Summary
该协议提出了外周血单核细胞的重新编程,以诱导神经干细胞由仙台病毒感染,将iNSCs分化为多巴胺能神经元,将DA前体移植到单方面病变帕金森病小鼠模型,并评价iNSC衍生DA前体用于PD治疗的安全性和有效性。
Abstract
帕金森病 (PD) 是由心内脑素 (VM) 中基拉多巴胺能 (DA) 神经元的退化引起的。细胞替代疗法对PD的治疗大有希望。 最近,诱导神经干细胞(iNSCs)由于肿瘤形成的风险降低和可塑性增加而成为细胞替代治疗的潜在候选者。区域特定的神经元和胶质。iNSCs可以从自体体细胞源(如成纤维细胞、外周血单核细胞(PBMC)和各种其他类型的细胞)重新编程。与其他类型的体细胞相比,PBMC是一个有吸引力的起始细胞类型,因为易于访问和扩展的培养。仙台病毒(SeV),一种RNA非整合性病毒,编码重新编程的因素,包括人类OCT3/4,SOX2,KLF4和c-MYC,具有负感,单链,非分段基因组,不集成到宿主基因组,但仅在受感染细胞的细胞质中复制,为重新编程提供了高效和安全的工具。在本研究中,我们描述了一种协议,其中通过重新编程PBMC获得iNSC,并通过两阶段方法分化成专门的VM DA神经元。然后DA前体被移植到单方面的6-羟基多巴胺(6-OHDA)病变PD小鼠模型中,以评估PD治疗的安全性和有效性。该方法为研究患者特异性DA神经细胞在体外和体内的功能和治疗效果提供了一个平台。
Introduction
帕金森病 (PD) 是一种常见的神经退行性疾病,由心内脑素 (VM) 的底状尼格拉帕压实 (SNpc) 的多巴胺能 (DA) 神经元退化引起,60 岁以上人群的患病率超过 1%1,2.在过去十年中,细胞疗法,旨在取代退行性或受损的细胞,或滋养退化神经元周围的微环境,在PD3的治疗中显示出潜力。同时,重新编程技术也取得了显著进展,为替代疗法提供了有前途的细胞源。人类诱导多能干细胞(iPSCs)和胚胎干细胞(ESCs)已被证明能够分化成DA神经细胞,当移植到大鼠和非人类灵长类动物PD模型中时,这些神经细胞可以存活、成熟,并改善运动功能5 ,6,7,8.iPSC是细胞再编程技术的一个里程碑,在细胞移植方面有着巨大的潜力;然而,人们仍然担心肿瘤从不完全分化的细胞形成的风险。细胞移植的替代细胞来源是通过直接重新编程获得的系世型成人干细胞,如诱导神经干细胞(icCS),可以从不稳定的中间体中提取,绕过多能性阶段9,10,11.
iPSC 和 iNSCs 都可以从自体细胞源(如成纤维细胞、外周血单核细胞 (PBMC)和各种其他类型的细胞12、13、14)重新编程,从而减少移植细胞的免疫原性在很大程度上。此外,与iPSCs相比,iNSCs是固有的,肿瘤形成和系骨的可塑性风险降低,只能分化成神经元和胶质11。在最初的研究中,人类或小鼠iPSC和iNSCs是由从皮肤活检中获得的成纤维细胞产生的,这是一个侵入性程序14,15。在这方面,PBMNCs是一个有吸引力的起始细胞源,因为侵入性较小,并且易于在短时间内获得大量的细胞扩展时间16。初始重新编程研究采用综合输送系统,如慢病毒或抗逆转录病毒载体,这些系统在多种细胞中高效且易于实施17;然而,这些传递系统可能导致突变和残留转基因的重新激活,这提出了临床治疗目的的安全问题12。仙台病毒(SeV)是一种非整合性RNA病毒,具有负感的单链基因组,不集成到宿主基因组中,但只在受感染细胞的细胞质中复制,为重新编程提供了高效和安全的工具 ,19.可组合SeV向量,包含重新编程的因素,包括人类OCT3/4,SOX2,KLF4和c-MYC在其开放阅读帧。此外,通过引入温度敏感突变,可以进一步改善SeV病毒载体,以便在培养温度升高至39°C20时迅速去除。在本文中,我们将介绍一种使用 SeV 系统将 PBMC 重新编程到 iNSC 的协议。
许多研究已经报告从人类ESCs或iPSC衍生的DA神经元使用各种方法6,8,21。然而,在细节上描述DA神经元与iNSCs分化的协议很缺乏。在此协议中,我们将使用两阶段方法描述从 iNSC 高效生成 DA 神经元。DA神经元前体可移植到PD小鼠模型的纹状体中,用于安全性和有效性评估。本文将介绍一个详细的方案,涵盖从仙台病毒生成诱导神经干细胞,将iNSCs分化为DA神经元,建立小鼠PD模型,到将DA前体移植到纹状体的各个阶段PD 模型。使用该协议,人们可以从患者和健康捐赠者生成iNSC,并得出安全、标准化、可扩展和均匀的DA神经元,用于细胞移植目的,或用于在培养皿中建模PD和研究机制潜在的疾病开始和发展。
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Protocol
所有程序都必须遵守机构人类研究伦理委员会的指导方针。采血前必须征得患者或健康志愿者的知情同意。该协议由该机构的人类研究伦理委员会批准,并根据该机构的虐待和使用动物指南执行。
1. PBMC的收集、隔离和扩展
- PBMC 的收集
- 收集10-20 mL的供体的外周静脉血,用肝素钠防腐剂小瓶进行静脉穿刺。
注:血液样本应在室温(RT)下储存或运送。在24小时内处理血液样本。
- 收集10-20 mL的供体的外周静脉血,用肝素钠防腐剂小瓶进行静脉穿刺。
- 培养媒介的准备
