Summary
I cambiamenti morfologici si verificano nelle cellule fibroblaste immunitarie dopo l'attivazione e promuovono alterazioni nel reclutamento cellulare. Utilizzo dell'imaging a 2 fotoni in combinazione con una proteina specifica fibroblasta geneticamente ingegnerizzata 1 (FSP1)-cre; tdTomato- linea di mouse flossa-stop-floxed (TB/TB) e verde fluorescente etichettato lipopolysaccharide-FITC, possiamo illustrare l'assorbimento altamente specifico di lipopolissaccharide nei fibroblasti dermici e cambiamenti morfologici in vivo.
Abstract
I fibroblasti sono cellule mesenchymiche che cambiano la loro morfologia al momento dell'attivazione, influenzando in ultima analisi il microambiente del tessuto in cui si trovano. Anche se le tecniche di imaging tradizionali sono utili per identificare le interazioni proteiche e la morfologia nel tessuto fisso, non sono in grado di fornire informazioni su quanto velocemente le cellule sono in grado di legare e assorbire proteine, e una volta attivato come la loro morfologia cambia in vivo. Nel presente studio, ci poniamo due domande principali: 1) qual è il corso temporale dell'attivazione del fibroblasto tramite il recettore-4 a pedaggio (TLR4) e l'interazione di lipopoliosaccorio (LPS) e 2) come si comportano queste cellule una volta attivate? Utilizzando l'imaging a 2 fotoni, abbiamo sviluppato una nuova tecnica per valutare la capacità di LPS-FITC di legarsi al suo recettore cognato, TLR4, espresso sui fibroblasti periferici nella linea genetica del topo del reporter; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox in vivo. Questo approccio unico consente ai ricercatori di creare video approfonditi e/o immagini di proteine che interagiscono con le cellule vive che consentono di avere un maggiore livello di granularità nella comprensione di come le proteine possono alterare il comportamento cellulare.
Introduction
Lipopolysaccharide (LPS) è un'endotossina presente nella membrana esterna dei batteri gram-negativi1. LPS ha un'alta affinità di legame per il recettore a pedaggio 4 (TLR4)/CD14/MD2 recettore complesso2. TLR4 è un recettore di riconoscimento modello comunemente presente sulla membrana esterna di una vasta gamma di cellule immunitarie, cellule mesenchymiche e un sottoinsieme di neuroni sensoriali3,4,5. L'attivazione del TLR4 espresso sulle cellule immunitarie porta a sistemi di seconda messaggerità indipendenti e dipendenti da MyD88, che terminano con la traslocazione kappa beta (NF-B) a fattore nucleare nel nucleo della cellula. In questo modo la cellula immunitaria prototipica produce e rilascia citochine pro-infiammatorie come Interleucin (IL)-1, IL-6 e TNF-'6 . Tuttavia, il modo in cui altri tipi di cellule rispondono alla stimolazione TLR4 non è così chiaro. I fibroblasti sono stati implicati in una vasta gamma di patologie come i tumori e la fibrosi cistica e hanno recentemente dimostrato di svolgere un ruolo monocitico che-attrazione e promuovere l'infiammazione7,8,9. Il nostro laboratorio è interessato al ruolo dei fibroblasti nello sviluppo del dolore acuto e cronico, poiché le prime evidenze suggeriscono che i fattori rilasciati dai fibroblasti (matrix metalloproteinasi (MMP), l'inibitore dei tessuti delle metalloproteine (Tim) e il fibroblasto fattori di crescita (FGF)) sono coinvolti nel dolore neuropatico10.
