Summary
De volgende procedure beschrijft een methode voor ruimtelijke en temporele controle van melanocytische tumor initiatie in muizen dorsale huid, met behulp van een genetisch gemanipuleerde muismodel. Dit protocol beschrijft macroscopische en microscopische cutane melanoom initiatie.
Abstract
Cutane melanoom is bekend als de meest agressieve huidkanker. Hoewel de risicofactoren en belangrijke genetische veranderingen nog steeds worden gedocumenteerd met toenemende diepte, de incidentie van cutane melanoom heeft aangetoond een snelle en continue toename in de afgelopen decennia. Met het oog op effectieve preventieve methoden te vinden, is het belangrijk om de vroege stappen van melanoom initiatie in de huid te begrijpen. Eerdere gegevens heeft aangetoond dat folliculaire melanocyt stamcellen (MCSCs) in de volwassen huid weefsels kunnen fungeren als melanoomcellen van herkomst bij het uitdrukken van oncogene mutaties en genetische veranderingen. Tumorigenesis die voortvloeien uit melanoom-gevoelige MCSCs kan worden geïnduceerd wanneer MCSCs overgang van een rustige naar actieve staat. Deze overgang in melanoom-gevoelige MCSCs kan worden bevorderd door de modulatie van ofwel haarfollikel stamcellen ' activiteit staat of door middel van Extrinsieke omgevingsfactoren zoals ultraviolet-B (UV-B). Deze factoren kunnen kunstmatig worden gemanipuleerd in het laboratorium door chemische ontharing, die de overgang van de haarfollikel stamcellen oorzaken en MCSCs van een rustige naar actieve toestand, en door UV-B blootstelling met behulp van een benchtop licht. Deze methoden bieden een succesvolle ruimtelijke en temporele controle van cutane melanoom initiatie in de muizen dorsale huid. Daarom, deze in vivo modelsystemen zal waardevol zijn om de vroege stappen van cutane melanoom initiatie te definiëren en kan worden gebruikt om mogelijke methoden voor de preventie van tumoren te testen.
Introduction
Melanoom, de kwaadaardige vorm van melanocytische tumoren, is de meest agressieve kanker in de huid met cutane melanoom verantwoordelijk voor de meerderheid van de huidkanker sterfgevallen1. In de Verenigde Staten, melanoom wordt vaak gediagnosticeerd; het is naar verwachting de 5th tot 6e meest voorkomende vorm van kanker onder de geschatte nieuwe kankergevallen in 20182. Bovendien, terwijl de algehele incidentie van kanker hebben aangetoond dat de trend van geleidelijke vermindering van de afgelopen decennia, cutane melanoom incidentie percentages in de afgelopen decennia tonen een continue en snelle toename van beide geslachten2.
Om cutane melanoom efficiënter te bestrijden, is het belangrijk om de vroege gebeurtenissen van melanoom ontwikkeling van hun cellen van herkomst duidelijk te begrijpen om klinisch effectieve preventieve methoden beter te kunnen identificeren. Het is nu bekend dat volwassen stamcellen aanzienlijk kunnen bijdragen aan de vorming van tumoren als de cellulaire oorsprong van kanker in veel verschillende soorten organen, waaronder huid weefsels3,4,5. Evenzo, volwassen melanocyt stamcellen (MCSCs) in de muizen dorsale huid kan werken als melanoomcellen van herkomst bij afwijkende activering van de RAS/RAF en Akt paden6. Echter, deze oncogene mutaties alleen niet in staat zijn om efficiënt te induceren tumorvorming van rustige MCSCs. melanocytische tumoren ontwikkelen zich uiteindelijk wanneer MCSCs actief worden tijdens natuurlijk haar fietsen. Echter, in dit protocol, zullen we beschrijven methoden om kunstmatig induceren cellulaire activering van tumor-gevoelige MCSCs, waardoor de precieze controle van melanoom initiatie6,7.
Door middel van de hier beschreven methoden, ruimtelijke en temporele controle van cutane melanoom initiatie van tumor-gevoelige MCSCs uiten oncogene BrafV600E samen met het verlies van Pten expressie kan met succes worden uitgevoerd, zoals we hebben eerder gemeld6. Deze methode bevat eerdere bevindingen die aantonen haarfollikel stamcel activering door ontharing, alsmede hoe de blootstelling van muizen huid aan UV-B kan vergemakkelijken activering van MCSCs inwoner van de haarfollikel en de verplaatsing van deze cellulaire subpopulatie aan interfollicular epidermis6,8,9,10. Deze in vivo modelsystemen kunnen waardevolle informatie verschaffen over hoe fysiologische en milieuveranderingen de cellulaire status van melanoom-gevoelige MCSCs kunnen veranderen, wat op zijn beurt een significante initiatie van melanoom in de huid kan veroorzaken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures worden uitgevoerd in overeenstemming met de Cornell University Institutional Animal Care en use Committee (DEC).
