Summary
このプロトコルは、仙台ウイルス感染による神経幹細胞を誘導する末梢血単核細胞のリプログラミング、ドーパミン作動性ニューロンへのiNSCの分化、DA前駆体の一方的な病変への移植を提示するパーキンソン病マウスモデル、およびPD治療のためのiNSC由来DA前駆体の安全性および有効性の評価。
Abstract
パーキンソン病(PD)は、腹部メセンスファロン(VM)における基数ニグラパースコンパクター(SNpc)におけるドーパミン作動性(DA)ニューロンの変性によって引き起こされる。細胞置換療法はPDの治療に大きな期待を寄せており、最近、腫瘍形成のリスクが低下し、可塑性が生じるため、誘導神経幹細胞(iNSC)が細胞補充療法の候補として浮上している。領域特異的ニューロンとグリア。iNSCは、線維芽細胞、末梢血単核細胞(PBMNC)および様々な他のタイプの細胞などの自家体細胞源から再プログラムすることができる。他のタイプの体細胞と比較して、PBMNCは培養中にアクセスし、拡大しやすいので魅力的なスターターセルタイプです。センダイウイルス(SeV)は、ヒトOCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCを含む再プログラミング因子をコードするRNA非統合型ウイルスであり、ネグレーション、一本鎖、非セグメントゲノムを有し、 宿主ゲノムは、感染した細胞の細胞質でのみ複製し、リプログラミングのための効率的で安全な手段を提供する。本研究では,PBMNCを再プログラミングしてiNSCを得るプロトコルを用いて,2段階の方法で特殊なVM DAニューロンに分化するプロトコルについて述べた.次に、DA前駆体を一方的に6-ヒロキシドパミン(6-OHDA)病変PDマウスモデルに移植し、PDの治療の安全性と有効性を評価する。この方法は、インビトロおよびインビボにおける患者特異的DA神経細胞の機能および治療効果を調べるためのプラットフォームを提供する。
Introduction
パーキンソン病(PD)は、視室メゼンサロン(VM)におけるドーパミン作動性(DA)ニューロンの変性によって引き起こされる一般的な神経変性疾患であり、60歳以上の人口で1%以上の有病率を有する。1,2.過去10年間にわたり、細胞療法は、変性または損傷した細胞を置き換えるか、または変性ニューロンの周りの微小環境に栄養を与えることを目的とし、PD3の治療における可能性を示している。一方、リプログラミング技術は、補充療法のための有望な細胞源を提供する4、大きな進歩を遂げました。ヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)と胚性幹細胞(ESC)は、ラットおよび非ヒト霊長類PDモデルに移植すると、生き残り、母性、運動機能を改善することができるDA神経細胞に分化できることが証明されている5 ,6,7,8.iPSCは細胞リプログラミング技術のマイルストーンであり、細胞移植の大きな可能性を秘めています。しかし、不完全に分化した細胞からの腫瘍形成のリスクについては、依然として懸念がある。細胞移植のための代替細胞源は、不安定な中間体から導き出すことができる誘導神経幹細胞(iNSC)などの直接リプログラミングを通じて得られた系統コミット成人幹細胞であり、多能性をバイパスするステージ9,10,11.
iPSCとiNsCの両方は、線維芽細胞、末梢血単核細胞(PBMcNC)および様々な他のタイプの細胞12、13、14などの自家細胞源から再プログラムすることができ、したがって、移植細胞の免疫原性を大いに高める。さらに、iPSCと比較して、iNSCは腫瘍形成および系統コミット可塑性のリスクが減少し、ニューロンおよびグリア11に区別することができるだけである。初期研究では、ヒトまたはマウスのiPSCおよびiNSCは、侵襲的処置14、15である皮膚生検から得られた線維芽細胞から生成された。これに関して、PBMNCは、侵襲性の低いサンプリングプロセスのため魅力的なスターター細胞源であり、拡張時間16の短い期間内に多数の細胞を得ることが容易である。初期のリプログラミング研究では、レンチウイルスベクターやレトロウイルスベクターなどの統合デリバリーシステムを採用し、多くのタイプの細胞で効率的かつ簡単に実装できます17;しかしながら、これらの送達システムは、残留トランスジーンの変異および再活性化を引き起こす可能性があり、これは臨床治療目的12の安全性問題を提示する。センダイウイルス(SeV)は、宿主ゲノムに統合されない負感のある一本鎖ゲノムを持つ非統合型RNAウイルスであるが、感染細胞の細胞質中にのみ複製し、リプログラミングのための効率的で安全な手段を提供する18 、19.組換えSeVベクトルは、オープンリーディングフレームにヒトOCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCを含む再プログラミング因子を含む利用可能です。 さらに、SeVウイルスベクターは、温度感受性変異を導入することによってさらに改善することができ、培養温度が39°C20に上昇したときに迅速に除去することができる。この記事では、SeV システムを使用して PBMC を iNsC に再プログラムするプロトコルについて説明します。
多くの研究は、様々な方法を使用してヒトESCまたはiPSCからDAニューロンの誘導を報告しています 6,8,21.しかし、iNSCからのDAニューロンの分化を詳細に説明するプロトコルが不足しています。このプロトコルでは、2段階法を用いてiNSCからのDAニューロンの効率的な生成について述べた。DAニューロン前駆体は、安全性および有効性評価のためのPDマウスモデルの線条体に移植することができる。本稿では、仙台ウイルスによる誘導神経幹細胞の生成、DAニューロンへのiNSCの分化、マウスPDモデルの確立、DA前駆体の線条体への移植まで、様々な段階をカバーする詳細なプロトコルを紹介する。PDモデルの。このプロトコルを使用して、患者や健康なドナーからiNSCを生成し、細胞移植の目的のために安全、標準化、スケーラブルで均質なDAニューロンを導き出したり、皿の中でPDをモデル化したり、メカニズムの調査を行うことができます。根本的な病気の発症と発症。
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Protocol
すべての手続きは、制度的な人間研究倫理委員会のガイドラインに従わなければならない。インフォームド・コンセントは、採血前に患者または健康なボランティアから得る必要があります。このプロトコルは、機関の人間研究倫理委員会によって承認され、動物のケアと使用のための機関のガイドラインに従って行われました.
