeer bij 190 x g gedurende 5 min. ASPIRATE PBS zonder het eilandje te storen.
- Onderbreek de pellet van het eilandje opnieuw in 0,5 mL van een voorverwarmd proteolytisch en collagenolytisch enzym mengsel en pipet 5x met behulp van een P1000 pipet om eilandjes te mengen. Inbroed bij 37 °C gedurende 5 min. Meng door pipetteren op en neer zachtjes 1 − 5 keer.
Opmerking: Agressief pipetteren verhoogt het celverlies. - Controleer op troebelheid (enkele cellen) en het aantal vlokken (onverteerde eilandjes). Voeg 2 − 3 minuten toe aan een incubatie van 37 °C, afhankelijk van de mate van vertering die wordt beoordeeld door troebelheid en het aantal vlokken. Stop de spijsvertering wanneer vlokken worden teruggebracht tot ~ 10% van de voorkeur en de oplossing troebel is.
Opmerking: De tijd die nodig is voor de spijsvertering verschilt afhankelijk van de grootte van de eilandje van elke menselijke eilandje voorbereiding. - Plaats een zeef van 40 μm in een Petri schaaltje van 35 mm en Bevochtig de zeef door 1 mL 10% HiFBS CMRL toe te voegen en te persen met 1 mL zuiger van de spuit. Breng alle celsuspensie bovenop de zeef en verzamel de Pass-Through in een verse 15 mL Tube.
- Was de buis die wordt gebruikt voor de spijsvertering van het eilandje met 0,5 mL vers CMRL-medium om overgebleven cellen te verzamelen en de wassing door de zeef te passeren. Combineer de Pass-Through in een 15 mL Tube. Eenmaal herhalen.
- Vervolgens dissociëren onverteerde eilandjes op de zeef door het indrukken van de zeef geplaatst in een 35 mm schotel met 1 ml zuiger van de spuit. Verzamel opnieuw Pass-Through en was de zeef met verse CMRL-1066 om alle overgebleven verteerde eilandjes van de zeef en het gerecht te verwijderen. Een totaal van ~ 3 mL eencellige suspensie zal nu in de 15 mL Tube.
- Noteer het totale volume van de celsuspensie en neem 10 μL aliquot cellen om het celgetal op een hemocytometer te tellen.
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 200 x g. Verwijder medium zonder de pellet te storen. Ga verder met stap 3.1.1 bij gebruik van een 96-well Ultra-Low-bevestigingsplaat of stap 3.2.1 als u een 24-Well micro well-kweek plaat gebruikt om de cellen te reaggregate.
3. pseudo-eiland vorming en transductie door lentivirus
- Protocol met een 96-goed ultra-lage bevestigingsplaat
- Bepaal het gewenste aantal cellen per pseudo-eilandje en het aantal pseudo eilandjes om te maken. Meestal worden 1000 − 3000 cellen gebruikt voor elk pseudo eilandje voor een 96-goed ultra-lage bevestigingsplaat. Voor 3.000 cellen per pseudo eilandje, stel de celsuspensie in op 1 x 105 cellen/ml door de pellet van het eilandje te resuspenteren uit stap 2,10 in 10% HiFBS cmrl, zodat 30 μL celsuspensie 3.000 cellen heeft. Bereken het totale volume van 1 x 105 cellen/ml enkelvoudige celsuspensie (ml) met behulp van de volgende vergelijking:
Het totale volume van 1 x 105 cellen/ml enkelvoudige celsuspensie (ml) = (aantal cellen per pseudo eilandje) x (aantal pseudo-eilandjes gemaakt)/1 x 105.
Opmerking: Pas de concentratie van de celsuspensie aan op basis van het gewenste aantal cellen per pseudo eilandje, zodat 30 μL celsuspensie één pseudo-eilandje maakt. - Breng het benodigde volume (30 μL x aantal pseudoislets) van een enkelvoudige celsuspensie over in een nieuwe tube van 15 mL. Voeg 250 transductie eenheden (TU)/cel van lentivirus bevattende shRNA gericht op een gen van belang of controle.