- 通过组合以下成分制备无血清介质(SFM):245 mL 的 Iscove 改良 Dulbeco 介质 (IMDM),240 mL 的火腿的 F-12,5 mL 的胰岛素转移素-硒-X 补充剂 (ITS-X),5 mL 的 100x 谷氨酰胺库存溶液(表材料),5 mL化学定义的脂精,2.5克胎儿牛血清,0.025克抗坏血酸和9μL的1-硫甘油。过滤介质并将其存储在 4°C。
注意:抗坏血酸和1-硫甘油对皮肤接触和吸入有毒。 - 要制备单核细胞(MNC)介质,补充SFM介质10纳克/mL人白细胞介素3(IL-3),2 U/mL红细胞生成素(EPO),100纳克/mL人类干细胞因子(SCF),40纳克/mL人类胰岛素样生长因子1(IGF-1),100微克/mL霍洛转移素和1_M 地塞米松。过滤介质并将其存储在 4°C。
注:在使用前立即准备介质。
- 通过组合以下成分制备无血清介质(SFM):245 mL 的 Iscove 改良 Dulbeco 介质 (IMDM),240 mL 的火腿的 F-12,5 mL 的胰岛素转移素-硒-X 补充剂 (ITS-X),5 mL 的 100x 谷氨酰胺库存溶液(表材料),5 mL化学定义的脂精,2.5克胎儿牛血清,0.025克抗坏血酸和9μL的1-硫甘油。过滤介质并将其存储在 4°C。
- 多溴联苯醚的隔离
- 使用前,请对干净的工作台进行紫外线消毒。用 75% 的酒精对所有表面和设备进行消毒。使用高压灭菌器消毒所有提示。
- 将外周血 (PB) 转移到 50 mL 锥形管中,用同等体积的无菌 Dulbeco 的磷酸盐缓冲盐水 (D-PBS) 稀释 PB。
- 在另一根50 mL锥形管中制备15 mL的灭菌密度梯度介质(材料表)。
注:在RT处保持密度梯度介质和PB,以更好地隔离PBMC。 - 将含有密度梯度介质的锥形管以 45° 角倾斜,然后缓慢小心地将 30 mL 的稀释 PB 倾斜到密度梯度介质上。
注:小心,让PB缓慢地从锥形管的一侧运行到密度梯度介质层上。红血球会沉积在管的底部。仔细倾斜管,以尽量减少层界面的中断。 - 在 RT 处以 800 x g将管离心 15 分钟,将离心机制动器设置为"关闭"位置。吸出黄色,上层的血浆层,并丢弃它。然后,将含有 MN 的含有 MN 的 10 mL 移液器的白色云薄膜层转移到新的 50 mL 锥形管中。
注:关闭离心制动器对于隔离 MNC 非常重要。 - 在管中加入 30 mL 的 D-PBS,在 600 x g 下以 600 x g进行 10 分钟,在 4°C 下使用。丢弃上清液,然后添加45 mL的D-PBS来重新悬浮细胞。在 4°C 下 400 x g下离心 10 分钟。
注:本台离心制动器应为此和以下离心步骤打开。由于细胞颗粒是密集的,加入1-2 mL的D-PBS轻轻重新悬浮颗粒,然后将D-PBS添加到45 mL。 - 丢弃上清液,用5 mL的D-PBS重新悬浮细胞,用锥体蓝色排除法对活细胞进行计数。
- 在预留扩展所需的 MMC 后,冻结剩余的电池以供将来使用。
注:至少5 x 106 MNC可冷冻在一个瓶中,冷冻介质为1 mL(材料表)。可以在此处暂停该协议。
- 扩大跨国公司
- 在第14天,种子MNC的密度为每毫升2-3 x 106细胞,在一口六孔板中,预加热(37°C)MNC介质为1.5 mL。在37°C下孵育,5%CO2孵育2天。
- 在第11天,用消毒移液器收集细胞和介质,并转移到新的15 mL锥形管中。在RT下以250 x g将细胞离心5分钟。丢弃上清液,在1mL的预加热(37°C)MNC培养基中重新悬浮细胞。
- 用锥蓝色计算可行的细胞。在预加热的MNC培养基中,以每毫升1 x106细胞的密度将MNC播种,并在37°C、5%CO2下孵育3天。
注:预计在第-11天,细胞总数可能会减少。 - 在第 8 天,重复步骤 1.4.2-1.4.3 并培养细胞 3 天。
- 在第-4天,重复步骤1.4.2-1.4.3,并培养细胞3天。
注:经过14天的文化,同等数量或更多的跨国公司应留在文化中。
2. 通过SeV感染将PBMC重新编程到iNSC
- 解决方案和文化介质的准备
- 通过溶解 100 mL 的 PDL 100 mL H2O,以 1 mg/mL 的浓度,制备多 D-溶酶 (PDL) 库存溶液。储存在-20°C在1 mL等分。
- 在0.01 N HCl的20 mL中溶解100mg胰岛素,以5mg/mL的浓度制备胰岛素储存溶液。储存在-20°C在1 mL等分。
- 要制备 200 mL 的 iNSC 基础介质,请将 96 mL 的 DMEM-F12 和 96 mL 的基本介质(材料表)与 2 mL 的 100x 谷氨酰胺库存溶液、2 mL 的非必需氨基酸 (NEAA)、2 mL 的 N2 补充剂和 2 mL 的 B27 补充剂相结合。在使用前添加10纳克/mL重组人类白血病抑制因子,3μM CHIR99021和2μM SB431542。过滤介质并将其存储在 4°C。
注意:在 2 周内使用介质。在使用前加入重组人类白血病抑制因子CHIR99021和SB431542。
- 通过SeV感染对PBMC的重新编程
- 使用前,请对干净的工作台进行紫外线消毒。用 75% 的酒精对所有表面和设备进行消毒。使用高压灭菌器消毒所有提示。
- 在第0天,收集MNC培养基中的细胞并转移到15 mL锥形管中。在200 x g下将细胞离心5分钟。吸气上清液,用预加热的MNC培养基1mL重新悬浮细胞。