1. PBMNCの収集、隔離、拡張
- PBMNCのコレクション
- ヘパリン防腐剤バイアルで静脈穿刺することにより、ドナーの末梢静脈血の10-20 mLを収集します。
注:血液サンプルは室温(RT)で保存または出荷する必要があります。24時間以内に血液サンプルを処理します。
- ヘパリン防腐剤バイアルで静脈穿刺することにより、ドナーの末梢静脈血の10-20 mLを収集します。
- 培養培地の調製
- 以下の成分を組み合わせて血清フリー培地(SFM)を調製:イコーブの改変ダルベッコ培地(IMDM)の245mL、ハムのF-12の240mL、インスリン-トランスフェリンセレン-Xサプリメント(ITS-X)の5mL、100倍のグルタミンストック溶液の5mL(表材料は、化学的に定義された脂質濃縮物の5mL、胎児ウシ血清の2.5g、アスコルビン酸の0.025gおよび1-チオグリセロールの9μLである。培地をろ過し、4°Cに保存します。
注意: アスコルビン酸と1-チオグリセロールは、皮膚接触と吸入によって有毒です. - 単核細胞(MNC)培地を調製するには、SFM培地を10ng/mLヒトインターロイキン3(IL-3)、2 U/mLエリスロポエチン(EPO)、100ng/mLヒト幹細胞因子(SCF)、40ng/mLヒトインスリン様成長因子1(IGF-1)、100gμ/mLホロを補うμM デキサメタゾン培地をろ過し、4°Cに保存します。
注: 使用する直前にメディアを準備します。
- 以下の成分を組み合わせて血清フリー培地(SFM)を調製:イコーブの改変ダルベッコ培地(IMDM)の245mL、ハムのF-12の240mL、インスリン-トランスフェリンセレン-Xサプリメント(ITS-X)の5mL、100倍のグルタミンストック溶液の5mL(表材料は、化学的に定義された脂質濃縮物の5mL、胎児ウシ血清の2.5g、アスコルビン酸の0.025gおよび1-チオグリセロールの9μLである。培地をろ過し、4°Cに保存します。
- PBMNC の分離
- 使用前にきれいなベンチを紫外線殺菌する。75%のアルコールですべての表面および装置を殺菌する。オートクレーブを使用してすべてのヒントを殺菌します。
- 末梢血(PB)を50mL円錐管に移し、無菌ダルベッコのリン酸緩衝生理食生(D-PBS)の等容積でPBを希釈する。
- 殺菌密度勾配媒体(材料のテーブル)の15 mLを別の50 mL円錐形の管に準備する。
注: PBMNC をより良く分離できるように、密度グラデーションメディアとPBをRTに保持します。 - 密度勾配媒体を含む円錐管を45°の角度で傾け、その後、ゆっくりと慎重に30 mLの希釈PBを密度勾配媒体に置きます。
注:注意して、PBがゆっくりと密度勾配中層に円錐管の側面を実行できるようにします。赤血球は管の底に沈着するレイヤインターフェイスの中断を最小限に抑えるためにチューブを慎重に傾けます。 - 遠心ブレーキを「オフ」位置に設定したRTで800 x gのチューブを15分間遠心分離します。黄色、上部プラズマ層を吸引し、それを破棄します。次に、10 mLピペットでMNCを含む白い曇り薄膜層を新しい50 mL円錐管に移します。
注:遠心ブレーキを切り替えるには、MNCの分離に重要です。 - MNCと遠心分離機でチューブに30 mLのD-PBSを加え、600 x gで4°Cで10分間使用します。上清を廃棄し、45 mLのD-PBSを加えて細胞を再懸濁させる。4°Cで10分のための400 x gの遠心分離機。
注:遠心ブレーキは、これと次の遠心分離ステップのためにオンにする必要があります。細胞ペレットが密集しているので、D-PBSの1-2 mLを加えてペレットを穏やかに再中断し、次に45 mLにD-PBSを加えます。 - 上清を廃棄し、D-PBSの5 mLで細胞を再懸濁し、トリパンブルー排除法で生細胞をカウントします。
- 拡張に必要な MNC を脇に置いた後、残りのセルをフリーズして将来使用します。
注:少なくとも5 x 106 MNCは凍結媒体の1 mL(材料のテーブル)の1つのバイアルで凍結することができる。プロトコルはここで一時停止できます。
- MNCの拡大
- 14日目に、予温められた(37°C)MNC培地の1.5 mLの6ウェルプレートの1つの井戸で1ミリリットル当たり2-3 x 106細胞の密度でMNCを種子。37°C、5%CO2で2日間インキュベートします。
- 11日目に、殺菌されたピペットで細胞と培地を収集し、新しい15 mL円錐形チューブに移します。RTで250 x gで細胞を遠心分離し、上清を廃棄し、予め温められた(37°C)MNC培地の1 mLで細胞を再懸濁する。
- トリパンブルーで実行可能なセルをカウントします。予め温められたMNC培地で1ミリリットル当たり1x106細胞の密度でMNCを播種し、37°C、5%CO2で3日間インキュベートする。
注:11日目には、細胞の総数が減少する可能性があります。 - 8日目にステップ1.4.2-1.4.3を繰り返し、細胞を3日間培養する。
- 4日目に、ステップ1.4.2-1.4.3を繰り返し、細胞を3日間培養する。
注: 14 日間のカルチャの後、同等以上の数の MNC がカルチャに残る必要があります。
2. SeV感染によるiNsCへのPBNCの再プログラミング
- 溶液・培養培地の調製
- 1mg/mLの濃度にH2 Oの100 mLでPDLの100mgを溶解することにより、ポリD-リジン(PDL)ストック溶液を調製する。-20 °Cを1mLのアリコートで保存します。
- 0.01 N HClの20mLに100mgのインスリンを5mg/mLの濃度に溶解することによりインスリンストック溶液を調作する。-20 °Cを1mLのアリコートで保存します。
- iNSC基底培地の200mLを調製するには、DMEM-F12の96mLと96mLの塩基性培地(材料表)と100倍グルタミンストック溶液の2mL、非必須アミノ酸(NEAA)の2mL、N2サプリメント2mL、B27サプリメント2mLを組み合わせます。10 ng/mL組換えヒト白血病阻害因子、3 μM CHIR99021および2 μM SB431542を使用前に追加します。培地をろ過し、4°Cに保存します。
注:2週間以内に媒体を使用してください。組換えヒト白血病阻害因子、CHIR99021およびSB431542を使用直前に添加する。
- SeV感染によるINSCへのPBMCのリプログラミング
- 使用前にきれいなベンチを紫外線殺菌する。75%のアルコールですべての表面および装置を殺菌する。オートクレーブを使用してすべての先端を殺菌します。