Gli stati di attivazione delle cellule possono essere determinati da una varietà di fattori che includono: induzione di geni immediati-primi, espressione proteica alterata, proliferazione cellulare e cambiamenti morfologici11,12,13. Ci sono molte tecniche che esistono per rispondere alle domande che potremmo avere su come l'attivazione delle cellule contribuisce alle patologie, ma tutte hanno i loro limiti. L'immunohistochimica prototipo utilizza anticorpi marcati fluorescentmente per etichettare le proteine di interesse per i tessuti fissi, che possono essere non specifici e spesso richiedono una risoluzione significativa dei problemi prima di produrre risultati fruttuosi14. L'umidità occidentale è una tecnica utile quando si confrontano i livelli di espressione proteica nel tessuto post-mortem; tuttavia, la componente istologica è carente in questa tecnica e i ricercatori non sono in grado di identificare eventuali cambiamenti nella morfologia15. RNA-Seq ci permette di quantificare la presenza di RNA messaggero in un campione che in molti casi produce dati penetranti; tuttavia, il divario tra la trascrizione e la traduzione rende difficile avere una risoluzione temporale dopo uno stimolo16. L'imaging confocale è utile per determinare l'espressione e la co-localizzazione delle proteine che esistono in una sezione trasversale di tessuti17. Spesso, questo non è rappresentativo della totalità del campione di tessuto. Al contrario, i microscopi multifotoni consentono agli utenti di immaginare circa 1 mm di profondità in un campione, creando una rappresentazione tridimensionale completa18. Pertanto, scegliamo di concentrarci su prep per l'imaging in vivoe a 2 fotoni, poiché i dati raccolti da questi esperimenti sono più direttamente riconoscibili al microambiente altamente plastico e interconnesso dei tessuti viventi.
Un vantaggio dello studio delle interazioni proteina-recettore in vivo è che possiamo catturare chiaramente come le cellule rispondono a uno stimolo, in tempo reale, nel loro ambiente nativo senza l'influenza dannosa e imprevedibile dell'estrazione dei tessuti post-mortem19. Inoltre, possono essere eseguiti studi longitudinali per valutare la plasticità cellulare e l'innesco che possono verificarsi a causa dell'attivazione. Utilizzando l'imaging a 2 fotoni, conserviamo l'integrità del microambiente presente quando viene applicato uno stimolo esterno. Questo protocollo fornisce un modo per identificare l'assorbimento di molecole nei fibroblasti dopo l'iniezione periferica di LPS fluorescente nel corso di diverse ore in vivo e il ruolo del TLR4 nell'attivazione del fibroblasto.
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Protocol
Le procedure sugli animali sono state approvate dall'Università del Texas al Dallas Institutional Animal Care and Use Committee ed erano in conformità con le linee guida del National Institutes of Health. Tutti gli esperimenti sono stati effettuati utilizzando topi maschi e femmine di 8-12 settimane allevati internamente su uno sfondo C57BL/6. I topi transgenici con cre-ricombinanteguidati dal promotore di proteina 1 specifico del fibroblasto sono stati acquistati commercialmente (Jackson, 012641) (FSP1cre) e incrociati con topi tdTomatolox-stop-lox, acquistati anche commercialmente ( Jackson, 007914) e (FSP1cre)- ; tdTomatolox-stop-lox e FSP1cre-/-; Topi tdTomatolox-stop-lox sono stati allevati internamente su uno sfondo C57BL/6 (Figura 1A,B,C). La proteina specifica per il fibroblasto 1 è una proteina endogena espressa su circa il 72% del fibroblasto e rappresenta un efficace produttore di cre nel tessuto dermico20. I topi erano alloggiati in gruppo e hanno avuto accesso al libitum ad cibo e acqua. La temperatura ambiente è stata mantenuta a 21 , 2 gradi centigradi. Mentre abbiamo usato C57BL/6 topi maschi e femmine incrociati a 8-12 settimane, non crediamo che l'età, il sesso, o il background genetico sono requisiti necessari per eseguire esperimenti multi-foton. I topi erano profondamente anestesizzati subito dopo l'esperimento e l'eutanasia.
