Summary
Morfologiske endringer skjer i immunrespons Fibroblast celler etter aktivering og fremme endringer i mobilnettet rekruttering. Bruk av 2-Foton Imaging i forbindelse med en genetisk konstruert Fibroblast-spesifikt protein 1 (FSP1)-grobunn; tdTomato floxed-Stop-floxed (TB/TB) muse linje og grønn fluorescensmerkete merket LIPOPOLYSAKKARID-FITC, kan vi illustrere svært spesifikke opptak av lipopolysakkarid i dermal fibroblaster og morfologiske endringer i vivo.
Abstract
Fibroblaster er mesenchymal celler som endrer sin morfologi ved aktivering, til slutt påvirke mikromiljøet av vevet de befinner seg i. Selv om tradisjonelle Imaging teknikker er nyttige i å identifisere protein interaksjoner og morfologi i fast vev, de er ikke i stand til å gi innsikt om hvor raskt celler er i stand til å binde og opptak proteiner, og en gang aktivert hvordan deres morfologi endringer i Vivo. I denne studien, spør vi to store spørsmål: 1) Hva er tiden-løpet av Fibroblast aktivisering via toll-lignende reseptor-4 (TLR4) og lipopolysakkarid (LPS) samhandling og 2) Hvordan oppfører disse cellene en gang aktivert? Ved hjelp av 2-Foton Imaging, har vi utviklet en ny teknikk for å vurdere evnen til LPS-FITC å binde til sin beslektet reseptor, TLR4, uttrykt på perifere fibroblaster i genetisk reporter muse linje; FSP1cre; tdTomatoLOX-Stop-LOX in vivo. Denne unike tilnærmingen gjør det mulig for forskere å lage inngående, time-lapse videoer og/eller bilder av proteiner i samspill med levende celler som gjør det mulig å ha en økt nivå av kornethet i å forstå hvordan proteiner kan endre cellulære atferd.
Introduction
Lipopolysakkarid (LPS) er en endotoksin funnet i den ytre membran av gram-negative bakterier1. LPS har en høy binding affinitet for toll-lignende reseptor 4 (TLR4)/CD14/MD2 reseptor kompleks2. TLR4 er et mønster anerkjennelse reseptor vanligvis finnes på den ytre membran av et bredt spekter av immunceller, mesenchymal celler, og en undergruppe av sensoriske neurons3,4,5. Aktivering av TLR4 uttrykt på immunceller fører til MyD88-avhengige og uavhengige andre Messenger-systemer, som slutter med kjernefysiske-faktor Kappa beta (NFκB) translokasjon til kjernen i cellen. Dette fører til prototypic immun celle til å produsere og løslate Pro-inflammatorisk cytokiner som interleukin (IL) -1 β, IL-6, og TNF-α6. Men hvordan andre celle-typer reagerer på TLR4 stimulering er ikke så klart. Fibroblaster har vært innblandet i et bredt spekter av sykdommer som kreft og cystisk fibrose og har nylig blitt vist å spille en rolle monocytt kjemoterapi-attraksjon og fremme betennelse7,8,9. Vår Lab er interessert i rollen som fibroblaster i utviklingen av akutte og kroniske smerter, som tidlige bevis tyder på at faktorer utgitt av fibroblaster (Matrix metalloproteinases (MMPs), vev inhibitor av metalloproteinases (TIMPs), og Fibroblast vekstfaktorer (FGFs)) er involvert i nevropatisk smerte10.
Aktivering tilstander av celler kan bestemmes av en rekke faktorer som inkluderer: induksjon av umiddelbare-tidlige gener, endret protein uttrykk, celle spredning, og morfologiske endringer11,12,13. Det er mange teknikker som finnes for å svare på spørsmål vi kan ha om hvordan aktivering av celler bidrar til patologi, men de har alle sine begrensninger. Prototypiske immunhistokjemi bruker fluorescensmerkete merket antistoffer for å merke proteiner av interesse i fast vev, som kan være løs og ofte krever betydelig feilsøking før gir fruktbare resultater14. Vestlig blotting er en nyttig teknikk for å sammenlikne nivåer av protein uttrykk i etter obduksjon vev; men den histologiske komponenten mangler i denne teknikken, og forskerne er ikke i stand til å identifisere eventuelle endringer i morfologi15. RNA-SEQ tillater oss å kvantifisere tilstedeværelsen av Messenger RNA i en prøve som i mange tilfeller gir innsiktsfulle data; men gapet mellom transkripsjon og oversettelse gjør det vanskelig å ha Temporal resolusjon etter en stimulans16. Konfokalmikroskopi Imaging er nyttig for å bestemme uttrykket og co-lokalisering av proteiner som finnes i et tverrsnitt av vev17. Ofte er dette ikke representativt for helheten av vevsprøven. I kontrast, multiphoton mikroskop tillate brukere å bildet omtrent 1 mm dypt inn i en prøve, og skaper en omfattende tredimensjonal representasjon18. Derfor velger vi å fokusere på in vivo, 2-Foton Imaging forbereder, som data samlet inn fra disse eksperimentene er mer direkte relatable til svært plast og sammenhengende mikromiljøet av levende vev.
