Summary
O protocolo apresenta a reprogramação de células mononucleares do sangue periférico para induzir células-tronco neurais por infecção pelo vírus de Sendai, diferenciação de iNSCs em neurônios dopaminérgicos, transplante de precursores da DA na unilateralmente lesionada Modelos do rato da doença de Parkinson, e avaliação da segurança e da eficácia de precursores DA DA do iNSC-derivados para o tratamento do paládio.
Abstract
A doença de Parkinson (DP) é causada pela degeneração dos neurônios dopaminérgicos (da) no substância negra nigra pars compacta (SNPC) no mesencon ventral (VM). A terapia da recolocação da pilha prende a grande promessa para o tratamento do paládio. recentemente, as pilhas de haste neural induzidas (iNSCs) emergiram como um candidato potencial para a terapia da recolocação da pilha devido ao risco reduzido da formação do tumor e da plasticidade para dar o aumento neurônios específicos da região e glia. os iNSCs podem ser reprogramados a partir de fontes celulares somáticas autólogas, como fibroblastos, células mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) e vários outros tipos de células. Comparado com outros tipos de células somáticas, PBMNCs são um tipo de célula iniciante atraente por causa da facilidade de acesso e expansão na cultura. O vírus de Sendai (SeV), um vírus não integrativo do RNA, codificando fatores de reprogramação que incluem o OCT3/4humano, SOX2, KLF4 e c-Myc, tem um genoma negativo-sentido, único-encalhado, não-segmentado que não integre em genoma do hospedeiro, mas apenas Replica no citoplasma de células infectadas, oferecendo um veículo eficiente e seguro para a reprogramação. Neste estudo, nós descrevemos um protocolo em que o iNSCs é obtido reprogramando PBMNCs, e diferenciado em neurônios especializados DA VM DA por um método Two-stage. Então os precursores são transplantados em modelos unilateralmente 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned do rato do paládio para avaliar a segurança e a eficácia para o tratamento do paládio. Este método fornece uma plataforma para investigar as funções e os efeitos terapêuticos de células neurais DA DA do paciente-específicas in vitro e in vivo.
Introduction
A doença de Parkinson (DP) é uma desordem neurodegenerativa comum, causada pela degeneração dos neurônios dopaminérgicos (da) no substância negra nigra pars compacta (SNPC) no mesencéfalo ventral (VM), com uma prevalência de mais de 1% na população acima de 60 anos de idade 1. º , 2. ao longo da década passada, a terapia celular, destinada a substituir as células degenerativas ou danificadas, ou Nutrir o microambiente em torno dos neurônios degenerativos, mostrou potencial no tratamento de PD3. Enquanto isso, a tecnologia de reprogramação fez progressos significativos4, que fornece uma fonte celular promissora para a terapia de reposição. As pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) e as pilhas de haste embrionário (ESCS) foram provadas ser capazes de diferenciar-se em pilhas neural de da, que poderiam sobreviver, maturate, e melhorar as funções de motor quando enxertadas em ratos e em modelos não-humanos do PD do primata5 ,6,7,8. os iPSCs representam um marco nas tecnologias de reprogramação celular e têm um grande potencial de transplante celular; Entretanto, há ainda uma preocupação sobre o risco de formação tumoral a partir das células incompletamente diferenciadas. Uma fonte celular alternativa para o transplante de células é células-tronco adultas comprometidas por linhagem obtidas por meio de reprogramação direta, como células-tronco neurais induzidas (iNSCs), que podem ser derivadas dos intermediários instáveis, ignorando a pluripotência etapa9,10,11.
