Summary
다음 절차는 유전자 조작 된 마우스 모델을 사용 하 여 뮤 린 등 피부에 멜 라 세포 종양 개시의 공간적 및 시간적 제어를 위한 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 거시적 뿐만 아니라 현미경 피부 흑색 종 개시를 설명 합니다.
Abstract
피부 흑색 종은 가장 공격적인 피부 암으로 잘 알려져 있습니다. 비록 위험 요인과 주요 유전 변화는 계속 해 서 증가 하는 깊이로 문서화 될 수 있지만, 피부 흑색 종의 발병 률은 최근 수십 년 동안 급속 하 고 지속적인 증가를 보이고 있다. 효과적인 예방 방법을 찾기 위해, 피부에 흑색 종 개시의 초기 단계를 이해 하는 것이 중요 합니다. 이전 데이터는 종양 생성 돌연변이 및 유전적 변경을 발현 할 때 성체 피부 조직에서 여 포 멜 라 닌 세포 (MCSCs)가 원산지의 흑색 종 세포로 작용할 수 있다는 것을 입증 하였다. 흑색 종에 걸리기 쉬운 MCSCs에서 발생 하는 종양은 대기에서 활성 상태로의 MCSCs 전이로 인해 유발 될 수 있다. 흑색 종 발생 가능한 MCSCs에서의 이러한 전환은 모 낭 줄기 세포의 활성 상태 또는 자외선-b와 같은 외적 환경적 요인을 통해 어느 하나의 변조에 의해 촉진 될 수 있다. 이러한 요인은 화학 탈모에 의해 실험실에서 인위적으로 조작 될 수 있으며,이는 모 낭 줄기 세포와 MCSCs를 정 동작 상태에서 활성 상태로, 그리고 벤치탑 광을 사용 하 여 UV-B 노출로 전환 시키는 원인이 됩니다. 이 방법 뮤 린 등 쪽 피부에 있는 피부 흑색 종 개시의 성공적인 공간 그리고 시간적 통제를 제공 합니다. 따라서, 이러한 생체 내 모델 시스템은 피부 흑색 종 개시의 초기 단계를 정의 하 고 종양 예방을 위한 잠재적인 방법을 시험 하는데 사용 될 수 있는 가치가 있을 것 이다.
Introduction
흑색 종, 멜 라 세포 종양의 악성 형태는 대부분의 피부 암 사망1을 담당 하는 피부 흑색 종으로 피부의 가장 공격적인 암입니다. 미국에서, 흑색 종은 일반적으로 진단 됩니다; 20182에서 추정 된 새로운 암 발병 사례 중 5th 내지 6번째 가장 흔한 암 유형으로 예상 된다. 더욱이, 전반적인 암 발생률은 최근 수십 년 동안 점진적으로 감소 하는 경향을 보이고 있지만, 지난 몇 십년 동안 피부 흑색 종 발생률은 두 성별 모두에서 지속적이 고 급속 한증가를 보여줍니다.
피부 흑색 종을 보다 효율적으로 퇴치 하기 위해, 임상적으로 효과적인 예방 방법을 더 잘 식별 하기 위해 원산지 세포에서 흑색 종 발달의 초기 사건을 명확 하 게 이해 하는 것이 중요 합니다. 현재 성체 줄기 세포는 피부 조직3,4,5등 다양 한 유형의 장기에서 암의 세포 기원으로 종양 형성에 크게 기여할 수 있는 것으로 알려져 있습니다. 마찬가지로, 뮤 린 등 쪽 피부에 있는 성체 멜 라 닌 세포 (MCSCs)는 Ras/Raf 및 Akt 통로의 변종 활성화 시 기원의 흑색 종 세포로 서 일할 수 있다6. 그러나, 이러한 발암 돌연변이 단독은 정 맥 내에서 종양 형성을 효율적으로 유도할 수 없다. 멜 리 세포 종양은 결국 MCSCs 자연 헤어 사이클링 동안 활성화 될 때 개발. 그러나,이 프로토콜에서, 우리는 인위적으로 흑색 종 개시6의 정확한 통제를 촉진 하는 종양에 걸리기 쉬운 mcscs의 세포 활성화를 유도 하는 방법을 설명할 것입니다,7.
