Summary
Un protocole pour créer des pseudoislets humains modifiés de gène des cellules humaines dispersées d'îlots qui sont transduced par lentivirus portant l'ARN court d'épingle à cheveux (shRNA) est présenté. Ce protocole utilise des vaisseaux d'enzymes et de culture facilement disponibles, peut être exécuté facilement, et produit des pseudoislets humains génétiquement modifiés appropriés pour des études fonctionnelles et morphologiques.
Abstract
Divers outils génétiques sont disponibles pour moduler les gènes dans les îlots pancréatiques des rongeurs pour disséquer la fonction des gènes des îlots pour la recherche sur le diabète. Cependant, les données obtenues à partir d'îlots de rongeurs ne sont souvent pas entièrement reproduites ou applicables aux îlots humains en raison de différences bien connues dans la structure et la fonction des îlots entre les espèces. Actuellement, les techniques qui sont disponibles pour manipuler l'expression génique des îlots humains sont très limitées. L'introduction du transgène dans les îlots intacts par l'adénovirus, le plasmide et les oligonucléotides souffre souvent d'une faible efficacité et d'une toxicité élevée. La faible efficacité est particulièrement problématique dans les études de dérégulation des gènes dans les îlots intacts, qui exigent une grande efficacité. On sait que les cellules d'îlots enzymatiquement dispersées se réagrégent dans la culture formant des sphéroïdes appelés pseudoislets. La réaggrége des cellules humaines d'îlots contrôlées par la taille crée des pseudoislets qui maintiennent la sécrétion dynamique d'insuline de première phase après une culture prolongée et fournissent une fenêtre pour introduire efficacement l'ARN lentiviral à épingle à cheveux courte (ARSH) avec une faible toxicité. Ici, un protocole détaillé pour la création des pseudoislets humains après la transduction lentivirale utilisant deux plaques multiwell disponibles dans le commerce est décrit. Le protocole peut être facilement exécuté et permet une régulation efficace des gènes et l'évaluation du dynamisme de la sécrétion d'insuline à l'aide de cellules d'înets humains. Ainsi, les pseudoislets humains avec la modulation médiée de gène lentiviral fournissent un modèle puissant et polyvalent pour évaluer la fonction de gène dans les cellules humaines d'îlots.
Introduction
La perte de masse cellulaire bêta fonctionnelle est la pathologie centrale pour le diabète de type 1 et de type 21. Alors que les cellules bêta sont les producteurs d'insuline dans les îlots pancréatiques, la communication entre les cellules bêta et les cellules non bêta joue un rôle critique dans la régulation de la sécrétion d'insuline2. En outre, la dysrégulation de la sécrétion de glucagon contribue à l'hyperglycémie dans le diabète3. Ainsi, il y a un grand intérêt à moduler l'expression génique des cellules dans les îlots pancréatiques pour aborder le mécanisme derrière le développement du dysfonctionnement d'îlots dans le diabète. Une variété d'approches comprenant des souris transgéniques sont disponibles pour moduler l'expression de gène des îlots de souris. Cependant, les îlots humains et de souris montrent l'innervation distincte, la distribution cellulaire, le rapport de bêta aux cellules alpha, et la réponse aux sécréagogues4. Par conséquent, l'évaluation directe de la fonction génique dans les îlots humains est extrêmement importante pour comprendre la pathophysiologie des îlots pancréatiques humains.
Le vecteur adénoviral est le vecteur viral le plus largement utilisé pour transduire les îlots pancréatiques in vitro en raison de la forte efficacité de la transduction dans les cellules non-divisantes. Cependant, l'adénovirus ne pénètre pas efficacement au cœur des îlots, en particulier dans les îlots humains5, et est cytotoxique à fortes doses6. En comparaison, le vecteur lentiviral est moins cytotoxique et délivre des gènes exogènes de façon permanente dans le chromosome des cellules post-mitotiques, ce qui en fait un véhicule largement testé pour la thérapie génique7. Cependant, la capacité du lentivirus à pénétrer le noyau des îlots humains intacts est également limitée, nécessitant ainsi une dispersion partielle par digestion enzymatique pour augmenter l'efficacité de la transduction8. La mise en garde avec la dispersion des îlots humains intacts est l'interruption de la communication cellule-cellule et cellule-matrice,qui compromet la régulation dynamique de la sécrétion d'insuline critique pour le maintien de l'homéostasie de glucose chez l'homme 9. Ainsi, il a été difficile d'évaluer l'impact de la modulation des gènes sur la régulation dynamique de la fonction des îlots dans un modèle d'îlots humains.