En fordel med å studere protein-reseptor interaksjoner in vivo er at vi kan tydelig fange hvordan cellene reagerer på en stimulans, i sanntid, i sitt eget miljø uten skadelig og uforutsigbar påvirkning av etter obduksjon vev utvinning19. I tillegg kan langsgående studier utføres for å vurdere mobilnettet plastisitet og grunning som kan oppstå på grunn av aktivering. Ved hjelp av 2-Foton Imaging, bevarer vi integriteten til mikromiljøet stede når en ekstern stimulans brukes. Denne protokollen gir en måte å identifisere opptak av molekyler i fibroblaster etter perifer injeksjon av fluorescensmerkete merket LPS i løpet av flere timer i vivo og rollen til TLR4 i Fibroblast aktivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal prosedyrer ble godkjent av The University of Texas i Dallas institusjonelle Animal Care og bruk komiteen og var i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer. Alle eksperimenter ble utført ved hjelp av 8-12-ukers-gamle mannlige og kvinnelige mus avlet in-House på en C57BL/6 bakgrunn. Transgene-mus med grobunn-recombinase drevet av den Fibroblast protein-1 arrangøren ble kjøpt kommersielt (Jackson, 012641) (FSP1cre)+/- og krysset med tdTomatoLOX-Stop-LOX mus, også kjøpt kommersielt ( Jackson, 007914) og (FSP1cre)+/- ; tdTomatoLOX-stopp-LOX og FSP1cre-/-; tdTomatoLOX-Stop-LOX mus ble avlet in-House på en C57BL/6 bakgrunn (figur 1a, B, C). Fibroblast protein 1 er en endogene protein uttrykt på omtrent 72% av Fibroblast og representerer en effektiv grobunn i Dermal vev20. Mus var gruppe huset og gitt annonsen lib tilgang til mat og vann. Romtemperaturen ble opprettholdt ved 21 ± 2 ° c. Mens vi brukte C57BL/6 krysset mannlige og kvinnelige mus på 8-12 uker, tror vi ikke alder, kjønn, eller genetisk bakgrunn er nødvendige krav for å kjøre multiphoton eksperimenter. Mus ble dypt anesthetized umiddelbart etter eksperimentet og euthanized.
1. utarbeidelse av narkotika
- Klargjør en oppløsning på 5 μg/20 μL av lipopolysakkarid-FITC (se tabell over materialer) i STERIL 1x PBS (pH 7,4). Vortex den lagerløsning på middels intensitet i minimalt 30 sekunder for å sikre homogen miksing for en lik konsentrasjon gjennom hele løsningen før pipettering (LPS er et klebrig molekyl).
Merk: ikke plasser LPS i en glassbeholder, hvis mulig, bruk silikonbehandlet mikrosentrifugen rør. Hold på isen til bruk.
2. Imaging oppsett
- Sett opp multiphoton systemet (se tabell over materialer) for Imaging med to farger. Dette krever bruk av to separate eksitasjon lasere (se tabell av materialer), en GFP/RFP filter Cube sett (se materiale tabell), og en 25x (1,05 na) vann-nedsenking mål (se tabell over materialer).
Merk: brukere kan endre disse innstillingene for å passe bedre til alternative oppsett og multiphoton mikroskop funksjoner. Dette er parametrene som brukes i den eksperimentelle protokollen. Se tabell over materialer for spesifikke detaljer. - Plasser et stereotaxic apparat (se tabell over materialer) på scenen i det multiphoton mikroskopet. Koble dette til en anestesi levering maskin (se tabell over materialer) for å sikre at dyrene er anesthetized for varigheten av eksperimentet. Plasser et stykke matt svart papir på overflaten av apparatet som et koblingspunkt for musen labben.