여기에 설명 된 방법을 통해 서, 피부 흑색 종의 공간적 및 시간적 제어는 종양 발생 가능성이 있는 MCSCs에서 시작 하 여 Pten 발현 손실과 함께 발암 성 brafV600E 을 발현 하 여 성공적으로 수행 될 수 있습니다. 이전에 보고 된6. 이 방법은 탈모를 통해 모 낭 줄기 세포 활성화를 보여주는 이전 연구 결과를 통합 하 고 뮤 린 피부를 UV-B에 노출 시키는 방법 뿐만 아니라 모 낭에 거주 하는 MCSCs의 활성화와이 세포의 이식에 도움이 될 수 있습니다. 간 모 낭 표 피6,9,10에 대 한 하위 집단. 이러한 생체 내 모델 시스템은 피부에 흑색 종의 현저한 개시를 유도할 수 있는 흑색 종 경향이 있는 MCSCs의 세포 상태를 변화 시킬 수 있는 생리 적 및 환경적 변화가 어떻게 하는지에 관한 귀중 한 정보를 제공할 수 있다.
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Protocol
모든 동물 절차는 코넬 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 따라 수행 됩니다.
1. 준비
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12 일간의 산 후 마우스에서 꼬리 클립을 수집 하 고 400 µ L의 0.05에서 NaOH를 95 ° c에서 1 시간 동안 µ를 첨가 하 고 1M(1 M), pH 7의 1m 인 트리 스-HCl을 32 추가 하였다. 유전자 형 마우스는 잭슨 실험실을 통해 제공 된 PCR 프로토콜에 따라, 마우스를 관심의 유전자 형으로 식별 하 고6.
-티 르 -크 레 머- 헤이 거 대 한 (+/creer)
- LSL-BrafV600E -이종 접합 체 (+/lsl-600e)
- Pten- 동형 접합 체 (flox/flox)
- LSL-트 토마토 -헤이 큰 (+/l sl-td토마토)
참고: 프라이 머 서 열은 재료의 표로제공 된다. - 머리 깎기 (전동 트리머)를 사용 하 여 아래에 설명 된 모든 실험을 시작 하기 2 ~ 3 일 전에 등 쪽 피부를 면도 하 고, 생쥐가 약 7 주 나 되는 경우. 전기 트리머를 사용 하 여 얇은 마우스 피부가 손상 되지 않도록 주의 하십시오. 모든 부상은 MCSCs를 포함 한 모 낭 줄기 세포를 활성화 하는 상처 치유 반응을 끌어낼 수 있습니다.
- 헤어 사이클이 휴지기에 있는지, 그리고 대기 기간 동안 피부가 상처를 입는 지 확인 합니다. 피부에 부상의 징후가 나타나면 마우스를이 절차에 사용 하지 말아야 합니다.
참고: 모발 주기는 유전 배경 사이에서 경미하게 다를 수 있더라도,이 나이에 등 쪽 피부에 있는 머리 주기는 일반적으로 휴지기 상태11에서입니다. 티 르 -creer 이식 유전자는 휴지기 피부에 있는 mcscs를 표적으로 하 고, 연속적인 유전 변경은 분화 된 멜 라 닌 세포 및 멜 라 이드 종양을 포함 하 여 mcscs의 모든 선 지에서 영구히 발현 될 것입니다.
2. 크리 록스 유전 재조합을 위한 타 목 타 펜 처리
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전신 또는 국 소화 된 유전 재조합을 위한 복 강 내 주입 (IP) 또는 국 소 투여를 위한 타 목 타 펜의 제조
참고: 타 목 시 펜이 재결합을 유도 하기 위해서는, 처음에는 간에 서 4-하이드 록 시 타 펜 타 펜 (4OHT)으로 물질 대사로 변화 시켜야 하며,이는 Creer에 바인딩하고 활성화 될 수 있습니다. 타 목 시 펜의 국 소 적용은이 방법으로 대사 되지 않으며, 4-OHT가 직접 사용 해야 합니다. 충분 한 재결합을 위해서는 타 목 시 펜 전달의 한 가지 방법이 필요 합니다.- 타 목 시 펜: 옥수수 기름에 용 해 된 10 밀리 그램-1 의 농도에서에 스 타 목을 준비 하십시오. 약물의 용액으로의 용 해를 돕기 위해 분말 형태로 약물에 100%의 총 부피의 10%의 분자 등급 에탄올을 추가 하 고 3 분간 소용돌이 한 다음 남은 양의 옥수수 오일을 추가 합니다. 결정 재료가 더 이상 용액에서 명백 해질 때까지 소용돌이를 계속 합니다. 타 목 타 펜 용액은 0.2 µm 필터를 통과 시켜 멸 균 할 수 있다. 치료를 위해 2.2.1 단계를 진행 하십시오.
- 4-OHT: 100% 에탄올에서 최대 3mg/ml의 하이드 록 시 타 목의원 액을 제조 한다. 그런 다음, 작업 용액은 관심 있는 피부 영역 (일반적으로 단일 응용 프로그램)을 충당 하기 위해 필요한 만큼 적용 할 수 있습니다.