1. voorbereiding
-
Verzamel de staart clips van 12 dagen postnatale muizen en Digest in 400 µ L van 0,05 N NaOH bij 95 °C voor 1 h. Vortex en voeg 32 µ L van 1 M Tris-HCl, pH 7. Genotype muizen volgens PCR protocollen die via het Jackson laboratorium en identificeren muizen met genotype van belang6.
- Tyr-creer – hemizygous (+/CreER)
- LSL-BrafV600E – zygoot (+/LSL-V600E)
- Pten – homozygous flox (flox/flox)
- LSL-tdTomato – hemizygous (+/LSL-tdTomato)
Opmerking: Primer sequenties zijn voorzien in de tabel van materialen. - Gebruik een tondeuse (elektrisch trimmer) te scheren de dorsale huid 2 tot 3 dagen voor alle experimenten hieronder beschreven, en wanneer muizen zijn ongeveer 7 weken oud. Zorg ervoor dat de dunne muis huid niet met behulp van de elektrische trimmer schade als elke verwonding kan een wondgenezing reactie die zal activeren haarfollikel stamcellen, met inbegrip van MCSCs.
- Bepaal of de haar cyclus in telogene is en of de huid tijdens de wachttijd wordt verwond. Als de huid een teken van verwonding toont, zou de muis niet voor deze procedures moeten worden gebruikt.
Opmerking: Hoewel de haar cyclus enigszins kan verschillen tussen genetische achtergronden, op deze leeftijd de haar cyclus in de dorsale huid is meestal in de telogene staat11. De Tyr-creer transgene zal doelwit MCSCs in telogene huid, en de daaropvolgende genetische veranderingen zullen permanent worden uitgedrukt in alle geslachten van de MCSC, met inbegrip van gedifferentieerde melanocyten en melanocytische tumoren.
2. Tamoxifen behandeling voor CRE-Lox genetische recombinatie
-
Voorbereiding van Tamoxifen voor intraperitoneale injectie (IP) of actuele toediening voor systemische of gelokaliseerde genetische recombinatie
Opmerking: Om Tamoxifen te induceren recombinatie, moet eerst worden afgebroken door de lever tot 4-hydroxytamoxifen (4-OHT), die kunnen binden aan en activeer de creer. Actuele toepassing van Tamoxifen zal niet worden omgezet op deze manier en 4-OHT moet direct worden gebruikt. Voor voldoende recombinatie is slechts één methode van Tamoxifen-levering vereist.- Tamoxifen: bereid tamoxifen bij een concentratie van 10 mg mL-1 opgelost in maïsolie voor. Om te helpen bij de ontbinding van het medicijn in oplossing, toe te voegen tot 10% totaal volume van 100% moleculaire ethanol aan de drug in poedervorm, Vortex voor 3 min en voeg vervolgens de resterende hoeveelheid maïsolie. Ga verder met Vortex totdat kristallijn materiaal niet meer zichtbaar is in oplossing. Tamoxifen oplossing kan worden gesteriliseerd door het passeren van een 0,2 µm filter. Ga verder met stap 2.2.1 voor behandeling.
- 4-OHT: bereid een stockoplossing van hydroxytamoxifen tot 3 mg mL-1 in 100% ethanol. Dan, kan een het werkoplossing zo veel worden toegepast zoals nodig om het huid gebied van belang (over het algemeen één enkele toepassing) te behandelen.
Opmerking: Een stockoplossing van hydroxytamoxifen kan in 100% ethanol opgelost worden voor een eindconcentratie van 5 mM. Dan, om een werkende oplossing voor te bereiden, kan 5 µ L van 4OH-Tamoxifen voorraadoplossing in 15 µ L van 100% ethylalcohol worden verdund. Voor 4 mm2 ruimte, kan 1 tot 3 µ l van werkende oplossing plaatselijk worden toegepast.
-
Het behandelen van muizen met tamoxifen hetzij systemisch of plaatselijk
- Voor systemische behandeling, het beheer van 2 mg Tamoxifen via IP-injectie eenmaal daags gedurende 3 dagen met behulp van een 26 G naald.