1. Preparazione di farmaci
- Preparare una soluzione di lipopolysaccharide-FITC (vedere Tabella deimateriali) in uno sterile 1x PBS (pH 7.4). Vorticare la soluzione di riserva a intensità media per almeno 30 secondi per garantire la miscelazione omogenea per una concentrazione equa in tutta la soluzione prima della pipettatura (LPS è una molecola glutinous).
NOTA: Non inserire LPS in un contenitore di vetro, se possibile, utilizzare tubi di microcentrifuga siliconici. Tenere sul ghiaccio fino all'uso.
2. Configurazione dell'imaging
- Impostare il sistema multifotona (vedere Tabella dei materiali) per l'imaging a due colori. Ciò richiede l'uso di due laser di eccitazione separati (vedere Tabella dei materiali), un set di cubi di filtro GFP/RFP (vedi tabella dei materiali) e un obiettivo di immersione dell'acqua 25x (1,05 NA) (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Gli utenti possono modificare queste impostazioni per adattarle meglio alle configurazioni alternative e alle funzionalità del microscopio multifotone. Questi sono i parametri utilizzati nel protocollo sperimentale. Vedere Tabella dei materiali per dettagli specifici. - Posizionare un apparato stereotassico (vedi Tabella deimateriali) sullo stadio del microscopio multifotone. Collegare questo ad una macchina per la consegna di anestesia (vedi Tabella deimateriali) per assicurarsi che gli animali siano anestesizzati per tutta la durata dell'esperimento. Posizionare un pezzo di carta nera opaca sulla superficie dell'apparecchio come punto di connessione per la zampa del mouse.
- Selezionare lo scanner risonante con un'area di scansione fissa di 512 m x 512 m.
NOTA: non eseguire gli esperimenti in questo protocollo utilizzando uno scanner galvanometro. A causa della frequenza di campionamento più lenta, ci sarà distorsione nei video time-lapse z-stack a causa della respirazione dell'animale che è inevitabile. - Ottimizzare i due laser di eccitazione alle lunghezze d'onda di eccitazione di GFP e RFP rispettivamente, 930 nm e 1100 nm e dirigere il percorso di luce di entrambi i laser di eccitazione al singolo obiettivo utilizzando uno specchio dicroico di 690-1,050 nm che consente il laser di excitazione 930 nm sintonizzato da riflettere allo scanner principale e al laser da 1.100 nm-tuned per passare direttamente nello scanner principale (Figura 2).
NOTA: è possibile modificare queste lunghezze d'onda di eccitazione a seconda della configurazione dell'utente. - Impostare la potenza laser di FITC al 5% e GFP al 20%.
NOTA: questa configurazione fornisce un rapporto segnale-rumore ottimale (SNR) in questi esperimenti. Rilevare il segnale tramite tubi fotomoltiplicatori multi-alcali (PMT); tuttavia, i rivelatori GaAsP possono essere utilizzati invece in esperimenti ad altissima sensibilità. - Preparare la stanza per l'imaging in condizioni di buio senza luce vagante.
3. Imaging in vivo
- Posizionare il mouse nella camera di induzione del sistema di distribuzione dell'anestesia e utilizzare il 5% di isoflurane (vedi Tabella deimateriali) ad una portata di ossigeno di 2 L/min per posizionare il topo sotto anestesia profonda.
NOTA: si consiglia vivamente di indossare tutto il PPE appropriato durante l'esperimento.- Trasferire il mouse all'apparato stereotassico con accesso a un cono naso per mantenere l'anestesia durante l'esperimento. Ridurre l'isoflurane all'1,5%-2% e mantenere costante la portata.
-
Apporre saldamente la zampa posteriore a un pezzo di carta nera con nastro nero su aree sia prossimali che distali all'area di interesse (questo riduce gli effetti della respirazione del mouse sulla qualità dell'immagine), assicurandosi che la superficie plantare della zampa sia libera e rivolta verso l'obiettivo. Assicurarsi che la testa del mouse sia stabile all'interno del cono del naso attaccato all'apparecchio.