Let op: Lentivirus is geclassificeerd als bioveiligheid niveau 2 en kan worden geïntegreerd in DNA van geïnfecteerde cellen.
Opmerking: Gebruik geconcentreerd lentivirus zodat het volume van lentivirus toegevoegd is minimaal. Per cel vereiste titer voor efficiënte gen-uitschakeling kan verschillen afhankelijk van de linvirale constructie. - Meng celsuspensie met virus door zachtjes 5x te pipetteren met een P1000-pipet. Meng cellen in een steriel 50 mL-reagens reservoir overbrengen bij gebruik van een 8-kanaals pipet.
- Verdeel 30 μL per putje van een enkelvoudige celsuspensie met lentivirus in elk putje met een 8-kanaals pipet of een P200 Pipet, afhankelijk van het aantal putten.
- Centrifugeer de 96-put plaat in een swingende-emmer plaat centrifuge bij 270 x g bij RT gedurende 7 min. Controleer of er cellen in het midden van elke put worden verzameld. Zo niet, dan Centrifugeer je opnieuw als het verzamelen van alle cellen in het midden van de put cruciaal is voor de vorming van pseudo-eiland. Cultuur bij 37 °C in een nacht met bevoficeerd 5% CO2 incubator.
- Voeg in de volgende ochtend 100 μL vooraf opgewarmde 10% HiFBS CMRL toe om te voorkomen dat cellen worden gedroogd tijdens de daaropvolgende kweek. Centrifugeer bij 270 x g, RT gedurende 7 min. cultuur bij 37 °c in een incubator van 5% Co2 . Pseudo-eilandjes zullen de vorming in 5 − 7 dagen voltooien.
- Bij het oogsten van pseudo-eilandjes, pre-warm het gewenste volume van 10% HiFBS CMRL (100 μL per eilandje), bereiden 1 50 mL steriel reservoir, één steriele 10 cm Petri schaal, en één 8-kanaals pipet in BSC.
- Verwijder de 96-put plaat uit de incubator en plaats in BSC. Pipetteer 100 μL per eilandje van 10% HiFBS CMRL in een reservoir.
- Pipetteer 100 μL per put van 10% HiFBS CMRL van een reservoir naar pseudoislets en Pipetteer op en neer 2 − 3 keer zachtjes in de put om de eilandjes omhoog te tillen. Vervolgens aspireren medium in de put met een pseudo eilandje en uitwerpen in een 10 cm Petri schaal. Gebruik van een 8-kanaals pipet maakt overdracht van 8 pseudo-eilandjes tegelijk mogelijk.
- Controleer de plaat onder een lichte Microscoop om de volledige verwijdering van alle pseudo-eilandjes te garanderen. Pseudoislets vormen stevige aggregaten en blijven na het heffen samengevoegd. De pseudo-eilandjes zijn nu klaar voor downstreamexperimenten.
- Bepaal het gewenste aantal cellen per pseudo-eilandje en het aantal pseudo eilandjes om te maken. Meestal worden 1000 − 3000 cellen gebruikt voor elk pseudo eilandje voor een 96-goed ultra-lage bevestigingsplaat. Voor 3.000 cellen per pseudo eilandje, stel de celsuspensie in op 1 x 105 cellen/ml door de pellet van het eilandje te resuspenteren uit stap 2,10 in 10% HiFBS cmrl, zodat 30 μL celsuspensie 3.000 cellen heeft. Bereken het totale volume van 1 x 105 cellen/ml enkelvoudige celsuspensie (ml) met behulp van de volgende vergelijking:
- Protocol met behulp van een 24-Well micro well cultuur plaat
- Opwarmen van de anti-hechting spoeloplossing (tabel van de materialen) naar RT voor efficiënte spheroid vorming. Ook, pre-warm Plain CMRL-1066 en 10% HiFBS CMRL.