- Velg resonans skanneren med et fast skanneområde på 512 μm x 512 μm.
Merk: ikke Utfør eksperimentene i denne protokollen ved hjelp av en galvano skanner. På grunn av den tregere samplingsfrekvensen, vil det være forvrengning i z-stack time-lapse videoer på grunn av åndedrett av dyret som er uunngåelig. - Tune de to eksitasjon lasere til eksitasjon bølgelengder av GFP og RFP, 930 NM og 1100 NM henholdsvis, og direkte lyset banen både eksitasjon lasere til enkelt mål ved hjelp av en dichroic speil av 690-1050 NM slik at 930 NM-innstilt eksitasjon laser å bli reflektert til det hovedavdeling skanner og det 1 100 NM-innstilt laser å admission card direkte inn i hovedavdeling skanner (skikkelsen 2).
Merk: det er mulig å endre disse eksitasjon bølgelengder avhengig av brukerens oppsett. - Sett laseren effekt av FITC til 5% og GFP til 20%.
Merk: Dette oppsettet gir et optimalt signal-til-støy-forhold (SNR) i disse eksperimentene. Oppdage signal via multi-alkali Foto-multiplikator rør (eksportert pmts); GaAsP-detektorer kan imidlertid brukes i stedet for svært følsomme eksperimenter. - Forbered rommet for bildebehandling under mørke forhold uten lys som beveger seg.
3. inne vivo tenkelig
- Plasser musen i induksjon kammeret i anestesi levering systemet og bruk 5% isoflurane (se tabell av materialer) ved en 2 L/min strømningshastighet av oksygen for å plassere musen under dyp anestesi.
Merk: det anbefales sterkt å bruke all egnet PPE under eksperimentet.- Overfør musen til stereotaxic apparat med tilgang til en nese kjegle for å opprettholde anestesi gjennom eksperimentet. Reduser isoflurane til 1,5%-2% og hold strømningshastigheten konstant.
-
Fest bak-labben til et stykke svart papir med svart tape på områder som både er proksimale og er i ferd med å være av interesse (dette reduserer effekten av mus respirasjon på bildekvalitet), og pass på at den plantar overflaten av labben er uhindret og vendt mot opp mot målet. Pass på at hodet på musen er stabil i nese membranen som er festet til apparatet.
Merk: Overvåk musen for tegn på nød eller dehydrering gjennom hele eksperimentet og Juster isoflurane tilsvarende.
- Plasser en generøs mengde steril vannbasert smøremiddel (gel, se tabell av materialer) på plantar overflaten av labben og berøre målet til det for å skape en kolonne av væske mellom labben og målet.
- Bruk FITC eksitasjon lys til å fokusere på dermal laget av labben. Kontroller at tdTomato-kodede fibroblaster er avbildet før du fortsetter (dette trinnet er viktig for å bestemme riktig fokal plan til bildet).
Merk: dermal laget av labben er ca 100-150 μm inn i labben. - Image området av celler som ligger like under den plantar overflaten av bakben med både 930 NM og 1100 NM-tuned lasere og erverve en 15-minutters tidsforløp på ca 5-10 z-skiver på ca 1 μm per skive for å etablere en representasjon av miljøet før injeksjon med LPS-FITC.
- Utfør en intraplantar injeksjon på 5 μg/20 μL LPS-FITC på musen bak labben ved hjelp av en 25 μL glass Hamilton sprøyte (se tabell over materialer) og 30G nål (se tabell over materialer), ta vare å ikke forstyrre posisjonen til labben.