참고: 하이드 록 시 타 목 시 펜의 원 액을 100% 에탄올에 녹 인 후 최종 농도 5mm로 할 수 있다. 이어서, 작동 용액을 제조 하기 위하여, 4OH-타 목 타 정 원 액의 5 µ L을 100% 에탄올에 15 µ L로 희석 시킬 수 있다. 4mm2 영역에 대해서는 1 ~ 3 µ의 작업 용액을 국 소 적으로 적용할 수 있습니다.
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전신 또는 국 소 적으로 타 목 타 펜으로 생쥐 치료
- 전신 치료를 위해, 26G 바늘을 사용 하 여 3 일 동안 매일 한 번씩 IP 주입을 통해 타 목 타 펜 2 mg을 투여 하십시오.
참고: 이 모델을 사용 하 여 정 동작 MCSCs의 약 93% ± 4%가 tdTomato6으로 표시 됩니다. - 지역 활성화를 위해, 4-OHT와 하나의 국 소 치료를 수행 합니다. 작업 솔루션으로 관심의 피부 영역을 커버. 작업 용액의 양은 단계 2.1.2에서 기술 한 바와 같이 관심 영역의 크기에 의해 결정 될 수 있다.
- 전신 치료를 위해, 26G 바늘을 사용 하 여 3 일 동안 매일 한 번씩 IP 주입을 통해 타 목 타 펜 2 mg을 투여 하십시오.
- 타 목 시 펜의 마지막 투여 량 다음에 48 h에서, 화학 탈모 유발 종양 개시를 위한 단계 3 또는 UV B 유도 종양 개시를 위한 4 단계로 진행
3. 화학적 탈모
- 아이 소 루 레인 시스템이 포함 된 마우스 트리트먼트 룸에 다음과 같은 필수 자료가 장착 되어 있습니다: 헤어 제거 크림, 코 튼 면봉, 종이 피복 및 물.
- 마우스를 유도 챔버에 넣고 3.5 4.5%의이 소 폴 루 레인 및 1L/min 산소로 마 취 시켰다.
- 호흡 률이 안정화 되 면, 마우스가 발가락 핀치를 수행 하 여 적절 한 마 취 면에 있는지 확인 하 고 마우스를 메인 튜브에 1 ~ 1.5%의 아이 소 루 레인 및 1 L/min 산소와 함께 마 취 유지로 이동 시킨다. 눈가 마 취하에 있는 동안 건조에서 눈을 유지 하기 위해 안구 연 고를 적용 합니다.
- 면봉을 사용 하 여 머리카락 제거 크림의 얇은 층을 마우스 피부의 면도 영역에 적용 하십시오.
- 크림이 고르게 도포 되 면, 깨끗 한 면봉을 사용 하 여 제거를 시작 합니다. 크림이 피부와 접촉 하는 총 시간은 1 분을 초과 하지 않아야 합니다.
- 젖은 종이 천으로 피부를 부드럽게 닦아 내 고 잔류 크림이 제거 되었는지 확인 합니다.
참고: 모발 제거 크림은 완전히 제거 되지 않은 경우 피부에 자극을 유발할 수 있습니다. C57BL/6 배경에 있는 것과 같은 일부 생쥐는 피부염12를 개발 하는 경향이 있을 수 있습니다. 드문 경우 지만, 일부 동물은 제 모 크림 응용 프로그램 또는 기계적 탈모 후 24 시간 이내에 피부염을 개발할 것입니다. 지역 피부 자극의 흔적을 찾기 위해 치료 후 하루에 생쥐를 확인 하십시오. - 제거 된 머리 샤프트와 생물 학적 빈에 사용 된 모든 재료를 버리십시오.
- 마 취가 닳아 없어질 때까지 마우스를 빈 깨끗 한 마우스 케이지에 놓습니다.
- 생쥐를 케이지로 돌려 준다.
4. UV-B 조사
- 아이 소 루 레인 시스템이 포함 된 마우스 트리트먼트 룸에 다음과 같은 필수 자료가 장착 되어 있습니다. 자외선-b 광 시스템, 자외선-B 라이트 미터, 마우스 보호용 커버, 연구원을 위한 추가 UV-B 보호 PPE 및 타이머.
- 마우스는 관심의 UV-B 용량 (즉, 0-180 mJ/2cm2)에서 조사 되어야 한다. UV-B 라이트 미터를 사용 하 여 마우스를 조사 하는 적절 한 시간 길이를 결정 합니다.
참고: mW/센티미터2 x 시간 = 복용량 - 마우스를 아이 소 루 레인으로 마 취 시킵니다. 유도 챔버에 있는 동안, 3.5를 4.5% 아이 소 루 레인 및 1L/min 산소에 사용 하십시오.