- 0日目に、MNC培地で細胞を集め、15 mL円錐管に移す。細胞を200 x gで5分間遠心分離し、上清を吸引し、予め温められたMNC培地の1 mLで細胞を再中断する。
- トリパンブルーで実行可能なセルをカウントします。予温められた(37°C)MNC培地で細胞を24ウェルプレートでウェル当たり2 x 105細胞の濃度に再び中断する。
- -80 °Cの貯蔵からSeV管を取り除き、37°Cの水浴でSeVを含むチューブを5〜10sで解凍し、RTで解凍できるようにします。解凍したら、すぐに氷の上に置きます。
- ヒトKlf4、10月3/4、SOX2およびc-MyCをウェルに10の多重感染(MOI)でエンコードするSeVを追加する。細胞の付着を容易にするために1,000 x gの1,000 x gのプレートを持つ遠心分離機の細胞。細胞と上清をプレートに残します。プレートをインキュベーターに37°C、5%CO2に置きます。
注意:SeVに関するすべての手順は安全キャビネットで行う必要があり、すべての先端およびチューブは処分前にエタノールまたは漂白剤で処理する必要があります。 - 1日目に、培地と細胞を15mL遠心管に移します。MNC培地の1mLで井戸をすすいで下します。200 x gでセル懸濁液を5分間遠心分離し、上清を吸引し、24ウェルプレートで500μLの新鮮な予温められたMNC培地で細胞を再懸濁します。
注:PDL/ラミニンにめっきする前に、任意の細胞の付着を防ぐために、低アタッチメント24ウェルプレートを使用してください。 - 2日目に、D-PBSの19 mLで1mg/mL PDLの1mLを50μg/mLの濃度に希釈する。RTで少なくとも2時間の50 μg/mL PDLで6ウェルプレートをコーティングします。
- D-PBSの20 mLで0.5mg/mLラミニンの200 μLを5μg/mLの濃度に希釈します。6ウェルプレートにPDLを吸引し、垂直クリーンベンチで乾燥させます。
- 5 μg/mLラミニンで6ウェルプレートをコーティングし、37°Cで4-6 hのインキュベートします。使用前にD-PBSで洗い流してください。
- 3日目に、PDL/ラミニンコーティングされた6ウェルプレート上のiNSC培地でステップ2.2.6で得られたトランスメ下細胞をプレート化する。
注:細胞がPDL/ラミニンコーティングされたプレート上に置かれた後、細胞の付着を妨げないように、必要に応じてプレートを穏やかに動かします。 - 5日目には、6ウェルプレートに各ウェルに予め温めた(37°C)iNSC培地を1mL加えます。
注:細胞は劇的な死(>60%)を受けることが予想されます。 - 7日目には、6ウェルプレートに各ウェルに予め温めた(37°C)iNSC培地を1mL加えます。
- 9日目から28日目まで、使用済み培地を毎日新鮮な予温め(37°C)iNSC培地に置き換えます。iNSC コロニーの出現を監視します。約2〜3週間で拡張のためのiNSCクローンをピックして転送します。焼かれたガラスピペットを使用して適切な形態を持つコロニーをピックアップし、汚染細胞を除き、200 μLの先端でコロニーを吸引します。
注:特徴付けられたiNsCは1つのバイアルの2-5コロニーとの将来の使用のために凍結することができる。凍結培地には、血清フリー基底培地(材料表)とジメチルスルホキシドを9:1の比率で混合し、使用直前に調製する必要があります。プロトコルはここで一時停止できます。
3. ドーパミン作動性ニューロンへのiNSCの分化
- 溶液・培養培地の調製
- DMEM-F12の192mLを100倍グルタミンストック溶液の2mL、NEAAの2mL、N2サプリメントの2mL、B27サプリメントの2mLを組み合わせて200mLのiNSC分化基底媒体を調製する。
注:2週間以内に媒体を使用してください。 - iNSC分化段階I培地を1μM SAG1及び100ng /mL FGF8bでiNSC分化基底媒体を補記して調記する。
注:2週間以内に媒体を使用してください。 - iNSC分化段階II培地を0.5mM環状アデノシン一リン酸(cAMP)、0.2mMアスコルビン酸、10μM DAPT、10 ng/mL脳由来神経栄養因子(BDNF)、10ng/mLグリアル由来で補うiNSC分化期II培地を調べニュートフロン症因子(GDNF)および1 ng/mL形質転換増殖因子βIII(TGF-βIII)。
注:2週間以内に媒体を使用してください。
- DMEM-F12の192mLを100倍グルタミンストック溶液の2mL、NEAAの2mL、N2サプリメントの2mL、B27サプリメントの2mLを組み合わせて200mLのiNSC分化基底媒体を調製する。
- 文化料理のコーティング
- 使用前にきれいなベンチを紫外線殺菌する。75%のアルコールですべての表面および装置を殺菌する。オートクレーブを使用してすべての先端を殺菌します。
- PDLコーティングの場合、細胞を再めっきする少なくとも1日前に、D-PBSの19 mLで1mg/mL PDLの1mLを50μg/mLの濃度に希釈する。コート12ミリメートルガラスカバーリップは、少なくとも2時間RTで50 μg/mL PDLと24ウェルプレートで75%アルコールで殺菌されたスリップ。
- ラミニンコーティングの場合は、0.5mg/mLのラミニンを20mLのD-PBSで5μg/mLの濃度に希釈します。PDLを吸引し、きれいなベンチで井戸を乾燥させます。12 mm カバースリップを 5 μg/mL ラミニンでコーティングし、37 °C で 4-6 h のインキュベートします。使用前にD-PBSで洗い流してください。
- 分化のための通過細胞。
- 培養iNSCの合流が70〜90%に達すると、培養プレートから培地を吸引し、1mLのD-PBSを加えて細胞を洗浄する。予め温めた(37°C)細胞解離試薬(材料の表)をウェルごとに1mL加え、37°Cで3分間インキュベートして細胞を解離します。
- 3分間のインキュベーションの後、細胞は半浮遊している。予め温められた(37°C)DMEM-F12培地をウェル当たり3mL加え、ピペット細胞を上下に加えて細胞ペレットを単一細胞に解離させる。
- 細胞を15mL円錐管に移し、250 x gで3分間遠心分離機を上清を吸引し、細胞数に応じて予め温めた(37°C)iNSC培地の適切な体積で細胞を再中断する。
- トリパンブルーの除外方法を使用してセルをカウントします。24ウェルプレートで12mmガラスカバーあたりプレート5 x 103セルを滑り、37°C、5%CO2でインキュベートします。
- ドーパミン作動性ニューロンに iNSC を区別します。.