- 用锥蓝色计算可行的细胞。在24孔板中,用预加热(37°C)MNC培养基重新悬浮至每孔2 x 105个细胞的浓度。
- 从 -80°C 存储中取出 SeV 管后,在 37°C 水浴中解冻含有 SeV 的管 5-10 s,然后允许它们在 RT 解冻。一旦解冻,立即将它们放在冰上。
- 将SeV编码人类Klf4、Oct3/4、SOX2和c-MyC添加到井中,感染(MOI)的倍数为10。带板在1,000 x g的离心细胞30分钟,以方便细胞的附着。将细胞和上清液留在板中。将板置于培养箱中的 37°C,CO25%。
注意:所有涉及 SeV 的程序都必须在安全柜中进行,所有吸头和管在处置前均应使用乙醇或漂白剂处理。 - 在第1天,将介质和细胞转移到15 mL的离心管中。用 1 mL 的 MNC 介质冲洗油井。将细胞悬浮液在200 x g下离心5分钟。在24孔板中用500μL的新鲜预加热MNC培养基吸气,将上清液吸气,重新悬浮细胞。
注:在PDL/层宁电镀之前,使用低附件24孔板防止任何电池附着。 - 第2天,将1毫克/mL PDL稀释1mL,D-PBS浓度为19 mL,浓度为50微克/mL。在 RT 处涂上 50 μg/mL PDL 的 6 孔板,至少 2 小时。
- 用20 mL的D-PBS稀释200 μL 0.5毫克/mL层宁,浓度为5微克/mL。在 6 孔板中吸气 PDL,在垂直清洁的长凳上干燥。
- 用5μg/mL层宁涂覆6孔板,在37°C下孵育4-6小时。使用前用 D-PBS 清洗。
- 第3天,在PDL/层宁涂层6孔板上的iNSC介质中,将步骤2.2.6中获得转导的细胞板。
注:将细胞放在PDL/层宁涂层板上后,如果需要,轻轻移动板,尽量不要干扰电池的附着。 - 在第5天,在每个孔中轻轻在6孔板中加入1mL的预加热(37°C)iNSC介质。
注:预计细胞将经历剧烈死亡(>60%)。 - 在第7天,在每个孔中轻轻在6孔板中加入1mL的预加热(37°C)iNSC介质。
- 从第 9 天到第 28 天,每天用新鲜的预加热 (37 °C) iNSC 介质替换废介质。监测iNSC菌落的出现。挑选并传输 iNSC 克隆,在大约 2-3 周内进行扩展。使用燃烧的玻璃移液器,使用燃烧的玻璃移液器,去除具有适当形态的菌落,排除任何可能污染的细胞,并用 200 μL 吸头吸出菌落。
注:特征的iNSC可以冷冻,以便将来在一个小瓶中使用2-5个菌落。冷冻培养基包括无血清基础培养基(材料表)和二甲基硫酸盐混合,比例为9:1,应在使用前立即制备。可以在此处暂停该协议。
3. iNSC与多巴胺能神经元的分化
- 解决方案和文化介质的准备
- 通过将 192 mL 的 DMEM-F12 与 2 mL 的 100x 谷氨酰胺库存溶液、2 mL 的 NEAA、2 mL 的 N2 补充剂和 2 mL 的 B27 补充剂相结合,制备 200 mL 的 iNSC 分化基底介质。
注意:在 2 周内使用介质。 - 通过用1μM SAG1和100 ng /mL FGF8b补充iNSC分化基础介质,制备iNSC分化阶段I介质。
注意:在 2 周内使用介质。 - 通过补充iNSC分化基底介质,补充0.5 mM环腺苷单磷酸(cAMP)、0.2 mM抗坏血酸、10μM DAPT、10纳克/mL脑衍生神经营养因子(BDNF)、10纳克/mL胶质衍生物,制备iNSC分化II介质中营养因子(GDNF)和1纳克/mL转化生长因子+III(TGF-+III)。
注意:在 2 周内使用介质。
- 通过将 192 mL 的 DMEM-F12 与 2 mL 的 100x 谷氨酰胺库存溶液、2 mL 的 NEAA、2 mL 的 N2 补充剂和 2 mL 的 B27 补充剂相结合,制备 200 mL 的 iNSC 分化基底介质。
- 涂覆文化菜肴
- 使用前,请对干净的工作台进行紫外线消毒。用 75% 的酒精对所有表面和设备进行消毒。使用高压灭菌器消毒所有提示。
- 对于 PDL 涂层,至少在重新电镀电池前一天,将 1 mL 的 1 mg/mL PDL 稀释 19 mL 的 D-PBS,浓度为 50 μg/mL。在 RT 下用 50 μg/mL PDL 的 24 孔板中用 75% 酒精对 12 mm 玻璃盖唇进行消毒,至少 2 小时。
- 对于层宁涂层,将 200 μL 的 0.5 mg/mL 层压,与 20 mL 的 D-PBS 稀释至 5 μg/mL 的浓度。吸气 PDL,在干净的长凳中干燥水井。用 5 μg/mL 层宁涂抹 12 mm 盖玻片,并在 37°C 下孵育 4-6 小时。使用前用 D-PBS 清洗。
- 用于分化的通道细胞。
- 当培养的iNSCs的汇合达到70-90%时,从培养板上吸出培养基,并加入1mL的D-PBS来洗涤细胞。每孔加入1mL的预加热(37°C)细胞分离试剂(材料表),在37°C孵育3分钟,分离细胞。
- 孵育3分钟后,细胞变为半浮;每孔加入3mL的预加热(37°C)DMEM-F12介质,上下移液细胞将分离细胞颗粒分解到单个细胞中。
- 将细胞转移到15mL锥形管中,并在250 x g下离心3分钟。 释放上清液,根据细胞数量,用适当体积的预加热(37°C)iNSC培养基重新悬浮细胞。
- 使用锥蓝色排除方法计算单元格。板 5 x 103细胞每 12 毫米玻璃盖板在 24 孔板和孵育在 37°C, 5% CO2.