Opmerking: Met behulp van dit model, ongeveer 93% ± 4% van rustige MCSCs zijn gelabeld met tdTomato6. - Voor regionale activering, voert u een Topische behandeling met 4-OHT. Bedek de huid gebied van belang met de werkende oplossing. De hoeveelheid werkende oplossing kan worden bepaald door de grootte van de regio van belang zoals beschreven in stap 2.1.2.
- Voor systemische behandeling, het beheer van 2 mg Tamoxifen via IP-injectie eenmaal daags gedurende 3 dagen met behulp van een 26 G naald.
- Bij 48 h na de laatste dosis van Tamoxifen, ga naar stap 3 voor chemische ontharing geïnduceerde tumor initiatie of naar stap 4 voor UV-B geïnduceerde tumor initiatie
3. chemische ontharing
- Voorzie een muis behandelkamer met een Isofluraan systeem met de volgende vereiste materialen: Ontharingscrème, wattenstaafjes, papieren doek en water.
- Plaats de muis in de inductie kamer en verdoven met 3,5 tot 4,5% Isofluraan en 1 L/min zuurstof.
- Zodra de ademhalingsfrequentie is gestabiliseerd, bevestigen dat de muis in het juiste vlak van anesthesie door het uitvoeren van een teen knijpen en de overdracht van de muis om de belangrijkste buis te handhaven anesthesie met 1 tot 1,5% Isofluraan en 1 L/min zuurstof. Toepassing Eye zalf om de ogen te houden van het drogen, terwijl onder narcose.
- Gebruik een wattenstaafje om een dun laagje van de Ontharingscrème toe te passen op de geschoren regio van de muis huid.
- Zodra de crème is gelijkmatig toegepast, gebruik schone wattenstaafjes om te beginnen met verwijderen. De totale tijd dat de crème in contact met de huid mag niet meer dan 1 min.
- Veeg de huid voorzichtig af met een vochtige papieren doek en zorg ervoor dat de rest crème is verwijderd.
Opmerking: Ontharingscrème kan irritatie veroorzaken aan de huid als het niet volledig verwijderd. Sommige muizen, zoals die op een C57BL/6 achtergrond, kan gevoelig zijn voor het ontwikkelen van dermatitis12. Hoewel zeldzaam, sommige dieren zal ontwikkelen dermatitis binnen 24 uur na ontharing crème toepassing of mechanische ontharing. Zorg ervoor dat de muizen controleren de dag na de behandeling op zoek naar tekenen van regionale huidirritatie. - Gooi de verwijderde haarschachten en alle materialen die worden gebruikt in een Biohazard bin.
- Plaats de muis in een lege, schone muis kooi tot de anesthesie is verslijt.
- De muizen terug te keren naar hun kooien.
4. UV-B bestraling
- Voorzie een muis behandelkamer met een Isofluraan systeem met de volgende vereiste materialen: UV-B licht systeem, UV-B licht meter, beschermende bekleding voor de muis, extra UV-B beschermingsmiddelen voor onderzoeker, en een timer.
- Muizen moeten worden bestraald op de UV-B-dosis van belang (dat wil zeggen, 0-180 mJ/cm2). Gebruik de UV-B licht meter om de juiste tijdsduur vast te stellen om de muizen te bestralen.
Opmerking: MW/cm2 x tijd = dosis - Verdoven de muis met Isofluraan. Terwijl in de inductie kamer, gebruik 3,5 tot 4,5% Isofluraan en 1 L/min zuurstof.
- Zodra de muis is gestabiliseerd, bevestig anesthesie effecten met een teen knijpen en breng de muis naar de belangrijkste anesthesie buis gelegen in UV-kamer. Toepassing Eye zalf om de ogen te voorkomen drogen, terwijl onder narcose. Onderhoud anesthesie met 1 tot 1,5% Isofluraan en 1 L/min zuurstof.
- Bedek de dorsale huid met UV-B beschermende materiaal, zodat alleen de gewenste regio zal worden blootgesteld.
Opmerking: Op dit moment moet passende BESCHERMINGsmiddelen worden gebruikt. De lengte van de tijd die nodig is om de muis te bestralen is afhankelijk van de intensiteit van de gloeilamp gebruikt, maar anesthesie kan nodig zijn om te worden gecontroleerd als de vereiste tijd meer dan 30 s. - Bedek de UV-kamer met behulp van UV-bestendig deksel of andere geschikte materialen.