- Bilde et område av celler som ligger like under den plantar overflaten av bakben med både 930 NM og 1100 NM-tuned lasere og erverve en 60-120 minutters time-lapse på om lag 5-10 z-skiver på ca 1 μm per skive for å identifisere opptaket av LPS-FITC av celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Først injisert vi LPS-FITC i bak-labben av vill-type mus for å visualisere opptaket av LPS-FITC i alle celletyper til stede i dermal laget av labben. Etter å ha observert en myriade av celler i dermal laget av bak-labb opptak fluorescensmerkete-merket LPS i en vill type mus (video figur 1, 2), prøvde vi å spesifikt målrette fibroblaster som de er et hovedfokus i forskningen vår. Før Imaging poter av dyr injisert med LPS-FITC vi ønsket å være klart at det ikke er iboende fluorescens av celler i dermal laget. Dette er for å sikre at etter injeksjon, bildene vi tar er sanne interaksjoner av celler med fluorescensmerkete-merket LPS og ikke noen tenkelig gjenstander (video figur 3, 4). Etter LPS-FITC injeksjon, bare FSP1+ FIBROBLASTER uttrykker TLR4 bind og opptak injisert protein, med et høyt nivå av co-lokalisering med tdTomato koden uttrykt av disse cellene (video figur 5). I kontrast, mus som har TLR4 slått ut av hele kroppen (TLR4ko) ikke bind og opptak LPS etter injeksjon. Som tydelig i videoen, silhuetter av celler er synlige etter LPS-FITC injeksjon som indikerer at stoffet er Dispergering i interstitiell væske rundt cellene, men er ikke faktisk blir bundet av en reseptor (video figur 6).
For å oppsummere våre resultater, viser vi, in vivo, at etter INJEKSJON av LPS-FITC, i en FSP1cre; tdTomatoLOX-Stop-LOX Cell-spesifikke reaktivert dyr bare fibroblaster samhandle med og opptak LPS. I kontrast, hele kroppen Knockouts av TLR4 ikke bind og opptak LPS-FITC etter injeksjon.
Figur 1 . tdTomato uttrykkes bare i FSP1+ fibroblaster på en grobunn-avhengig måte. A) FSP1cre transgene mus avlet på en C57BL/6 bakgrunn er krysset med tdTomato mus avlet på en C57BL/6 bakgrunn for å generere mus uttrykt TDTOMATO i FSP1+ Fibroblast på en grobunn-avhengig måte. B) representative PCR-resultater som viser både positive og negative FSP1cre-mus som uttrykker tdTomato. C) representative pictograph av dermal fibroblaster i ekstracellulære plass ligger i musen labben. FSP1+ mus uttrykke et rødt fluorescerende protein bare i FIBROBLASTER mens FSP1- mus ikke. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Lys sti av to-farge 2-Foton mikroskop. Beskrivelsen av lys banen som er satt opp for eksperimentet med 2-fargers 2-Foton. Laser 1 er innstilt til 930 NM å opphisse FITC-bøyd LPS og laser 2 er innstilt til 1100 NM å opphisse tdTomato funnet i fibroblaster. Eksitasjon lys fra laser 1 gjenspeiles av dichroic speilet (690-1050 NM) mens eksitasjon lys fra laser 2 passerer gjennom til de viktigste skanneren. Eksitasjon lyset fra begge lasere er reflektert av en sette av speilet å en andre dichroic speilet (650 NM) tillater eksitasjon lyset å admission card igjennom målet og inn i tissue å opphisse det fluorophores. Lys slippes ut fra opphisset fluorophores og fanges opp av 25x mål og reflekteres av dichroic speilet (650) til multi-alkali photomultiplier rør. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Eksperimentell Flow diagram av 2-Foton mikroskopi. Mus er anesthetized og immobilisert ved hjelp av en lav-flow anestesi system og stereotaxic apparater. Det plantar overflate av det pote ansikter målet og er avbildet for 15 minuttene. Intraplantar injeksjon på 5 μg/20 μL LPS-FITC utføres på anesthetized mus og labben blir deretter avbildet i en tidsperiode som er nødvendig for målet med eksperimentet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video figur 1. Z-stack videoer av LPS-FITC opptak i celler i Wild type C57BL/6 mus. Z-stable video av dermal laget av bak-labben av en C57BL/6-mus før LPS-FITC injeksjon. Den plantar aspekt av en vill type mus labben ble avbildet i 15 minutter før injeksjon med LPS-FITC å kontrollere for autofluorescence produsert i GFP kanalen. Det er lite eller ingen signal i GFP kanalen indikerer ingen autofluorescence. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video figur 2. Z-stack video av dermal laget av bak labben av en C57BL/6 mus etter LPS-FITC injeksjon. Den plantar aspekt av en vill type mus labben ble avbildet for 1,5 timer post-LPS-FITC injeksjon for å visualisere opptak av LPS-FITC av alle celler uttrykker TLR4. Som tydelig i videoen, en rekke celler bind og opptak LPS-FITC gjennom hele løpet av eksperimentet. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video figur 3. Z-stack video av dermal laget av bakben av en FSP1cre; tdTomato musen før LPS-FITC injeksjon. Den plantar aspekt av en FSP1cre; tdTomato mus labben ble avbildet i 15 minutter før injeksjon med LPS-FITC å kontrollere for autofluorescence produsert i GFP kanalen. Det er lite eller ingen signal i GFP kanalen indikerer ingen autofluorescence. tdTomato-positive fibroblaster er visualisere. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video figur 4. Z-stack video av dermal laget av bak labben av en TLR4ko Mouse før LPS-FITC injeksjon. Den plantar aspekt av TLR4ko Mouse Paw ble avbildet i 15 minutter før INJEKSJON med LPS-FITC å kontrollere for autofluorescence produsert i GFP kanalen. Det er lite eller ingen signal i GFP kanalen indikerer ingen autofluorescence. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video figur 5. Z-stack video av dermal laget av bakben av en FSP1cre; tdTomato musen etter LPS-FITC injeksjon. Den plantar aspekt av en FSP1cre; tdTomato mus Paw ble avbildet for 1,5 timer post-LPS-FITC injeksjon for å visualisere opptaket av LPS-FITC av tdTomato-positive fibroblaster uttrykke TLR4. Som tydelig i videoen, svært spesifikke opptak av LPS-FITC via TLR4 uttrykt på tdTomato-positive fibroblaster er sett. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video figur 6. Z-stack video av dermal laget av bak-labben av en TLR4ko Mouse etter LPS-FITC injeksjon. Den plantar aspekt av en TLR4ko Mouse Paw ble avbildet for 1,5 timer post-LPS-FITC injeksjon for å visualisere om OPPTAKET av LPS-FITC av celler i en hel-kropp KNOCKOUT av TLR4 er mulig. Som tydelig i videoen, ingen opptak av LPS-FITC er sett av cellen i dermal laget av bakben. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uten tvil de viktigste trinnene i in vivo 2-Foton Imaging er: 1) velge riktig genetisk reporter mus og fluorescensmerkete-Tagged protein for multi-Foton oppsett og eksperimentelle behov21,22; 2) Imaging riktig fokalplanet for å ha en nøyaktig representasjon av bestanden av celler i vevet23; 3) minimere bevegelse på grunn av en ukorrekt immobilisert dyr24; og 4) velge når du skal analysere data kvalitativt vs kvantitativt25,26,27. Å sørge for å ta opp disse punktene før du begynner et eksperiment vil gi kunnskap til å samle inn data som er både reproduserbar og vitenskapelig strenge.
En viktig faktor i protokollen er riktig immobilizing regionen for å bli avbildet. Åndedrett fra dyret forårsaker minutt skift i fokalplanet under bildebehandling og når du utfører z-stack og time-lapse video, dette fører til betydelig forvrengning i videoen og kan negativt påvirke kvaliteten på data som produseres. Forsikrer det det pote er riktig immobilisert ville tillate heldig tenkelig av det pote uten forstyrrelsen fra åndedrett. I tillegg vet lokalisering av celler i eksperimentet er et kritisk skritt i å identifisere riktig fokalplanet å visualisere. Fordi vi valgte å fokusere på dermal fibroblaster, vi trenger bare å bilde en relativt kort avstand i labben for å kunne visualisere vår celletyper av interesse (~ 100-150 μm). I andre eksperimenter, er det viktig å vurdere egenskapene til mikroskopet og objektive en bruker fordi utføre et eksperiment til bilde celler dypt inne i vevet kan være utfordrende å umulig gitt brukerne satt opp. Til slutt, velge hvordan tilnærming dataanalyse er en viktig faktor i de siste trinnene i eksperimentet. Her viser vi at fibroblaster uttrykker TLR4 er i stand til opptak og bind fluorescensmerkete-merket LPS som er tydelig av den robuste co-lokalisering av grønn (LPS) og rød (tdTomato uttrykt av fibroblaster) i videoene. Selv om ingen kvantitativ bildeanalyse er gjort i denne protokollen, er det en rekke måter en bruker kan tolke data som er samlet inn fra denne protokollen. Den første er en enkel co-lokalisering analyse ved hjelp av åpen kildekode-programvare for å måle intensiteten av to forskjellige farger i en gitt piksel28. Dette gjør det mulig for brukeren å identifisere om to spente fluorophores oppdages på en gitt piksel i et ervervet bilde eller video, og hvor mye av denne overlappingen det er i et gitt område. Dette er nyttig for å identifisere om cellene av interesse er i samspill til en viss kapasitet med injisert molekylet. En alternativ metode for kvantitativ analyse er fluorescens intensitet29. Brukeren er i stand til å samle informasjon om intensiteten av et gitt signal i en celle av interesse. Data som samles inn fra disse analysene kan indikere hvordan celler kan opptaket ulike mengder av et molekyl i forhold til andre. Disse metodene for dataanalyse er et eksempel på hvordan brukeren kan søke å analysere data som er samlet inn fra et eksperiment som ligner på det som er utført i denne protokollen.