- 細胞をPDL/ラミニンコーティングされたカバーリップに再めっきした後、24時間分化を開始します。吸引培地培地を、D-PBSで細胞を1回洗浄し、次いで24ウェルプレートに1回の温め前分化段階I培地を加え、37°C、5%CO2でインキュベートする。
- 分化の最初の段階で、1日目から10日目まで毎日媒体を変更します。
- 10日目に培養培地を吸引し、D-PBSで細胞を1回洗浄する。24ウェルプレートに600μLの予温め(37°C)分化段階II培地をウェル当たり追加し、37°C、5%CO2でインキュベートします。
- 分化の第2段階では、11日目から25日目まで1日おきに媒体を変更します。分化した細胞は、分析のために異なる時点でパラホルムアルデヒドによって固定することができる。
- 免疫蛍光染色の場合は、分化11~25日目内に選択した時点でD-PBSで細胞を3回穏やかに洗浄する。
- ピペット300μLのニオニオン界面活性剤(材料表)をPBSの100mLにして、PBSで0.3%のニオニオン界面活性剤を作ります。
注意:ニオニオニック界面活性剤は、皮膚接触および吸入によって有毒である。 - RTで10分間4%のパラホルムアルデヒドで細胞を固定します。その後、PBSで0.3%で3回洗浄します。
注意:パラホルムアルデヒドは、皮膚の接触と吸入によって有毒です。 - RTで2時間3%ロバ血清で細胞をブロックします。
- 一次抗体を適切な濃度で1%ロバ血清で希釈し、穏やかに混合する。24ウェルプレートの各ウェルに一次抗体溶液の300μLを添加する。細胞を一晩4°Cでインキュベートする。PBSで0.3%のニオニオン界面活性剤で細胞を3回洗浄する。
- 適切な濃度で1%ロバ血清で二次抗体を希釈し、穏やかに混合するトリチュレート。24ウェルプレートの各ウェルに300μLの二次抗体溶液を添加する。光から保護された2時間RTで細胞をインキュベートする。
- PBSで0.3%のニオニオン界面活性剤で細胞を3回洗浄する。希釈 4',6-ジアミド-2-フェニリンドール (DAPI) 1:500 希釈を伴う PBS を使用します。光から保護されたRTで15分間希釈DAPIの300 μLで24ウェルプレートの各ウェル内の細胞をインキュベートします。PBSで0.3%のニオニオン界面活性剤で細胞を3回洗浄する。
- 鉗子でプレートの井戸からカバーリップをそっと取り出します。RT.蛍光顕微鏡下で一晩暗く乾燥します。
4. 一方的な6-ヒロキシドパミン(6-OHDA)病変PDマウスモデルの確立
- 細胞移植のためのPDマウスモデルを生成するには、6-OHDA注射のために20〜25gの重さの成人男性SCIDベージュマウスを使用する。
- 手術用薬剤の調製
- 殺菌生理食塩水の0.2gを100mLの殺菌生理食塩水(0.9%)に溶解することにより、0.2%のアスコルビン酸溶液を調出す使用するまで-80°Cで保管してください。手術当日、0.2%のアスコルビン酸溶液を10倍希釈し、0.02%のアスコルビン酸溶液を得た。
注:アスコルビン酸は、不活性形態に6-OHDAの酸化を防ぐために添加されます。 - 6-OHDA溶液を調製するには、6-OHDAの適量を殺菌した1 mLチューブに加え、0.02%のアスコルビン酸を加えて5μg/μL 6-OHDA溶液を作ります。溶解するまで混合物を渦。使用するまで氷の上に6-OHDAを置く。
注:6-OHDAは温度および光に敏感である。溶液を光から保護し、使用前に氷の上に保管するように注意してください。
- 殺菌生理食塩水の0.2gを100mLの殺菌生理食塩水(0.9%)に溶解することにより、0.2%のアスコルビン酸溶液を調出す使用するまで-80°Cで保管してください。手術当日、0.2%のアスコルビン酸溶液を10倍希釈し、0.02%のアスコルビン酸溶液を得た。
- 手術前にオートクレーブによって殺菌された外科装置を準備する。ステレオタックスフレームを設定する際は、エタノールですべての機器と表面領域を清掃してください。暖房ランプの下にマウス回復ケージを設定します。
- 一方的な6-OHDA病変マウスモデルを確立するための手術を行う。
- 各マウスの重量を量り、体重を記録し、投与する必要がある薬物の量を計算します。各マウスは、手術の20分前に0.5 mg/kgのアトロピンを受け取ります。80 mg/kg ケタミンと 10 mg/kg キシラジンでマウスを麻酔する.
- 精米注射による 0.5 mg/kg アトロピンを投与します。.