- Zet de UV-B-lamp en bestraling van de muis voor de tijd bepaald door onderzoekers voor het specifieke doel.
- Zet de UV-systeem en Isofluraan, plaats dan de muis om een lege muis kooi totdat de anesthesie is verslijt.
- De muizen terug te keren naar hun kooien.
5. weefsel verwerking
-
Huid isolatie
- Verkrijg de volgende voor aanvang: necropsie instrumenten, filtreerpapier en papieren handdoeken.
- Euthanaseren de muizen volgens dec goedgekeurde protocollen, en bevestig de dood voorafgaand aan de procedure.
- Met behulp van een tondeuse, scheren elk haar uit de dorsale huid gebied. Licht borstel het gebied met een pluisvrij weefsel om het gebied te ontruimen.
- Maak een kleine incisie met een scherpe schaar net boven de onderkant van de staart.
- Steek grote botte schaar in de incisie en scheid de subdermale bindweefsel.
- Zorgvuldig isoleren van de huid regio van belang door te snijden met een scherpe schaar langs de rand van het weefsel.
- Plaats de huidweefsel op een schone papieren handdoek en gebruik doffe tang om de huid te strekken, zodat het zich houdt aan de handdoek en wordt onderwezen. Deze stap dient om extra steun voor het weefsel te verstrekken zodat het kan worden gemanipuleerd en worden verwerkt terwijl het handhaven van zijn vorm.
Opmerking: Wees voorzichtig om alleen omgaan met de buitenste regio's van het huidweefsel, als de Tang kan schade veroorzaken aan de huid die kan worden gezien histologisch.
-
Weefsel fixatie
- Vouw een stuk filtreerpapier in de helft en het etiket op de juiste wijze. Plaats de huid samen met papieren handdoek backing in het gevouwen papier direct naast de plooi, ervoor te zorgen dat het monster glad is en niet gevouwen of gekreukt. Verzegel het filtreerpapier door de open kanten te nieten, en dan trim zodat het resterende document voor toekomstige steekproeven kan worden gebruikt.
Opmerking: Deze stap wordt uitgevoerd, zodat de huid behoudt zijn vorm tijdens de fixatie. - Dompel het weefselmonster volledig onder in 10% neutraal gebufferde formaline voor 3 tot 5 h bij kamertemperatuur of overnachting bij 4 °C.
- Na fixatie, verwijder de monsters van formaline, wassen in deioniseerde water (2x, 5 min elk) en gaan om weefsel blokken te maken. Verwijder zorgvuldig alle reststoffen uit het huidweefsel (dat wil zeggen, rest papier).
- Vouw een stuk filtreerpapier in de helft en het etiket op de juiste wijze. Plaats de huid samen met papieren handdoek backing in het gevouwen papier direct naast de plooi, ervoor te zorgen dat het monster glad is en niet gevouwen of gekreukt. Verzegel het filtreerpapier door de open kanten te nieten, en dan trim zodat het resterende document voor toekomstige steekproeven kan worden gebruikt.
-
Het maken van bevroren weefsel blokken (Figuur 1)
- Trim de randen van de huid monster, zodat ze niet zijn gekarteld en maak dan 3 sagittale bezuinigingen. De breedte van deze stroken mag niet meer zijn dan de hoogte van de cryomold (5 mm). Vervolgens maken transversale bezuinigingen te hebben stukjes van de huid die niet langer zijn dan de breedte van de cryomold (20 mm) en kan worden ingebed. Herhaal dit met de resterende helft van de dorsale huid, of sla het weefsel voor andere toepassingen (afwisselend, sparen de helft voorafgaand aan de fixatie).
Opmerking: Het is belangrijk om de huid stukken te houden in de juiste oriëntatie. - Oriënteer de cryomold (25 x 20 x 5 mm3) in een portret oriëntatie en plaats 4 tot 5 stukjes van de huid op de top van de okt. Zodra alle stukken op zijn plaats, gebruik 2 paren van fijne tang om de lange rand van huid aan de bodem van de cryomold te brengen. Huid moet nu opstaan in de LGO loodrecht op de basis van de mal. Zorg ervoor dat de vorming van luchtzakken te minimaliseren binnen de LGO tijdens deze stap (Figuur 1).
- Vul de mal met okt naar de tweede lip, en plaats op het platte oppervlak van droog ijs. Gebruik een tang om alle huid stukken die kunnen hebben verschoven tijdens de overdracht als het blok begint te bevriezen aan te passen. Zodra de onderste laag is verhard, manipulatie van weefsels zal onmogelijk zijn.
- Cut 8-10 µm dia's voor analyse.
- Trim de randen van de huid monster, zodat ze niet zijn gekarteld en maak dan 3 sagittale bezuinigingen. De breedte van deze stroken mag niet meer zijn dan de hoogte van de cryomold (5 mm). Vervolgens maken transversale bezuinigingen te hebben stukjes van de huid die niet langer zijn dan de breedte van de cryomold (20 mm) en kan worden ingebed. Herhaal dit met de resterende helft van de dorsale huid, of sla het weefsel voor andere toepassingen (afwisselend, sparen de helft voorafgaand aan de fixatie).
-
Het maken van formaline vaste paraffine embedded (FFPE) weefsel blokken
- Plaats 2 stukken van vaste huid in een geëtiketteerde cassette en droog in stijgende concentraties van ethylalcohol (75% ethylalcohol voor 30 min, 85% voor 30 min, 90% voor 30 min, 95% voor 30 min, 100% voor 2x 30 min, xyleen of xyleen substituut voor 2x 30 min). Incubeer met paraffine op 58-60 ˚, eerst voor 30 min, en dan 's nachts.
- Embed het weefsel in een 24 x 24 mm2 roestvrijstaal weefsel mal met vloeibare paraffine en stollen bij-5 ° c. Het weefsel oriëntatie moet vergelijkbaar zijn met die van bevroren weefsel blokken, zodat longitudinale secties over meerdere haarzakjes kunnen worden gevisualiseerd (Figuur 1).
- Zodra de paraffine heeft gestold, verwijder de mal en snijd ze in 5-10 μm secties voor analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cutane melanoom initiatie geïnduceerd door chemische ontharing
De procedure van chemische ontharing is afgebeeld in Figuur 2. Wanneer muizen zijn 7-weken postnatale, hun dorsale huid is in telogene. Tijdens telogene, haarfollikel stamcellen en MCSCs staan bekend om in een rustige, rusttoestand. De huid moet tonen geen significante haargroei na het scheren. Aan de andere kant, chemische ontharing kan induceren haarfollikel stamcel activering, die op zijn beurt toont significante haargroei uit de regio van belang (Figuur 2). Evenzo, tumor-gevoelige MCSCs uitdrukken oncogene mutaties moeten ook actief zijn voor versnelde tumorvorming. De chemische ontharing kan de activering van zowel de cel van de haarfollikel stamcel als MCSCs beduidend veroorzaken. melanoom-gevoelige MCSCs in een actieve toestand kan vormen tumoren, en microscopische melanoom initiatie kan worden waargenomen binnen 2 weken na chemische ontharing met behulp van de Lineage tracing allel LSL-tdTomato (Figuur 3).
Cutane melanoom initiatie geïnduceerd door UV-B bestraling
Gelijkaardig aan chemische ontharing, kan UV-B tumor initiatie van rustige tumor-naar voren gebogen MCSCs (Figuur 4) veroorzaken. Terwijl de muizen huid die tumor-naar voren gebogen MCSCs in een rustige staat bevat geen significante tumor initiatie en gebrek aan significante pigmentatie toont, de dorsale huid die aan UV-B wordt blootgesteld (tweemaal, 180 mJ/cm2) toont zwarte gepigmenteerde vroege melanocytische tumors die zijn macroscopische duidelijk (figuur 4a, B). Hoewel UV-B kan aanzienlijk induceren macroscopische duidelijk tumor initiatie binnen 2 weken, de toepassing van zonnebrandcrème kan beschermen UV-B-gemedieerde melanoom initiatie in de huid, vergelijkbaar met een UV-bestendig doek (figuur 4c, D).
Belangrijk, UV-B induceert de directe verplaatsing van MCSCs van hun folliculaire stamcel niche naar de interfollicular epidermis. Bovendien, UV-B kan induceren MCSC-oorsprong cutane melanoom vorming in de interfollicular epidermis, en de microscopische fenotype kan worden waargenomen door de Lineage tracing marker, tdTomato (Figuur 5). Aangezien deze tumorcellen kwaadaardig zijn, groeien ze snel en invasief (Figuur 5). Vergelijkbaar met de dorsale huid, UV-B-geïnduceerde melanoom initiatie kan met name worden waargenomen in andere huid gebieden, zoals het oor huid (Figuur 6). Vergeleken met de controle huid bedekt met UV-bestendig doek, de oor huid blootgesteld aan UV-B toont een hogere pigmentatie als gevolg van een hogere last van melanoom initiatie (Figuur 6).
Figuur 1: huidweefsel isolatie en Cryo-inbedding. Na euthanasie, scheren de muis dorsale huid regio van belang en embed de huid in cryomold met OCT. De gestippelde lijn op de muis staat voor het middelpunt. Typisch, 3 of 4 stukjes van de huid kan worden geïsoleerd met lijnsegment 3-4 langs de Middellijnen; één dergelijk stuk wordt vermeld door rechthoek 1/2/3/4. Deze huid stukken moeten worden ingebed in de LGO, zoals aangegeven in de figuur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: macroscopische fenotypen na chemische ontharing. (A) diagram van chemische ontharing. (B) na het scheren, werd de haar cyclus bevestigd om in telogene te zijn. (C) chemische ontharing werd uitgevoerd om haarschachten te verwijderen uit de haarzakjes, die kunnen activeren zowel haarfollikel en melanocyt stamcellen. (D) ongeveer een week later, zal de vroege haargroei gemakkelijk merkbaar. (E) dan, significante haargroei kan worden waargenomen in de tijd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: microscopische waarneming van melanoom initiatie gecontroleerd door chemische ontharing. De chemische ontharing kan de activering van rustige tumor-naar voren gebogen MCSCs beduidend veroorzaken. Dan, microscopische tumor initiatie aangetoond door de Lineage tracing marker tdTomato kan worden waargenomen binnen 2 weken. Dit cijfer toont de microscopische fenotype 16 dagen na 3 dagen Tamoxifen door IP-injectie, gevolgd door chemische ontharing met behulp van verschillende visualisaties van hetzelfde gezichtsveld. (A) tdTomato+ tumorcellen afkomstig van de haarfollikel samengevoegd met DAPI nucleaire tegen vlek. (B) de haarfollikels en de interfollicular epidermis worden geschetst in wit. (C) een schematische weergave van hoe tdTomato+ tumorcellen binnenvallen in de dermis van de haarfollikel, gewijzigd van maan, H. et al.6. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: macroscopische fenotype van cutane melanoom geïnduceerd door UV-B-straling. Muizen werden behandeld door Tamoxifen voor 3 dagen (dag 1 tot 3), gevolgd door 2 UV-B blootstelling (dag 4 en 6). (A) schema van UV-b-straling op de dorsale huid met Mutant MCSCs. (B) macroscopische fenotype tussen controle en UV-b blootgestelde dorsale huid. Significante zwarte pigmentatie met betrekking tot melanocytische tumorvorming kan worden waargenomen binnen 2 weken na de tweede UV-B bestraling. (C) schema van zonnebrandcrème toepassing. (D) terwijl UV-b aanzienlijk kan induceren tumor initiatie van mutant MCSCs, de toepassing van zonnebrandcrème toonde aanzienlijk onderdrukt UV-b-gemedieerde tumor initiatie (16 dagen na de tweede UV-b-straling). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: microscopische observatie van het door UV-B geïnduceerde cutane melanoom. De muizen werden behandeld met tamoxifen door IP injectie 3 dagen (dag 1 tot 3) gevolgd door 2 UV-B blootstelling (dag 4 en 5). (a-C) Vroege tumor initiatie in de interfollicular epidermis aangetoond door Lineage tracing tdTomato kan worden getoond op dag 17. (A) tdTomato + tumorcellen worden getoond migreren van de haarfollikel in de interfollicular epidermis. DAPI wordt gebruikt als een nucleaire tegen vlek. (B) DAPI kleuring wordt verwijderd en stippellijn geeft de locatie van de haarfollikels en interfollicular epidermis. (C) Schematische vermelding van tdTomato+ Cell migratie van de haar kiem naar de interfollicular epidermis na UV-B blootstelling. Gewijzigd van Moon et al.6. (D-F) Dan, tumorcellen groeien snel en binnenvallen de huid weefsels hieronder (dag 25). (D) tdTomato+ tumorcellen zijn blijven vermenigvuldigen en binnen te vallen in de huid weefsels. DAPI wordt gebruikt als een nucleaire tegen vlek. (E) DAPI kleuring wordt verwijderd en stippellijn geeft de locatie van de haarzakjes en interfollicular epidermis. (F) Schematische vermelding van tdTomato+ Cell invasie in de dermis en melanocytische tumorgroei. Gewijzigd van Moon et al.6. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: macroscopische en microscopische observatie van het door UV-B geïnduceerde melanoom in de huid van het oor. Aexperimentele regeling. De muizen werden behandeld door Tamoxifen 3 dagen (dag 1 tot 3) gevolgd door 3 blootstelling aan UV-B straling (dag 4, 6 en 8). (B) significant verhoogde melanoom initiatie door UV-B-straling werd op dag 28 zowel macroscopische als microscopisch waargenomen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hallmark genetische veranderingen vaak gevonden in cutane melanoom tumoren zijn goed beschreven13. De meest dominante driver mutatie is BrafV600E, en een genetisch gemanipuleerde muismodel voor BrafV600E-gemedieerde melanoom werd gegenereerd door de Bosenberg groep14 en neergelegd in het Jackson Laboratory. Met behulp van deze muismodel, onze recente studie aangetoond dat de eis van cellulaire activering van tumor-gevoelige MCSCs voor de significante initiatie van BrafV600E-gemedieerde melanoom in de dorsale huid6.
De ontharing is gekend om een efficiënte methode te zijn om de muizen van de haarfollikel stamcel activering op de dorsale huid te veroorzaken6,10. Muizen MCSCs bevinden zich in de haarfollikels, en bovendien, de cellulaire status van folliculaire MCSCs wordt gesynchroniseerd met de stand van de haarfollikel stamcellen8. Kunstmatige modulatie van de haarfollikel stamcellen kunnen veranderen MCSC status, dus ontharing kan direct activeren zowel melanocyt en haarfollikel stamcellen. Deze activeringsmethode voor MCSCs kan voor tumor-naar voren gebogen MCSCs worden toegepast om vroege stappen van cutane melanoom initiatie in genetisch gemanipuleerde melanoom Muismodellen te onderzoeken. Door middel van een chemische ontharing methode, melanoom vorming in de regio van belang in de muizen dorsale huid kan direct worden geïnitieerd. Ontharing kan worden uitgevoerd door verschillende methoden, zoals waxen of plukken, die beide zijn soorten van mechanische ontharing waar haarschachten worden gewonnen uit de haarfollikel. Echter, deze mechanische ontharing methoden kunnen onnauwkeurig zijn met betrekking tot een specifieke regio van belang. Aan de andere kant, een chemische ontharing methode met behulp van Ontharingscrème is eenvoudig te presteren en zorgt voor een precieze toepassing met betrouwbare activering van de haar cyclus, en kan minder hard op de huid dan mechanische verwijdering.
Onder verschillende risicofactoren, UV-B is de meest bekende risicofactor in cutane melanoom15. UV-B-straling is bekend dat de directe migratie van folliculaire MCSCs te induceren in de interfollicular epidermis9. Bovendien, UV-B is een sterke milieu-stressor die aanzienlijk kan induceren melanoom initiatie van tumor-gevoelige MCSCs6. In de hierboven beschreven experimentele protocol, een klein gebied van belang op de muizen dorsale huid kan worden blootgesteld aan UV-B licht, terwijl het gebruik van een UV-bestendige doek gemakkelijk beschermt de rest van de muis tegen ongewenste blootstelling. Deze behandeling kan worden uitgevoerd, terwijl de muis is onder narcose. Belangrijk is dat de migratie van MCSCs en de vorming van MCSC melanoom na blootstelling aan UV-B zijn UV-B-dosisafhankelijk6. Daarom, om succesvolle resultaten, is het belangrijk om regelmatig te controleren de intensiteit van de gloeilamp met behulp van een UV-B meter en pas de belichtingstijd en de afstand tussen de huid en gloeilampen als nodig is. Zoals algemeen bekend is, kan de huid branden in reactie op een hoge dosis van UV-B licht, maar zwakke UV-B blootstelling is ook schadelijk voor het experiment, omdat het onvoldoende zal zijn om MCSC-van oorsprong melanoom induceren.
Het hier beschreven protocol richt zich primair op de milieurisico factor, UV-B, in de dorsale huid. Echter, het experimentele protocol hierboven kan worden toegepast op verschillende doelstellingen. Zo kan het protocol worden aangepast met gloeilampen van verschillende Spectrums om het effect van alternatieve lichtbronnen of golflengten van UV, zoals UV-A te bepalen. Dit protocol in de eerste plaats gericht op de dorsale huid als het toegankelijk is en de status van MCSCs is goed gedefinieerd. Echter, het kan ook worden gewijzigd om UV-licht blootstelling aan aanhangsels, zoals het oor, staart of Palm huid, met inbegrip van voetkussentjes. Als voorbeeld, in Figuur 6, is het mogelijk om te onderzoeken mogelijke verschil in vroege melanocytische tumorvorming op alternatieve weefsel sites. Echter, in tegenstelling tot de dorsale huid, de status van MCSCs in deze sites zijn minder goed gedefinieerd; Vandaar dat de potentiële spontane activatie van MCSCs leidt tot willekeurige voorvallen van melanoom vorming moet worden overwogen. Daarom, in vergelijking met het protocol in de dorsale huid, alternatieve benaderingen zal een verhoogd aantal experimenten nodig om nauwkeurige experimentele resultaten te verkrijgen.
Bovendien, terwijl het huidige protocol in de eerste plaats blijkt BrafV600E-gemedieerde melanoom initiatie, onze vorige studie ook gemeld soortgelijke vroege melanoom vorming met een oncogene RAS/Pten combinatie, met behulp van de LSL-krasG12D genetisch allel6. Echter, andere driver mutaties, zoals Mutant nri's genen kunnen ook worden beschouwd met het experimentele systeem hier beschreven om vroege melanoom initiatie gedreven door andere oncogene combinaties te begrijpen.
Samen genomen, hier beschreven is een in vivo modelsysteem dat het mogelijk maakt voor het onderzoek van de vroege cutane melanoom initiatie in genetisch gemanipuleerde muizen. Deze muizenmodellen bieden de methoden voor temporele en ruimtelijke controle van melanoom initiatie van mutant MCSCs in de huid. Deze protocollen bieden een nieuw paradigma voor de studie van de mechanismen van de vroege melanoom initiatie van tumor-gevoelige MCSCs evenals een platform om de fysiologische en milieu-stressoren die kunnen bijdragen aan de inwijding van melanoom te bepalen. Dit niveau van spatiotemporal controle kan ook een instrument voor meer precieze melanoom inductie te testen geneesmiddelen werkzaamheid in het voorkomen van melanoom vorming, evenals tumorgroei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Bureau van de adjunct-minister van defensie voor gezondheidszaken, via de peer reviewed kankeronderzoek programma onder gunning W81XWH-16-1-0272. Adviezen, interpretaties, conclusies en aanbevelingen zijn die van de auteurs en zijn niet noodzakelijkerwijs onderschreven door het ministerie van defensie. Dit werk werd ook gesteund door een zaad toelage van het Cornell programma van de stam cel aan A.C. wit. H. de maan werd gesteund door het Cornell centrum voor geleerden van het gewervelde Genomics programma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26 G 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 mm x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG |
|
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG |
|
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA |
|
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA |
|
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
References
- Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force. The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- White, A. C., Lowry, W. E. Refining the role for adult stem cells as cancer cells of origin. Trends in Cell Biology. 25 (1), 11-20 (2015).
- Moon, H., Donahue, L. R., White, A. C. Understanding cancer cells of origin in cutaneous tumors. Cancer Stem Cells. , 263-284 (2016).
- Blanpain, C.
- Moon, H., Donahue, L. R., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Moon, H., White, A. C. A path from melanocyte stem cells to cutaneous melanoma illuminated by UVB. Molecular & Cellular Oncology. 5 (2), e1409864 (2018).
- Rabbani, P., Takeo, M., et al. Coordinated activation of Wnt in epithelial and melanocyte stem cells initiates pigmented hair regeneration. Cell. 145 (6), 941-955 (2011).
- Chou, W. C., Takeo, M., et al. Direct migration of follicular melanocyte stem cells to the epidermis after wounding or UVB irradiation is dependent on Mc1r signaling. Nature Medicine. 19 (7), 924-929 (2013).
- Keyes, B. E., Segal, J. P., et al. Nfatc1 orchestrates aging in hair follicle stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (51), E4950-9 (2013).
- Müller-Röver, S., Handjiski, B., et al. A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages. The Journal of Investigative Dermatology. 117 (1), 3-15 (2001).
- Kastenmayer, R. J., Fain, M. A., Perdue, K. A. A retrospective study of idiopathic ulcerative dermatitis in mice with a C57BL/6 background. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 45 (6), 8-12 (2006).
- Vultur, A., Herlyn, M.
- Dankort, D., Curley, D. P., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Viros, A., Sanchez-Laorden, B., et al. Ultraviolet radiation accelerates BRAF-driven melanomagenesis by targeting TP53. Nature. 511 (7510), 478-482 (2014).