- Voeg 500 μL per put van de anti-hechting spoeloplossing toe aan elk goed van de 24-Well micro well cultuur plaat die gebruikt kan worden voor pseudo-eilandjes. Centrifugeer bij 1.300 x g gedurende 5 minuten in een swingende emmer plaat centrifuge.
- Let op de plaat onder een microscoop om ervoor te zorgen dat luchtbellen worden verwijderd uit micro putten. Als er luchtbellen worden gevangen in micro putten, centrifugeer dan opnieuw bij 1.300 x g gedurende 5 minuten.
- Aspirate de anti-hechting spoeloplossing uit de putten in een BSC. Spoel elk goed met 2 mL warme Plain CMRL-1066 eenmaal. Aspirate CMRL-1066. Voeg toe 0,5 mL/goed van warme 10% HiFBS CMRL aan elke goed gepland voor gebruik. Wells zijn nu klaar voor het laden van verspreide menselijke eilandje cellen bereid in stap 2,10.
- Bepaal het totale aantal cellen dat nodig is voor elke put. Een goed van 24-Well micro well cultuur plaat bevat 1.200 micro putten en vormen 1.200 pseudoislets. 500 cellen per pseudo eilandje x 1200 micro Wells = 6 x 105 cellen. Respendeer enkele cellen van stap 2,10 tot 6 x 105 cellen in 0,8 ml 10% HiFBS cmrl in een steriele 1,5 ml tube.
Opmerking: Het maximale volume per put is 2 mL. Het volume van de celsuspensie mag niet groter zijn dan 1,5 mL. Het protocol beschrijft stappen voor het maken van een put van pseudo eilandje getransduceerde door lentivirus. Opschalen afhankelijk van het aantal putjes dat voor elk linvirus moet worden gemaakt. - Voor virale transductie, voeg 125 TU/cel toe aan de eencellige suspensie. Houd het volume van het virus onder 0,2 mL. Inbroed de cel en het virus mengsel bij 37 ° c met occasioneel Zacht mengen voor 1 h om contact van cellen met virus toe te staan vóór condensatie van cellen in stap 3.2.8.
Opmerking: Gebruik geconcentreerd lentivirus zodat het volume van lentivirus toegevoegd is minimaal. Een lager aantal TU per cel wordt gebruikt voor protocol 2 in vergelijking met protocol 1, omdat het totale volume van het medium per cel minder is. Echter, titer vereist per cel voor efficiënte gen-uitschakeling kan verschillen afhankelijk van de lentivirale constructie en moet worden geoptimaliseerd.
Let op: Lentivirus is geclassificeerd als bioveiligheid niveau 2 en kan worden geïntegreerd in DNA van geïnfecteerde cellen. - Pas na 1 uur het totale volume van de eilandje-cel en het virus mengsel aan tot 1 mL door 10% HiFBS-CMRL toe te voegen. Als cellen na 1 h incubatie een klonter vormen, dispergeer dan in eencellige suspensie door voorzichtig en snel pipetteren 2 − 3 keer. Het pipetteren is zeer belangrijk voor gelijkmatige verdeling van cellen in micro putten. Breng celsuspensie over naar een put van de 24-Well micro well cultuur plaat.
- Centrifugeer onmiddellijk na het pipetteren op 100 x g gedurende 3 minuten bij RT om cellen in alle micro putten vast te leggen. Observeer onder een microscoop om te controleren of cellen gelijkmatig in alle micro putten worden verdeeld.
- Kweek de micro well cultuur plaat bij 37 °C in een 5% CO2 incubator. Pseudoislets vormen in 24 − 48 h. Pseudoislets kunnen worden gekweekt zonder gemiddelde verandering gedurende maximaal 7 dagen.
- Als u het medium voor cultuur na 7 dagen wijzigt, vervangt u 50% − 75% van het medium voor elke gemiddelde verandering als volgt. Verwijder langzaam 0,5 − 1 mL medium met behulp van een P1000 Pipet van elke put. Voeg langzaam 0,5 − 1 mL verse 10% HiFBS CMRL toe door een punt aan de wand van de put te plaatsen om te voorkomen dat pseudoislets uit de micro well cultuur plaat worden ontzet.
