Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

إعداد نخاع العظام كله لتحليل الكتلة الخلايا من الخلايا العدلية النسب

Published: June 19, 2019 doi: 10.3791/59617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Division of Inflammation Biology, La Jolla Institute for Immunology, 2Flow Cytometry Core Facility, La Jolla Institute for Immunology

Summary

هنا، نقدم بروتوكول لمعالجة نخاع العظم الطازج (BM) معزولة عن الماوس أو الإنسان لالكتلة عالية الأبعاد الخلايا (الخلايا من قبل وقت الرحلة، CyTOF) تحليل الخلايا العدلية النسب.

Abstract

في هذه المقالة، نقدم بروتوكول احسن للحفاظ على الخلايا العدلية النسب في BM الطازجة لتحليل كامل BM CyTOF. لقد استخدمنا لوحة ثلاثية الأبعاد ثلاثية الأبعاد للأجسام المضادة ثلاثية الأبعاد لتقييم نظام الخلايا الدموية مع التركيز على خلايا العدلات السلالة باستخدام هذا البروتوكول. تم تحليل نتيجة CyTOF مع خوارزمية الحد من الأبعاد مفتوحة المورد، viSNE، وقدمت البيانات لإظهار نتيجة هذا البروتوكول. لقد اكتشفنا مجموعات خلايا جديدة على أساس هذا البروتوكول. هذا البروتوكول من إعداد BM كاملة جديدة يمكن استخدامها ل1)، وتحليل CyTOF لاكتشاف مجموعات الخلايا غير معروف من BM كله، 2)، والتحقيق في عيوب BM كاملة للمرضى الذين يعانون من اضطرابات الدم مثل سرطان الدم، 3)، والمساعدة في تحسين الفلورسنت تنشيط تدفق البروتوكولات السيتوميالتي تستخدم BM كامل الطازجة.

Introduction

في العقود القليلة الماضية، كانت أساليب القياس السيتومي أداة قوية للتحقيق في نظام المكون ة في BM. وتشمل هذه الأساليب الفلورسنت تنشيط تدفق السيل والطريقة الجديدة من CyTOF باستخدام الأجسام المضادة الثقيلة التي تحمل علامات المعادن. وقد أدت إلى اكتشافات العديد من أنواع الخلايا في عينة بيولوجية غير متجانسة عن طريق تحديد ملامح التعبير فريدة من نوعها علامة السطح. يؤدي تداخل الطيف المتزايد المرتبط بالمزيد من القنوات إلى عدم دقة البيانات في تطبيقات قياس الدفق الفلوري. لذلك، تتم إزالة الخلايا غير المرغوب فيها بشكل روتيني من أجل إثراء مجموعات الخلايا ذات الأهمية لتحليل الخلايا المتدفقة المنشط الفلورسنت. على سبيل المثال، تعتبر Ly6G (أو Gr-1) و CD11b علامات الخلايا النخاعية الناضجة وLy6G+ (أو Gr-1+) وCD11b+ الخلايا تتم إزالتها بشكل روتيني من عينات BM باستخدام مجموعات التخصيب المغناطيسي قبل تحليل الخلايا المتدفقة من الخلايا الجذعية والسلف المكونة للدم (HSPCs) أو من خلال الجمع بين هذه العلامات في قناة واحدة تفريغ كوكتيل1،2،3. مثال آخر هو أن العدلات تتم إزالتها بشكل روتيني من عينة الدم البشري لإثراء خلايا الدم الطرفية أحادية النواة (PBMC) للدراسات المناعية. نخاع العظم كله معزولة عن الماوس أو الإنسان، ومع ذلك، نادرا ما يتم التحقيق سليمة لتحليل الخلايا.