On sait que les cellules des îlots dispersés des îlots humains et des rongeurs se réagroupent de façon autonome en structures semblables à des îlots appelées « pseudoislets ». Pseudoislets montrent la distribution des cellules bêta et non bêta similaire aux îlots indigènes10,11. En outre, après la culture à long terme, les îlots indigènes perdent progressivement la sécrétion robuste d'insuline de première phase5,10,11,12. Pourtant, les pseudoislets ont démontré une meilleure conservation de la sécrétion d'insuline de première phase en réponse au glucose comparé aux îlots indigènes après la même période de culture5. En plus d'avoir une meilleure conservation de la sécrétion d'insuline, la réagrégation contrôlée par la taille des cellules des frayons humains dans les plaques à faible attachement11 offre une fenêtre d'opportunité pour introduire des vecteurs de lentivirus avant leur réaggrégement dans pseudoislets. Plusieurs études ont démontré l'utilité des pseudoislets combinés à la transduction médiée par lentiviral. Caton et coll.13 ont signalé que l'introduction de la protéine fluorescente verte (GFP) exprimant le lentivirus avait peu d'effet sur la sécrétion d'insuline tout en atteignant l'expression homogène du GFP dans les pseudoislets de rat comparés au contrôle non-infecté. Ils ont également démontré l'effet spécifique de différentes connexines sur la sécrétion d'insuline en surexprimant connexins 32, 36, et 43 par l'intermédiaire de lentivirus13. Les pseudoislets humains préparés avec une plaque d'attachement ultra-faible de 96 puits disponible dans le commerce ont démontré que la surexpression par le facteur de transcription SIX3 améliore la sécrétion d'insuline évaluée par incubation statique14. Récemment, des pseudoislets humains préparés avec une plaque d'attachement ultra-faible de 96 puits ont été utilisés pour réguler la glucokinase par l'intermédiaire de l'ARN lentiviral à épingle à cheveux courte (arsh) comme preuve de principe pour montrer que la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose est réduite, tandis que La sécrétion d'insuline stimulée par KCl a été préservée5. L'étude a également démontré que les pseudoislets humains sont semblables aux îlots indigènes dans l'expression des gènes et les profils sécréteurs, soutenant davantage l'utilité des pseudoislets humains pour disséquer la régulation de la fonction d'îlots5. Bien que la perifusion n'ait pas été effectuée, une plaque de culture de micropuits bioengineered qui est récemment devenue commercialement disponible, a été également rapportée pour être compatible pour la transduction lentivirale et a produit des pseudoislets humains qui ont exhibé l'excellente insuline sécrétion in vitro et in vivo après la transplantation11. Collectivement, la formation de pseudoislet humain combinée à la transduction lentivirale est une approche simple et efficace pour étudier la pathophysiologie humaine d'îlots, fournissant un outil valable pour effectuer des études mécanistes dans les îlots humains.
Dans le rapport actuel, un protocole pour former des pseudoislets humains transduiré s'est transduifait avec le lentivirus à l'aide de deux plates-formes disponibles dans le commerce, une plaque d'attachement ultra-faible de 96 puits et une plaque de culture de micropuits est présentée. Les deux permettent de modulation efficace de l'expression génique et de créer des pseudoislets humains compatibles pour les évaluations en aval, y compris l'incubation statique et la perifusion.
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Protocol
Avant le début des études, une détermination de la recherche sur les sujets humains a été faite par la Commission d'examen institutionnel de l'Université de l'Iowa, qui a déterminé que l'étude ne répondait pas aux critères de recherche sur les sujets humains. Consultez la commission d'examen locale avant le début de l'étude afin de déterminer si la source des îlots et l'étude prévue doivent être approuvées au préalable.
REMARQUE: En règle générale, 1 200 à 1 400 îlots équivalents (IEQ) d'îlots humains sont nécessaires pour la formation de 192 pseudoislets de la taille de 3 000 cellules/pseudoislets dans une plaque d'attachement ultra-faible de 96 puits ou 1 200 pseudoislets de la taille de 500 cellules/pseudoislets dans un plaque de culture microwell. IEQ des îlots requis varie entre les différentes préparations des îlots humains que les facteurs de donneur (âge, santé, poids), l'efficacité de l'isolement, et les conditions de culture affectent le rendement de la suspension de cellule unique. Dans ce protocole, le lentivirus contenant du shRNA ciblant un gène d'intérêt est utilisé. Le cytomégalovirus (CMV) et le pestphosglycéride humain kinase (hPGK) vecteurs lentiviraux basés sont signalés à réguler le gène efficacement dans les pseudoislets humains5,15. L'utilisation du lentivirus nécessite des précautions comme biorisque16. Communiquez avec le comité local de biosécurité avant le début de l'utilisation du lentivirus.
1. La culture de nuit des îlots humains pour la récupération après expédition
- Préparer Connaught Medical Research Laboratories 1066 (CMRL-1066) moyen complété par 1% d'albumine de sérum humain (HSA) en combinant 50 ml de CMRL-1066, 0,5 g de HSA, 0,5 mL de pénicilline-streptomycine et 0,5 mL de glutamine de 100 mg/mL (1 % HSA CMRL) en sécurité (BSC) et en passant par un filtre de 0,2 m pour la stérilisation.
- Faites tourbillonner doucement la bouteille d'expédition pour maintenir les îlots en suspension. Transférer le milieu d'expédition contenant des îlots dans un tube conique de centrifugeuse de 50 ml. Laisser reposer le tube en BSC pendant 15 minutes afin que les îlots se déposent au fond du tube.
- Retirer doucement le milieu d'expédition sans déranger la pastille d'îcàme à l'aide d'une pipette de 10 ml. Resuspendre la pastille d'înce en 1% HSA CMRL à une concentration de 400 IEQ/mL.