- Voor te bereiden voor het oogsten van pseudoislets, opwarmen van de 10% HiFBS CMRL medium. Pseudoislets hebben de neiging om te zweven in serum vrije CMRL-1066 waardoor het moeilijk is om ze te plukken.
- Aspirate 0,5 mL medium van goed met behulp van een 1 mL pipet en verdeel de media krachtig terug naar het oppervlak van de plaat om pseudoislets op te tillen van de micro well cultuur plaat.
- Voorzichtig aanzuigen van pseudoislets met behulp van de Pipet van 1 ml en de overdracht van eilandjes in een niet-weefselcultuur behandeld 6-well plaat. Passeren een kleine 37 μm omkeerbare zeef geplaatst op een 15 mL conische buis. Pseudo-eilandjes blijven op het filter staan; alle afzonderlijke cellen worden doorgegeven.
Opmerking: Om te voorkomen dat kleinere grootte pseudo-eilandjes door middel van zeef, kan de zeef worden weggelaten. - Verdeel 1 ml 10% hifbs cmrl over het gehele oppervlak van de put om eventuele overgebleven pseudo-eilandjes te Verdoe-gen, aspiraat-pseudoislets uit te stellen en door de zeef te passeren. Herhaal 3x om volledige collectie van alle pseudoislets uit Wells te garanderen.
- Observeer de titer cultuur plaat onder een Inverteer Microscoop om ervoor te zorgen dat alle pseudoislets worden verzameld. Herhaal de wassing zoals in stap 3.2.14 als pseudoislets blijven.
4. RNA-extractie voor evaluatie van gen-uitschakeling-efficiëntie
- Kies pseudoislets in de RNase vrije PBS in een micro centrifugebuis van 1,5 mL en centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 minuten bij 4 °c. Verwijder PBS zonder het eilandje te storen en was eenmaal met PBS, gevolgd door centrifugeren bij 300 x g gedurende 3 minuten bij 4 °c.
- Zuig de meeste PBS met behulp van een P1000 pipet. Vervolgens verandert u in een P10-pipet om de rest van PBS te verwijderen zonder de pellet van het eilandje te verstoren.
- Voeg 0,5 ml teruggehydrolyseerd kaliumthiocyanaat RNA-extractie reagens (tabel met materialen) toe per buis. Homogeniseren de pseudoislets met behulp van een Motorgestuurde stamper 2 − 3 keer. Het homogenaat in het teruggehydrolyseerd kaliumthiocyanaat RNA-extractie reagens kan nu worden opgeslagen bij-80 °c of worden verwerkt voor RNA-zuivering.
Opmerking: 24 van de 3.000 cel-pseudoislets gevormd in een 96 goed bord of 48 van de 500 cel-pseudoislets gevormd in een micro well cultuur plaat volstaan om 0,5 − 1 μg RNA te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 illustreert de belangrijkste stappen in de productie van pseudoislets met behulp van een 96-well Ultra-Low-bevestigingsplaat en een micro well-kweek plaat. Figuur 2a toont sequentiële veranderingen in de morfologie tijdens de vorming van pseudo-eilandjes van 3 x 103 menselijke eilandje cellen in een 96-goed ultra-lage bevestigingsplaat. Monolayer of losse klonters cellen waargenomen in dag 1 veranderden in vaste aggregaten met een gladde, ronde rand op dag 5 tot 7 (Figuur 2a). In een micro well cultuur plaat is de vorming van massieve pseudoislets meestal zichtbaar binnen 4 dagen (Figuur 2b). Toen 600 cellen/titer werden geplateerd in de micro well cultuur plaat, werden menselijke eiland cellen gecondenseerd in spheroïden van uniforme grootte. Er wordt opgemerkt dat een micro well cultuur plaat de succesvolle vorming van pseudoislets uit een klein aantal cellen mogelijk maakt in vergelijking met een 96-goed ultra-lage bevestigingsplaat. Meestal zijn er meer dan 1.500 cellen/pseudo-eilandje nodig voor een 96-goed ultra-lage bevestigingsplaat, terwijl 500 cellen/pseudo Islet voldoende zijn voor een 24-Well micro well cultuur plaat. Met succes gevormde pseudoislets blijven als spheroïden na herstel van een 96 ultra-lage bevestigingsplaat of een micro well cultuur plaat en zijn compatibel voor downstreamtoepassingen, waaronder statische incubatie (Figuur 