في الآونة الأخيرة، أصبح CyTOF أداة ثورية للتحقيق في نظام المكونة للدم4،5،6. مع CyTOF، يتم استبدال الأجسام المضادة التي تحمل علامة الفلوروفور بالأجسام المضادة الثقيلة التي تحمل اسم المراسل. وتتيح هذه الطريقة قياس أكثر من 40 علامة في آن واحد دون الاهتمام بتداخل الطيف. وقد مكّن ذلك من تحليل العينة البيولوجية السليمة دون خطوات ما قبل الاستنفاد أو قناة تفريغ. ولذلك، يمكننا أن نرى نظام المكونة للدم بشكل شامل مع الأبعاد عالية المحتوى من التقليدية 2-D مخطط الانسيابية. يمكن الآن جلب مجموعات الخلايا التي تم حذفها في الماضي أثناء عملية الاستنفاد أو الضخ إلى النور مع البيانات عالية الأبعاد التي تم إنشاؤها بواسطة CyTOF4،5. لقد صممنا لوحة الأجسام المضادة التي تقيس في وقت واحد 39 المعلمات في نظام المكونة للدم مع التركيز على linage النخاعي7. بالمقارنة مع البيانات التقليدية للتدفق الخلوي، فإن تفسير وتصور البيانات عالية الأبعاد غير المسبوقة أحادية الخلية التي تولدها CyTOF أمر صعب. وقد طور العلماء الحسابية تقنيات الحد من البعد من أجل تصور مجموعات البيانات عالية الأبعاد. في هذه المقالة، استخدمنا الخوارزمية، viSNE، والتي تستخدم تقنية T-توزيع الجار الاستوتشاستيك (t-SNE) لتحليل بيانات CyTOF وتقديم نتيجة عالية الأبعاد على خريطة ثنائية الأبعاد مع الحفاظ على بنية عالية الأبعاد من البيانات8،9،10. على مؤامرة tSNE، يتم تجميع خلايا مماثلة في مجموعات فرعية ويتم استخدام اللون لتمييز ميزة الخلايا. على سبيل المثال، في الشكل 1 يتم توزيع الخلايا النخاعية في عدة مجموعات فرعية الخلية على أساس أوجه التشابه من أنماط التعبير عن 33 علامات السطح الناجمة عن CyTOF (الشكل 1)4. هنا نحن التحقيق نخاع عظم الماوس مع لدينا ذكرت سابقا 39-علامة لوحة CyTOF بواسطة تحليل viSNE7. كشف تحليل viSNE لبيانات نا سيف عن مجموعة خلايا غير محددة أظهرت كلا HSPC (CD117+) والعدلات (Ly6G+) خصائص (الشكل 2)7.

في الختام، نقدم بروتوكولا لمعالجة نخاع العظم كله الطازجة لتحليل CyTOF. في هذه المقالة، استخدمنا نخاع عظم الفأر كمثال، في حين يمكن استخدام هذا البروتوكول أيضا لمعالجة عينات نخاع العظم البشري. كما أن التفاصيل الخاصة بعينات نخاع العظم البشري مذكورة في البروتوكول أيضاً. ميزة هذا البروتوكول هو أنه يحتوي على تفاصيل مثل وقت الحضانة ودرجة الحرارة التي تم تحسينها للحفاظ على خلايا العدلة النسب في نخاع العظام كله لتمكين التحقيق على نخاع العظام كله سليمة. ويمكن أيضا تعديل هذا البروتوكول بسهولة لتطبيقات قياس الدفق الفلوري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

اتبعت جميع التجارب المبادئ التوجيهية المعتمدة من معهد لا جولا للحساسية والمناعة لجنة رعاية الحيوانات واستخدام، وتم الحصول على الموافقة على استخدام القوارض من معهد لا جولا للحساسية والمناعة وفقا للمعايير المبينة في دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة.