- Transférer les îlots dans un plat traité par culture non tissulaire. Si les îlots sont divisés en plusieurs plats, conserver les îlots uniformément suspendus à feu moyen en tourbillonnant doucement avant de les fendre. Îlots de culture à 37 oC dans un incubateur de CO2 de 5 % pendant la nuit.
REMARQUE: L'utilisation d'un plat traité par culture non tissulaire est nécessaire pour empêcher l'attachement des îlots à l'assiette.
2. Préparation de la suspension à cellule unique des îlots humains
- Préparer ce qui suit: CMRL-1066 moyen avec 10% de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (HiFBS), pénicilline-streptomycine, et la glutamine (10% HiFBS CRML) à température ambiante (RT), une passoire de 40 m, un plat Petri de 35 mm, une seringue de 1 mL de tuberculine, et un hécymocytomètre.
- Transférer les îlots humains après la culture de nuit dans un tube conique de centrifugeuse de 15 ml. Centrifugeuse à 190 x g pendant 5 min dans un rotor à seau oscillant. Aspirer le milieu avec une pipette de 5 ml sans déranger la boulette d'îtte.
- Laver la pastille en ajoutant 10 ml de saline tamponnée de phosphate (PBS) dans le tube, mélanger délicatement et la centrifugeuse à 190 x g pendant 5 min. Aspirate PBS sans déranger la pastille d'îc.
- Resuspendre la pastille d'îlots dans 0,5 ml d'un mélange d'enzymes protéolytiques et collagènes préréchauffé et une pipette 5x à l'aide d'une pipette P1000 pour mélanger les îlots. Incuber à 37 oC pendant 5 min. Mélanger en faisant monter et descendre doucement 1 à 5 fois.
REMARQUE: Le tuyautage agressif augmentera la perte cellulaire. - Vérifiez la nébulosité (cellules uniques) et le nombre de flocons (îlots non digérés). Ajouter de 2 à 3 min à 37 oC d'incubation selon l'étendue de la digestion jugée par la nébulosité et le nombre de flocons. Arrêter la digestion lorsque les flocons sont réduits à 10 % de la prédigestion et que la solution est trouble.
REMARQUE: Le temps requis pour la digestion diffère en fonction de la distribution de la taille des îaux de chaque préparation d'îcles humains. - Placer une passoire de 40 m dans un plat Petri de 35 mm et mouiller la passoire en ajoutant 1 ml de 10 % HiFBS CMRL et en appuyant sur un piston à seringues de 1 ml. Transférer toute la suspension cellulaire sur le dessus de la passoire et recueillir le passage dans un tube frais de 15 ml.
- Laver le tube utilisé pour la digestion des îaux avec 0,5 ml de milieu CMRL frais pour recueillir les cellules restantes et passer le lavage à travers la passoire. Mélanger le passage dans un tube de 15 ml. Répétez une fois.
- Ensuite, dissoisez les îlots non digérés restant sur la passoire en appuyant sur la passoire placée dans un plat de 35 mm avec un piston à seringues de 1 ml. Recueillir à nouveau la pass-through et laver la passoire avec cMRL-1066 frais pour enlever tous les îlots digérés restants de la passoire et du plat. Un total de 3 ml de suspension à une seule cellule sera désormais dans le tube de 15 ml.
- Enregistrez le volume total de la suspension cellulaire et prenez 10 aliquot ll de cellules pour compter le nombre de cellules sur un hémocytomètre.
- Centrifugeuse suspension cellulaire pendant 5 min à 200 x g. Retirer le milieu sans déranger la pastille. Passez à l'étape 3.1.1 si vous utilisez une plaque d'attachement ultra-faible de 96 puits ou une étape 3.2.1 si vous utilisez une plaque de culture de micropuits de 24 puits pour réagréger les cellules.
3. Formation de pseudoislet et transduction par Lentivirus
- Protocole utilisant une plaque d'attachement ultra-faible de 96 puits
- Déterminer le nombre souhaité de cellules par pseudoislet et le nombre de pseudoislets à créer. Typiquement, 1.000-3.000 cellules sont employées pour chaque pseudoislet pour une plaque d'attachement ultra-faible de 96 puits. Pour 3 000 cellules par pseudoislet, ajustez la suspension cellulaire à 1 x 105 cellules/mL en rependant la pastille d'înce de l'étape 2.10 dans 10% HiFBS CMRL de sorte que 30 'L de suspension cellulaire a 3.000 cellules. Calculer le volume total de 1 x 105 cellules/mL de suspension à une seule cellule (mL) requise à l'aide de l'équation suivante :
Le volume total de 1 x 105 cellules/mL de suspension à une seule cellule (mL) -(nombre de cellules par pseudoislet) x (nombre de pseudoislets en cours de production) / 1 x 105.
REMARQUE: Ajuster la concentration de la suspension cellulaire en fonction du nombre désiré de cellules par pseudoislet de sorte que 30 L de suspension cellulaire fait un pseudoislet. - Transférer le volume requis (30 X nombre x de pseudoislets en cours de travail) de suspension à une seule cellule dans un tube frais de 15 ml. Ajouter 250 unités de transduction (TU)/cellule de lentivirus contenant du shRNA ciblant un gène d'intérêt ou de contrôle.