Våre genetiske modeller tillate oss å selektivt fluorescensmerkete tag (tdTomato) FSP1+ fibroblaster i en grobunn/loxP-avhengig måte, som gjør det mulig for rask og enkel visualisering av celler i dermis av huden. Selv om dette gjør visualisere celler lett på grunn av deres iboende fluorescens, er det mulig å utføre 2-Foton Imaging uten genetisk kodede celler hvis brukeren er erfarne i å bestemme overgangen fra epidermis til dermis. Ved hjelp av robuste nivåer av autofluorescence fra håret på huden kan være en nyttig indikator på hvor brukeren er fokus og retningen man trenger å flytte inn for å oppnå ønsket fokalplanet. Dette åpenbart vil bare fungere hvis fokalplanet av interesse i nær huden og vil ikke cellen av interesse er dypt inne i vevet.
Å spore et fokal fly gjennom hele eksperimentet er ideelt; men på grunn av åndedrett av et levende dyr, det gjør det vanskelig å hindre rammeskift over tid når innlemme z-stabler i et tidsforløp eksperiment. For å feilsøke dette problemet, kan brukeren vurdere å redusere bildekvaliteten ved å redusere linje gjennomsnitt når du bruker en resonans skanner og øke samplingsfrekvensen. Som nevnt tidligere, er det nesten umulig å bruke en tradisjonell galvano Scanner i et eksperiment der en z-stack og time-lapse er innarbeidet på grunn av tregere samplingsfrekvensen av skanneren.
Endre varigheten av bildet oppkjøpet kan tillate brukeren å bedre dekke behovene til eksperimentet sitt. Mens Imaging dyret i lengre perioder tillater brukeren å samle inn data gjennom alle trinnene i molekylet endocytose og metabolisme, forkorte tiden til bildet bare bestemte deler av prosessen vil øke effektiviteten. Det er mulig å bilde for en kortere periode (~ 1-15 minutter) for å identifisere molekylet vedlegg, en lengre periode (~ 15-30 minutter) for å visualisere reseptor-ligand endocytose30, og full varighet (~ 30-60 minutter) for å visualisere mobilnettet aktivering og potensiell metabolisme av molekylet. Dette er imidlertid svært avhengig av molekylet injisert og cellene ble visualisere (Figur 3).
Et viktig notat i den eksperimentelle protokollen som er beskrevet i dette manuskriptet er at for øyeblikket er vi ikke i stand til å bilde identiske prøveområder før og etter injeksjon. Dette er på grunn av arten av oppsettet og metoden for narkotika levering. Men vi er i stand til å spore celler fra en tid tidlig post-injeksjon i flere timer. Selv om det er viktig å holde rede på enkeltceller i løpet av eksperimentet, er regionale skift i mobil aktivering like viktige og kan fanges opp ved hjelp av denne metoden. Visualisere mer enn to fluorophores på et multiphoton mikroskop samtidig i øyeblikket er umulig gitt oppsettet, derfor en begrensning av denne metoden er at brukerne er bare i stand til bildet to fluorophores i motsetning til andre tenkelig utstyr der 4 eller flere fluorophores er i stand til å bli visualisere samtidig31. Samlet protokollen beskrevet er spesifikke for målene for laboratoriet vårt, og gir et nyttig verktøy for å identifisere mobilnettet aktivering der eksperimentelle mulighetene oppveier begrensningene i protokollen.