- 将 iNSCs 分化为多巴胺能神经元。
- 将细胞重新镀在PDL/层膜涂层盖玻片上后,24小时开始分化。吸气培养基,用D-PBS洗涤细胞一次,然后在24孔板中每孔加入600μL的预加热分化阶段I培养,并在37°C,5%CO2孵育。
- 在分化的第一阶段,每天从第 1 天更改为第 10 天。
- 在第10天,吸出培养基,用D-PBS清洗细胞一次。在24孔板中每孔加入600μL的预加热(37°C)分化II介质,并在37°C、5%CO2下孵育。
- 在分化的第二阶段,每隔一天从第11天改为第25天更换介质。分化的细胞可以在不同时间点通过甲醛固定进行分析。
- 对于免疫荧光染色,在分化日11至25号选择的时间点用D-PBS轻轻清洗细胞三次。
- 将非离子表面活性剂(材料表)移液300μL放入100 mL的PBS中,在PBS中制造0.3%的非离子表面活性剂。
注意:非离子表面活性剂对皮肤接触和吸入有毒。 - 在RT处用4%的甲醛固定细胞10分钟。然后在PBS中用0.3%洗涤三次。
注意:甲醛因皮肤接触和吸入而有毒。 - 在RT处将细胞块2小时,将3%的驴血清块。
- 以适当的浓度稀释1%驴血清中的原抗体,然后轻轻三聚物混合。在24孔板的每个孔中加入300μL的初级抗体溶液。在4°C孵育细胞过夜。用0.3%的非离子表面活性剂在PBS中清洗细胞三次。
- 以适当的浓度稀释1%驴血清中的二级抗体,然后轻轻三聚物混合。在24孔板的每个孔中加入300μL的二级抗体溶液。在RT下孵育细胞2小时,防止光线照射。
- 用0.3%的非离子表面活性剂在PBS中清洗细胞三次。稀释 4',6-二酰胺-2-苯酚 (DAPI),带 PBS,稀释 1:500。在RT处用300μL稀释的DAPI孵育24孔板的每个孔中的细胞15分钟,防止光线照射。用0.3%的非离子表面活性剂在PBS中清洗细胞三次。
- 用钳子轻轻地从板的井中拿出盖片。在荧光显微镜下在RT.Mount的黑暗中干燥过夜。
4. 建立单方面6-羟基多巴胺(6-OHDA)病变PD小鼠模型
- 要生成用于细胞移植的 PD 小鼠模型,请使用体重为 20-25 g 的成年雄性 SCID-米色小鼠进行 6-OHDA 注射。
- 手术药物的准备
- 通过将 0.2 克抗坏血酸溶解到 100 mL 的灭菌盐水中(0.9%) 制备 0.2% 抗坏血酸溶液并储存在-80°C,直到使用。在手术当天,将0.2%抗坏血酸溶液稀释10倍,获得0.02%抗坏血酸溶液。
注:加入抗坏血酸,以防止6-OHDA氧化为非活性形式。 - 要制备 6-OHDA 溶液,将适量的 6-OHDA 称重到灭菌的 1 mL 管中,然后加入 0.02% 抗坏血酸的体积,以制造 5 μg/μL 6-OHDA 溶液。涡旋混合物,直到它溶解。将 6-OHDA 放在冰上,直到使用。
注:6-OHDA 是温度和光敏。小心保护溶液免受光线照射,并在使用前将其保持在冰上。
- 通过将 0.2 克抗坏血酸溶解到 100 mL 的灭菌盐水中(0.9%) 制备 0.2% 抗坏血酸溶液并储存在-80°C,直到使用。在手术当天,将0.2%抗坏血酸溶液稀释10倍,获得0.02%抗坏血酸溶液。
- 手术前通过高压灭菌准备消毒手术设备。设置立体框架时,使用乙醇清洁所有设备和表面积。在加热灯下设置鼠标回收笼。
- 进行手术以建立单侧6OHDA病变小鼠模型。
- 称量每只老鼠,记录重量并计算需要施用的药物量。每只小鼠在手术前20分钟收到0.5毫克/千克阿托品。用80毫克/千克氯胺酮和10毫克/千克木氨酸麻醉小鼠。
- 通过腹内注射施用0.5毫克/千克阿托品。
- 在注射阿托品20分钟后,通过腹内注射,用80毫克/千克氯胺酮和10毫克/千克木氨酸麻醉小鼠。
- 将鼠标放入封闭的密室中。3-5分钟后,小鼠将被深度麻醉,而对后腿捏合没有反应。
注:预计接受麻醉的小鼠将经历一个激励期。 - 切毛小鼠头部,在小鼠眼睛上涂抹红霉素眼膏,以防止角膜溃疡。
- 将鼠标放在立体装置上。首先用切口杆固定鼠标。正确插入耳罩,使鼠标头处于平坦且固定的位置。
- 用波维酮碘和等丙醇对小鼠头部进行消毒。用手术刀切下垂(约1.5厘米)的头部皮肤,并露出头骨。调整切口杆和耳杆,将胸膜和羊肉之间的高度差减小到 0.1 mm 以下。
注: 小鼠胸膜位于冠状和下垂缝合线的交汇处,而 lambda 位于羔羊和下垂缝合线的交汇处。 - 慢慢移动并降低针尖朝向胸膜,并将胸针视为零点。将尖端移到坐标为 A/P ±0.5 mm、M/L -2.1 mm 的位置。收回尖端并标记点。在头骨上挖一个小洞
- 将2μL的5μg/μL 6-OHDA溶液提取到微注射器(材料表)。将针头返回到标记的点,并将针头插入 D/V -3.2 mm。
- 以1μL/min的速率注入2μL的5μg/μL 6-OHDA溶液(共10微克)。注射6-OHDA后,将针头留在原位5分钟。然后慢慢缩回注射针。
- 用缝合线关闭切口,并在小鼠眼睛上涂抹红霉素眼药膏。提供0.5 mL盐水皮下,以防止脱水,并直接在缝合皮肤上应用抗生素膏。
- 将鼠标从立体设备中取出,放入恢复笼中。把鼠标放回去,让食物和水进入,直到它恢复意识。在手术后每天在饮用水中用镇痛药治疗小鼠2-3天,推荐的布洛芬剂量为每天0.03毫克/克的体重。
- 手术后每天检查鼠标。
5. 单边6-OHDA病变后的行为评估
- 手术后两到三周,进行行为评估以估计PD症状。称量每只小鼠,记录其重量并计算应施用的药物量(评估前0.5毫克/千克阿波吗啡)。
- 在评估前,通过皮下注射施用0.5毫克/千克阿波坦,并将小鼠放入玻璃缸中。
- 在5分钟的习惯期后,计算每分钟相对于病变方的反向和侧边旋转次数,并用摄像机记录其活动。