MISE EN GARDE: Le lentivirus est classé comme niveau de biosécurité 2 et peut être intégré dans l'ADN des cellules infectées.
REMARQUE: Utilisez le lentivirus concentré de sorte que le volume de lentivirus ajouté est minime. Le tiseur requis par cellule pour un silençage efficace des gènes peut différer selon la construction lentivirale. - Mélanger la suspension cellulaire avec le virus en pipetting doucement 5x avec une pipette P1000. Transférer les cellules mélangées dans un réservoir de réactif stérile de 50 ml si vous utilisez une pipette à 8 canaux.
- Distribuer 30 L par puits de suspension à une seule cellule mélangé e avec du lentivirus dans chaque puits à l'aide d'une pipette à 8 canaux ou d'une pipette P200 selon le nombre de puits.
- Centrifuger la plaque de 96 puits dans une centrifugeuse à plaque oscillante à 270 x g à RT pendant 7 min. Vérifier si les cellules sont recueillies au centre de chaque puits. Si ce n'est pas le cas, la centrifugeuse à nouveau comme la collecte de toutes les cellules dans le centre du puits est critique pour la formation de pseudoislet. Culture à 37 oC dans un incubateur humidifié de 5 % de CO2 pendant la nuit.
- Ajouter 100 L de 10 % hiFBS CMRL préréchauffé par puits le lendemain matin pour éviter le séchage des cellules pendant la culture subséquente. Centrifugeuse à 270 x g,RT pour 7 min. Culture à 37 oC dans un incubateur de CO2 à 5 %. Les pseudoislets termineront la formation en 5 à 7 jours.
- Lors de la récolte des pseudoislets, réchauffez le volume désiré de 10 % hiFBS CMRL (100 l par îlots), préparez un réservoir stérile de 50 ml, un plat stérile Petri de 10 cm et une pipette à 8 canaux en BSC.
- Retirer la plaque de 96 puits de l'incubateur et la placer dans BSC. Pipette 100 l par islet de 10% HiFBS CMRL dans un réservoir.
- Pipette 100 l par puits de 10 % HiFBS CMRL d'un réservoir à des pseudoislets et des pipettes de haut en bas 2 à 3 fois doucement dans le puits pour soulever les îlots. Ensuite, aspirer le milieu dans le puits contenant un pseudoislet et éjecter dans un plat Petri de 10 cm. L'utilisation d'une pipette à 8 canaux permet le transfert de 8 pseudoislets à la fois.
- Vérifiez la plaque sous un microscope léger pour assurer l'élimination complète de tous les pseudoislets. Les pseudoislets forment des agrégats fermes et restent agrégés après le levage. Les pseudoislets sont maintenant prêts pour des expériences en aval.
- Déterminer le nombre souhaité de cellules par pseudoislet et le nombre de pseudoislets à créer. Typiquement, 1.000-3.000 cellules sont employées pour chaque pseudoislet pour une plaque d'attachement ultra-faible de 96 puits. Pour 3 000 cellules par pseudoislet, ajustez la suspension cellulaire à 1 x 105 cellules/mL en rependant la pastille d'înce de l'étape 2.10 dans 10% HiFBS CMRL de sorte que 30 'L de suspension cellulaire a 3.000 cellules. Calculer le volume total de 1 x 105 cellules/mL de suspension à une seule cellule (mL) requise à l'aide de l'équation suivante :
- Protocole utilisant une plaque de culture de micropuits de 24 puits
- Réchauffez la solution de rinçant anti-adhérence (Table of Materials) à RT pour une formation sphéroïde efficace. De plus, cMRL-1066 et 10 % HiFBS CMRL.
- Ajouter 500 L par puits de la solution de rinçant anti-adhérence à chaque puits de la plaque de culture de micropuits de 24 puits à utiliser pour les pseudoislets. Centrifugeuse à 1 300 x g pendant 5 min dans une centrifugeuse à assiette oscillante.
- Observez la plaque sous un microscope pour s'assurer que les bulles d'air sont retirées des micropuits. Si des bulles d'air sont emprisonnées dans des micropuits, centrifugeuse à 1 300 x g pendant 5 min à nouveau.
- Aspirez la solution de rinçant anti-adhérence des puits dans un BSC. Rincer chaque puits avec 2 ml de CMRL-1066 plat chaud une fois. Aspirate CMRL-1066. Ajouter 0,5 mL/puits de chaud 10% HiFBS CMRL à chaque bien planifié pour une utilisation. Les puits sont maintenant prêts à charger des cellules d'ists humains dispersés préparées à l'étape 2.10.
- Déterminer le nombre total de cellules nécessaires pour chaque puits. Un puits de 24 puits de plaque de culture micropuits contient 1 200 micropuits et forme 1 200 pseudoislets. 500 cellules par pseudoislet x 1200 micropuitss 6 x 105 cellules. Resuspendre les cellules simples de l'étape 2.10 à 6 x 105 cellules dans 0.8 ml de 10% HiFBS CMRL dans un tube stérile de 1,5 ml.