1. حصاد النخاع العظمي للفأر (BM)

  1. شراء الفئران C57BL/6J من بائع تجاري. تغذية النظام الغذائي القوارض حساء القياسية والمنزل في أقفاص microisolator في منشأة خالية من مسببات الأمراض.
  2. استخدام الفئران الذكور، 6-10 أسابيع من العمر، لأغراض تجريبية. الاستئصال الرحيم عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون 2 يليه خلع عنق الرحم.
  3. ضع الماوس على وسادة جراحية معقمة مع الجانب البطن حتى. تعقيم الجلد من منطقة البطن والخلفية عن طريق رش 70٪ الإيثانول. استخدام زوج من تشريح مقص الجراحية لقطع تجويف البطن مفتوحة.
  4. إزالة الجلد لفضح الخلفية. استخدم يَلَمَرُم ِبَلِة ِ اللّواب ِ لِمَتْسَسَة َ سِرَبَة َ الماوس أسفل الكاحل. استخدم زوج ًآخر من ملقط الضمادات المنحني لتثبيت الساق أسفل ملقط الضمادات الحادة. كسر الساق وفضح العظام عن طريق تمزيق العضلات مع ملقط خلع الملابس حادة طرف.
    ملاحظة: يتم ربط الساق بشكل فضفاض إلى مفصل الركبة ويمكن انتقاؤها بسهولة باستخدام ملقط خلع الملابس حادة طرف.
  5. ضع الساق في 1X الباردة PBS.
  6. بعد ذلك، حرك ملقط خلع الملابس المنحني ة الاستقرال إلى أسفل إلى عظم الفخذ. حرك ملقط خلع الملابس الغير حادة الطرف أسفل مفصل الركبة وامسك الرضفة. خلع الرضفة عن طريق سحب بلطف عنه. كشف عظم الفخذ عن طريق تمزيق قبالة العضلات تعلق على الرضفة. عقد عظم الفخذ المكشوفة من قبل ملقط خلع الملابس المنحني وقطع عظم الفخذ من الجزء السفلي من العظام باستخدام تشريح مقص الجراحية.
  7. ضع عظم الفخذ في 1X الباردة PBS.
  8. لكمة ثقب في أنبوب ميكروسينتريسيد 0.5 مل مع إبرة 18 G.
  9. ضع كل من الساق وعظم الفخذ في نفس أنبوب microcentrifuge 0.5 مل مع نهاية مفتوحة من العظام التي تواجه أسفل إلى الحفرة.
  10. ضع أنبوب 0.5 مل الذي يحتوي على كل من الساق وعظم الفخذ في أنبوب microcentrifuge 1.7 مل.
  11. تدور الأنابيب مزدوجة الطبقات التي تحتوي على كل من الساق وعظم الفخذ في 5,510 x ز لمدة 30 s في أجهزة الطرد المركزي الدقيقة.
  12. تأكد من أن يتم استخراج BM من العظام وبيليه في الجزء السفلي من الأنبوب. اُذيب أنبوب 0.5 مل الذي يحتوي على العظام المقدسة. الماوس BM على استعداد للخطوات التالية.
    ملاحظة: يتم حصاد BM الإنسان في الموارد السريرية كما هو موضح سابقا11.