NOTA: Monitorare il mouse per eventuali segni di disagio o disidratazione durante l'esperimento e regolare isoflurane di conseguenza.
- Posizionare una generosa quantità di lubrificante sterile a base d'acqua (gel, vedi Tabella deimateriali) sulla superficie plantare della zampa e toccare l'obiettivo ad esso al fine di creare una colonna di liquido tra la zampa e l'obiettivo.
- Utilizzare la luce di eccitazione FITC per mettere a fuoco nello strato dermico della zampa. Assicurarsi che i fibroblasti con tag tdTomato siano visualizzati prima di continuare (questo passaggio è importante per determinare il piano focale corretto per l'immagine).
NOTA: Lo strato dermico della zampa è di circa 100-150 m nella zampa. - Immagine dell'area delle celle situata appena sotto la superficie plantare della zampa posteriore con entrambi i laser da 930 nm e 1100 nm e l'acquisizione di un time-lapse di 15 minuti di circa 5-10 z-slice a circa 1 m per slice per stabilire una rappresentazione dell'ambiente prima iniezione con LPS-FITC.
- Eseguire un'iniezione intraplantara di 5 G/20 lL LPS-FITC sulla zampa posteriore del mouse utilizzando una siringa Hamilton in vetro da 25 l (vedi Tabella deimateriali) e un ago 30G (vedere Tabella deimateriali), facendo attenzione a non disturbare la posizione della zampa.
- Immagine di un'area di celle situata appena sotto la superficie plantare della zampa posteriore con entrambi i laser da 930 nm e 1100 nm e acquisire un time-lapse di 60-120 minuti di circa 5-10 z-slice a circa 1 m per slice per identificare l'assorbimento di LPS-FITC da parte delle cellule.
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Representative Results
Inizialmente, abbiamo iniettato LPS-FITC nella zampa posteriore dei topi selvatici al fine di visualizzare l'assorbimento di LPS-FITC in tutti i tipi di cellule presenti nello strato dermico della zampa. Dopo aver osservato una miriade di cellule nello strato dermico della zampa posteriore verso l'assorbimento Fluorescente-tagged LPS in un mouse di tipo selvatico (Video Figura 1, 2), abbiamo cercato di indirizzare specificamente i fibroblasti in quanto sono un obiettivo primario nella nostra ricerca. Prima di immaginare le zampe degli animali iniettati con LPS-FITC, volevamo essere chiari sul fatto che non esiste una fluorescenza intrinseca delle cellule nello strato dermico. Questo per garantire che dopo l'iniezione, le immagini che prendiamo siano vere interazioni di cellule con l'LPS con tag fluorescenti e non con artefatti di imaging (Video Figure 3, 4). Dopo l'iniezione di LPS-FITC, solo i fibroblasti FSP1- che esprimono TLR4 legano e assumono la proteina iniettata, con un alto livello di co-localizzazione con il tag tdTomato espresso da queste cellule (Video Figure 5). Al contrario, i topi che hanno TLR4 buttato fuori da tutto il corpo (TLR4KO) non si legano e prendono LPS dopo l'iniezione. Come evidente nel video, le sagome delle cellule sono visibili dopo l'iniezione LPS-FITC che indica che il farmaco si sta disperdendo nel fluido interstiziale intorno alle cellule, ma non è in realtà vincolato da un recettore (Video Figure 6).
Per riassumere i nostri risultati, mostriamo, in vivo, che dopo l'iniezione di LPS-FITC, in un FSP1cre; i fibroblasti riattivati solo per cellule tdTomato-stop-lox sono stati riattivati con i fibroblasti che interagiscono e assumono LPS. Al contrario, i knockout di tutto il corpo di TLR4 non si legano e accettano LPS-FITC dopo l'iniezione.