REMARQUE: Le volume maximum par puits est de 2 ml. Le volume de suspension cellulaire ne doit pas dépasser 1,5 ml. Le protocole décrit les étapes pour créer un puits de pseudoislet transducé par lentivirus. Échelle en fonction du nombre de puits à faire pour chaque lentivirus. - Pour la transduction virale, ajouter 125 TU/cellule à la suspension à cellule unique. Maintenez le volume de virus en dessous de 0,2 ml. Incuber le mélange cellulaire et le mélange de virus à 37 oC avec un mélange doux occasionnel pendant 1 h pour permettre le contact des cellules avec le virus avant la condensation des cellules à l'étape 3.2.8.
REMARQUE: Utilisez le lentivirus concentré de sorte que le volume de lentivirus ajouté est minimum. Un nombre plus faible de TU par cellule est utilisé pour le protocole 2 par rapport au protocole 1, car le volume total du nombre moyen par cellule est inférieur. Cependant, le titer requis par cellule pour un silençage efficace des gènes peut différer selon la construction lentivirale et l'optimisation des besoins.
MISE EN GARDE: Le lentivirus est classé comme niveau de biosécurité 2 et peut être intégré dans l'ADN des cellules infectées. - Après 1 h, ajustez le volume total de la cellule de l'ît et du mélange de virus à 1 ml en ajoutant 10% HiFBS CMRL. Si les cellules se forment agglomérantes après 1 h d'incubation, dispersez-les en suspension à une seule cellule par un tuyauterie doux et rapide 2 à 3 fois. La pipetting est très importante pour une distribution uniforme des cellules à travers les micropuits. Transférer la suspension cellulaire à un puits de la plaque de culture de micropuits de 24 puits.
- Immédiatement après le tuyauterie, centrifugeuse à 100 x g pendant 3 min à RT pour capturer les cellules dans tous les micropuits. Observez au microscope pour vérifier que les cellules sont réparties uniformément dans tous les micropuits.
- Culture de la plaque de culture micropuits à 37 oC dans un incubateur de CO2 à 5 %. Les pseudoislets se formeront en 24 à 48 h. Les pseudoislets peuvent être cultivés sans changement moyen jusqu'à 7 jours.
- Lorsque vous changez le milieu de la culture au-delà de 7 jours, remplacez 50 % à 75 % du milieu pour chaque changement moyen comme suit. Retirez lentement 0,5 ml de milieu à l'aide d'une pipette P1000 de chaque puits. Ajouter lentement 0,5 à 1 ml de HiFBS CMRL frais en plaçant une pointe sur la paroi du puits pour éviter de déloger les pseudoislets de la plaque de culture du micropuits.
- Pour se préparer à la récolte des pseudoislets, réchauffez le milieu De 10% HiFBS CMRL. Pseudoislets ont tendance à flotter dans le sérum libre CMRL-1066, ce qui rend difficile de les ramasser.
- Aspirez 0,5 ml de milieu à partir d'un puits à l'aide d'une pipette de 1 ml et distribuez les milieux avec force à la surface de la plaque pour soulever les pseudoislets de la plaque de culture du micropuits.
- Aspirez doucement les pseudoislets délogés à l'aide de la pipette de 1 ml et transférez les îlots dans une culture non tissulaire traitée à 6 puits. Passer à travers une petite passoire réversible de 37 m placée sur un tube conique de 15 ml. Les pseudoislets resteront sur le filtre; toutes les cellules individuelles non constituées en société s'écouleront à travers.
REMARQUE: Pour éviter la perte de pseudoislets de plus petite taille par la passoire, la passoire peut être omise. - Distribuer 1 mL de 10% HiFBS CMRL sur toute la surface du puits pour déloger les pseudoislets restants, aspirer les pseudoislets délogés, et passer à travers la passoire. Répétez 3x pour assurer une collection complète de tous les pseudoislets des puits.
- Observez la plaque de culture du micropuits sous un microscope inversion pour s'assurer que tous les pseudoislets sont recueillis. Répétez le lavage comme à l'étape 3.2.14 si les pseudoislets restent.
4. Extraction d'ARN pour l'évaluation de l'efficacité du silençage génétique
- Choisissez des pseudoislets dans le PBS libre de RNase dans un tube de microcentrifuge de 1,5 ml et une centrifugeuse à 300 x g pendant 3 min à 4 oC. Retirer le PBS sans déranger la pastille d'îplier et laver une fois avec du PBS suivi d'une centrifugation à 300 x g pendant 3 min à 4 oC.
- Aspirez la plupart des PBS à l'aide d'une pipette P1000. Ensuite, passer à une pipette P10 pour enlever le reste de PBS sans déranger le granule d'îcet.
- Ajouter 0,5 ml de réagent d'extraction d'ARN thiocyanate de guanidinium (Tableau des matériaux) par tube. Homogénéiser les pseudoislets à l'aide d'un pilon motorisé pendant 2 à 3 fois. L'homogénéisme dans le réagent d'extraction d'ARN de thiocyanate de guanidinium peut maintenant être stocké à -80 oC ou traité pour la purification d'ARN.
REMARQUE : 24 des 3 000 pseudoislets cellulaires formés dans une plaque de puits de 96 ou 48 des 500 pseudoislets cellulaires formés dans une plaque de culture de micropuits sont suffisants pour obtenir 0,5 à 1 g d'ARN.