3a) en Perifusie (figuur 3B). de uniforme grootte van pseudo-eilandjes vermindert de variatie binnen een testgroep en maakt statische incubatie mogelijk met slechts 5 pseudo-eilandjes per meting (Figuur 3a). Ook, menselijke pseudoislets onderhouden robuuste eerste fase insuline secretie in reactie op glucose na 7 dagen van de cultuur wanneer de oorspronkelijke menselijke eilandjes gekweekt voor een vergelijkbare periode toonde de eerste fase glucose-gestimuleerd insuline secretie ( Figuur 3b)5. De introductie van lentivirus in een eencellige suspensie waarborgt de efficiënte en homogene transductie van eiland cellen en bereikt een zeer efficiënte Downregulatie van genen zoals weergegeven in figuur 3c. Alle getoonde resultaten werden verkregen met behulp van menselijke eilandjes van niet-diabetische donoren.
Figuur 1: proces van menselijke pseudo-eilandje voorbereiding. a) de suspensie die 4.000 IEQ van menselijke eilandjes bevat, troebel wordt na de spijsvertering door een proteolytisch en collagenolytisch enzym mengsel en milde Pipetteer functie. b) menselijke eilandjes na dispersie door een zeef worden doorgegeven. Onverteerde eilandjes die bovenop de zeef achterblijven, worden gedispergeerd met een 1 mL zuiger van de spuit. (c, d) Microscoop-afbeeldingen van de eencellige suspensie met 3.000 cellen/goed in een 96-goed ultra-lage bevestigingsplaat vóór (c) en na (d) centrifugeren. (e, f) Microscoop-afbeeldingen van de eencellige suspensie met 500 cellen/titer in een 24-Well micro well cultuur plaat vóór (e) en na (f) centrifugeren. Schaalbalk = 250 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: morfologie van menselijke pseudoislets. Sequentiële veranderingen in de morfologie van menselijke pseudoislets gemaakt (a) in een 96-goed ultra-lage bevestigingsplaat van 3.000 cellen en (b) in een 24-Well micro well cultuur plaat van 500 cellen. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: voorbeelden van Functionele assays met behulp van menselijke pseudoislets. a) representatieve statische incubatie uitgevoerd met behulp van humane pseudoislets die in een micro well-kweek plaat zijn gemaakt van één donor ter grootte van 500 menselijke eilandjes per pseudo eilandje. Vier sets van 5 pseudoislets werden gedurende 1 uur geïnincubeerd in Krebs-Ringer bicarbonaat buffer aangevuld met een glucose van 2 mM of 16,8 mM. Elk symbool vertegenwoordigt de insuline secretie van één set van 5 pseudo-eilandjes. De gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) wordt weergegeven. *, p < 0,05 door student t test. Representatieve resultaten van drie donoren. b) representatieve periofusie test van de insuline secretie van humane pseudoislets, gemaakt in een titer kweek plaat in reactie op 16,7 mm glucose en 30 mm KCl. methode voor perifusion werd eerder gepubliceerd5. Gemiddelde ± SEM insuline secretie uit twee sets van 40 pseudoislets gemaakt in een micro well cultuur plaat van een enkele donor op de grootte van 500 menselijke eilandjes cellen per pseudo eiland plaat wordt getoond. Representatieve gegevens van zes donoren. (c) pseudoislets werden gemaakt met lentivirus met shRNA gericht op humane atgl (gericht op CCTGCCACTCTATGAGCTTAA, left) of PLIN5 (gericht op GACAAGCTGGAAGAGAAGCTT, rechts). Controle pseudoislets waren getransduceerde met lentivirus uitdrukken van roerei (SCR) eerder gepubliceerde5. De mRNA-uitdrukking van elk gen werd bepaald door de real-time polymerase kettingreactie (PCR) zoals eerder gepubliceerd5. Gegevens werden uitgedrukt met 2-ddct inname van peptidylprolyl isomerase b (ppib) als een interne controle17. Elke stip staat voor gegevens van elke donor voor een aangegeven primer en een gegevensset van dezelfde donor is met elkaar verbonden door een lijn. N = 3 donoren. *; p < 0,05 door student t-toets. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier, een gedetailleerd protocol voor het genereren van menselijke pseudoislets die door lentivirus worden getransduceerd met behulp van een 96-goed ultra-lage bevestigingsplaat of een micro well cultuur plaat wordt gepresenteerd. Pseudoislets zijn gemeld om morfologie en secretoire functies te demonstreren die vergelijkbaar zijn met inheemse menselijke eilandjes en kunnen worden gekweekt voor langere tijd in vitro5,11,18. In tegenstelling tot inheemse menselijke eilandjes die een grote variatie in grootte vertonen, zijn pseudo-eilandjes relatief uniform in grootte, waardoor de variatie tussen donoren en experimentele replicaten van5,11wordt verminderd. Downregulatie van genen die een hoge efficiëntie van transductie vereisen, kan gemakkelijk worden uitgevoerd voorafgaand aan de vorming van pseudoislets in eencellige suspensie. Deze methode vermijdt de moeilijkheid van virale penetratie door lagen cellen in intacte eilandjes. Zo heeft dit eenvoudige, zeer efficiënte en reproduceerbare protocol voor het maken van menselijke pseudoislets brede toepassingen.
Hoewel er verschillende platformen zijn gerapporteerd voor de vorming van pseudoislets12,14,19,20, zijn zowel een 96-goed ultra-lage bevestigingsplaat als een micro well cultuur plaat commercieel beschikbaar, waardoor deze techniek door elk laboratorium kan worden goedgekeurd. Hoewel de Hanging drop methode12 ook de vorming van menselijke pseudoislets met gemeenschappelijk labware mogelijk maakt, omvatten mogelijke beperkingen de moeilijkheid om de grootte en reaggregation duur van pseudo-eilandjes te beheersen. Deze beperkingen waren het gevolg van het beperkte volume per druppel pseudo-eilandje en voortdurende verdamping tijdens de 5 − 7-daagse cultuur die nodig was voor de vorming van pseudo-eiland. Bovendien is het gemakkelijker om lentivirus te bevatten met het gebruik van een 96 goed ultra-lage bevestigingsplaat of een micro well cultuur plaat in vergelijking met de Hanging-drop methode.
Verschillende stappen in het protocol vereisen nauwe aandacht. Het optimaliseren van de vertering van intacte eilandjes met het Proteolytische en collagenolytische enzym mengsel is van cruciaal belang, aangezien zowel de ondervergisting als overmatige spijsvertering de opbrengst van eencellige suspensie zal verminderen en vervolgens de aggregatie van pseudoislets beïnvloedt. Tijdens de spijsvertering is het belangrijk om de eilandjes nauwlettend te volgen voor het verdwijnen van klonten en de toename van vertroebelingen als eilandjes dissociëren in afzonderlijke cellen. Het is belangrijk op te merken dat de optimale tijd voor de spijsvertering varieert tussen eilandjes van verschillende donoren. De optimale tijd is afhankelijk van verschillende factoren, waaronder medische geschiedenis en leeftijd van elke donor, de lengte van ischemie tijd, de eilandje isolatie procedure gebruikt, eilandje grootte, eilandje zuiverheid, eilandje levensvatbaarheid, en scheepvaart voorwaarden. Typisch, menselijke eilandjes met levensvatbaarheid en zuiverheid hoger dan 80% en binnen 5 dagen van isolatie worden gebruikt. Zorgvuldige en zachte pipetteren tijdens de dispersie is ook belangrijk om de levensvatbaarheid en het herstel van de cel te behouden, wat uiteindelijk de celaggregatie beïnvloedt en de uiteindelijke grootte van pseudo-eilandjes wordt gevormd. Bij het doseren van eilandje celsuspensie naar Wells (stappen 3.1.4 en 3.2.7), is een zachte en grondige menging van cellen belangrijk om een gelijkmatige verdeling van afzonderlijke cellen in micro putten te bereiken. Als cellen na 1 uur incubatie met lentivirus samen klonteren, vereist het een zachte Pipetteer wijze om de klonten te breken tot één celsuspensie voorafgaand aan de uiteindelijke centrifugeren.