Figura 1 . tdTomato è espresso solo in FSP1- Fibroblasti in un Manicomio Dipendente dal Creme. A) I topi transgenici FSP1cre allevati su uno sfondo C57BL/6 sono incrociati con topi tdTomato allevati su uno sfondo C57BL/6 per generare topi espressi tdTomato in FSP1- fibroblasto in modo dipendente dal crescitizio. B) Risultati di PCR rappresentativi raffiguranti topi FSP1cre positivi e negativi che esprimono tdTomato. C) Pittografo rappresentativo dei fibroblasti dermici nello spazio extracellulare situato nella zampa del topo. FSP1- I topi esprimono una proteina fluorescente rossa solo nei fibroblasti, mentre i topi FSP1- non lo fanno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Percorso chiaro del microscopio a 2 fotoa a due colori. La rappresentazione del percorso luminoso impostato per l'esperimento a 2 fotoni a 2 colori istituito. Laser 1 è sintonizzato a 930 nm per eccitare LPS fitC coniugato e Laser 2 è sintonizzato a 1100 nm per eccitare tdTomato trovato nei fibroblasti. La luce di eccitazione del laser 1 viene riflessa dallo specchio dicroico (690-1050 nm) mentre la luce di eccitazione dal laser 2 passa allo scanner principale. La luce di eccitazione di entrambi i laser è riflessa da una serie di specchi a un secondo specchio dicroico (650 nm) che permette alla luce di eccitazione di passare attraverso l'obiettivo e nel tessuto per eccitare i fluorofori. La luce viene emessa dai fluorofori eccitati e viene catturata dall'obiettivo 25x e riflessa dallo specchio dicroico (650) ai tubi fotomoltiplicatori multi-alcali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Diagramma di flusso sperimentale di microscopia a 2 fotoni. I topi sono anestesizzati e immobilizzati utilizzando un sistema di anestesia a basso flusso e un apparato stereotassico. La superficie plantare della zampa si affaccia sull'obiettivo ed è immagine per 15 minuti. L'iniezione intraplantara di 5 g/20 L LL LPS-FITC viene eseguita sul topo anestesizzato e la zampa viene quindi immagine per un periodo di tempo necessario per l'obiettivo dell'esperimento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video Figura 1. Video impilati di assorbimento LPS-FITC nelle celle in mouse Wild Type C57BL/6. Video a z dello strato dermico della zampa posteriore di un mouse C57BL/6 prima dell'iniezione LPS-FITC. L'aspetto plantare di una zampa di topo di tipo selvaggio è stato immaginato per 15 minuti prima dell'iniezione con LPS-FITC per controllare l'autofluorescenza prodotta nel canale GFP. C'è poco o nessuno segnale nel canale GFP che indica nessuna autofluorescenza. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Video Figura 2. Video a z dello strato dermico della zampa posteriore di un mouse C57BL/6 dopo l'iniezione LPS-FITC. L'aspetto plantare di una zampa di topi di tipo selvaggio è stato ripreso per 1,5 ore dopo l'iniezione LPS-FITC per visualizzare l'assorbimento di LPS-FITC da tutte le cellule che esprimono TLR4. Come evidente nel video, una moltitudine di cellule si legano e assumono LPS-FITC nel corso dell'esperimento. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Video Figura 3. Video a z dello strato dermico della zampa posteriore di un FSP1cre; mouse tdTomato prima dell'iniezione LPS-FITC. L'aspetto plantare di un FSP1cre; La zampa di topo tdTomato è stata mappata per 15 minuti prima dell'iniezione con LPS-FITC per il controllo dell'autofluorescenza prodotta nel canale GFP. C'è poco o nessuno segnale nel canale GFP che indica nessuna autofluorescenza. vengono visualizzati i fibroblasti tdTomato-positivi. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Figura video 4. Video a z dello strato dermico della zampa posteriore di un mouse TLR4KO prima dell'iniezione LPS-FITC. L'aspetto plantare della zampa di topi TLR4KO è stato immagine per 15 minuti prima dell'iniezione con LPS-FITC per controllare l'autofluorescenza prodotta nel canale GFP. C'è poco o nessuno segnale nel canale GFP che indica nessuna autofluorescenza. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Video Figura 5. Video a z dello strato dermico della zampa posteriore di un FSP1cre; mouse tdTomato dopo l'iniezione LPS-FITC. L'aspetto plantare di un FSP1cre; la zampa di topo tdTomato è stata ripresa per 1,5 ore dopo l'iniezione LPS-FITC per visualizzare l'assorbimento di LPS-FITC da parte dei fibroblasti tdTomato-positivi che esprimono TLR4. Come evidente nel video, si osserva l'assorbimento altamente specifico di LPS-FITC tramite TLR4 espresso su fibroblasti tdTomato-positivi. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Video Figura 6. Video a z dello strato dermico della zampa posteriore di un mouse TLR4KO dopo l'iniezione LPS-FITC. L'aspetto plantare di una zampa di mouse TLR4KO è stato immaginato per 1,5 ore dopo l'iniezione LPS-FITC per visualizzare se l'assorbimento di LPS-FITC da parte delle cellule in un knockout di tutto il corpo di TLR4 è possibile. Come evidente nel video, nessun assorbimento di LPS-FITC è visto dalla cella nello strato dermico della zampa posteriore. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
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Discussion
Probabilmente i passi più importanti dell'imaging in vivo a 2 fotoni sono: 1) Scegliere il topo reporter genetico giusto e la proteina fluorescente per l'installazione multi-fotone e le esigenze sperimentali21,22; 2) imaging del piano focale corretto per avere una rappresentazione accurata della popolazione di cellule nel tessuto23; 3) minimizzare il movimento a causa di un animale immobilizzato in modo improprio24; e 4) scegliere quando analizzare i dati qualitativamente rispetto quantitativamente25,26,27. Garantire di affrontare questi punti prima di iniziare un esperimento fornirà le conoscenze per raccogliere dati riproducibili e scientificamente rigorosi.
Una considerazione importante nel protocollo è immobilizzare correttamente la regione da immaginare. La respirazione dall'animale provoca piccoli spostamenti nel piano focale durante l'imaging e quando si esegue il video z-stack e time-lapse, ciò causa distorsioni significative nel video e può influire negativamente sulla qualità dei dati prodotti. Garantire che la zampa sia correttamente immobilizzata consentirà il successo dell'imaging della zampa senza interruzione della respirazione. Inoltre, conoscere la localizzazione delle cellule nell'esperimento è un passo fondamentale nell'identificare il piano focale corretto da visualizzare. Poiché abbiamo scelto di concentrarci sui fibroblasti dermici, abbiamo solo bisogno di immaginare una distanza relativamente breve nella zampa per essere in grado di visualizzare i nostri tipi di interesse cellulare (100-150 m). In altri esperimenti, è importante considerare le capacità del microscopio e dell'obiettivo che si usano perché l'esecuzione di un esperimento per immagini di cellule in profondità all'interno del tessuto può essere difficile da impossibile dato che gli utenti istituito. Infine, la scelta di come affrontare l'analisi dei dati è una considerazione importante nelle fasi finali dell'esperimento. Qui, stiamo mostrando che i fibroblasti che esprimono TLR4 sono in grado di assorbire e legare LPS fluorescenti con tag fluorescenti che è evidente dalla robusta co-localizzazione del verde (LPS) e rosso (tdTomato espresso dai fibrolanti) nei video. Anche se non viene eseguita alcuna analisi quantitativa delle immagini in questo protocollo, esistono diversi modi in cui un utente potrebbe interpretare i dati raccolti da questo protocollo. Il primo è una semplice analisi di co-localizzazione utilizzando software open-source per misurare l'intensità di due colori distinti in un dato pixel28. Ciò consente all'utente di identificare se vengono rilevati due fluorofori eccitati su un determinato pixel in un'immagine o in un video acquisito e la sovrapposizione che c'è in un determinato spazio. Ciò è utile per identificare se le cellule di interesse interagiscono ad una certa capacità con la molecola iniettata. Un metodo alternativo di analisi quantitativa è l'intensità della fluorescenza29. L'utente è in grado di raccogliere informazioni sull'intensità di un dato segnale all'interno di una cella di interesse. I dati raccolti da queste analisi possono indicare come le cellule potrebbero assorbire varie quantità di una molecola rispetto ad altre. Questi metodi di analisi dei dati sono un esempio di come l'utente potrebbe cercare di analizzare i dati raccolti da un esperimento simile a quello eseguito in questo protocollo.