- 마우스가 안정 되 면, 발가락 핀치와 마 취 효과를 확인 하 고 UV 챔버에 있는 주요 마 취 튜브에 마우스를 전송 합니다. 눈이 마 취하는 동안 건조에서 눈을 방지 하기 위해 안구 연 고를 적용 합니다. 아이 소 루 레인 1 ~ 1.5%와 1 L/min 산소로 마 취를 유지 합니다.
- 등 쪽 피부를 UV-B 보호 물질로 덮어 서 원하는 부위만 노출 시킵니다.
참고: 이때 적절 한 PPE를 활용 해야 합니다. 마우스를 조사 하는 데 필요한 시간은 사용 된 전구의 강도에 따라 다르지만 필요한 시간이 30 초를 초과 하면 마 취를 모니터링 해야 할 수 있습니다. - Uv 방지 뚜껑 또는 다른 적합 한 재료를 사용 하 여 UV 챔버를 덮으 십시오.
- 자외선 B 램프를 켜고 특정 목적을 위해 연구자에 의해 결정 된 시간 동안 마우스를 조사.
- UV 시스템과 아이 소 포컬을 끄고, 마 취가 닳아 없어질 때까지 마우스를 빈 마우스 케이지에 놓습니다.
- 생쥐를 케이지로 돌려 준다.
5. 조직 처리
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피부 분리
- 시작 하기 전에 다음을 구하십시오: 악기, 필터 종이 및 종이 타월.
- IACUC 승인 프로토콜에 따라 마우스를 안락사 시키고, 진행 하기 전에 사망을 확인 한다.
- 머리 깎기를 사용 하 여 등 쪽 피부 부분에서 어떤 머리를 면도. 보풀이 없는 티슈로 가볍게 닦 고 지역을 지웁니다.
- 꼬리의 기저 부 바로 위에 날카로운가 위로 작은 절 개를 하십시오.
- 절 개에 큰 무딘가 위를 삽입 하 고 진 피 결합 조직을 분리 합니다.
- 조직의 가장자리를 따라 날카로운가 위를 절단 하 여 관심 있는 피부 영역을 조심 스럽게 분리 합니다.
- 깨끗 한 종이 타월 위에 피부 조직을 놓고 무딘 집게를 사용 하 여 피부를 스트레칭 하 여 수건에 부착 하 고가 르 쳤 다. 이 단계는 그것의 모양을 유지 하면서 조작 하 고 처리 할 수 있도록 조직에 대 한 추가 지원을 제공 하는 역할을 한다.
참고: 조직 학적으로 볼 수 있는 피부에 손상을 일으킬 수 있기 때문에 피부 조직의 외부 영역을 처리 하는 것에 주의 하십시오.
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조직 고정
- 필터 용지를 반으로 접어 적절 하 게 라벨을 부착 합니다. 종이 타월과 함께 피부를 주름에 바로 인접 한 접힌 용지에 놓고 샘플이 부드럽고 접혀 있지 않도록 합니다. 열린 면을 스테이플 하 여 여과 지를 밀봉 한 다음 나머지 용지가 향후 샘플에 사용 될 수 있도록 트림 합니다.
참고: 이 단계는 고정 하는 동안 피부가 모양을 유지 하도록 수행 됩니다. - 실 온에서 3 ~ 5 시간 동안 10% 중성 완충 포 르 말린으로 조직 샘플을 완전히 서브 머지 하 고 4°c에서 밤새 한다.
- 고정 후, 포 르 말린에서 샘플을 제거 하 고, 탈 이온 수 (각 5 분)에 세척 하 고 조직 블록을 만들기로 진행 합니다. 피부 조직 (즉, 잔여 종이)에서 잔류 물질을 조심 스럽게 제거 하십시오.
- 필터 용지를 반으로 접어 적절 하 게 라벨을 부착 합니다. 종이 타월과 함께 피부를 주름에 바로 인접 한 접힌 용지에 놓고 샘플이 부드럽고 접혀 있지 않도록 합니다. 열린 면을 스테이플 하 여 여과 지를 밀봉 한 다음 나머지 용지가 향후 샘플에 사용 될 수 있도록 트림 합니다.
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냉동 조직 블록 만들기 (그림 1)
- 피부 샘플의 가장자리를 정돈 하 여 톱니가 고르지 않도록 하 고 3 개의 궁탈 컷을 만듭니다. 이러한 스트립의 폭은 냉동 몰드 (5mm)의 높이 이상 이어야 한다. 다음으로, 하 부 금형 (20mm)의 폭 보다 더 길고, 포함 될 수 있는 피부 조각을 갖도록 횡 방향 절단을 합니다. 등 쪽 피부의 나머지 절반을 반복 하거나 다른 용도로 조직을 저장 하십시오 (또는 고정 하기 전에 반을 저장 하십시오).