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Representative Results
La figure 1 illustre les étapes clés de la production de pseudoislets à l'aide d'une plaque d'attachement ultra-faible de 96 puits et d'une plaque de culture de micropuits. La figure 2a montre des changements séquentiaux dans la morphologie pendant la formation de pseudoislets à partir de 3 x 103 cellules d'îlots humains dans une plaque d'attachement ultra-faible de 96 puits. Monolayer ou amas lâches de cellules observés au jour 1 se sont transformés en agrégats solides avec une bordure lisse et ronde au jour 5 à 7 (Figure 2a). Dans une plaque de culture de micropuits, la formation de pseudoislets solides est habituellement visible dans les 4 jours (figure 2b). Quand 600 cellules/micropuits ont été plaquées dans la plaque de culture de micropuits, les cellules humaines d'îtte ont été condensées en sphéroïdes de taille uniforme. On observe qu'une plaque de culture de micropuits permet la formation réussie de pseudoislets à partir d'un petit nombre de cellules par rapport à une plaque d'attachement ultra-faible de 96 puits. Typiquement, plus de 1.500 cellules/pseudoislet sont nécessaires pour une plaque d'attachement ultra-faible de 96 puits, alors que 500 cellules/pseudoislet sont suffisants pour une plaque de culture de micropuits de 24 puits. Les pseudoislets formés avec succès demeurent comme sphéroïdes après la récupération d'une plaque d'attachement ultra-faible de 96 ou d'une plaque de culture de micropuits et sont compatibles pour les applications en aval, y compris l'incubation statique (Figure 3a) et la perifusion (Figure 3b). La taille uniforme des pseudoislets réduit la variation au sein d'un groupe d'essai et permet l'incubation statique en utilisant aussi peu que 5 pseudoislets par mesure (Figure 3a). En outre, les pseudoislets humains ont maintenu la sécrétion robuste d'insuline de première phase en réponse au glucose après 7 jours de culture quand les îlots humains originaux cultivés pendant une période semblable de temps ont montré la sécrétion d'insuline glucose-stimulée de première phase émoussée ( Figure 3b)5. L'introduction du lentivirus dans une suspension à cellule unique assure la transduction efficace et homogène des cellules des îlots et permet une régulation des gènes très efficace, comme le montre la figure 3c. Tous les résultats montrés ont été obtenus utilisant des îlots humains des donateurs non-diabétiques.
Figure 1 : Processus de préparation de pseudoislet humain. (a) La suspension contenant 4 000 IEQ d'îlots humains devient trouble après digestion par un mélange d'enzymes protéolytiques et collagènes et un tuyauterie doux. (b) Les îlots humains après dispersion sont passés à travers une passoire. Les îlots non digérés qui restent sur le dessus de la passoire sont dispersés à l'aide d'un piston à seringues de 1 ml. (c,d) Images de microscope de la suspension à cellule unique contenant 3.000 cellules/puits dans une plaque d'attachement ultra-faible de 96 puits avant (c) et après (d) centrifugation. (e,f) Images de microscope de la suspension de cellules simples contenant 500 cellules/micropuits dans une plaque de culture de micropuits de 24 puits avant (e) et après (f) centrifugation. Barre d'échelle de 250 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Morphologie des pseudoislets humains. Changements séquentiels dans la morphologie des pseudoislets humains créés (a) dans une plaque d'attachement ultra-faible de 96 puits à partir de 3 000 cellules et (b) dans une plaque de culture de micropuits de 24 puits à partir de 500 cellules. Barre d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Exemples de essais fonctionnels à l'aide de pseudoislets humains. (a) Incubation statique représentative réalisée à l'aide de pseudoislets humains créés dans une plaque de culture de micropuits à partir d'un seul donneur de la taille de 500 cellules d'îlots humains par pseudoislet. Quatre ensembles de 5 pseudoislets ont été incubés pendant 1 h dans le tampon de bicarbonate Krebs-ringer complété avec 2 mM ou 16,8 mM de glucose. Chaque symbole représente la sécrétion d'insuline à partir d'un ensemble de 5 pseudoislets. L'erreur moyenne de la moyenne (SEM) est affichée. p 'lt; 0.05 par l'essai de t de l'étudiant. Résultats représentatifs de trois donateurs. (b) La perifusion représentative testant la sécrétion d'insuline à partir de pseudoislets humains créés dans une plaque de culture de micropuits en réponse à 16,7 mM de glucose et 30 mM KCl. La méthode pour la perifusion a été précédemment éditée5. Moyenne - SEM de sécrétion d'insuline à partir de deux ensembles de 40 pseudoislets créés dans une plaque de culture micropuits à partir d'un seul donneur de la taille de 500 cellules d'îlots humains par plaque de pseudoislet est montré. Données représentatives de six donateurs. (c) Les pseudoislets ont été créés avec des lentivirus transportant des shRNA ciblant l'ATGL humain (ciblant CCTGCCACTCTATGAGCTTAA, à gauche) ou PLIN5 (ciblage GACAAGCTGGAAGAGAAGCTTT, à droite). Les pseudoislets de contrôle ont été transducés avec le lentivirus exprimant la séquence brouillée (Scr) précédemment édité5. L'expression de l'ARNm de chaque gène a été déterminée par réaction en chaîne de polymérase en temps réel (PCR) comme précédemment publié5. Les données ont été exprimées à l'aide de 2-DDCT prenant peptidylprolyl Isomerase B (PPIB) comme un contrôle interne17. Chaque point représente les données de chaque donneur pour une amorce indiquée et un ensemble de données du même donneur est connecté par une ligne. N - 3 donateurs. *; p lt; 0,05 par l'étudiant t test. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ici, un protocole détaillé pour générer des pseudoislets humains qui sont transducés par lentivirus à l'aide d'une plaque d'attachement ultra-faible de 96 puits ou d'une plaque de culture de micropuits est présenté. Pseudoislets ont été rapportés pour démontrer la morphologie et les fonctions sécrétrices semblables aux îlots humains indigènes et peuvent être cultivés pendant une période prolongée in vitro5,11,18. Contrairement aux îlots humains indigènes qui montrent une grande variation de taille, les pseudoislets sont relativement uniformes en taille, réduisant la variation entre les donneurs et les répliques expérimentales5,11. La régulation des gènes nécessitant une grande efficacité de la transduction peut être effectuée facilement avant la formation de pseudoislets dans la suspension à cellule unique. Cette méthode évite la difficulté de la pénétration virale à travers les couches de cellules dans les îlots intacts. Ainsi, ce protocole simple, très efficace et reproductible pour la création de pseudoislets humains a de larges applications.
Alors que plusieurs plates-formes différentes ont été signalées pour la formation de pseudoislets12,14,19,20, à la fois une plaque d'attachement ultra-faible de 96 puits et une plaque de culture micropuits sont disponibledans, permettant à cette technique d'être adoptée par n'importe quel laboratoire. Bien que la méthode de chute de suspension12 permet également la formation de pseudoislets humains à l'aide de matériel de laboratoire commun, les limitations potentielles incluent la difficulté à contrôler la taille et la durée de réaggrégeation des pseudoislets. Ces limitations étaient dues au volume limité par goutte de pseudoislet et à l'évaporation continue pendant la culture de 5 à 7 jours exigée pour la formation de pseudoislet. En outre, il est plus facile de contenir le lentivirus avec l'utilisation d'une plaque d'attachement 96 bien ultra-faible ou une plaque de culture micropuits par rapport à la méthode de pendaison-goutte.
Plusieurs étapes du protocole nécessitent une attention particulière. Optimiser la digestion des îlots intacts avec le mélange d'enzymes protéolytiques et collagèneest est critique puisque la sous- et la sur-digestion réduira le rendement de la suspension de cellules simples et affectera plus tard l'agrégation des pseudoislets. Pendant la digestion, il est important de surveiller de près les îlots pour la disparition des amas et l'augmentation de la nébulosité que les îlots se dissocier en cellules simples. Il est important de noter que le temps optimal pour la digestion varie entre les îlots de différents donneurs. Le temps optimal dépend de plusieurs facteurs, y compris les antécédents médicaux et l'âge de chaque donneur, la durée du temps d'ischémie, la procédure d'isolement des înles utilisée, la taille des îaux, la pureté des îlettes, la viabilité des îlettes et les conditions d'expédition. Typiquement, les îlots humains avec la viabilité et la pureté supérieures à 80% et dans les 5 jours de l'isolement sont utilisés. La pipetage soigneuse et douce pendant la dispersion est également importante pour maintenir la viabilité et la récupération cellulaires qui affecteront finalement l'agrégation cellulaire et la taille finale des pseudoislets étant formés. Lors de la distribution de la suspension des cellules des élets aux puits (étapes 3.1.4 et 3.2.7), un mélange doux et approfondi des cellules est important pour atteindre une distribution uniforme des cellules simples dans les micropuits. Si les cellules forment des amas après 1 h d'incubation avec le lentivirus, il faut un tuyauterie doux pour briser les amas en suspension à cellule unique avant la centrifugation finale.
Nous avons eu le succès semblable en créant des pseudoislets humains après la transduction lentiviral utilisant une plaque de 96 puits et une plaque de culture de micropuits. Le choix entre les deux plates-formes dépend de la taille et du nombre de pseudoislets souhaités. Une plaque de culture de micropuits a de petits fonds en forme de pyramide permettant la condensation d'un plus petit nombre de cellules comparées à une plaque inférieure bien ronde de 96. Ainsi, le nombre de cellules par pseudoislet peut être réduit pour une plaque de culture de micropuits. En outre, une seule étape de centrifugation crée tous les pseudoislets simultanément dans une plaque de culture de micropuits tandis que la pipetting multiple est exigée pour créer des pseudoislets dans une plaque de 96 puits. Ainsi, l'échelle de la création de pseudoislets est plus facile dans une plaque de culture microwell. Cependant, la plaque de culture de micropuits actuellement disponible n'offre pas de flexibilité dans le nombre de pseudoislets en cours de création. Actuellement, le nombre minimum de pseudoislets créés à l'aide d'une plaque de culture micropuits est de 1 200 et ne peut être augmenté que par le facteur de 1 200. Ainsi, nous utilisons généralement une plaque de 96 puits pour des expériences pilotes à petite échelle et pour une expérience dans laquelle une petite quantité d'échantillons est suffisante comme un essai de sécrétion d'insuline et l'extraction de l'ARN pour l'expression des gènes. Nous avons utilisé des pseudoislets d'une plaque de culture de micropuits pour des essais qui exigent un grand nombre de cellules telles que la tache occidentale, la détermination de taux de consommation d'oxygène par un analyseur métabolique, et l'extraction de triglycérides.