Tanto o iPSCs quanto o inscs podem ser reprogramados a partir de fontes celulares autólogas, como fibroblastos, células mononucleares do sangue periférico (pbmncs) e vários outros tipos de células12,13,14, reduzindo assim a imunogenicidade das células transplantadas em grande grau. Além disso, comparado com iPSCs, os iNSCs são inerentes com risco reduzido da formação do tumor e da plasticidade linhagem-comprometida, somente capaz de diferenciar-se em neurônios e em glia11. Nos estudos iniciais, os iPSCs humano ou camundongo e os inscs foram gerados a partir de fibroblastos obtidos a partir de biópsias cutâneas, o que é um procedimento invasivo14,15. Com este respeito, os PBMNCs são uma fonte de célula de partida atraente por causa do processo de amostragem menos invasivo, e a facilidade de obter um grande número de células dentro de um curto período de tempo de expansão16. Os estudos de reprogramação inicial empregaram sistemas integrativos de entrega, como vetores lentivirais ou anti-retrovirais, que são eficientes e fáceis de implementar em muitos tipos de células17; no entanto, esses sistemas de parto podem causar mutações e reativação de transgenes residuais, que apresentam problemas de segurança para fins terapêuticos clínicos12. O vírus de Sendai (SeV) é um vírus de RNA não integrativo com um genoma de sentido negativo, único que não se integra no genoma do hospedeiro, mas apenas Replica no citoplasma de células infectadas, oferecendo um veículo eficiente e seguro para reprogramar18 ,19. Os vetores de SeV recombinantes estão disponíveis que contêm fatores de reprogramação, incluindo OCT3/4, SOX2, KLF4 e c-Myc humanos em seus quadros de leitura abertos. Além disso, os vetores virais SeV podem ser melhorados através da introdução de mutações sensíveis à temperatura, para que possam ser rapidamente removidas quando a temperatura da cultura é aumentada para 39 ° c20. Neste artigo, descrevemos um protocolo para reprogramar PBMNCs para iNSCs usando o sistema SeV.
Muitos estudos relataram a derivação dos neurônios da ESCS humana ou iPSCs usando vários métodos6,8,21. No entanto, há uma escassez de protocolos descrevendo a diferenciação de neurônios da da iNSCs em detalhes. Neste protocolo, descreveremos a geração eficiente de neurônios da do iNSCs usando um método de dois estágios. Os precursores neuronais DA DA podem ser transplantados para o estriado de modelos de mouse PD para avaliações de segurança e eficácia. Este artigo apresentará um protocolo detalhado que cubra vários estágios da geração de pilhas de haste neural induzidas pelo vírus de Sendai, diferenciação de inscs em neurônios da da, estabelecimento de modelos do PD do rato, à transplantação de precursores do da no estriado dos modelos de PD. Usando este protocolo, pode-se gerar iNSCs de pacientes e doadores saudáveis e derivar neurônios DA DA que são seguros, padronáveis, escalonáveis e homogêneos para fins de transplante celular, ou para modelar PD em um prato e investigação dos mecanismos início e desenvolvimento da doença subjacente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos devem seguir as diretrizes do Comitê institucional de ética em pesquisa humana. O consentimento informado deve ser obtido de pacientes ou voluntários saudáveis antes da coleta de sangue. Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de ética em pesquisa humana da instituição e foi realizado de acordo com as diretrizes da instituição para o cuidado e uso de animais.
1. recolha, isolamento e expansão de PBMNCs
- Coleção de PBMNCs
- Colete 10-20 mL de sangue venoso periférico do doador por punção venosa com um frasco de conservante de heparina sódica.
Nota: as amostras de sangue devem ser armazenadas ou enviadas à temperatura ambiente (RT). Processe as amostras de sangue dentro de 24 h.
- Colete 10-20 mL de sangue venoso periférico do doador por punção venosa com um frasco de conservante de heparina sódica.
- Preparação do meio de cultura
- Prepare o meio livre de soro (SFM) combinando os seguintes componentes: 245 mL do meio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM), 240 mL de F-12 de presunto, 5 mL de insulina-transferrina-selênio-X suplemento (ITS-X), 5 mL de solução de stock de 100x glutamina (tabela de Materiais), 5 ml de concentrado lipídico quimicamente definido, 2,5 g de soro fetal bovino, 0, 25 g de ácido ascórbico e 9 μL de 1-tioglicerol. Filtre o suporte e guarde-o a 4 ° c.
PRECAUÇÃO: o ácido ascórbico e o 1-tioglicerol são tóxicos por contacto com a pele e inalação. - Para preparar o meio de células mononucleares (MNC), complementar o meio SFM com 10 ng/mL de interleucina humana 3 (IL-3), 2 U/mL de eritropoietina (EPO), 100 ng/mL fator de células-tronco humanas (SCF), 40 ng/mL fator de crescimento semelhante à insulina humana 1 (IGF-1), 100 μg/mL holo-transferrina e 1 dexametasona μM. Filtre o suporte e guarde-o a 4 ° c.