참고: 적절 한 방향으로 피부 조각을 유지 하는 것이 중요 합니다. - 세로 방향으로 동결 금형 (25 x 20 x 5mm)의 방향을 지정 하 고 10 월에 4 ~ 5 개 피부를 놓습니다. 모든 조각이 제자리에 되 면, 두 쌍의 미세 집게를 사용 하 여 피부의 긴 가장자리를 저온 금형의 바닥으로 가져옵니다. 이제 피부가 몰드의 베이스에 수직인 OCT에 서 있어야 합니다. 이 단계에서 10 월 내에에 어 포켓의 형성을 최소화 하기 위해 주의를 기울여야 합니다 (그림 1).
- 10 월에 두 번째 립에 금형을 채우고 드라이 아이스의 평평한 표면에 놓습니다. 집게를 사용 하 여 블록이 동결 되기 시작 하면 이동 중에 이동 했을 수 있는 모든 피부 조각을 조정 하십시오. 바닥 층이 응고 되 면, 조직의 조작은 불가능 할 것 이다.
- 컷 8-10 µm 슬라이드를 분석 합니다.
- 피부 샘플의 가장자리를 정돈 하 여 톱니가 고르지 않도록 하 고 3 개의 궁탈 컷을 만듭니다. 이러한 스트립의 폭은 냉동 몰드 (5mm)의 높이 이상 이어야 한다. 다음으로, 하 부 금형 (20mm)의 폭 보다 더 길고, 포함 될 수 있는 피부 조각을 갖도록 횡 방향 절단을 합니다. 등 쪽 피부의 나머지 절반을 반복 하거나 다른 용도로 조직을 저장 하십시오 (또는 고정 하기 전에 반을 저장 하십시오).
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포 르 말린 고정 파라핀 임베디드 (FFPE) 조직 블록을 만들기
- 고정 된 피부 2 개를 표지 된 카세트에 넣고 에탄올의 농도를 30 분으로 증가 시 킴으로써 (75% 에탄올, 30 분에 대 한 85%, 30 분에 대 한 90%, 2 배 30 분에 대 한 100 95%, 자일 렌 또는 자일 렌은 2x 30 분으로 대체 합니다. 58-60 ˚에서 파라핀으로 30 분 동안 먼저 배양 한 다음 밤새 사용 합니다.
- 액체 파라핀으로 24 x 24 mm2 스테인레스 스틸 티슈 몰드에 조직을 내장 하 고-5°c에서 응고 시켰다. 조직 방향은 여러 모 낭에 걸쳐 세로 섹션을 시각화 할 수 있도록 냉동 조직 블록의 것과 비슷해야 합니다 (그림 1).
- 파라핀이 응고 되 면 몰드를 제거 하 고 분석을 위해 5-10 μ m 섹션으로 자릅니다.
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Representative Results
화학 탈모에 의해 유도 된 피부 흑색 종 개시
화학 탈모의 절차는 그림 2에 묘사 되어 있습니다. 생쥐가 7 주 후 나 탈 때, 등 쪽 피부가 telogen에 있습니다. Telogen 동안, 모 낭 줄기 세포 및 MCSCs는 정 동작, 휴식 상태에 있는 것으로 알려져 있다. 피부는 면도 후 중요 한 머리카락의 성장을 표시 해야 합니다. 한편, 화학적 탈모는 모 낭 줄기 세포 활성화를 유도할 수 있으며,이는 차례로 관심 영역 으로부터 상당한 모발 성장을 나타낸다 (도 2). 유사 하 게, 종양에 걸리기 쉬운 MCSCs는 발암 돌연변이를 발현 하 고 또한 종양 형성 가속화를 위해 활성화 될 필요가 있다. 화학적 탈모는 모 낭 줄기 세포 및 MCSCs 모두의 활성화를 현저 하 게 유도할 수 있다. 흑색 종 활성 상태의 MCSCs는 종양을 형성할 수 있으며, 현미경 흑색 종 개시는 화학 탈모 후 2 주 이내에 관찰 될 수 있다 계보 추적 대립 유전자 LSL-tdTomato (그림 3).
UV B 조사에 의해 유도 된 피부 흑색 종 개시
화학적 탈모와 유사 하 게, UV-B는 정 동작 종양이 발생 하기 쉬운 MCSCs에서 종양 개시를 유도할 수 있습니다 (그림 4). 종양이 발생 하기 쉬운 MCSCs를 대기 상태에서 함유 하는 뮤 린 피부는 유의 미 한 종양 개시 및 현저한 색소 침착 부족을 나타내고, UV-B에 노출 되는 등 쪽 피부 (2회, 180 mJ/2cm)는 흑색 색소를 조기 멜 라 균 종양으로 보여준다 은 거시적으로 분명 합니다 (그림 4a, B). UV-B는 2 주 안에 거시적으로 명백한 종양 개시를 현저 하 게 유도할 수 있지만, 자외선 차단제의 적용은 UV-저항 하는 피복과 유사한 피부에 UV-매개 흑색 종 개시를 보호할 수 있습니다 (도 4c, D).