2. الخلايا BM وصمة عار لCyTOF

  1. إعادة تعليق BM في 1 مل 1X خلية الدم الحمراء (RBC) العازلة lysis. لBM الإنسان، وقف التنفيذ BM كله في حجم 10X من 1X خلية الدم الحمراء (RBC) العازلة lysis. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  2. تدور الأنبوب في 350 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. بالنسبة لـ BM البشري، كرر الخطوة 2.1 و2.2 قبل الانتقال إلى الخطوة 2-3.
  3. ازهر بعناية supernatant وترك بيليه دون انقطاع. إعادة تعليق بيليه مع 1 مل من 1X PBS الباردة. قم بتصفية الكرية في أنبوب مخروطي سعة 15 مل من خلال مصفاة خلايا 70 ميكرومتر. خلايا BM الآن معزولة تماما في الأنبوب من الحطام العضلات والعظام. غسل الخلايا عن طريق إضافة 9 مل من 1X الباردة PBS في الأنبوب.
  4. تدور أنبوب 15 مل في 350 × ز لمدة 5 min عند 4 درجة مئوية.
  5. تستنشق بعناية supernatant وإعادة تعليق خلايا BM مع 10 مل PBS الباردة. خذ a aaquot من الخلايا للعد. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيتومتر.
  6. Aliquot 5 x 106 خلايا BM في أنبوب 15 مل جديد لتلطيخ CyTOF.
  7. تدور 15 مل أنبوب aliquot في 350 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
  8. تستنشق بعناية supernatant وإعادة تعليق الخلايا BM مع 125 NM Cisplatin في 1 مل من CyTOF العازلة الملطخة كمؤشر قابلية للبقاء للعينة. احتضان لمدة 5 دقائق في RT.
  9. بعد الحضانة، إضافة 4 مل من CyTOF العازلة تلطيخ إلى الأنبوب. تدور الأنبوب في 350 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. لBM الإنسان، إضافة 10٪ المصل AB الإنسان في العازلة تلطيخ CyTOF.
  10. تستنشق بعناية supernatant وإعادة تعليق خلايا BM مع 50 μL من FC المستقبل الحل حجب. احتضان لمدة 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية. تخطي هذه الخطوة لBM الإنسان.
  11. إضافة 50 μL من كوكتيل الأجسام المضادة CyTOF محلية الصنع5 إلى العينة حتى حجم تلطيخ إجمالي 100 μL. ماصة بلطف لخلطها. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية. الحجم النهائي لكوكتيل الأجسام المضادة هو 100 ميكرولتر لكل من العينات BM الماوس والبشرية BM.
  12. إضافة 2 مل من CyTOF العازلة تلطيخ إلى كل أنبوب بعد حضانة لغسل الخلايا، وتدور الأنبوب في 350 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
  13. كرر الخطوة 2.12 لما مجموعه اثنين من البوافيات.
  14. إعداد الطازجة 1.6٪ الفورمالديهايد الحل من 16٪ من الأسهم أمبولة. تمييع 1 جزء من الفورمالديهايد الأسهم مع 9 أجزاء من 1X PBS.
  15. استنشق بعناية supernatant وإعادة تعليق بيليه مع 1 مل حل الاتحاد الإنجليزي الطازجة 1.6٪. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
  16. تدور الأنبوب في 800 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
  17. تستنشق بعناية supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية مع 125 nM حل الكحولة في 1 مل إصلاح / بيرم العازلة.
  18. احتضان العينة في حل التشابك بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.

3. إعداد الخلايا لاقتناء CyTOF

  1. دوامة بلطف وتدور الخلايا في 800 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
  2. غسل الخلايا عن طريق إضافة 2 مل من العازلة التلطيخ CyTOF، تدور الخلايا في 800 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية وإزالة supernatant عن طريق الطموح.
  3. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من diH2O. الاحتفاظ بحجم صغير (حوالي 10 ميكرولتر) من كل أنبوب لحساب الخلايا.
  4. تدور الخلايا في 800 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
  5. كرر الخطوة 3.3 و 3.4.
  6. تُزهِب النواهي بعناية وتُترك الخلايا في الكريّة. خلايا BM هي الآن على استعداد لإعادة تعليق لتركيز 1 X 106 خلايا / مل للحصول على CyTOF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الشكل 1 هو عرض كمثال على ذلك من تجارب CyTOF. على هذه المؤامرة tSNE تم تجميع الخلايا عبر أنسجة الماوس متعددة في مجموعات فرعية استناداً إلى تشابه ملامح التعبير علامة السطح قياسها بواسطة لوحة CyTOF 33 معلمة. تم تجميع الخلايا ذات الخصائص المشابهة بشكل تلقائي معًا مثل العدلات أو الضامة أو وحدات DCs استنادًا إلى تعبير العلامات الـ 33 على كل خلية.