Nota: Prepare o meio imediatamente antes de usar.
- Prepare o meio livre de soro (SFM) combinando os seguintes componentes: 245 mL do meio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM), 240 mL de F-12 de presunto, 5 mL de insulina-transferrina-selênio-X suplemento (ITS-X), 5 mL de solução de stock de 100x glutamina (tabela de Materiais), 5 ml de concentrado lipídico quimicamente definido, 2,5 g de soro fetal bovino, 0, 25 g de ácido ascórbico e 9 μL de 1-tioglicerol. Filtre o suporte e guarde-o a 4 ° c.
- Isolamento de PBMNCs
- Ultravioleta-esterilizar um banco limpo antes de usar. Esterilizar todas as superfícies e equipamentos com 75% de álcool. Esterilizar todas as pontas usando uma autoclave.
- Transferir o sangue periférico (PB) para um tubo cônico de 50 mL e diluir o PB com um volume igual de soro fisiológico tamponado de Dulbecco estéril (D-PBS).
- Prepare 15 mL de meio de gradiente de densidade esterilizado (tabelas de materiais) em outro tubo cônico de 50 ml.
Nota: Mantenha o meio de gradiente de densidade e o PB em RT para permitir um melhor isolamento dos PBMNCs. - Incline o tubo cônico contendo o meio de gradiente de densidade em um ângulo de 45 ° e, em seguida, lentamente e cuidadosamente coloque 30 mL de PB diluído no meio de gradiente de densidade.
Nota: Tome cuidado e permita que o PB corra lentamente para baixo do lado do tubo cônico na camada média do gradiente de densidade. Os glóbulos vermelhos depositam na parte inferior do tubo. Incline o tubo com cuidado para minimizar o rompimento da interface da camada. - Centrifugue os tubos a 800 x g durante 15 min em RT com o travão de centrifugador fixado na posição "off". Aspirar a camada de plasma superior amarela e descartá-la. Em seguida, transfira a camada de película fina branca e turva contendo MNCs com uma pipeta de 10 mL para um novo tubo cônico de 50 mL.
Nota: a comutação do travão do centrifugador é importante para o isolamento das MNCs. - Adicionar 30 mL de D-PBS ao tubo com MNCs e centrifugar a 600 x g durante 10 min a 4 ° c. Descarte o sobrenadante e, em seguida, adicione 45 mL de D-PBS para re-suspender as células. Centrifugador a 400 x g durante 10 min a 4 ° c.
Nota: o travão do centrifugador deve ser ligado para este e as seguintes etapas de centrifugação. À medida que as pelotas de células são densas, adicione 1-2 mL de D-PBS para resuspender suavemente as pelotas e, em seguida, adicionar D-PBS a 45 mL. - Descarte o sobrenadante e Resuspenda as células com 5 ml de D-PBS e conte as células ao vivo com o método de exclusão azul de Tripan.
- Depois de deixar de lado as MNCs necessárias para a expansão, congele as células restantes para uso futuro.
Nota: pelo menos 5 x 106 MNCs podem ser congelados em um frasco com 1 ml de meio de congelação (tabela de materiais). O protocolo pode ser pausado aqui.
- Expansão das MNCs
- No dia-14, as MNCs de sementes em uma densidade de 2-3 x 106 células por mililitro em um poço de seis poços placas com 1,5 ml de pré-aquecido (37 ° c) MNC médio. Incubar a 37 ° c, 5% CO2 por 2 dias.
- No dia-11, colete as células e o meio com uma pipeta esterilizada e transfira para um novo tubo cônico de 15 mL. Centrifugue as pilhas em 250 x g por 5 minutos em RT. descarte o sobrenadante e Resuspenda as células em 1 ml de meio MNC pré-aquecido (37 ° c).
- Conte as células viáveis com azul de Tripan. Semeie as MNCs com uma densidade de 1 x 106 células por mililitro em meio de MNC pré-aquecido e incubar a 37 ° c, 5% co2 por 3 dias.
Nota: espera-se que o número total de células pode diminuir no dia-11. - No dia-8, repita os passos 1.4.2-1.4.3 e cultura das células para 3 dias.