중요 한 것은, UV-B는 간 모 낭 성 표 피에 그들의 모 낭 모양 줄기 세포 틈새에서 MCSCs의 직접적인 위치를 유도 합니다. 더욱이, UV-B는 전 여 포 표 피 전반에 걸쳐 MCSC-유래 피부 흑색 종을 유도할 수 있고, 현미경 표현 형은 계보 추적 마커, tdTomato (도 5)에 의해 관찰 될 수 있다. 이 종양 세포는 악성 이기 때문에, 그들은 급속 하 게 그리고 침 습 적 성장 합니다 (그림 5). 등 쪽 피부와 유사 하 게, 자외선-B-유도 흑색 종 개시는 귀 피부와 같은 그밖 피부 지역에서 현저 하 게 관찰 될 수 있다 (그림 6). 자외선에 강한 천으로 덮인 대조 군 피부에 비해 UV B에 노출 된 귀 피부는 흑색 종 개시의 부담이 높기 때문에 더 높은 색소 침착을 보여줍니다 (그림 6).
그림 1: 피부 조직 분리 및 cryo 포함. 안락사 후, 마우스를 관심의 등 쪽 피부 영역으로 면도 하 고, 10 월을 포함 하는 저온 성형 기에 피부를 삽입 한다. 마우스의 점선은 중간 선을 나타냅니다. 전형적으로, 3 개 또는 4 개의 피부는 중간 선을 따라 선 세그먼트 3-4와 분리 될 수 있다; 이러한 조각 중 하나는 직사각형 1/2/3/4으로 표시 됩니다. 이러한 피부 조각은 도면에 도시 된 바와 같이 OCT에 포함 되어야 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도표 2: 화학적 탈모 후의 거시적 표현 형. (A) 화학 탈모의 다이어그램. (B) 면도 후, 모발 사이클이 telogen 인 것으로 확인 되었다. (C) 모 낭에서 모발을 제거 하기 위해 화학적 탈모를 수행 하였으며,이는 머리 여 포 및 멜 라 닌 세포를 모두 활성화 시킬 수 있다. (D) 약 1 주일 후, 조기 모발 성장이 쉽게 눈에 띄는 것입니다. (E) 이어서, 상당한 모발 성장이 시간이 지남에 따라 관찰 될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 흑색 종 개시의 현미경 관찰은 화학 탈모에 의해 통제 됩니다. 화학적 탈모는 정 동작 종양이 발생 하기 쉬운 MCSCs의 활성화를 현저 하 게 유도할 수 있습니다. 이어서, 계보 추적 마커 tdTomato에 의해 입증 된 현미경 종양 개시는 2 주 이내에 관찰 될 수 있다. 이 도면은 현미경 표현 형 16 일 포스트 IP 주입에의 한 타 목 제 3 일 후 동일한 시야각의 상이한 시각화를 사용 하 여 화학적 탈모를 수행 하는 것을 보여준다. (A) 모 낭에서 유래한 tdtomato+ 종양 세포는 dapi 핵 카운터 얼룩과 합병 되었습니다. (B) 모 낭과 여 포 성 표 피는 흰색으로 윤곽이 있습니다. (C) tdTomato+ 종양 세포가 모 낭에서 진 피 내로 침입 하는 방법, 달 로부터개질 된, h. 외. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 4: UV-B 조사에 의해 유도 된 피부 흑색 종의 거시적 표현 형. 마우스는 3 일 동안 타 목에 의해 처리 되었고 (일 1 ~ 3) 이어서 2 개의 UV-B 노출 (day 4 및 6)을 하였다. (A) 돌연변이 된 mcscs를 포함 하는 등 쪽 피부에 대 한 UV-b 조사에 관한 도면. (b) 대조 군 및 UV b 노출 등 쪽 피부 사이의 거시적 표현 형. 멜 트 세포 종양 형성에 관련 된 현저한 흑색 색소 침착은 두 번째 UV-B 조사 후 2 주 이내에 관찰 될 수 있다. (C) 자외선 차단제 응용 프로그램의 다이어그램. (D) Uv-b가 돌연변이 된 mcscs 로부터 종양 개시를 현저 하 게 유도할 수 있는 반면, 선스크린의 적용은 현저 하 게 억제 된 자외선-b-매개 종양 개시 (제 2 Uv-b 조사 후 16 일 후)를 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 자외선 B 유도 피부 흑색 종의 현미경 관찰. 