We hebben een soortgelijk succes gehad bij het creëren van menselijke pseudoislets na lentivirale transductie met behulp van zowel een 96-goed plaat en micro well cultuur plaat. De keuze tussen de twee platformen is afhankelijk van de gewenste grootte en het aantal pseudo-eilandjes. Een micro well cultuur plaat heeft kleine, piramidevormige bodems waardoor condensatie van een kleiner aantal cellen in vergelijking met een 96 goed ronde bodemplaat. Zo kan het aantal cellen per pseudo eilandje worden verlaagd voor een micro well cultuur plaat. Bovendien creëert een enkele centrifuge stap alle pseudoislets tegelijkertijd in een micro well cultuur plaat, terwijl meerdere Pipetteer nodig is voor het maken van pseudoislets in een 96-well plate. Zo is het opschalen van de creatie van pseudoislets makkelijker in een micro well cultuur plaat. De momenteel beschikbare micro well cultuur plaat biedt echter geen flexibiliteit in het aantal pseudo-eilandjes dat wordt gecreëerd. Momenteel is het minimum aantal pseudo-eilandjes gemaakt met behulp van een micro well cultuur plaat 1.200 en kan alleen worden verhoogd door de factor 1.200. Zo gebruiken we meestal een 96-well plate voor kleinschalige pilot experimenten en voor een experiment waarbij kleine hoeveelheid monsters voldoende is, zoals een insuline secretie assay en RNA-extractie voor genexpressie. We hebben pseudoislets gebruikt van een micro well-cultuur plaat voor assays die grote aantallen cellen vereisen, zoals Western Blot, zuurstofverbruik door een metabole analysator en triglyceriden extractie.
De belangrijkste beperkende factor voor de generatie van menselijke pseudo-ismen is het verlies van cellen tijdens de bereiding van eencellige suspensie. Terwijl 1 IEQ van menselijk eilandje wordt geacht ongeveer 2.000 cellen bevatten, het herstel van eencellige suspensie is meestal 30% of lager als gevolg van meerdere wassen en passeren door een zeef. Heterogeniteit van de eilandje grootte maakt het ook moeilijk om alle eilandjes tegelijkertijd te ontkoppelen. Hoewel zachte Pipetteer werkzaamheden en het gebruik van het Proteolytische en collagenolytische enzym mengsel in het protocol inspanningen zijn om mechanische en enzymatische krachten te combineren voor een maximaal herstel van afzonderlijke cellen, is er nog steeds een onvermijdelijk verlies van cellen. Zo vereist de toepassing van pseudo-eilandjes een duidelijke rechtvaardiging voor het bestuderen van intact menselijke eilandjes. Er moet ook aan worden herinnerd dat de insuline secretie van pseudo-eilandjes robuuster is dan eilandjes die voor dezelfde periode van de tijd worden gekweekt, maar meestal lager zijn in vergelijking met vers geïsoleerde eilandjes5,11.