- 反向减边旋转 >7 rpm/min 的小鼠被视为成功病变,并被选为细胞移植实验的候选对象。休息30分钟后,将老鼠送回外壳笼。
注:如果小鼠成功病变,6-OHDA注射小鼠将表现出更大的偏置转向反向侧,因为DA激动剂主要激活病变侧的超敏感变性纹状体。 - 在细胞移植后一周和2、4、6、8、12、16周进行行为评估。
6. DA前体的细胞移植
- 准备细胞悬浮液进行移植。对于细胞移植,在移植缓冲液的平衡盐溶液(材料表)中,以1:7在4μL的5gL-1葡萄糖中以1:7的比例将D10和D13 DA前体混合在2 x105 DA前体。
- 按照第4.4节所述的程序进行细胞移植手术,但6-OHDA被DA前体细胞悬浮液或缓冲液所取代。
- 按照第5节所述程序,在DA前体细胞移植后2、4、6、8、12、16周进行行为评估。计算每分钟相对于病变侧引起的反侧旋转数,并用摄像机记录其活动。
注:移植后,反向旋转速度降低表明运动功能有所改善。 - 在细胞移植后的4、8、12和16周,在深度麻醉下用4%的甲醛将小鼠注入,直到小鼠身体变硬,小鼠肝脏变苍白。
- 轻轻地分离小鼠的大脑,在4°C处将大脑放入4%的甲醛中过夜。
- 第二天,将大脑放入30%的蔗糖中脱水,直到大脑下沉到底部。
- 使用冷冻的缩微托姆将大脑切成40微米厚度。
- 执行免疫染色,如步骤 3.4.5-3.4.12 中所述。
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Representative Results
在这里,我们报告一个协议,涵盖iNSC-DA细胞治疗的不同阶段,以治疗PD模型。首先,对PBMC进行分离和扩展,并通过SeV感染重新编程为iNSC。图1显示了使用PBMNC扩展和iNSC感应的过程的示意图。在-14日,使用密度梯度介质(材料表)对PBMC进行隔离。离心前,用PBS稀释的血液和密度梯度介质被分成两层。离心后,出现四个梯度层(从下到上):底层包含粒细胞和红细胞;第二层包含密度梯度介质;第三个包含PBMC(红色箭头);顶层包含富含血小板的等离子体(图2A)。经过14天的扩展,PBMC在0日感染了SeV。第 1 天,使用 SeV 的介质被移除 (图 2B)。如图2B所示,预计细胞数量会逐渐减少。细胞严重死亡(>60%)直到第5天(图2B)。iNSC菌落最早出现在第12天(图2B)。在拾取和转移iNSC克隆以进行多个通道的扩展后,细胞的形态如图2C所示。 iNSC表现出良好的形态学,可以在iNSC介质中以单层形式或作为球体(图2C)中能够自续自续。
iNSCs 可以使用两阶段方法产生 DA 神经元 (图1)。在持续10天的第一阶段,用SAG1和FGF8b对iNSC进行治疗,以诱导具有神经源电位的VM地板细胞的规范。然后在第二阶段用抗坏血酸、BDNF、GDNF、cAMP、DAPT、TGF-III处理细胞(图1)。通过这种两阶段的方法,DA前体可以在第一阶段结束时获得,并在第二阶段结束时生成更成熟的DA神经元。经过24天的分化后,iNSCs可以有效地指定给DA神经元,因为大多数神经元表示叉头盒A2(FOXA2)、神经元特异性类IIIβ-tubulin(TUJ1)和酪氨酸羟基酶(TH)(图3)。
在建立单方6-OHDA病变PD小鼠模型三周后,进行了行为评估以估计PD症状(图4A)。一周后,多巴胺能前体被移植到PD小鼠模型(图4A)。行为评估在细胞移植前一周进行,在细胞移植后进行2、4、6、8、12周(图4A)。接受细胞移植的小鼠运动功能明显改善(图4B)。6-OHDA引起的病变程度可以通过在纹状体、中脑束(MFB)和SNpc(图4C)的TH进行死后免疫荧光染色来验证。在SNpc植入细胞并温和恢复的纹状体中,移植小鼠的TH阳性信号被大大恢复(图4C)。移植三个月后,存活细胞中约13.84%为TH+ DA神经元(图4D,E)。约91.72%和86.76%的TH+细胞分别被表达为孤立核受体(NURR1)和FOXA2(图4D,E)。约98.77%的TH+细胞与G-蛋白耦合的内整流化剂钾(GIRK2)共同标记(图4D,E)。
图 1:关于PBMNC扩展、iNSC诱导和将iNSCs分化为DA前体的程序的示意图。PBMC在MNC介质中分离和扩展超过14天,然后感染SeV编码人类SOX2,OCT3/4,c-MYC和KLF4。iNSC菌落在SeV感染后12天就出现。3-4周后,通过两阶段方法选取iNSC菌落并分化成DA前体。PBMCNCs:外周血单核细胞;跨国公司:单核细胞;iNSCs:诱导神经干细胞;SeV:仙台病毒;DA:多巴胺能;PDL:多D-莱辛;BDNF:脑源性神经营养因子;GDNF:胶质细胞系衍生神经营养因子;AA:抗坏血酸;cAMP:二丁丁丁辛环单磷酸;TGF:转变增长因子。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:PBMC 被分离和扩展,然后通过SeV感染重新编程到iNSC。(A) 梯度离心前后的 PBMC 示例.离心前,稀释的血液样本和密度梯度培养被分成两层。离心后,从下到上形成四个密度梯度层:底层包含粒细胞和红细胞;第二层包含密度梯度介质;第三层包含PBMC(红色箭头);顶层含有富含血小板的血浆。(B) PBMC 在 1、2、5 和 12 天感染 SeV 后细胞的典型形态图像。PBMC感染SeV后,一些细胞死亡,细胞数量逐渐减少。第5天还留有少量细胞。第12天,iNSC的殖民地出现了。刻度条,100 μm。(C) 单层和球体文化中第 20 号通道的 iNSC 的典型形态。刻度条,100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:将iNSC分化为多巴胺能神经元。