마우스는 3 일 동안 IP 주입에 의해 타 목 타 펜으로 처리 하 고 2 개의 UV B 노출 (day 4 및 5)을 하였다. (A-C) TdTomato 계보 추적에 의해 입증 된 간 모 낭 표 피에 걸쳐 초기 종양 개시 17 일에 표시 될 수 있습니다. (A) tdtomato + 종양 세포는 모 낭 성 표 피에 머리 여 포에서 마이그레이션하는 것으로 나타났다. Dapi는 핵 카운터 얼룩으로 사용 됩니다. (B) dapi 염색은 제거 되 고 점선은 모 낭 및 여 포 성 표 피의 위치를 나타냅니다. (C) 자외선 노출 후 모 낭 표 피에 모발 배아 로부터 tdTomato+ 세포 이동을 나타내는 개략. 문 외에서 수정6. (D. F) 그런 다음 종양 세포가 급속히 성장 하 고 아래의 진 피 조직을 침범 합니다 (일 25). (D) tdtomato+ 종양 세포는 진 피 조직으로 증식 하 고 침범 하는 것을 계속 하였다. Dapi는 핵 카운터 얼룩으로 사용 됩니다. (E) dapi 염색은 제거 되 고 점선은 모 낭 및 간 낭 성 표 피의 위치를 나타낸다. (F) 진 피 및 멜 라 세포 종양 성장에 대 한 tdTomato+ 셀 침입을 나타내는 개략도. 문 외에서 수정6. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 귀 피부에 있는 UV B 유도 흑색 종의 거시적 및 현미경 관찰. (A) 실험 방식. 마우스는 3 일 동안 타 목에 의해 처리 되었고 (일 1 ~ 3) 이어서 UV B 조사에 3 노출을 하였다 (넷째 날, 6 및 8). (B) UV b 조사에의 한 흑색 종 개시가 현저히 증가 하 여 28 일째에 현미경 적으로 뿐만 아니라 미세 하 게 관찰 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
피부 흑색 종 종양에서 자주 발견 되는 홀 마크 유전 변경은 잘 설명 되어 있습니다13. 가장 지배적 인 드라이버 돌연변이는 BrafV600E이 고, brafV600E매개 흑색 종을 위한 유전적으로 조작 된 마우스 모델은 보 센 버그 그룹14 에 의해 생성 되 고 잭슨 실험실에서 증 착 되었다. 이 마우스 모델을 사용 하 여, 우리의 최근 연구는 등 쪽 피부에 BrafV600E매개 흑색 종의 유의 한 개시를 위한 종양이 발생 하기 쉬운 mcscs의 세포 활성화의 요구 사항을 설명 했다6.
탈모는 등 쪽 피부에 뮤 린 모 낭 줄기 세포 활성화를 유도 하는 효과적인 방법으로 알려져 있다6,10. 뮤 린 MCSCs는 모 낭 내에 위치 하 고, 또한, 여 포 MCSCs의 세포 상태는 모 낭 줄기 세포 (8)의 상태와 동기화 된다. 모 낭 줄기 세포의 인공 변조는 MCSC 상태를 변경할 수 있으므로 탈모는 직접적으로 멜 라 닌과 모 낭 줄기 세포를 모두 활성화 할 수 있습니다. MCSCs에 대 한이 활성화 방법은 유전적으로 조작 된 흑색 종 마우스 모델에서 피부 흑색 종 개시의 초기 단계를 검사 하기 위해 종양이 발생 하기 쉬운 MCSCs에 적용 될 수 있습니다. 화학적 탈모 법을 통해, 뮤 린 등 쪽 피부에 관심 영역에서 흑색 종 형성은 직접적으로 개시 될 수 있다. 탈모는 모 낭에서 머리 여 포에서 추출 되는 기계적인 머리 제거의 모형입니다 둘 다 왁 싱 또는 따 버릴와 같은 각종 방법에 의해 수행 될 수 있습니다. 그러나, 이러한 기계적 탈모 법은 특정 관심 영역에 대하여 부정확 할 수 있다. 한편, 제 모 크림을 이용한 화학 탈모 법은 수행이 간단 하 고 모발 주기의 신뢰성 있는 활성화와 정밀한 적용을 가능 하 게 하며, 기계적 제거 보다 피부에 덜 가혹 할 수 있다.