Le principal facteur limitant pour la génération de pseudoislets humains est la perte de cellules lors de la préparation de la suspension d'une seule cellule. Tandis que 1 IEQ de l'ît humain est considéré pour contenir environ 2.000 cellules, la récupération de la suspension de cellules simples est typiquement 30% ou plus bas dû au lavage multiple et passant par une passoire. L'hétérogénéité de la taille des îlots rend également difficile la dissociation simultanée de tous les îlots. Tandis que la pipetage douce et l'utilisation du mélange protéolytique et d'enzyme de collagène dans le protocole sont des efforts pour combiner des forces mécaniques et enzymatiques pour la récupération maximale des cellules simples, il y a toujours une perte inévitable des cellules. Ainsi, l'application de pseudoislets exige une justification claire sur l'étude des îlots humains intacts. Il faut également rappeler que la sécrétion d'insuline des pseudoislets est plus robuste que les îlots cultivés pour la même période de temps, mais tend à être plus faible par rapport aux îlots fraîchement isolés5,11.
Bien que des limitations existent, le silençage stable et très efficace de gène combiné avec une meilleure conservation de la sécrétion d'insuline glucose-stimulée pendant le temps prolongé dans la culture permettent l'évaluation de la fonction de gène dans les cellules humaines d'îcle. En outre, la communication intercellulaire complexe entre les cellules bêta-bêta et bêta-bêta est proposée pour avoir un rôle de régulation dans la fonction d'ît. Cependant, il y a actuellement peu d'information concernant la communication intercellulaire dans les îlots humains. Avec une disponibilité accrue de marqueurs spécifiques aux cellules21, il est possible de créer des pseudoislets humains avec une composition cellulaire définie, comme récemment signalé dans les cellules des îlots de souris22, ce qui facilitera une meilleure compréhension de la cellule-cellule communication entre les cellules des ists humains. L'avancement récent de l'imagerie des tissus tridimensionnels augmente également potentiellement l'utilité des pseudoislets humains comme modèle pour démasquer la façon dont la polarité cellulaire et la communication intercellulaire sont réglementées dans les îlots humains. Ainsi, les pseudoislets humains fournissent un modèle utile pour disséquer les fonctions des gènes d'intérêt et d'autres questions dans le domaine de la biologie des îlots.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu financièrement par les National Institutes of Health to Y.I. (R01-DK090490) et l'American Diabetes Association to Y.I. (1-17-IBS-132). J.A. et Y.I. sont soutenus par le Centre fraternel de recherche sur le diabète de l'Ordre des Aigles. A.B. est soutenu par une subvention de formation des National Institutes of Health (T32NS45549). Les auteurs ont utilisé des îlots pancréatiques humains fournis par le Programme intégré de distribution des îlots (IIDP) financé par le NIDDK à la Ville de l'espoir (2UC4DK098085).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-adherence rinsing solution | Stemcell technologies | 7919 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series Type A2 | |
| Cell strainer, 40 micrometer | Corning | 431750 | |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530037 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | Heracell VIOS 160i | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent | ThermoFisher | 15596026 | Trizol |
| Glutamine | ThermoFisher | 25030164 | |
| Hemocytometer | Marien Feld | Neubauer-Improved Bright line | |
| Human serum albumin | Sigma | A1653 | |
| Inverted microscope | Fisher brand | 11-350-119 | |
| Microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 20 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microwell culture plate | Stemcell technologies | 34411 | Aggrewell 400, 24 well |
| Motor-driven pestle | GAMUT | #399X644 | |
| Non-tissue culture treated dish, 10 cm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| PBS | ThermoFisher | 14190250 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Petri dish, 35 mm | Celltreat | 229638 | |
| Pipette, 5 mL | DOT Scientific, | 667205B | |
| Pipette, 8-channel | VWR | #613-5253 | |
| Pipette, 10 mL | VWR | 667210B | |
| Pipette, P10 | Denville | UEZ-P-10 | |
| Pipette, P200 | Denville | UEZ-P-200 | |
| Pipette, P1000 | Denville | UEZ-P-1000 | |
| Proteolytic and collagenolytic enzyme mixture | Sigma | A6965 | Accutase |
| Reagent reservoir, 50 mL | VWR | 89094-680 | |
| Reversible strainer, 37 micrometer | Stemcell technologies | 27251 | |
| Swing bucket plate centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14R | |
| Swing bucket rotor | Beckman Coulter | SX4750A | |
| Tuberculin syringe, 1 mL | BD | 309659 | |
| Ultra low attachment microplate, 96 well | Corning | 4515 |
References
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