I nostri modelli genetici ci permettono di etichettare in modo selettivo fluorescente (tdTomato) FSP1- fibroblasti in modo dipendente da crespa/loxP, che consente una visualizzazione rapida e facile delle cellule nel derma della pelle. Anche se questo rende facile la visualizzazione delle cellule a causa della loro fluorescenza intrinseca, è possibile condurre l'imaging a 2 fotoni senza cellule geneticamente etichettate se l'utente ha esperienza nel determinare il passaggio dall'epidermide al derma. Utilizzando i robusti livelli di autofluorescenza dai capelli sulla pelle può essere un indicatore utile di dove l'utente si sta concentrando e la direzione si deve spostare per ottenere il piano focale desiderato. Questo ovviamente funzionerà solo se il piano focale di interesse vicino alla pelle e non sarà la cellula di interesse è in profondità all'interno del tessuto.
Tracciare un piano focale durante l'esperimento è l'ideale; tuttavia, a causa della respirazione di un animale vivo, rende difficile prevenire spostamenti di telainel tempo quando si incorporano z-stack in un esperimento time-lapse. Per risolvere questo problema, l'utente può prendere in considerazione la riduzione della qualità dell'immagine riducendo la media della linea quando si utilizza uno scanner risonante e aumentando la frequenza di campionamento. Come accennato in precedenza, è quasi impossibile utilizzare uno scanner galvanometro tradizionale in un esperimento in cui uno z-stack e time-lapse sono incorporati a causa della velocità di campionamento più lenta dello scanner.
La modifica della durata dell'acquisizione dell'immagine può consentire all'utente di soddisfare meglio le esigenze del loro esperimento. Mentre l'imaging dell'animale per lunghi periodi di tempo consente all'utente di raccogliere dati in tutte le fasi dell'endocitosi molecolare e del metabolismo, accorciando il tempo di immagine solo parti specifiche del processo aumenterà l'efficienza. È possibile immaginare per un periodo di tempo più breve (1-15 minuti) per identificare l'attaccamento della molecola, un periodo di tempo più lungo (15-30 minuti) per visualizzare il recettore-ligando endocitosi30e l'intera durata (30-60 minuti) per visualizzare il cellulare potenziale metabolismo della molecola. Questo è altamente dipendente dalla molecola iniettata e le cellule sono state visualizzate (Figura 3).
Una nota importante nel protocollo sperimentale descritto in questo manoscritto è che attualmente, non siamo in grado di immaginare aree campione identiche pre e post-iniezione. Ciò è dovuto alla natura dell'impostazione e al metodo di somministrazione di farmaci. Tuttavia, siamo in grado di monitorare le cellule da un tempo prima post-iniezione per diverse ore. Sebbene sia importante tenere traccia delle singole cellule nel corso dell'esperimento, i cambiamenti regionali nell'attivazione cellulare sono ugualmente importanti e possono essere acquisiti utilizzando questo metodo. La visualizzazione simultanea di più di due fluorofori su un microscopio multifotone al momento è impossibile data la configurazione, pertanto, una limitazione di questo metodo è che gli utenti sono in grado di immaginare solo due fluorofori rispetto ad altre apparecchiature di imaging in cui 4 o più fluorofori sono in grado di essere visualizzati contemporaneamente31. Nel complesso, il protocollo descritto è specifico per gli obiettivi del nostro laboratorio e fornisce uno strumento utile per identificare l'attivazione cellulare in cui le possibilità sperimentali superano i limiti del protocollo.