- アトロピンの投与後20分で80mg/kgケタミンと10mg/kgキシラジンでマウスを麻酔する。
- マウスを閉じた部屋に入れてください。3-5分後、マウスは後ろ足のピンチに応答することなく深く麻酔されます。
注:麻酔を受けたマウスは興奮期間を経験することが予想されます。 - マウスの頭部を剃り、角膜潰瘍の発症から保護するためにマウスの目にエリスロマイシン目のチントを適用します。
- マウスを立体装置の上に置きます。最初に切り傷バーでマウスを固定します。イヤーカップを正しく挿入して、マウスヘッドを平らで安全な位置にします。
- ポビドネヨウ素とイソプロピルアルコールでマウスの頭部を殺菌します。頭の皮に矢状切開(約1.5cm)をメスブレードで切り取り、頭蓋骨を露出させる。切開部バーとイヤーバーを調整して、ブレグマとラムダの高さの差を0.1mm未満に減らします。
注:マウスブレグマは、冠状動脈縫合糸と矢状縫合糸の交点に位置し、ラムダはラムドイドと矢状縫合糸の交点にあります。 - ゆっくりとブレグマに向かって針の先端を動かして下げ、ブレグマをゼロ点として扱います。先端を A/P +0.5 mm、M/L -2.1 mm の座標を持つ位置に移動します。先端を引き込み、ポイントをマークします。頭蓋骨に小さな穴を開けて
- 5 μg/μL 6-OHDA溶液の2 μLをマイクロシリンジ(材料の表)に抽出します。針をマークした点に戻し、針をD/V -3.2 mmに挿入します。
- 5 μg/μL 6-OHDA 溶液の 2 μL を 1 μL/分の速度で注入します。6-OHDAの注入が完了した後、別の5分間所定の位置に針を残します。その後、注射針をゆっくりと引き込みます。
- 縫合糸で切開を閉じ、マウスの目にエリスロマイシン目の斑点を適用します。脱水を防ぐために皮下に0.5mLの生理食水を提供し、縫合された皮膚に直接抗生物質の防血を適用する。
- 立体装置からマウスを取り出し、回収ケージに入れます。マウスを戻し、意識を取り戻すまで食べ物と水へのアクセスを許可します。2-3日間の飲料水の毎日の手術後に鎮痛薬でマウスを治療し、イブプロフェンの推奨投与量は1日あたり0.03mg/gの体重です。
- 手術後の毎日のマウスを検査します。
5. 一方的な6-OHDA病変後の行動評価
- 手術後2~3週間、PD症状を推定する行動評価を行う。各マウスの重量を量り、体重を記録し、投与すべき薬物の量を計算する(評価前に0.5 mg/kgアポモルフィン)。
- 評価の前に皮下注射で0.5mg/kgのアポモルヒネを投与し、マウスをガラスシリンダーに入れます。
- 5分間の居住期間の後、1分あたりの病変側に対する反対側およびipsial回転の数をカウントし、ビデオカメラでその活動を記録する。
- 反対のマイナスipsial回転>7 rpm/minを有するマウスは、正常に病変化され、細胞移植実験の候補として選択される。30分の休息後にマウスをハウジングケージに戻します。
注:マウスが正常に病変された場合、6-OHDA注入マウスは、DAアゴニストが主に病変側の超敏感転逸線を活性化するので、反対側に向かってより大きなバイアスを示す。 - 細胞移植後1週間前および2、4、6、8、12、16週前に行動評価を行う。
6. DA前駆体の細胞移植
- 移植のための細胞懸濁液を準備します。細胞生着の場合、D10とD13 DA前駆体を混合した2 x 105 DA前駆体を、移植バッファーのバランス塩溶液(材料表)における5gL-1グルコースの4μLの1:7の割合で中断する。
- セクション4.4に記載の手順に従って細胞移植手術を行い、6-OHDAがDA前駆体細胞懸濁液またはバッファーに置き換えられることを除く。
- 第5項に記載の手順に従ってDA前駆体の細胞移植後16週後に行動評価2、4、6、8、12、16週を行う。1 分あたりの病変側に対するアポモルフィン誘発逆側回転の数をカウントし、ビデオ カメラでその活動を記録します。
注:移植後、反対の回転の減少率は、改善された運動機能を示唆しています。 - 細胞移植後4,8,12,16週後に,マウスの体が硬くなり,マウスの肝臓が青くなるまで4%のパラホルムアルデヒドで深い麻酔下でマウスを透過する。
- マウスの脳を穏やかに分離し、一晩4°Cで4%パラホルムアルデヒドに脳を入れます。
- 2日目に、脳が底に沈むまで脱水のために30%のスクロースに脳を入れます。
- 凍結マイクロトームを使用して、40 μmの厚さで脳をスライスします。
- 前述の手順 3.4.5-3.4.12 で説明したように免疫染色を実行します。
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Representative Results
ここでは、PDモデルを治療するためのiNSC-DA細胞療法の異なる段階をカバーするプロトコルを報告する。まず、PBMNCを単離して拡張し、SeV感染によりiNsCに再プログラムした。PBMNC 拡張および iNSC 誘導を使用した手順の概略図を図1に示します。14日目、PBMNCは密度勾配媒体(材料の表)を用いて単離した。遠心分離の前に、PBSと密度勾配媒体で希釈した血液を2層に分離した。遠心分離の後、4つの勾配層が現れた(下から上へ):下層には顆粒球と赤血球が含まれていた。2番目の層には密度勾配媒体が含まれていました。3 番目の含まれている PBMNC (赤い矢印);最上層には血小板が豊富な血漿が含まれていた(図2A)。拡大の14日後、PBMNCは0日目としてSeVに感染した。1日目に、SeVを含む培地を除去した(図2B)。図2Bに示すように、細胞数が徐々に減少することが期待される。細胞は劇的な死を遂げました (>60%)5日目まで(図2B)。iNSCコロニーは、最も早い12日目に出現した(図2B)。多数の通路の拡張のためにiNSCクローンをピッキングして転送した後、細胞の形態を図2Cに示す。iNSCは良好な形態を示し、単層形態または球体としてiNSC培地で安定的に自己更新することができた(図2C)。
iNSCは、2段階の方法を用いてDAニューロンを生み出す可能性がある(図1)。10日間続いた第1段階において、iNSCをSAG1およびFGF8bで処理し、神経原性電位を有するVM床板細胞の仕様を誘導した。次いで、細胞をアスコルビン酸、BDNF、GDNF、cAMP、DAPT、TGF-βIIIを第2段階で処理した(図1)。この2段階法では、第1段階の終わりに向かってDA前駆体を得ることができ、第2段階の終わりにより成熟したDAニューロンが生成される可能性があります。24日間の分化の後、iNSCは、フォークヘッドボックスA2(FOXA2)、ニューロン特異的クラスIIIβ-チューブリン(TUJ1)およびチロシンヒドロキシラーゼ(TH)を発現するそれらの大部分としてDAニューロンに効率的に指定することができました(図3)。