الشكل 2 هو عرض كمثال على نتيجة للفأر ة BM CyTOF التجربة باستخدام البروتوكول المقدم في هذه الدراسة. حافظ البروتوكول على سلامة BM بأكمله، مما أدى إلى اكتشاف مجموعة خلايا غير معروفة سابقاً التي تشارك في التمعن العدل (Ly6G+، الشكل 2A)وHSPC (CD117+، الشكل 2B)علامات سطح التوقيع شكل متزامن. هذه الخلايا يظهر نمط اتمايز من تعبير علامة السطح يقاس بواسطة لوحة CyTOF لدينا (الشكل2C)وحذفت من قبل البحوث السلف النخاعي السابقة بسبب Ly6G+ استنزاف الخلية1،2، 3. والأهم من ذلك، أدت هذه النتيجة إلى اكتشاف مجموعة فرعية صغيرة من الكتلة إلى الجانب الأيسر من خريطة viSNE التي لا تعبر Ly6G ولكن تم تجميعها بشكل وثيق إلى CD117+Ly6G+ الخلايا، مما يشير إلى تشابه هذه الخلايا إلى العدلات النسب على أساس التعبير عن 39 علامات المستخدمة لهذه التجربة CyTOF.

استخدمنا ملف تعريف علامة التعبير من بيانات CyTOF هو موضح في الشكل 2C لبناء 13 لون FACS (فرز خلية الفلورسنت تنشيط) لوحة التي تسمح لنا لعزل السلالة العدلية عن طريق تدفق الخلايا للاختبارات الوظيفية المصب ( الشكل 3).

Figure 1
الشكل 1: مثال من المؤامرة tSNE نتج عن CyTOF. تم رسم بيانات الخلايا المفردة من جميع أنسجة الفئران التي تم تحليلها وترميز اللون من قبل 28 مجموعة "غير خاضعة للرقابة". وقد تم شرح الهويات الخشنة لكل مجموعة استنادا إلى تحليلات منشورة مختلفة. وقد تم تعديل هذا الرقم من المرجع4. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 تحليل خلية واحدة الآلي من لين-CD117+Ly6A /E- خلايا HSPC في نخاع العظام يحدد مجموعة متميزة من السلالة العدلية. يتم عرض خرائط viSNE من لين-CD117+Ly6A / E- يتم عرض خلايا HSPC كتراكبات نقطة لعرض 5 مجموعات الآلي. (أ) يظهر نمط التعبير CD117 و (ب) على خريطة viSNE من لين-CD117+Ly6A/E- خلايا HSPC كنقاط الطيف الملونة. (C) يتم عرض أنماط التعبير للعلامات المشار إليها كتراكبات الرسم البياني لكل كتلة. وقد تم تعديل هذا الرقم من المرجع7. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 : استراتيجية FACS gating أظهرت مع مجموعة البيانات الكتلة السيتومي (CyTOF). وعاد السكان المستهدفون المسور يدوياً إلى خريطة viSNE الآلية للتحقق من صحتها. وقد تم تعديل هذا الرقم من المرجع7. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في العقود الماضية، تم استخدام الفلورية القائمة على الخلايا تدفق كوسيلة رئيسية لدراسة السلالات الخلوية والتباين1،2،3. وعلى الرغم من أن قياس التدفق السيتومتري قد وفر بيانات متعددة الأبعاد، فإن هذه الطريقة محدودة بخيارات البارامترات والتداخل الطيفي. للتغلب على ضعف قياس تدفق الخلايا استغلنا CyTOF، الذي يستخدم نظائر المعادن الثقيلة بدلا من الفلوروفورس لتسمية الأجسام المضادة التي تزيل الكلام المتبادل بين قنوات الكشف أو الفلور التلقائي للخلايا، وبالتالي، يمكن قياس العديد من المزيد من المعلمات في وقت واحد على مستوى خلية واحدة وتوليد تقييم أعمق بكثير من التنوع الخلوي12. تم حذف مجموعات الخلايا في الماضي أثناء عملية الاستنفاد أو الالتصاق، وخاصة الخلايا المناعية الهامة مثل خلايا العدلات النسب التي كانت لفترة طويلة تعتبر متجانسة13،14، يمكن أن تتميز بشكل أفضل CyTOF 2 ،3،7.