I metodi descritti in questo manoscritto offrono una serie di vantaggi rispetto ai metodi esistenti per visualizzare l'attivazione delle cellule. Il primo è che gli esperimenti eseguiti qui sono in vivo, consentendo la visualizzazione in tempo reale delle cellule leganti e fino a prendere molecole che è direttamente indicativo di attivazione specificamente per quanto riguarda un insulto. Questo offre vantaggi rispetto ad altri metodi come le tradizionali tecniche di imaging delle cellule vive perché siamo in grado di preservare l'ambiente delle cellule che riduce significativamente la probabilità di risultati confusi a causa dell'ipereccitabilità e dell'ectopico attività delle cellule legate al trauma della dissociazione32. Inoltre, l'uso di un microscopio multifotone in questa impostazione sperimentale riduce la velocità con cui il fotoccheoflue fluorofori permettendo sessioni di imaging continue e significativamente più lunghe, il che è importante se l'utente applica questo metodo agli studi studiare il tasso di metabolismo o attivazione a lungo termine33. Infine, se i tipi di interesse delle cellule risiedono in profondità all'interno del tessuto (>100 mm) utilizzando un microscopio multifotone è necessario per ottenere il segnale ottimale34. Nel complesso, se l'obiettivo dell'esperimento di un utente è quello di studiare l'assorbimento e l'attivazione in tempo reale delle cellule in risposta a un insulto, l'utilizzo della microscopia a due fotoni accoppiata con linee di reporter transgenici è più adatto rispetto ad altre tecniche di immaginazione convenzionali.
Questa tecnica consente agli utenti di eseguire studi longitudinali su una vasta gamma di tipi di cellule per quanto riguarda l'attivazione, motilità, e le interazioni cellula-cellula. Il vantaggio di questa tecnica è che permette agli utenti di utilizzare i propri animali segnalati geneticamente etichettati e sostituire la molecola fluorescente per soddisfare i loro interessi di ricerca (ad esempio, Tie2cre per le cellule epiteliali). Questo protocollo non è limitato alla configurazione specifica mostrata nei nostri esperimenti e può essere altamente modificato per soddisfare le esigenze di qualsiasi laboratorio che utilizza linee di reporter genetici e immagini dermiche a 2 fotoni nei loro studi. Prevediamo di utilizzare questo approccio per identificare l'attivazione e il reclutamento di cellule immunitarie sul sito di lesioni a seguito di traumi periferici e determinare quale sia il corso temporale specifico di attivazione e reclutamento in modo da poter comprendere meglio quale sia l'approccio migliore per le terapie preventive è per quanto riguarda varie forme di dolore.
In conclusione, abbiamo sviluppato una nuova tecnica che consente agli utenti di immaginare l'assorbimento di LPS fluorescente con tag LPS da fibroblasti dermici con tag tdTomato che esprimono TLR4 utilizzando la microscopia a 2 fotoni.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato dalla sovvenzione NS096030 (MDB). Ringraziamo anche il responsabile del nucleo di imaging Ved Prakash. Vorremmo anche ringraziare l'Olympus Discovery Center/Imaging Core all'UT Dallas per la fornitura di attrezzature e supporto
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS, 4 L | Fisherbrand | BP3994 | |
| 700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe | Hamilton | 80501 | |
| BD Precision Glide Needle 30G | VWR | 305106 | |
| Blue Pad | Fisherbrand | 1420665 | |
| Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) | Olympus | FV30-FGR | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Vedco | 50989-150-15 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugate | Sigma-Aldrich | F3665-1MG | |
| Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics | ||
| Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | |
| Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN | Olympus | MPE-RS TWIN | |
| Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Personal Lubricant Jelly (Gel) | equate | ZH727 2E F1 | |
| SGM-4 Stereotaxic Apparatus | Narishige | 16030 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01 | |
| Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics |
References
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