Metodene som er beskrevet i dette manuskriptet gir en rekke fordeler i forhold til eksisterende metoder for å visualisere aktiveringen av celler. Det første er at forsøkene utføres her er in vivo, slik at for sanntids visualisering av celler bindende og opp med å ta molekyler som er direkte indikasjon på aktivering spesielt i forhold til en fornærmelse. Dette gir fordeler fremfor andre metoder som tradisjonelle Live-Cell Imaging teknikker fordi vi er i stand til å bevare miljøet i cellene som i betydelig grad reduserer sannsynligheten for forvirrende resultater på grunn av hyperexcitability og svangerskap utenfor livmoren aktivitet av celler knyttet til traumer av dissosiasjon32. I tillegg, bruk av et multiphoton mikroskop i denne eksperimentelle innstillingen reduserer hastigheten som fluorophores Foto-bleke tillater for kontinuerlig og betydelig lengre Imaging økter som er viktig hvis brukeren bruker denne metoden til studier undersøke hastigheten på stoffskiftet eller langsiktige aktivisering33. Til slutt, hvis cellen typer av interesse bor dypt inne i vevet (> 100 mm) ved hjelp av et multiphoton mikroskop er nødvendig for å oppnå optimalt signal34. Overall, hvis målet for en brukers eksperiment er å studere sanntids opptak og aktivering av celler som svar på en fornærmelse deretter bruke to-Foton mikroskopi kombinert med transgene reporter linjer er mer egnet over andre konvensjonelle forestille teknikker.
Denne teknikken gjør det mulig for brukere å utføre langsgående studier på et bredt utvalg av celletyper i forhold til aktivering, motilitet, og celle-til-celle interaksjoner. Fordelen med denne teknikken er at den tillater brukere å bruke sine egne genetisk-merkede rapporterte dyr og erstatte fluorescensmerkete-merket molekyl som passer deres forskningsinteresser (f. eks Tie2cre for epitelceller). Denne protokollen er ikke begrenset til det spesifikke oppsettet som vises i våre eksperimenter og kan bli svært modifisert for å passe behovene til enhver Lab utnytte genetiske reporter linjer og 2-Foton dermal Imaging i sine studier. Vi planlegger å bruke denne tilnærmingen til å identifisere aktivering og rekruttering av immunceller til området for skader etter perifere traumer og bestemme hva den spesifikke tiden løpet av aktivisering og rekruttering er slik at vi kan bedre forstå hva den beste tilnærmingen er for forebyggende legemiddel er i forhold til ulike former for smerte.
Avslutningsvis har vi utviklet en ny teknikk som lar brukerne bildeopptak av fluorescensmerkete-merket LPS av tdTomato-Tagged dermal fibroblaster uttrykke TLR4 bruker 2-Foton mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av tilskuddet NS096030 (MDB). Vi vil også gjerne takke Imaging Core Manager ved Prakash. Vi vil også gjerne takke Olympus Discovery Center/Imaging Core anlegget på UT Dallas for å tilby utstyr og støtte
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS, 4 L | Fisherbrand | BP3994 | |
| 700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe | Hamilton | 80501 | |
| BD Precision Glide Needle 30G | VWR | 305106 | |
| Blue Pad | Fisherbrand | 1420665 | |
| Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) | Olympus | FV30-FGR | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Vedco | 50989-150-15 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugate | Sigma-Aldrich | F3665-1MG | |
| Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics | ||
| Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | |
| Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN | Olympus | MPE-RS TWIN | |
| Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Personal Lubricant Jelly (Gel) | equate | ZH727 2E F1 | |
| SGM-4 Stereotaxic Apparatus | Narishige | 16030 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01 | |
| Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics |
References
- Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
- Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).
- Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma. Advances in Wound Care. 6 (10), New Rochelle. 356-369 (2017).
- Wadachi, R., Hargreaves, K. M. Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection. Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).
- Janssens, S., Beyaert, R. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).
- Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl. PLoS One. 10 (9), 0137179 (2015).
- Paish, H. L., et al. Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2. American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).
- Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders. Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
- Madiai, F., et al. Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain. Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).
- Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems. Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).
- Ieni, A., et al. Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Tsutsumi, R., et al. PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).
- Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies. Gene Therapy. 11, Suppl 1 85-91 (2004).
- Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
- Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity. Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
- Ruthazer, E. S., Cline, H. T. Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data. Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).
- Liu, K., et al. In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Barber, P. R., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Gaigalas, A. K., et al. The Development of Fluorescence Intensity Standards. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).
- Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy. Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).
- Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses. Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence. Nature Communications. 6, 8184 (2015).
- Makale, M., et al. Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue. Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032 (2009).