لاستيعاب هذه الأداة القوية للقياس الخلوي من CyTOF لدراسة عدم تجانس الخلايا وتمييز مجموعات الخلايا النادرة، والبروتوكولات التي تحافظ على سلامة العينات البيولوجية هي عملية للغاية لدراسات عدم التجانس. هنا وصفنا بروتوكول ابساة لمعالجة BM كله لCyTOF التي تمكن توصيف شامل للمجموعات الخلايا الجديدة في BM كلها سليمة، والتي يمكن استخدامها للفأر أو الدراسات البشرية. يحتوي نخاع العظم الكامل المعزول عن الماوس والإنسان على مجموعات الخلايا، وخاصة خلايا العدلات التي تتسم بهشاشة شديدة وحساسة للتغيرات البيئية مثل درجات الحرارة وظروف الثقافة. في هذا البروتوكول، قمنا بتحسين درجة الحرارة وظروف الحضانة لكل خطوة من أجل الحفاظ على هذه المجموعات الحساسة إلى أقصى مستوى. من خلال القيام بذلك سلامة خلايا نخاع العظم كله هو محمي بشكل جيد. مع لوحة علامة شخصية دمجها في هذا البروتوكول، قد يحدد الباحثون المزيد من الخلايا ذات الاهتمام في مجالات البحث المختلفة.