一方的な6-OHDA病変PDマウスモデルの確立から3週間後、PD症状を推定する行動評価を行った(図4A)。そして1週間後、ドーパミン作動性前駆体をPDマウスモデルに移植した(図4A)。行動評価は、細胞移植後1週間前および2、4、6、8、12週前に行った(図4A)。細胞移植を受けたマウスは運動機能に有意な改善を示した(図4B)。6-OHDA誘発病変の程度は、線条体におけるTHの死後免疫蛍光染色、中間前脳束(MFB)およびSNpc(図4C)によって確認することができる。生着したマウスのTH陽性シグナルは、細胞が移植され、SNpcで軽度に回収された線条体で大きく回収された(図4C)。移植後3ヶ月、生存細胞中のTH+DAニューロンは約13.84%であった(図4D,E)。TH+細胞の約91.72%および86.76%が、それぞれ孤児核受容体(NURR1)およびFOXA2を発現した(図4D,E)。TH+細胞の約98.77%をGタンパク質結合内直腸カリウム(GIRK2)と共標識した(図4D,E)。
図 1: PBMNC拡張、iNSC誘導およびDA前駆体へのiNSCの分化に関する手順の概略表現。PBMNCはMNC培地で14日間にわたって単離および拡張され、その後、ヒトSOX2、OCT3/4、c-MYCおよびKLF4をコードするSeVに感染した。iNSCコロニーは、SeV感染後早くも12日後に出現した。3〜4週間後、iNSCコロニーを採取し、2段階の方法によりDA前駆体に分化した。PBMNC: 末梢血単核細胞;MNC: 単核細胞;iNSC: 誘導神経幹細胞;SeV: 仙台ウイルス;DA: ドーパミン作動性;PDL: ポリD-リジン;BDNF: 脳由来神経栄養因子;GDNF: グリア細胞株由来神経栄養因子;AA: アスコルビン酸;cAMP: ジブチルリラデノシンサイクリック単リン酸;TGF: 成長因子の変換.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: PBMcNC は単離および拡張され、SeV 感染によって iNsC に再プログラムされます。(A) 勾配遠心分離の前後の PBMNC の例。遠心分離の前に、希釈された血液試料と密度勾配媒体を2層に分離した。遠心分離後、下から上に形成された4つの密度勾配層:下層には顆粒球と赤血球が含まれていた。2番目の層には密度勾配媒体が含まれていました。3 番目の層には PBMNC (赤い矢印) が含まれていました。最上層には血小板が豊富な血漿が含まれていた。(B) PBMNCが1日目、2日目、5日目、12日目にSeVに感染した後の細胞の典型的な形態の画像。PBMNCがSeVに感染した後、一部の細胞が死亡し、細胞数は徐々に減少した。5日目に少数の細胞が残った。12日目、iNSCコロニーが出現した。スケールバー、100 μm。(C)単層および球培養における通路数20のiNSCの典型的な形態。スケールバー、100 μm。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: ドーパミン作動性ニューロンに対するiNSCの分化FOXA2、TH、TUJ1、DAPIおよびiNSCから分化した細胞上の24日目の画像をマージした免疫蛍光染色。スケールバー、50 μm。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: iNSC分化DA前駆体を一方的な6-OHDA病変PDマウスモデルに移植する。(A) 細胞移植と行動試験のタイムライン(B) 6-OHDA+セル群(n=10)、6-OHDA+バッファー群(n=8)および対照群(n=3)とは異なる時点での行動試験の結果。データは平均±標準誤差(SEM)として提示される。p < 0.001 ダンネットの多重比較検定による分散(ANOVA)の双方向分析による。(C)線条体におけるTHに対する死後免疫蛍光染色、6-OHDA-ライジョン半球の中間前脳束(MFB)および実体ニグラ(SN)、6-OHDA+細胞半球、および対照群。スケールバー、100 μm。(D) 移植3ヶ月後の移植マウスにおけるFOXA2/TH、NURR1/TH、GIRK2/TH、TH/HNAの割合。HNA:ヒト核抗体。データは、細胞移植後12週後にPDマウスから脳スライス上のFOXA2、NURR1、GIRK2、THおよびHNAに対する平均±SEM.(E)免疫蛍光染色として提示される。HNA:ヒト核抗体。この数字は元ら11から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、PDモデルに対するiNSC-DA細胞療法の異なる段階をカバーするプロトコルを紹介した。このプロトコルの重要な側面は、(1)PBMNCの単離と拡大、SeV感染によるiNSCへのPBNCのリプログラミング、(2)INSCとDAニューロンの分化、(3)一方的な6-OHDA病変PDマウスモデルと行動の確立DA前駆体の細胞移植および行動評価
このプロトコルでは、最初の部分は、優先的にエリスロブラストを拡張し、リンパ球増殖をサポートしない血清フリー培地(MNC培地)でPBNCを収集し、拡大することを含む。以前の研究では、いくつかの体細胞タイプは、iPSCまたはiNSC12、13、14に再プログラムされています。他のタイプの体細胞と比較して、PBMNCにはいくつかの利点があります。最も重要な利点は、彼らの有利な遺伝子発現パターンおよびエピジェネティックプロファイルである。PBMNCは生体内で短命であり、活性化造血幹細胞から頻繁に補充され、皮膚線維芽細胞よりも少ない変異を蓄積することがある。また、PBMNCをサンプリングする方法は、線維芽細胞に比べて侵襲性が低く、PBMNCを拡張するのに短い時間(約14日)対線維芽細胞(約28日)16、22を要する。密度勾配媒体を使用して遠心分離した後、4つの密度勾配が下から上に形成されます。下層は顆粒球と赤血球を含み、第2下層は密度勾配媒体を含み、第3層はMNCを含み、最上層はプラズマを含む。PBMNCの収量は、通常、個人、特に異なる年齢の人によって異なります。一般的に、若い人は高齢者よりもPBMCの数が多い傾向があります。記載されたプロトコルでは、約1.8−3.4 x 107 PBMNCを15mLのPBから単離することができる。PBMNCの中でも、CD34+造血幹細胞は比較的リプログラミングを起こしやすく、MNC培地はCD34+造血幹細胞をある程度濃縮する可能性があります。MNC培地で培養した可視細胞の数は、14日後に残ることが予想される。RNA非統合型ウイルスであるSeVは、宿主ゲノムに統合されない負感、一本鎖、非セグメントゲノムを有するが、感染細胞18、19の細胞質中にのみ複製する。組換えSeV符号化リプログラミング因子OCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCは、39°C20で容易に除去することができる温度感受性変異体として生成することができる。このプロトコルでは、15 mLのPBを使用して1人の健康なボランティアまたは患者からPBMNCを再プログラミングすることにより、8-20 iNSCコロニーを導き出しました。その後、研究者は、さらなる通過とライン確立のための良好な形態を持つコロニーを選択することができました。公表された報告書では、通路番号10、20、および30のiNSCは同様の増殖率を示し、50回以上通過することができ、良好な自己再生および増殖能力11を示した。iNSCは、神経幹細胞マーカーSOX2、PAX6、NESTINおよびOLIG2、および増殖マーカーKi67の分化アッセイおよび免疫染色によって特徴付けることができる。iNSCは、これらの神経幹細胞マーカーを発現し、TUJ1 +、MAP2+ニューロン(6週間後)、GFAP+アストロサイト(6週間後)およびOLIG2 +、O1+になる分化能力を有する必要がありますオリゴデンドロサイト (7-8週間後)11.しかし、このプロトコルの1つの制限は、MNC培地がエリスロプラスト拡張に好ましく有利であり、紅斑形成の発症に欠乏している患者からiNSCを生成するのに適さない可能性がある。また、PBMNCをiNsCに再プログラミングする効率は高くない。1つは、特定の小分子を使用するか、より多くの開始PBMNC23を使用して収率を増加させることによって、再プログラミング効率を高めることができる。