Hoewel er beperkingen bestaan, is een stabiele en zeer efficiënte genuitschakeling gecombineerd met een beter behoud van de glucose-gestimuleerde insuline secretie gedurende langere tijd in de cultuur de beoordeling van genfunctie in menselijke eiland cellen mogelijk maken. Bovendien wordt de complexe intercellulaire communicatie tussen bèta-bèta en bèta-niet-bètacellen voorgesteld om een regelgevende rol te hebben in de functie van Islet. Er is momenteel echter beperkte informatie over intercellulaire communicatie binnen menselijke eilandjes. Met een verhoogde beschikbaarheid van cel-specifieke markers21, is het haalbaar om menselijke pseudoislets met gedefinieerde celsamenstelling te maken, zoals onlangs gerapporteerd in muis eilandjes cellen22, die een beter begrip van de cel-cel zal vergemakkelijken communicatie tussen menselijke eiland cellen. De recente vooruitgang van de beeldvorming van driedimensionale weefsels verhoogt ook mogelijk het nut van menselijke pseudoislets als een model om te ontmaskeren hoe cellulaire polariteit en intercellulaire communicatie worden gereguleerd in menselijke eilandjes. Zo bieden menselijke pseudoislets een nuttig model om de functies van genen van belangstelling en andere vragen op het gebied van de biologie van het eiland te ontleden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd financieel gesteund door National Institutes of Health to Y.I. (R01-DK090490) en American Diabetes Association Y.I. (1-17-IBS-132). J.A. en Y.I. worden ondersteund door de broederlijke orde van het Eagles Diabetes Research Center. A.B. wordt gesteund door een National Institutes of Health Training Grant (T32NS45549). Auteurs gebruikten menselijke pancreas eilandjes geboden door het door NIDDK gefinancierde geïntegreerde Islet-distributieprogramma (IIDP) in City of Hope (2UC4DK098085).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-adherence rinsing solution | Stemcell technologies | 7919 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series Type A2 | |
| Cell strainer, 40 micrometer | Corning | 431750 | |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530037 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | Heracell VIOS 160i | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent | ThermoFisher | 15596026 | Trizol |
| Glutamine | ThermoFisher | 25030164 | |
| Hemocytometer | Marien Feld | Neubauer-Improved Bright line | |
| Human serum albumin | Sigma | A1653 | |
| Inverted microscope | Fisher brand | 11-350-119 | |
| Microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 20 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microwell culture plate | Stemcell technologies | 34411 | Aggrewell 400, 24 well |
| Motor-driven pestle | GAMUT | #399X644 | |
| Non-tissue culture treated dish, 10 cm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| PBS | ThermoFisher | 14190250 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Petri dish, 35 mm | Celltreat | 229638 | |
| Pipette, 5 mL | DOT Scientific, | 667205B | |
| Pipette, 8-channel | VWR | #613-5253 | |
| Pipette, 10 mL | VWR | 667210B | |
| Pipette, P10 | Denville | UEZ-P-10 | |
| Pipette, P200 | Denville | UEZ-P-200 | |
| Pipette, P1000 | Denville | UEZ-P-1000 | |
| Proteolytic and collagenolytic enzyme mixture | Sigma | A6965 | Accutase |
| Reagent reservoir, 50 mL | VWR | 89094-680 | |
| Reversible strainer, 37 micrometer | Stemcell technologies | 27251 | |
| Swing bucket plate centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14R | |
| Swing bucket rotor | Beckman Coulter | SX4750A | |
| Tuberculin syringe, 1 mL | BD | 309659 | |
| Ultra low attachment microplate, 96 well | Corning | 4515 |
References
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. Stable and flexible system for glucose homeostasis. Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).
- Cryer, P. E. Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes. Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).
- Arrojo e Drigo, R., et al. New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment. Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).
- Harata, M., et al. Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets. Physiological Reports. 6 (20), e13907 (2018).
- Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response. Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).
- Hughes, A., et al. Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus. Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).
- Jimenez-Moreno, C. M., et al. A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors. Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).
- Bonora, E., et al. Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).
- Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets. Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).
- Yu, Y., et al. Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice. Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).
- Zuellig, R. A., et al. Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).
- Caton, D., et al. Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells. Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Peiris, H., et al. Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays. Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).
- Schlimgen, R., et al. Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Li, N., et al. Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).
- Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening. British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).
- Hilderink, J., et al. Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).
- Saunders, D. C., et al. Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis. Cell Metabolism. (18), (2018).
- Reissaus, C. A., Piston, D. W. Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets. Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).