FOXA2、TH、TUJ1、DAPI和合并图像的免疫荧光染色,第24天对与iNSC不同的细胞进行。刻度条,50 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:将iNSC分化DA前体移植到单边6-OHDA病变PD小鼠模型中。(A) 细胞移植和行为测试的时间表.(B) 6-OHDA+细胞组(n = 10)、6-OHDA+缓冲组(n = 8)和对照组(n = 3)不同时间点的行为测试结果。数据以均值 = 均值 (SEM) 的标准误差形式显示。p < 0.001 通过对方差 (ANOVA) 的双向分析(ANOVA) 与 Dunnett 的多重比较测试。(C) 6-OHDA-电光半球、6-OHDA细胞半球和对照组的纹状物、中脑束 (MFB) 和基斯坦尼格拉 (SN) 的 TH 的死后免疫荧光染色。刻度条,100 μm。(D) 移植后3个月移植小鼠的FOXA2/TH、NURR1/TH、GIRK2/TH、TH/HNA百分比。海航:人核抗体。数据以平均值 = SEM. (E) 在细胞移植后 12 周 PD 小鼠脑切片上的 FOXA2、NURR1、GIRK2、TH 和 HNA 的免疫荧光染色。海航:人核抗体。这个数字已由袁等人11日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这里,我们提出了一个协议,涵盖了PD模型的iNSC-DA细胞治疗的不同阶段。该协议的关键方面包括:(1) PBMC 的隔离和扩展,以及通过 SeV 感染将 PBMC 重新编程到 iNSC;(2) 将 iNSC 分化为 DA 神经元,(3) 建立单方面 6-OHDA 病变 PD 小鼠模型和行为评估,以及(4)DA前体的细胞移植和行为评估。
在此协议中,第一部分涉及在无血清介质(MNC介质)中收集和扩展PBMC,该介质优先扩展红细胞,不支持淋巴细胞增殖。在以前的研究中,几种体细胞类型被重新编程为iPSC或iNSCs12,13,14。与其他类型的体细胞相比,PBMC具有若干优点。最显著的优势是它们有利的基因表达模式和表观遗传特征。PBMC 在体内寿命短,经常从活化造血干细胞补充,并且可能比皮肤成纤维细胞积累更少的突变。此外,对PBMC的采样方法比对成纤维细胞的侵入性要小,并且需要更短的时间来扩展PBMC(约14天)与成纤维细胞(约28天)16、22。使用密度梯度介质离心后,从下到上将形成四个密度梯度;底层包含粒细胞和红细胞,第二下层包含密度梯度介质,第三层包含MNC,顶层包含等离子体。PBMC 的收益率通常因个体而异,尤其是不同年龄的人。一般来说,年轻人的PBMC数量往往比老年人多。使用所述协议,可以从 15 mL 的 PB 中分离出约 1.8×3.4 x 107 PBMNC。在PBMC中,CD34+造血干细胞相对容易重新编程,而MNC培养基可能在一定程度上丰富CD34+ 造血干细胞。预计在14天扩张后,使用MNC培养的可见细胞数量相等或更多。SeV,一种RNA非整合性病毒,具有负感、单链、非分段基因组,不集成到宿主基因组中,但只在受感染细胞的细胞质中复制18,19。重组SeV编码重新编程因子OCT3/4,SOX2,KLF4和c-MYC,可以生成为温度敏感突变体,在39°C20时可轻松去除。通过该协议,我们使用15 mL的PB对一名健康志愿者或患者重新编程,从而得出8-20个iNSC菌落。然后,研究人员可以选择具有良好形态的殖民地,以便进一步传交和建立线。在已发表的报告中,10、20和30通道的iNSCs显示出类似的扩散率,可以通过50多次,显示出良好的自我更新和增殖能力11。iNSCs的特征可以是神经干细胞标记SOX2、PAX6、NESTIN和OLIG2的分化测定和免疫染色,以及增殖标记Ki67。iNSC 应表达这些神经干细胞标记,并拥有分化能力,成为 TUJ1+MAP2+神经元 (6 周后),GFAP+星形细胞 (6 周后) 和 OLIG2=, O1|奥戈丁德罗茨 (7-8 周后)11.然而,该协议的一个限制是,MNC介质优先有利于红细胞扩张,这可能使其不适合从缺乏红细胞发育的患者生成iNSCs。此外,将 PBMC 重新编程到 iNSC 的效率不高。通过使用某些小分子或通过使用更多启动的PBMC23提高产量,可以提高重新编程效率。
此处描述的将 iNSCs 分化为 DA 神经元的方法基于大量神经分化协议。由于PD主要是由位于中脑1、2的DA神经元的退化引起的,因此协议的目的集中在在发育过程中产生于板细胞的专用VMDA神经元的推导上。具有神经源电位的VM地板细胞的诱导取决于两个关键形态,SHH和FGF8b6,25,26。SHH是一种腹腔化形态原,由诺托乔德26,27分分泌。在这里,我们用小分子SAG1代替了SHH,这是一种比SHH更经济的SHH通路激动剂。此外,基本神经培养基和补充(材料表)对神经元生存和分化也非常重要.通过该协议,在第一阶段接近尾声时获得DA前体,并在第二阶段结束时生成更成熟的DA神经元。将第二阶段的周期增加到40-55天可以进一步提高成熟DA神经元在培养中的比例。第二阶段介质包括视黄酸、BDNF、GDNF、TGF-III、DAPT和cAMP,它们已被证明能够促进DA神经元的成熟和存活。为了测试iNSCs在分化成DA神经元时的效率,对分化细胞的表达进行了检查,以检测其标记NURR1、FOXA2、GIRK2和TH的表达。在以前的研究中,在第一阶段(第10天)结束时,87.76%和65.33%的细胞分别表示NURR1和FOXA2,分别为11。在第二阶段结束时(第24天),NURR1+细胞的比例达到95.58%,FOXA2+细胞的比例达到77.33%11。 此时,57.23%和28.55%的细胞对TH和GIRK2分别为阳性,分别为11。与对DA神经元的iPSC分化观察到的类似,iNSC分化的批次到批次/线到线变异也存在,受细胞状态、使用的小分子的活性和可塑性等因素的影响。来自不同人的干细胞。还值得注意的是,分化效率的一个关键决定因素是细胞密度。建议在 24 孔板中每 12 mm 玻璃盖玻片的播种密度为 5 x 103个单元。事实上,在分化阶段I期间,iNSC表现出良好的增殖率。在24孔板的一口井中播种的iNSCs,在10~13日分化后,将产生足够数量的DA前体,移植到一只小鼠中(每只小鼠2×105)。