ここで説明するDAニューロンへのiNSCの分化に関する方法は、神経分化のための多数のプロトコルに基づいている。PDは主に中脳1、2に位置するDAニューロンの変性によって引き起こされるので、プロトコルの目的は、開発24の間に床板細胞から生じる特殊なVM DAニューロンの誘導に焦点を当てている。神経原性電位を持つVM床板細胞の誘導は、SHHおよびFGF8b6、25、26の2つの主要形態素に依存する。SHHは、ノトコード26、27によって分泌される腹部モルフォゲンである。ここでは、SHHをSHHよりも経済的なSHH経路であるSAG1に置き換えた。また、基本的な神経培養培地とサプリメント(材料の表)は、神経の生存と分化のために重要です。このプロトコルでは、第1段階の終わりに向かってDA前駆体が得られ、第2段階の終わりにより成熟したDAニューロンが生成された。第2段階の期間を40〜55日に増やすことは、培養における成熟したDAニューロンの割合をさらに高めることができる。第2段階培地に含まれるのは、レチノイン酸、BDNF、GDNF、TGF-βIII、DAPTおよびcAMPであり、DAニューロンの成熟および生存を促進できることが実証されている。DAニューロンへの分化におけるiNSCの効率を試験するために、分化細胞はNURR1、FOXA2、GIRK2およびTHのマーカーの発現について調べた。前の研究では、ステージI(10日目)の終わりに、87.76%および65.33%の細胞がNURR1およびFOXA2を発現し、それぞれ11。第II期(24日目)の終わりに、NURR1+細胞の割合は95.58%に達し、FOXA2+細胞の割合は77.33%11に達した。 この時点で、57.23%および28.55%の細胞はTHおよびGIRK2に対して陽性であったが、それぞれ11であった。DAニューロンに対するiPSC分化に対して観察されているものと同様に、iNSC分化のためのバッチ/ライン間変動も存在し、細胞状態、使用される小分子の活性、可塑性などの要因によって影響を受ける。異なる人からの幹細胞。また、分化効率の重要な決定要因は細胞密度であることも注目に値する。24ウェルプレートの12mmガラスカバースリップあたり5 x 103セルの播種密度をお勧めします。実際、iNSCは分化段階Iの間に良好な増殖率を示す。24ウェルプレートの1つのウェルに播種されたiNSCは、1匹のマウスに移植するための分化日10−13によって十分な数のDA前駆体を生み出す(各マウスに対して2 x 10 5)。
このプロトコルは、再現性と安定した一方的な6-OHDA病変PDマウスモデルの確立のための方法を提示する。6-OHDA病変の程度は、アポモルフィンの注入後の反対姿勢の回転を測定する行動評価によって推定することができる。また、6-OHDA誘発病変の程度は、SNpcにおけるTHに対する死後免疫蛍光染色により定量することができる。PDモデリングに使用される別のタイプの神経毒は、1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テルタヒドロピリジン(MPTP)であり、これはドーパミン作動性経路も破壊する。MPTPと比較して、6-OHDAは単一または両側に投与することができる。また、MPTP法は、動物の年齢、性別および緊張に対してより敏感であり、したがって、動物28間の変動の高い程度を示しうる。重要な要因は、一致する重量を持つマウスを選択し、新たに調製された6-OHDA溶液を注入し、正確かつ迅速に手術を行うことが含まれます。
DA前駆体を病変マウスの線条体に移植する手順は、基本的に6-OHDA病変PDマウスモデルの生成手順と同じであり、6-OHDAは注射工程でDA前駆体に置き換えられることを除く。この部分の重要な要因は、移植のためのDA細胞分化の最適な時間枠を検索することです。より高い程度の幹が高い生存率と相関するが、成熟したDAニューロン11への指定の可能性が低いことが実証されている。しかし、神経細胞のより成熟した段階はより脆弱であり、移植後の生存率が低い11を示す。したがって、成熟と生存の能力のバランスをとる適切な時間枠を見つけることは重要です。前回の研究では、分化日10日目と13日目の細胞を免疫不全のSCID-ベージュマウス11の線条体に移植した。生着の1ヶ月後、免疫蛍光染色の結果は、それぞれ10日目と13日目のTUJ1陽性で約88.63%と93.13%であったことが明らかにされ、一部のTH+細胞(5.30%)が13日目群から検出されたが、10日目からTH+細胞は少なかった。それにもかかわらず、13日目の細胞と比較して、10日目の細胞はわずかに高い全体的な生存率11を生じた。結果は、10日目から13日目は、生着11のための細胞の最適な時間枠であることを明らかにした。このプロトコルでは、分化日10日目と13日目のDA細胞の混合物を生着生の1:7の割合で使用し、生存および分化11の良好な結果を示した。10日目と13日目の細胞の混合物を用いて、比較的未熟で成熟した神経細胞を組み合わせると、互いに支持し合い得る、成熟したニューロンに囲まれたマウスにおける生体内の状況を連想させるという仮説に基づいていた。
このプロトコルは、SeV感染によってPBNCからiNSCを生成し、iNSCをDAニューロンに分化し、DA前駆体を6-OHDA病変PDマウスモデルに移植する方法を提示する。このプロトコルを使用すると、PDの治療だけでなく、他の神経変性疾患の可能性を持つiNSCを生成することができます。iNSCは原始的なNSC段階を表すので、筋萎縮性側索硬化症または脊髄損傷の治療に有望な有用性を有する可能性のある、脊髄ニューロンや運動ニューロンなどの異なる領域特異的神経細胞に指定することができる。また、家族性疾患患者由来のiNSCは、疾患の発症と発症の根底にあるメカニズムを研究し、薬物スクリーニング検査を行うためのプラットフォームを提供します。
移植研究のためのDA神経細胞を得るために複数の方法があります。.DA細胞は、iPSCまたは直接変換29によって生成することもできる。iPSCと比較して、iNSCは腫瘍形成のリスクの低減、リプログラミングとライン確立の短い期間、および系統コミットされた可塑性に固有であり、ニューロンとグリア11に区別することしかできない。直接変換と比較して、DA前駆体をiNsCから区別すると、より高い収率と効率30が生じます。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、幹細胞と翻訳国家キープロジェクト(2016YFA0101403)、中国国立自然科学財団(81661130160、81422014、81561138004)、北京市自然科学財団(5142005)の助成金によって支援されました。北京タレント財団(201700021223TD03)、第13次5カ年計画(CIT&TCD20180333)、北京医療システムハイレベル人材賞(2015-3-063)の北京市立大学の高レベル教師支援プロジェクト市保健委員会基金(PXM 2018_026283_000002)、北京100、千、1万人の人材基金(2018A03)、北京市病院行政特別資金支援(ZYLX201706)、ロイヤル・ソサエティ・ニュートン・アドバンスト・フェローシップ(NA150482)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15-ml conical tube | Corning | 430052 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic for inhalation and skin contact |