다양 한 위험 요소 중에서, UV-B는 피부 흑색 종에서 가장 잘 알려진 위험 요소15. UV-B 조사는 소 낭 성 MCSCs를 중 모 세포 표 피9로의 직접 이동을 유도 하는 것으로 알려져 있다. 더욱이, UV-B는 종양이 발생 하기 쉬운 MCSCs6에서 흑색 종 개시를 현저 하 게 유도할 수 있는 강한 환경 스트레스 이다. 위에서 설명한 실험 프로토콜에서, 뮤 린의 등 쪽 피부에 대 한 관심의 작은 영역은 자외선 차단 천을 사용 하 여 원치 않는 노출 로부터 마우스의 나머지 부분을 쉽게 보호 하면서 UV-B에 노출 될 수 있습니다. 이 치료는 마우스가 마 취하에 있는 동안 수행 할 수 있습니다. 중요 한 것은, MCSCS의 마이그레이션 및 UV-B 노출에 따라 발생 하는 맥 c-유래 흑색 종의 형성은 UV-B-용량 의존성6이다. 따라서, 성공적인 결과를 위해서는 UV-B 미터를 사용 하 여 전구의 강도를 정기적으로 확인 하 고 필요에 따라 피부와 전구 사이의 노출 시간과 거리를 조정 하는 것이 중요 합니다. 일반적으로 알려진 바와 같이, 피부는 높은 용량의 UV-B 광에 반응 하 여 연소 될 수 있지만, 약한 자외선-B 노출은 또한 MCSC-원산지 흑색 종을 유도 하기에 불충분 할 것 이므로 실험에 해로운 것 이다.
여기에 설명 된 프로토콜은 주로 등 쪽 피부에서 환경 위험 요소 인 UV-B에 초점을 맞추고 있습니다. 그러나, 상기 실험 프로토콜은 다른 목적에 적용 될 수 있다. 예를 들어, 프로토콜은 uv A와 같은 대체 광원 또는 UV 파장의 영향을 결정 하기 위해 다른 스펙트럼의 전구를 사용 하 여 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 주로 등 쪽 피부를 접근 가능 하 게 하 고 MCSCs의 상태는 잘 정의 되어 있습니다. 그러나,이는 또한 발 패드를 포함 하 여 귀, 꼬리 또는 손바닥 피부와 같은 부속 기에 UV 광 노출을 대상으로 변경할 수 있습니다. 일례로 서, 도 6에 있어서, 대체 조직 부 위에서 초기 멜 라 세포 종양 형성의 가능한 차이를 조사할 수 있다. 그러나 등 쪽 피부와는 달리,이 사이트에 있는 MCSCs의 상태는 덜 잘 정의 됩니다; 따라서, 흑색 종 형성의 무작위 발생으로 이끌어 내는 MCSCs의 잠재적인 자발적 활성화는 고려 되어야 합니다. 따라서 등 쪽 피부에서의 프로토콜과 비교 하 여, 대안적인 접근법은 정확한 실험 결과를 얻기 위해 증가 된 수의 실험을 요구할 것 이다.
더욱이, 현재 프로토콜은 주로 BrafV600E매개 흑색 종 개시를 입증 하는 반면, 우리의 이전 연구는 또한 종양 발생 Ras/pten 조합과 유사한 초기 흑색 종 형성을 보고 했습니다. LSL-크 라스G12D 유전 대립 유전자6. 그러나, 돌연변이 Nras 유전자와 같은 다른 드라이버 돌연변이는 또한 다른 발암 조합에 의해 구동 된 초기 흑색 종 개시를 이해 하기 위하여 여기에 기술 된 실험 시스템으로 고려 될 수 있다.
함께 찍은, 여기에 설명 된 생체 내 모델 시스템은 유전자 조작 마우스에 초기 피부 흑색 종 개시의 검사에 대 한 수 있습니다. 이 뮤 린 모델은 피부에 있는 돌연변이 MCSCs에서 흑색 종 개시의 현세 적 및 공간적 통제를 위한 방법을 제공 합니다. 이 프로토콜은 흑색 종 개시에 기여할 수 있는 생리 적이 고 환경 스트레스 요인을 결정 하는 플랫폼 뿐 아니라 종양에 걸리기 쉬운 MCSCs에서 초기 흑색 종 개시의 기계 장치를 연구 하는 새로운 패러다임을 제공 합니다. 시 공간 적인 제어의이 수준은 또한 종양 성장 뿐만 아니라 흑색 종 형성을 방지 하는 약물 효능을 테스트 하기 위해 보다 정밀한 흑색 종 유도를 위한 도구를 제공 할 수 있다.
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Disclosures
저자는 이해관계의 충돌을 선언 하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작업은 W81XWH-16-1-0272에서 피어 검토 된 암 연구 프로그램을 통해 건강 문제에 대 한 국방부 장관 비서에 의해 지원 되었습니다. 의견, 해석, 결론 및 권장 사항은 저자의 것 이며 반드시 국방부가 승인 하지는 않습니다. 이 작업은 또한 A.C. 흰색에 코넬 줄기 세포 프로그램에서 종자 그랜트에 의해 지원 되었다. H. 달은 척추 동물 유전체학 학자 프로그램에 대 한 코넬 센터에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26 G 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 mm x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG |
|
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG |
|
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA |
|
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA |
|
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
References
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