该协议提出了建立可重复的、稳定的单方6-OHDA病变PD小鼠模型的方法。6-OHDA病变的程度可以通过行为评估来估计,该评估测量注射阿波吗啡后的反向旋转。此外,6-OHDA引起的病变程度可以通过在SNpc的TH的死后免疫荧光染色来量化。另一种用于PD建模的神经毒素是1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-三氢丙氨酸(MPTP),这也扰乱了多巴胺能通路。与MPTP相比,6-OHDA可以单独或双边管理。此外,MPTP方法对动物年龄、性别和应变更为敏感,因此可能表现出动物之间更大程度的差异。关键因素包括选择体重相匹配的小鼠,注射新鲜制备的6-OHDA溶液,以及准确、快速地进行手术。
DA前体细胞移植到病变小鼠纹状体的程序与生成6-OHDA病变PD小鼠模型的程序基本相同,只是6-OHDA在注射步骤时被DA前体取代。本部分的关键因素是寻找移植的DA细胞分化的最佳时间窗口。已经证明,较高的茎度与较高的存活率相关,但规范的可能性较低,进入成熟的DA神经元11。然而,神经细胞的成熟阶段较脆弱,移植后存活率较低。因此,找到一个平衡成熟和生存能力的适当时间窗口具有重要意义。在以前的研究中,我们把第10天和第13天的分化细胞移植到免疫缺陷SCID-beige小鼠11的纹状体中。移植一个月后,免疫荧光染色结果显示,10日和第13组分别约88.63%和93.13%为TUJ1阳性,部分TH+细胞(5.30%) 从第13天组检测到,但从第10天组到很少TH+细胞。然而,与第13天细胞相比,第10天细胞的总存活率略高于11。结果显示,第10天至第13天是11日细胞移植的最佳时间窗口。在这个协议中,我们使用第10天和第13天分化的DA细胞的混合物,以1:7的比例进行移植,这显示了生存和分化11的良好结果。使用第10天和第13天细胞的混合物是基于一个假设,即相对不成熟和成熟的神经细胞,如果放在一起,可以互相支持,让人想起小鼠体内的情况,神经干细胞被成熟的神经元包围。
该协议提出了通过SeV感染从PBMC生成iNSCs的方法,将iNSCs区分到DA神经元中,并将DA前体移植到6-OHDA病变PD小鼠模型中。使用该协议,可以产生具有潜力的iNSCs,不仅用于治疗PD,而且用于其他神经退行性疾病。由于iNSCs代表一个原始的NSC阶段,它们可以被指定到不同区域特定的神经细胞,如脊髓神经元或运动神经元,这可能有希望用于治疗肌萎缩性侧索硬化症或脊髓损伤。此外,来自家族性疾病患者的iNSC提供了一个平台,用于研究疾病发病和发展的基本机制,以及进行药物筛选测试。
有一种多种方法获得DA神经细胞用于移植研究。DA细胞也可以从iPSC或直接转换29生成。与iPSC相比,iNSCs是固有的,肿瘤形成的风险降低,重新编程和线路建立周期短,并且系宗可塑性-只能分化成神经元和胶质11。与直接转化相比,将DA前体与iNSC区分为30,具有更高的产量和效率。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该课题资助项目为:干细胞与翻译国家重点项目(2016YFA0101403)、国家自然科学基金(81661130160、81422014、81561138004)、北京市自然科学基金(5142005)、北京人才基金会(201700021223TD03),北京市"十三五"期间高层次人才资助项目(CIT&TCD20180333),北京医疗系统高层次人才奖(2015-3-063),北京市卫生局基金(PXM 2018_026283_000002)、北京市百千人才基金(2018A03)、北京市医院临床医学发展专项资金支持(ZYLX201706)和皇家学会-牛顿高级奖学金(NA150482)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15-ml conical tube | Corning | 430052 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic for inhalation and skin contact |
| 24-well plate | Corning | 3337 | |
| 50-ml conical tube | Corning | 430828 | |
| 6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Cell dissociation reagent |
| Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A92902 | Toxic with skin contact |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | Brain derived neurotrophic factor |
| Blood collection tubes containing sodium heparin | BD | 367871 | |
| BSA | yisheng | 36106es60 | Fetal bovine serum |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dibutyryladenosine cyclic monophosphate |
| CellBanker 2 | ZENOAQ | 100ml | Used as freezing medium for PBMNCs |
| Chemically defined lipid concentrate | Invitrogen | 11905031 | |
| CHIR99021 | Gene Operation | 04-0004 | |
| Coverslip | Fisher | 25*25-2 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417-10mg | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915-100MG | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11330 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320 | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| EPO | Peprotech | 100-64-50UG | Human Erythropoietin |
| FGF8b | Peprotech | 100-25 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | P=1.077, density gradient medium |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | Glial derived neurotrophic factor |
| GlutaMAX | Invitrogen | 21051024 | 100 × Glutamine stock solution |
| Ham's-F12 | Gibco | 11765-054 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175079 | Balanced salt solution |
| Human leukemia inhibitory factor | Millpore | LIF1010 | |
| Human recombinant SCF | Peprotech | 300-07-100UG | |
| IGF-1 | Peprotech | 100-11-100UG | Human insulin-like growth factor |
| IL-3 | Peprotech | 200-03-10UG | Human interleukin 3 |
| IMDM | Gibco | 215056-023 | Iscove's modified Dulbecco's medium |
| Insulin | Roche | 12585014 | |
| ITS-X | Invitrogen | 51500-056 | Insulin-transferrin-selenium-X supplement |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | Serum free basal medium |
| Laminin | Roche | 11243217001 | |
| Microsyringe | Hamilton | 7653-01 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| NEAA | Invitrogen | 11140050 | Non-essential amino acid |
| Neurobasal | Gibco | 10888 | Basic medium |
| PDL | Sigma-Aldrich | P7280 | Poly-D-lysine |
| SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
| SB431542 | Gene Operation | 04-0010-10mg | Store from light at -20? |
| Sendai virus | Life Technologies | MAN0009378 | |
| Sucrose | baiaoshengke | ||
| TGFβ? | Peprotech | 100-36E | Transforming growth factor β? |
| Transferrin | R&D Systems | 2914-HT-100G | |
| Triton X 100 | baiaoshengke | Nonionic surfactant | |
| Trypan blue | Gibco | T10282 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 |
References
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