على الرغم من أن CyTOF هي أداة تحليلية قوية في نهاية المطاف لاكتشاف مجموعات خلايا جديدة وقادرة على التنبؤ بوظيفة السكان الجدد من خلال خصائص علاماتها، فإن هذه التكنولوجيا محدودة لإجراء المزيد من الدراسات الوظيفية في المصب. لتمكين الدراسات الوظيفية في المصب، استخدمنا viSNE لوصف شامل لكل مجموعة من خلال فحص مستوى التعبير من كل 39 علامة ووجدنا تركيبات علامات متميزة كما هو مبين في الشكل 2C. على الرغم من أن بيانات CyTOF لا يمكن تطبيقها على تقنيات الفرز الحالية، فإن ميزتها في قياس العديد من المعلمات في وقت واحد يمكن أن تساعدنا على تحديد أفضل مزيج من العلامات ضمن المعلمات المحدودة. ساعدتنا هذه الخطوة الحاسمة في تحليل البيانات على الاستفادة الكاملة من نتائج CyTOF لتصميم لوحة فرز متوافقة مع نظام مراقبة الأصول الميدانية. على سبيل المثال، في هذه التجربة، استخدمنا هذه المعلومات في الشكل 2C لبناء لوحة FACS 13 لون التي تسمح لنا لعزل سلف العدلة (NeP) عن طريق تدفق الخلايا للاختبارات الوظيفية المصب (الشكل3). باستخدام CyTOF وFACS في خط أنابيب، وهذه الأساليب معا يمكن أن تمكن عزل أنواع الخلايا المكتشفة حديثا للدراسات الوظيفية مثل مورفولوجيا، وبراعة، وفحوصات في المختبر، وفي الدراسات الحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نود أن نشكر النواة LJI تدفق الCytometry للمساعدة في إجراء قياس السيل الشامل. وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح R01HL134236، P01HL136275، و R01CA202987 (جميعها إلى C.C.H) و ADA7-12-MN-31 (04) (إلى C.C.H. و Y.P.Z).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CyTOF Antibodies (mouse)
Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y Fluidigm Cat# 3089005B
Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb Fluidigm Cat# 3176002B
Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified Biolegend Cat# 120402; RRID:AB_961070
Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified Biolegend Cat# 135502; RRID:AB_1937293
Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er Fluidigm Cat# 3166004B
Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified Biolegend Cat# 101101; RRID:AB_312774
Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd Fluidigm Cat# 3148003B
Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd Fluidigm Cat# 3142003B
Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er Fluidigm Cat# 3167004B
Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified Biolegend Cat# 149502; RRID:AB_2565302
Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 557787; RRID:AB_647340
Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified Biolegend Cat# 142402; RRID:AB_10916523
Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified Biolegend Cat# 149302; RRID:AB_2565277
Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified Biolegend Cat# 126502; RRID:AB_1027635
Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 137625; RRID:AB_2563744
Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified Biolegend Cat# 119302; RRID:AB_345280
Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd Fluidigm Cat# 3146009B
Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd Fluidigm Cat# 3156012B
Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready ThermoFisher Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481
Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified Biolegend Cat# 113802; RRID:AB_313563
Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified Biolegend Cat# 105202; RRID:AB_313169
Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb Fluidigm Cat# 3159009B
Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 134321; RRID:AB_2563768
Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 554404; RRID:AB_395370
Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb Fluidigm Cat# 3174003B
Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 556003; RRID:AB_396287
Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm Fluidigm Cat# 3169015B
Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified abcam Cat# ab53457; RRID:AB_881409
Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 127637; RRID:AB_2563784
Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho Fluidigm Cat# 3165018B
Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 552125; RRID:AB_394340
Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd Fluidigm (Clone H57-597)-143Nd
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 116241; RRID:AB_2563789
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
Antibody Stabilizer CANDOR Bioscience Cat# 130050
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich Cat# A4503
Cisplatin-194Pt Fluidigm Cat# 201194
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer ThermoFisher Cat# 00-4333-57
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set ThermoFisher Cat# 00-4333-57
EQ Four Element Calibration Beads Fluidigm Cat# 201078
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) ThermoFisher Cat# AM9260G
Fetal Bovine Serum Omega Scientific Cat# FB-02
HyClone Phosphate Buffered Saline solution GE Lifesciences Cat#SH30256.01
Intercalator-Ir Fluidigm Cat# 201192B
MAXPAR Antibody Labeling Kits Fluidigm http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich Cat# 158127
Sodium azide Sigma-Aldrich Cat# S2002
Triton X-100 Sigma-Aldrich Cat# X100
Trypsin EDTA 1x Corning Cat# 25-053-Cl
Experimental Model: Organism/Strains
Mouse: C57BL/6J The Jackson Laboratory Stock No: 000664
Software Alogrithm
Bead-based Normalizer Finck et al., 2013 https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf
Cytobank Cytobank https://www.cytobank.org/
Cytofkit v1.r.0 Chen et al., 2016 https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html
t-SNE van der Maaten and Hinton, 2008 https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
  2. Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26, 726-740 (2007).
  3. Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).
  4. Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
  5. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
  6. Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13, 493-496 (2016).
  7. Zhu, Y. P., et al. Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow. Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).
  8. Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
  9. Amir, E. A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).
  10. van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).
  11. Cloos, J., et al. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).
  12. Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).
  13. Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).
  14. Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. Heterogeneity of neutrophils. Nature Reviews in Immunology. , (2019).

Tags

المناعة والعدوى، العدد 148، القيمة الفارغة، القضية، خلايا النسب العدلي، نخاع العظام، BM، الكتلة الخلايا، Cytometry، تدفق الخلايا، viSNE
إعداد نخاع العظام كله لتحليل الكتلة الخلايا من الخلايا العدلية النسب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhu, Y. P., Padgett, L., Dinh, H.… More

Zhu, Y. P., Padgett, L., Dinh, H. Q., Marcovecchio, P., Wu, R., Hinz, D., Kim, C., Hedrick, C. C. Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells. J. Vis. Exp. (148), e59617, doi:10.3791/59617 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter