Summary
Следующая процедура описывает метод пространственного и временного контроля меланоцитарной опухоли инициации в куринной дорсальной кожи, используя генетически инженерии мыши модели. Этот протокол описывает макроскопические, а также микроскопические кожной меланомы инициации.
Abstract
Кожная меланома хорошо известна как самый агрессивный рак кожи. Хотя факторы риска и основные генетические изменения продолжают фиксироваться с увеличением глубины, частота заболеваемости кожной меланомой в последние десятилетия быстро и непрерывно растет. Для того, чтобы найти эффективные профилактические методы, важно понимать ранние шаги начала меланомы в коже. Предыдущие данные показали, что фолликулярные меланоциты стволовых клеток (MCSCs) в тканях кожи взрослой кожи может выступать в качестве клеток меланомы происхождения при выражении онкогенных мутаций и генетических изменений. Tumorigenesis возникает от меланомы подверженных MCSCs может быть вызвано при переходе MCSCs от покоя к активному состоянию. Этот переход в меланомы подверженных MCSCs может быть повышена путем модуляции либо волосяного фолликула стволовых клеток состояние или через внутренние экологические факторы, такие как ультрафиолет-B (УФ-B). Эти факторы могут быть искусственно манипулировать в лаборатории путем химического депиляции, которая вызывает переход стволовых клеток волосяного фолликула и MCSCs от тихого к активному состоянию, и УФ-B воздействия с помощью скамейки света. Эти методы обеспечивают успешный пространственный и временный контроль кожной меланомы инициации в куринной донской кожи. Таким образом, эти системы in vivo будут полезны для определения ранних этапов начала кожной меланомы и могут быть использованы для тестирования потенциальных методов профилактики опухоли.
Introduction
Меланома, злокачественная форма меланоцитических опухолей, является наиболее агрессивным раком в коже с кожной меланомой, ответственной за большинство случаев смерти от рака кожи1. В Соединенных Штатах, меланома обычно диагностируется; по прогнозам, это будет 5-й до 6-й наиболее распространенный тип рака среди предполагаемых новых случаев рака в 2018году 2. Кроме того, в то время как общие заболеваемости раком показали тенденцию постепенного сокращения в последние десятилетия, кожные показатели заболеваемости меланомой в течение последних нескольких десятилетий демонстрируют непрерывное и быстрое увеличение обоих полов2.
Для более эффективной борьбы с кожной меланомой важно четко понимать ранние события развития меланомы из их клеток происхождения, чтобы лучше определить клинически эффективные профилактические методы. В настоящее время известно, что взрослые стволовые клетки могут значительно способствовать образованию опухоли, как клеточного происхождения рака во многих различных типах органов, включая ткани кожи3,4,5. Аналогичным образом, взрослые стволовые клетки меланоцитов (MCSCs) в куринской нижней кожи может работать как клетки меланомы происхождения при аномальной активации Рас / Раф и Акт пути6. Тем не менее, эти онкогенные мутации сами по себе не в состоянии эффективно вызвать образование опухоли от тихих MCSCs. Меланоцитические опухоли в конечном итоге развиваться, когда MCSCs становятся активными во время естественного цикла волос. Однако, в этом протоколе, мы опишите методы искусственного индуцирования клеточной активации подверженных опухоли MCSCs, тем самым облегчая точный контроль меланомы инициации6,7.
С помощью методов, описанных здесь, пространственный и временный контроль кожной меланомы инициации от опухолевых MCSCs, выражающих онкогенные BrafV600E вместе с потерей экспрессии Pten может быть успешно выполнена, как мы ранее сообщалио 6. Этот метод включает в себя предыдущие выводы, которые демонстрируют активации волосяного фолликула через депиляцию, а также как воздействие кожи мурина на УФ-В может способствовать активации MCSCs резидентов волосяного фолликула и транслокации этой клеточной субпопуляции до межфолликулярной эпидермис6,8,9,10. Эти системы in vivo могут предоставить ценную информацию о том, как физиологические и экологические изменения могут изменить клеточный статус меланомы подверженных MCSCs, которые, в свою очередь, может вызвать значительное начало меланомы в коже.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных выполняются в соответствии с Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Корнельского университета (IACUC).
1. Подготовка
-
Соберите хвостовые зажимы от 12-дневных послеродовых мышей и переварить в 400 л 0,05 N NaOH при 95 градусах по Цельсию на 1 ч. Вихрь и добавьте 32 зл от 1 M Tris-HCl, pH 7. Генотип мышей в соответствии с протоколами ПЦР, предоставляемых через лабораторию Джексона и определить мышей с генотипом интереса6.
- Тир-Креер - гемизигоус (/ CreER)
- LSL-BrafV600E - гетерозиготный (
- Pten - гомозиготный флокс (флокс/флокс)
- LSL-tdTomato - hemizygous (
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Праймер последовательности приведены в таблице материалов. - Используйте клипер для волос (электрический триммер) для бритья сонной кожи от 2 до 3 дней до всех экспериментов, описанных ниже, и когда мыши примерно 7 недель. Позаботьтесь, чтобы не повредить тонкую кожу мыши с помощью электрического триммера, как любая травма может вызвать реакцию заживления ран, которые активируют стволовые клетки волосяного фолликула, в том числе MCSCs.
- Определите, если волос цикл в telogen и является ли кожа ранена в период ожидания. Если кожа показывает какие-либо признаки травмы, мышь не должна использоваться для этих процедур.
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Хотя цикл волос может немного отличаться между генетическими фонами, в этом возрасте цикл волос в сонной коже, как правило, в состоянии телегена11. Tyr-CreER transgene будет направлена MCSCs в тероген кожи, и последующие генетические изменения будут постоянно выражается во всех линиях MCSC, в том числе дифференцированных меланоцитов и меланоцитов опухолей.
2. Тамоксифен Лечение Cre-Lox генетической рекомбинации
-
Подготовка тамоксифена для интраперитонеальной инъекции (ИС) или местного введения для системной или локализованной генетической рекомбинации
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Для того, чтобы тамоксифен, чтобы вызвать рекомбинацию, он должен сначала быть метаболизируется печенью до 4-гидрокситамоксифен (4-OHT), который может связываться и активировать CreER. Актуальное применение тамоксифена не будет метаболизироваться таким образом и 4-OHT должны непосредственно использоваться. Для достаточной рекомбинации требуется только один способ доставки тамоксифена.- Тамоксифен уровень, подготовка тамоксифена при концентрации 10 мг мл-1, растворенного в кукурузном масле. Чтобы помочь в растворении препарата в раствор, добавить до 10% общий объем 100% молекулярного класса этанола к препарату в виде порошка, вихрь в течение 3 мин, а затем добавить оставшийся объем кукурузного масла. Продолжайте вихрь до тех пор, пока кристаллический материал больше не проявляется в растворе. Тамоксифен раствор может быть стерилизован путем прохождения через фильтр 0,2 мкм. Приступить к шагу 2.2.1 для лечения.
- 4-OHT, подготовка стокового раствора гидрокситамоксифена до 3 мг мл мл-1 в 100% этанола. Затем, рабочее решение может быть применено столько, сколько необходимо для покрытия области кожи интерес (как правило, одно приложение).
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Запасной раствор гидрокситамоксифена может быть растворен в 100% этаноле при окончательной концентрации 5 ММ. Затем, чтобы подготовить рабочий раствор, 5 л 4OH-тамоксифен бульона раствор может быть разбавлен в 15 зл 100% этанола. Для 4 мм2 области, от 1 до 3 л рабочего решения могут быть местно применены.
-
Лечение мышей тамоксифеном либо системно, либо местно
- Для системного лечения, управлять 2 мг тамоксифена через инъекции IP один раз в день в течение 3 дней с помощью 26 G иглы.
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Используя эту модель, примерно 93% и 4% потянительных MCSCs помечены tdTomato6. - Для региональной активации, выполнить один актуальный лечения с 4-OHT. Обложка области кожи интерес с рабочим решением. Объем рабочего решения может определяться размером региона интереса, как описано в шаге 2.1.2.
- Для системного лечения, управлять 2 мг тамоксифена через инъекции IP один раз в день в течение 3 дней с помощью 26 G иглы.
- На 48 ч после последней дозы тамоксифена, перейти к шагу 3 для химического депиляции индуцированной опухоли инициации или шаг 4 для УФ-B индуцированной инициации опухоли
3. Химическая депиляция
- Оборудуйте комнату для обработки мышей, содержащую изофларанную систему со следующими необходимыми материалами, сливками для удаления волос, ватными тампонами, бумажной тканью и водой.
- Поместите мышь в индукционную камеру и анестезируйте с 3,5 до 4,5% изофлуран и 1 л / мин кислорода.
- После того, как частота дыхания стабилизировалась, подтвердите, что мышь находится в надлежащей плоскости анестезии, выполняя щепотку ног и перенесите мышь в основную трубку, поддерживающую анестезию с 1 до 1,5% изофлураном и кислородом 1 л/мин. Нанесите глазную мазь, чтобы глаза не высыхать под наркозом.
- Используйте ватный тампон, чтобы нанести тонкий слой крема для удаления волос на бритую область кожи мыши.
- После того, как крем был равномерно применен, использовать чистые ватные тампоны, чтобы начать удаление. Общее время, в течение которого крем находится в контакте с кожей, не должно превышать 1 мин.
- Аккуратно протрите кожу влажной бумажной тканью и убедитесь, что любой остаточный крем был удален.
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Крем для удаления волос может вызвать раздражение кожи, если она не полностью удалена. Некоторые мыши, такие как на фоне C57BL/6, могут быть склонны к развитию дерматита12. Хотя редко, некоторые животные будут развиваться дерматит в течение 24 ч после удаления волос крем применения или механического депиляции. Убедитесь в том, чтобы проверить мышей на следующий день после лечения, чтобы искать какие-либо признаки регионального раздражения кожи. - Отбросьте удаленные волосяные валы и любые материалы, используемые в биоопасный ящик.
- Поместите мышь в пустую, чистую клетку мыши, пока анестезия не стирается.
- Верните мышей в клетки.
4. Облучение УФ-В
- Оборудуйте комнату для обработки мышей, содержащую изофларановую систему со следующими необходимыми материалами, с помощью следующей системы света УФ-В, ультрафиолетового светового метра, защитного покрытия для мыши, дополнительного УФ-Б защитного СИЗ для исследователя и таймера.
- Мыши следует облучать в дозе УФ-В интересах (т.е. 0-180 мДж/см2). Используйте ультрафиолетовый световой измеритель для определения соответствующего периода времени для облучения мышей.
ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ. mW/см2 x время и доза - Анестезируйка мыши с изофлюраном. В то время как в индукционной камере, использовать от 3,5 до 4,5% изофлуран и 1 л / мин кислорода.
- После того, как мышь стабилизировалась, подтвердите эффект анестезии с ног щепотку и передать мышь в основной анестезии трубки, расположенной в УФ-камеры. Нанесите глазную мазь, чтобы предотвратить высыхание глаз под наркозом. Поддерживайте анестезию с 1 до 1,5% изофлураном и 1 л/мин кислородом.
- Обложка сонной кожи с UV-B защитный материал, так что только желаемая область будет подвергаться.
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ В настоящее время следует использовать соответствующий СИЗ. Продолжительность времени, необходимого для облучения мыши, зависит от интенсивности используемой лампочки, но анестезию, возможно, потребуется контролировать, если требуемое время превышает 30 с. - Обложка УФ-камеры с помощью УФ-резистентной крышкой или любых других подходящих материалов.
- Включите лампу UV-B и облучаем мышь на время, определенное исследователями для конкретной цели.
- Выключите УФ-систему и изолюран, а затем поместите мышь в пустую клетку мыши, пока анестезия не стирается.
- Верните мышей в клетки.
5. Обработка тканей
-
Изоляция кожи
- Получить следующие до начала работы, некропсии инструменты, фильтровальная бумага и бумажные полотенца.
- Эвтаназия мышей в соответствии с протоколами IACUC утвержденных, и подтвердить смерть до начала разбирательства.
- Использование клипера для волос, брить любые волосы из области сонной кожи. Слегка щеткой области с ворсом свободной ткани, чтобы очистить область.
- Сделайте небольшой разрез острыми ножницами чуть выше основания хвоста.
- Вставьте большие тупые ножницы в разрез и отделите подкожные соединительные ткани.
- Тщательно изолировать область кожи интересующий путем резки с острыми ножницами вдоль края ткани.
- Поместите ткани кожи на чистое бумажное полотенце и использовать тупые щипцы, чтобы растянуть кожу так, чтобы она придерживается полотенце и преподается. Этот шаг служит для обеспечения дополнительной поддержки ткани, так что она может манипулировать и обрабатываться при сохранении своей формы.
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Будьте осторожны, чтобы обрабатывать только внешние области ткани кожи, так как щипки могут привести к повреждению кожи, которые можно увидеть гистологически.
-
Фиксация тканей
- Сложите кусок фильтровальной бумаги пополам и этикетку соответствующим образом. Поместите кожу вместе с бумажным полотенцем поддержку в сложенную бумагу непосредственно рядом с складкой, гарантируя, что образец гладкий и не сложить или мятый. Печать фильтровальной бумаги, скрепив открытые стороны, а затем обрезать так, что остальная бумага может быть использована для будущих образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Этот шаг выполняется так, что кожа сохраняет свою форму во время фиксации. - Полностью погрузите образец ткани в 10% нейтральный буферный формалин на 3-5 ч при комнатной температуре или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию.
- После фиксации, удалить образцы из формалина, мыть в деионизированной воде (2x, 5 мин каждый) и приступить к производству тканей блоков. Тщательно удалите любой остаточный материал из ткани кожи (т.е. остаточную бумагу).
- Сложите кусок фильтровальной бумаги пополам и этикетку соответствующим образом. Поместите кожу вместе с бумажным полотенцем поддержку в сложенную бумагу непосредственно рядом с складкой, гарантируя, что образец гладкий и не сложить или мятый. Печать фильтровальной бумаги, скрепив открытые стороны, а затем обрезать так, что остальная бумага может быть использована для будущих образцов.
-
Изготовление замороженных тканевых блоков(рисунок 1)
- Обрезать края образца кожи так, чтобы они не зубчатые, а затем сделать 3 sagittal сокращений. Ширина этих полос не должна быть больше, чем высота криомолд (5 мм). Далее, сделать поперечные порезы, чтобы иметь куски кожи, которые не больше, чем ширина криомолд (20 мм) и могут быть встроены. Повторите с оставшейся половиной стрижки кожи, или сохранить ткани для других целей (поочередно, сохранить половину до фиксации).
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Важно держать части кожи в правильной ориентации. - Ориентируйте криомольд (25 x20 x 5 мм 3) в портретной ориентации и поместите от 4 до 5 кусочков кожи поверх OCT. После того, как все части на месте, используйте 2 пары тонких щипцы, чтобы принести длинный край кожи на дно криомолд. Кожа должна теперь стоять в OCT перпендикулярно к основанию формы. Позаботьтесь, чтобы свести к минимуму образование воздушных карманов в ПРЕДЕЛАх OCT во время этого шага (Рисунок 1).
- Заполните форму с OCT на вторую губу, и место на плоской поверхности сухого льда. Используйте щиптем, чтобы настроить любые части кожи, которые, возможно, перешли во время передачи, как блок начинает замерзать. Как только нижний слой затвердеет, манипуляции с тканями будут невозможны.
- Вырезать 8-10 мкм слайды для анализа.
- Обрезать края образца кожи так, чтобы они не зубчатые, а затем сделать 3 sagittal сокращений. Ширина этих полос не должна быть больше, чем высота криомолд (5 мм). Далее, сделать поперечные порезы, чтобы иметь куски кожи, которые не больше, чем ширина криомолд (20 мм) и могут быть встроены. Повторите с оставшейся половиной стрижки кожи, или сохранить ткани для других целей (поочередно, сохранить половину до фиксации).
-
Создание формалин фиксированный параффин встроенных (FFPE) тканевых блоков
- Поместите 2 части фиксированной кожи в маркированную кассету и обезвождение в увеличении концентраций этанола (75% этанола в течение 30 мин, 85% за 30 мин, 90% за 30 мин, 95% за 30 мин, 100% для 2x 30 мин, ксилена или ксилена заменить 2x 30 мин). Инкубировать с парафином при 58-60 ", сначала в течение 30 минут, а затем на ночь.
- Встраивай ткань в форму 24 x 24 мм2 из нержавеющей стали с жидким парафином и затвердевай при -5 градусах Цельсия. Ориентация ткани должна быть похожа на замороженные блоки ткани, так что продольные секции через несколько волосяных фолликулов могут быть визуализированы(Рисунок 1).
- После того, как парафин затвердел, удалить плесень и нарезать 5-10 мкм разделов для анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Кожная меланома инициации индуцированной химической депиляции
Процедура химического депиляции изображена на рисунке 2. Когда мыши 7-недельный послеродовой, их дорсальная кожа находится в телегене. Во время telogen, стволовые клетки фолликула волосяного фолликула и MCSCs знаны, что находятся в quiescent, положении отдыха. Кожа не должна показывать значительный рост волос после бритья. С другой стороны, химическая депиляция может вызвать активацию стволовых клеток волосяного фолликула, что, в свою очередь, показывает значительный рост волос из интересуемого региона(рисунок 2). Аналогичным образом, подверженные опухоли MCSCs, выражающие онкогенные мутации, также должны быть активными для ускоренного формирования опухоли. Химическое депиляция может значительно вызвать активацию как волосяного фолликула стволовых клеток и MCSCs. Меланома подверженных MCSCs в активном состоянии может образовывать опухоли, и микроскопические начала меланомы может наблюдаться в течение 2 недель после химического депиляции с использованием линии отслеживания аллелей LSL-tdTomato (Рисунок 3).
Кожная меланома инициации индуцированной УФ-B облучения
Подобно химической депиляции, УФ-В может вызвать инициацию опухоли от тихих опухолей подверженных MCSCs(Рисунок 4). В то время как мурин кожи, содержащей опухолевые MCSCs в quiescent состоянии не показывает значительного инициирования опухоли и отсутствие значительной пигментации, дорсальная кожа подвергается УФ-B (дважды, 180 мДж/см2) показывает черный пигментированных ранних меланоцитических опухолей, которые макроскопически очевидны(рисунок 4A,B). В то время как УФ-В может значительно вызвать макроскопически очевидное начало опухоли в течение 2 недель, применение солнцезащитный крем может защитить УФ-B-опосредованного начала меланомы в коже, подобно УФ-резистентной ткани (Рисунок 4C, D).
Важно отметить, что УФ-В индуцирует прямую транслокацию MCSCs из их фолликулярной ниши стволовых клеток к межфолликулярной эпидермис. Кроме того, УФ-B может вызвать MCSC происхождения кожной меланомы формирования всей межфолликулярной эпидермис, и микроскопический фенотип может наблюдаться маркером отслеживания линии, tdTomato (Рисунок 5). Поскольку эти опухолевые клетки являются злокачественными, они быстро и инвазивно растут(рисунок 5). Подобно коже в области всасывания, УВК-B индуцированной меланомы инициации может быть заметно наблюдается в других областях кожи, таких как кожа уха (Рисунок 6). По сравнению с контрольной кожей, покрытой уф-резистентной тканью, кожа уха, подвергаемые ВОЗДЕЙСТВИю УФ-В, демонстрирует более высокую пигментацию из-за более высокого бремени инициации меланомы(рисунок 6).
Рисунок 1 Изыск тканей кожи и крио-встраивание. После эвтаназии, брить мышь дорсальной области кожи интерес и вставлять кожу в криомольд, содержащий OCT. Пунктирная линия на мыши представляет собой середину линии. Как правило, 3 или 4 части кожи могут быть изолированы с линией сегмента 3-4 вдоль средней линии; одна такая часть показана прямоугольником 1/2/3/4. Эти части кожи должны быть встроены в OCT, как показано на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Макроскопические фенотипы после химического депиляции. (A) Диаграмма химического депиляции. (B) После бритья, цикл волос было подтверждено, чтобы быть в telogen. (C) Химическое депиляция была выполнена для удаления волосяных валов из волосяных фолликулов, которые могут активировать как волосяной фолликул и меланоцит стволовых клеток. (D) Примерно через неделю, ранний рост волос будет легко заметно. (E) Тогда, значительный рост волос можно наблюдать с течением времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Микроскопическое наблюдение за инициацией меланомы, контролируемое химическим депиляцией. Химическое депиляция может значительно вызвать активацию тихих опухолевых MCSCs. Затем, микроскопические инициации опухоли продемонстрировали линии отслеживания маркерt tdTomato можно наблюдать в течение 2 недель. Эта цифра демонстрирует микроскопический фенотип 16 дней после 3 дней тамоксифен путем инъекции IP с последующим химическим депиляции с использованием различных визуализаций одного и того же поля зрения. (A) tdTomatoи опухолевые клетки, происходящие из волосяного фолликула слились с Дапи ядерного противоядерного пятна счетчика. (B) Волосяные фолликулы и межфолликулярные эпидермисы изложены в белом цвете. (C) Схема, показывающая, как tdTomatoи опухолевые клетки вторгаются в дерму из волосяного фолликула, измененный с Луны, H. et al.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4. Макроскопический фенотип кожной меланомы, индуцированной ультрафиолетовым облучением. Мыши лечились тамоксифеном в течение 3 дней (день от 1 до 3), а затем 2 УФ-B воздействия (день 4 и 6). (A) Диаграмма ОБлучения UV-B на коже дозалок, содержащей мутант MCSCs. (B) Макроскопический фенотип между контролем и УФ-B подвергаются дорсальной кожи. Значительная черная пигментация, связанная с образованием меланоцитической опухоли, может наблюдаться в течение 2 недель после второго облучения УФ-В. (C) Диаграмма применения солнцезащитных кремов. (D) В то время как УФ-В может значительно вызвать инициацию опухоли от мутантов MCSCs, применение солнцезащитный крем показал значительно подавлены УФ-B-опосредованных инициации опухоли (16 дней после второго ОБлучения УФ-B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5. Микроскопическое наблюдение уНИВ-В индуцированной кожной меланомы. Мыши лечились тамоксифеном путем инъекции ИС в течение 3 дней (день от 1 до 3), а затем 2 УФ-B воздействия (день 4 и 5). (A-C) Ранняя инициация опухоли по всей межполоклярной эпидермии, продемонстрированный отслеживанием линии tdTomato может быть показана на 17-й день. (A) tdTomato' опухолевые клетки показаны мигрирующие из волосяного фолликула в межфолликулярный эпидермис. Дапи используется в качестве ядерного противоядерного пятна. (B) Дапи окрашивание удаляется и пунктирная линия указывает расположение волосяных фолликулов и межфолликулярных эпидермис. (C) Схема, указывающая на тдТоматои миграцию клеток от зародыша волос к межфолликулярной эпидермису после воздействия УФ-В. Изменено с Луны и др.6. (D-F) Затем опухолевые клетки быстро растут и вторгаются в кожные ткани ниже (день 25). (D) tdTomatoи опухолевые клетки продолжают размножаться и вторгаться в кожные ткани. Дапи используется в качестве ядерного противоядерного пятна. (E) Dapi окрашивание удаляется и пунктирная линия указывает расположение волосяных фолликулов и межфолликулярных эпидермис. (F) Схематическая, указывающая tdTomatoи вторжение клеток в дерму и меланоцитарный рост опухоли. Изменено с Луны и др.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6. Макроскопическое и микроскопическое наблюдение уф-В-индуцированной меланомы в коже уха. (A) Экспериментальная схема. Мыши лечились тамоксифеном в течение 3 дней (день от 1 до 3), а затем 3 воздействия UV-B облучения (день 4, 6 и 8). (B) Значительно ежемовение меланомы UV-B облучение наблюдалось макроскопически также, как микроскопически на день 28. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hallmark генетические изменения часто встречаются в кожной меланомы опухолей были хорошо описаны13. Наиболее доминирующей мутацией драйвера является BrafV600E, а генетически модифицированная модель мыши для Braf V600E-опосредованноемеланома была создана группой Bosenberg14 и отложена в лаборатории Джексона. Используя эту модель мыши, наше недавнее исследование продемонстрировало требование клеточной активации подверженных опухолей MCSCs для значительного начала Braf V600E-опосредованнаямеланома в коже доза6.
Депилация, как известно, эффективный метод, чтобы вызвать активацию стволовой клетки волосяного фолликула на спинной коже6,10. Murine MCSCs расположены в пределах волосяных фолликулов, и, кроме того, клеточный статус фолликулярных MCSCs синхронизируется с состоянием стволовых клеток волосяного фолликула8. Искусственная модуляция стволовых клеток волосяного фолликула может изменить статус MCSC, таким образом, депиляция может непосредственно активировать как меланоциты, так и стволовые клетки волосяного фолликула. Этот метод активации для MCSCs может быть применен для опухолевых MCSCs для изучения ранних этапов кожной меланомы инициации в генетически модифицированных моделях мыши меланомы. С помощью химического метода депиляции, образование меланомы в регионе, представляющих интерес в курин-дорсальной кожи может быть непосредственно инициирована. Депиляция может быть выполнена различными методами, такими как воском или выщипывание, оба из которых являются типами механического удаления волос, где волосяные валы извлекаются из волосяного фолликула. Однако эти методы механического депиляции могут быть неточными в отношении конкретной области, представляющих интерес. С другой стороны, химический метод депиляции с использованием крема для удаления волос прост в выполнении и позволяет точно ею применять с надежной активацией волосяного цикла, и может быть менее резким на коже, чем механическое удаление.
Среди различных факторов риска, УФ-В является наиболее известным фактором риска кожной меланомы15. UV-B облучение, как известно, вызывают прямую миграцию фолликулярных MCSCs в межфолликулярной эпидермис9. Кроме того, УФ-В является сильным экологическим стрессором, который может значительновызвать начало меланомы от подверженных опухоли MCSCs 6. В экспериментальном протоколе, описанном выше, небольшая область интереса на куринской тонзатальной коже может подвергаться воздействию ультрафиолетового света, в то время как использование уф-резистентной ткани легко защищает остальную мышь от нежелательного воздействия. Это лечение может быть выполнено в то время как мышь находится под наркозом. Важно отметить, что миграция MCSCs и формирование MCSC происхождения меланомы после воздействия УФ-В являются УФ-B-дозы зависимы6. Поэтому, чтобы иметь успешные результаты, важно регулярно проверять интенсивность лампочки с помощью УФ-В-метра и регулировать время экспозиции и расстояние между кожей и лампочками по мере необходимости. Как известно, кожа может гореть в ответ на высокую дозу УФ-B света, но слабый УФ-B воздействия также вредно для эксперимента, как это будет недостаточно, чтобы вызвать MCSC происхождения меланомы.
Описанный здесь протокол в первую очередь фокусируется на факторе риска окружающей среды, УФ-В, в коже доза. Тем не менее, экспериментальный протокол выше может быть применен к различным целям. Например, протокол может быть изменен с лампочками различных спектров, чтобы определить влияние альтернативных источников света или длин волн УФ, таких как УФ-А. Этот протокол в первую очередь ориентированы на сонную кожу, как она доступна и статус MCSCs четко определены. Тем не менее, он также может быть изменен для целевой УФ-излучения воздействия придатков, таких как ухо, хвост или ладони кожи, в том числе ноги колодки. Например, на рисунке 6можно изучить возможную разницу в раннем образовании меланоцитных опухолей в альтернативных участках тканей. Однако, в отличие от сонной кожи, статус MCSCs в этих сайтах менее четко определены; следовательно, следует учитывать потенциальную спонтанную активацию MCSCs, приводящей к случайным возникновениям образования меланомы. Поэтому, по сравнению с протоколом в области содвиной кожи, альтернативные подходы потребуют увеличения числа экспериментов для получения точных экспериментальных результатов.
Кроме того, в то время как текущий протокол в первую очередь демонстрирует Braf V600E-опосредованноеначало меланомы, наше предыдущее исследование также сообщило об аналогичном раннем образовании меланомы с онкогенной комбинацией Рас/Птена, используя LSL-KrasG12D генетический аллель6. Тем не менее, другие мутации драйвера, такие как мутантные гены Nras, также могут быть рассмотрены с экспериментальной системой, описанной здесь, чтобы понять раннюю инициацию меланомы, обусловленную другими онкогенными комбинациями.
В совокупности описанная здесь модельная система in vivo позволяет иссучить раннюю кожную меланому у генетически модифицированных мышей. Эти модели мурин обеспечивают методы временного и пространственного контроля начала меланомы от мутантов MCSC в коже. Эти протоколы обеспечивают новую парадигму для изучения механизмов ранней инициации меланомы от подверженных опухоли MCSCs, а также платформу для определения физиологических и экологических стрессоров, которые могут способствовать инициации меланомы. Этот уровень пространственно-временного контроля может также обеспечить инструмент для более точной индукции меланомы для проверки эффективности препарата в предотвращении образования меланомы, а также роста опухоли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Управлением помощника министра обороны по вопросам здравоохранения, в рамках программы исследования рака Peer Reviewed в рамках премии W81XWH-16-1-0272. Мнения, толкования, выводы и рекомендации являются мнениями авторов и не обязательно одобрены министерством обороны. Эта работа была также поддержана семенной грант от Корнельской программы стволовых клеток для A.C. White. H. Moon был поддержан Корнельским центром позвоночной геномики Стипендиат программы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26 G 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 mm x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG |
|
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG |
|
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA |
|
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA |
|
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
References
- Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force. The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- White, A. C., Lowry, W. E. Refining the role for adult stem cells as cancer cells of origin. Trends in Cell Biology. 25 (1), 11-20 (2015).
- Moon, H., Donahue, L. R., White, A. C. Understanding cancer cells of origin in cutaneous tumors. Cancer Stem Cells. , 263-284 (2016).
- Blanpain, C.
- Moon, H., Donahue, L. R., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Moon, H., White, A. C. A path from melanocyte stem cells to cutaneous melanoma illuminated by UVB. Molecular & Cellular Oncology. 5 (2), e1409864 (2018).
- Rabbani, P., Takeo, M., et al. Coordinated activation of Wnt in epithelial and melanocyte stem cells initiates pigmented hair regeneration. Cell. 145 (6), 941-955 (2011).
- Chou, W. C., Takeo, M., et al. Direct migration of follicular melanocyte stem cells to the epidermis after wounding or UVB irradiation is dependent on Mc1r signaling. Nature Medicine. 19 (7), 924-929 (2013).
- Keyes, B. E., Segal, J. P., et al. Nfatc1 orchestrates aging in hair follicle stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (51), E4950-9 (2013).
- Müller-Röver, S., Handjiski, B., et al. A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages. The Journal of Investigative Dermatology. 117 (1), 3-15 (2001).
- Kastenmayer, R. J., Fain, M. A., Perdue, K. A. A retrospective study of idiopathic ulcerative dermatitis in mice with a C57BL/6 background. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 45 (6), 8-12 (2006).
- Vultur, A., Herlyn, M.
- Dankort, D., Curley, D. P., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Viros, A., Sanchez-Laorden, B., et al. Ultraviolet radiation accelerates BRAF-driven melanomagenesis by targeting TP53. Nature. 511 (7510), 478-482 (2014).