| 24-well plate | Corning | 3337 | |
| 50-ml conical tube | Corning | 430828 | |
| 6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Cell dissociation reagent |
| Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A92902 | Toxic with skin contact |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | Brain derived neurotrophic factor |
| Blood collection tubes containing sodium heparin | BD | 367871 | |
| BSA | yisheng | 36106es60 | Fetal bovine serum |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dibutyryladenosine cyclic monophosphate |
| CellBanker 2 | ZENOAQ | 100ml | Used as freezing medium for PBMNCs |
| Chemically defined lipid concentrate | Invitrogen | 11905031 | |
| CHIR99021 | Gene Operation | 04-0004 | |
| Coverslip | Fisher | 25*25-2 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417-10mg | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915-100MG | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11330 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320 | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| EPO | Peprotech | 100-64-50UG | Human Erythropoietin |
| FGF8b | Peprotech | 100-25 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | P=1.077, density gradient medium |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | Glial derived neurotrophic factor |
| GlutaMAX | Invitrogen | 21051024 | 100 × Glutamine stock solution |
| Ham's-F12 | Gibco | 11765-054 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175079 | Balanced salt solution |
| Human leukemia inhibitory factor | Millpore | LIF1010 | |
| Human recombinant SCF | Peprotech | 300-07-100UG | |
| IGF-1 | Peprotech | 100-11-100UG | Human insulin-like growth factor |
| IL-3 | Peprotech | 200-03-10UG | Human interleukin 3 |
| IMDM | Gibco | 215056-023 | Iscove's modified Dulbecco's medium |
| Insulin | Roche | 12585014 | |
| ITS-X | Invitrogen | 51500-056 | Insulin-transferrin-selenium-X supplement |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | Serum free basal medium |
| Laminin | Roche | 11243217001 | |
| Microsyringe | Hamilton | 7653-01 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| NEAA | Invitrogen | 11140050 | Non-essential amino acid |
| Neurobasal | Gibco | 10888 | Basic medium |
| PDL | Sigma-Aldrich | P7280 | Poly-D-lysine |
| SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
| SB431542 | Gene Operation | 04-0010-10mg | Store from light at -20? |
| Sendai virus | Life Technologies | MAN0009378 | |
| Sucrose | baiaoshengke | ||
| TGFβ? | Peprotech | 100-36E | Transforming growth factor β? |
| Transferrin | R&D Systems | 2914-HT-100G | |
| Triton X 100 | baiaoshengke | Nonionic surfactant | |
| Trypan blue | Gibco | T10282 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 |
References
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