- No dia-4, repita as etapas 1.4.2-1.4.3 e cultura das células por 3 dias.
Nota: após 14 dias de cultura, um número igual ou maior de MNCs deve permanecer na cultura.
2. reprogramação de PBMNCs para iNSCs por SeV infecção
- Preparação de solução e meio de cultura
- Prepare uma solução de estoque de poli-D-lisina (PDL) dissolvendo 100 mg de PDL com 100 mL de H2o a uma concentração de 1 mg/ml. Conservar a-20 ° c em alíquotas de 1 mL.
- Prepare uma solução de insulina dissolvendo 100 mg de insulina em 20 mL de 0, 1 N HCl para uma concentração de 5 mg/mL. Conservar a-20 ° c em alíquotas de 1 mL.
- Para preparar 200 mL de meio basal iNSC, combine 96 mL de DMEM-F12 e 96 mL de meio básico (tabela de materiais) com 2 ml de solução de estoque de glutamina 100x, 2 ml de aminoácido não essencial (neaa), 2 ml de suplemento de N2 e 2 ml de suplemento B27. Adicionar 10 ng/mL fator inibitório de leucemia humana recombinante, 3 μM CHIR99021 e 2 μM SB431542 antes da utilização. Filtre o suporte e guarde-o a 4 ° c.
Nota: Use o meio dentro de 2 semanas. Adicionar fator inibitório de leucemia humana recombinante, CHIR99021 e SB431542 imediatamente antes do uso.
- Reprogramação de PBMNCs para iNSCs por SeV infecção
- Ultravioleta-esterilizar um banco limpo antes de usar. Esterilizar todas as superfícies e equipamentos com 75% de álcool. Esterilizar todas as pontas usando uma autoclave.
- No dia 0, colete as células no meio MNC e transfira para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugue as células a 200 x g durante 5 min. Aspire o sobrenadante e Resuspenda as células com 1 ml de meio MNC pré-aquecido.
- Conte as células viáveis com azul de Tripan. Resuspenda as células com meio MNC pré-aquecido (37 ° c) a uma concentração de 2 x 105 células por poço em placas de 24 poços.
- Depois de remover os tubos SeV de-80 ° c de armazenamento, descongelar os tubos contendo SeV em banho de água de 37 ° c para 5-10 s e, em seguida, permitir-lhes descongelar at RT. Uma vez descongelados, coloque-os no gelo imediatamente.
- Adicione o Sev que codifica o Klf4 humano, Oct3/4, SOX2 e c-Myc aos poços, em um multiplicidade da infecção (moi) de 10. Centrifugue pilhas com as placas em 1.000 x g por 30 minutos para facilitar o acessório das pilhas. Deixe as células e sobrenadantes nas placas. Coloc as placas na incubadora em 37 ° c, 5% CO2.
Cuidado: todos os procedimentos envolvendo SeV devem ser realizados em um armário de segurança, e todas as pontas e tubos devem ser tratados com etanol ou lixívia antes da eliminação. - No dia 1, transfira o meio e as células para um tubo de centrifugação de 15 mL. Enxague o poço com 1 mL de meio MNC. Centrifugue a suspensão da pilha em 200 x g por 5 min. Aspire o sobrenadante e Resuspenda as células com 500 μL de meio de MNC pré-aquecido fresco em placas de 24 poços.
Nota: Use uma placa baixa do acessório 24-well para impedir o acessório de todas as pilhas antes de chapeamento em PDL/laminin. - No dia 2, diluir 1 mL de 1 mg/mL de PDL com 19 mL de D-PBS a uma concentração de 50 μg/mL. Cubra 6 placas de poço com 50 μg/mL de PDL por pelo menos 2 h em RT.
- Diluir 200 μL de 0,5 mg/mL de laminina com 20 mL de D-PBS a uma concentração de 5 μg/mL. Aspirar PDL nas placas de 6 poços, e secar no banco limpo vertical.
- Revestimento 6-placas de poço com 5 μg/mL de laminina e incubar para 4-6 h a 37 ° c. Lave com D-PBS antes de usar.
- No dia 3, a placa as pilhas transdoadas obtiveram na etapa 2.2.6 no meio do iNSC em placas de 6 poços PDL/laminina-revestidas.
Nota: Mova as placas suavemente, se necessário, depois de as células serem colocadas em placas revestidas com PDL/laminina, tentando não perturbar o acessório das células. - No dia 5, adicione 1 mL de meio iNSC pré-aquecido (37 ° c) em cada poço em placas de 6 poços suavemente.
Nota: espera-se que as células passarão por morte drástica (> 60%). - No dia 7, adicione 1 mL de meio iNSC pré-aquecido (37 ° c) em cada poço em placas de 6 poços suavemente.
- Do dia 9 ao dia 28, substitua o meio gasto com meio de iNSC pré-aquecido (37 ° c) fresco todos os dias. Monitore o surgimento de colônias do iNSC. Escolha e transfira clones de iNSC para expansão em cerca de 2-3 semanas. Pegar colônias com morfologia adequada usando pipetas de vidro queimado, excluindo quaisquer células possivelmente contaminantes, e aspirar as colônias com 200 μL de pontas.
Nota: os iNSCs caracterizados podem ser congelados para uso futuro com 2-5 colônias em um frasco. O meio de congelação inclui o meio basal livre do soro (tabela de materiais) e o dimetil sulfóxido misturado em uma relação de 9:1, que deve ser preparado imediatamente antes do uso. O protocolo pode ser pausado aqui.
3. diferenciação de iNSCs para neurônios dopaminérgicos
- Preparação de solução e meio de cultura
- Prepare 200 mL de meio basal de diferenciação iNSC combinando 192 mL de DMEM-F12 com 2 mL de solução de estoque de glutamina 100x, 2 mL de NEAA, 2 mL de suplemento de N2 e 2 mL de suplemento B27.
Nota: Use o meio dentro de 2 semanas. - Prepare o meio do estágio I da diferenciação do iNSC suplementando o meio basal da diferenciação de iNSC com 1 μM SAG1 e 100 ng/mL FGF8b.
Nota: Use o meio dentro de 2 semanas. - Prepare o meio do estágio II da diferenciação de Insc completando o meio basal da diferenciação de Insc com o monofosfato cíclico da adenosina de 0,5 milímetros (acampamento), o ácido ascórbico de 0,2 milímetros, o dapt de 10 μm, o fator neurotrófico derivado do cérebro de 10 ng/ml (BDNF), 10 ng/ml glial derivado fator neutrophic (GDNF) e 1 ng/mL que transforma o fator de crescimento βIII (TGF-βIII).
Nota: Use o meio dentro de 2 semanas.
- Prepare 200 mL de meio basal de diferenciação iNSC combinando 192 mL de DMEM-F12 com 2 mL de solução de estoque de glutamina 100x, 2 mL de NEAA, 2 mL de suplemento de N2 e 2 mL de suplemento B27.
- Revestimento dos pratos de cultura
- Ultravioleta-esterilizar um banco limpo antes de usar. Esterilizar todas as superfícies e equipamentos com 75% de álcool. Esterilizar todas as pontas usando uma autoclave.
- Para o revestimento PDL, pelo menos um dia antes de re-chapeamento das células, diluir 1 mL de 1 mg/mL PDL com 19 mL de D-PBS para uma concentração de 50 μg/mL. Cubra as coberturas de vidro de 12 mm que foram esterilizadas com álcool a 75% nas placas de 24 poços com 50 μg/mL de PDL em RT por pelo menos 2 h.
- Para o revestimento de laminina, diluir 200 μL de laminina de 0,5 mg/mL com 20 mL de D-PBS a uma concentração de 5 μg/mL. Aspirar PDL e secar os poços no banco limpo. Cubra as coberturas de 12 mm com laminina 5 μg/mL e incubar por 4-6 h a 37 ° c. Lave com D-PBS antes de usar.
- Células de passagem para diferenciação.
- Quando a confluência de iNSCs cultivadas atinge 70-90%, aspirar meio da placa de cultura, e adicionar 1 mL de D-PBS para lavar as células. Adicionar 1 mL de reagente de dissociação de células pré-aquecido (37 ° c) (tabela de materiais) por poço e incubar a 37 ° c durante 3 min para dissociar as células.
- Após a incubação por 3 min, as células tornaram-se semiflutuantes; Adicionar 3 mL de pré-aquecido (37 ° c) DMEM-F12 médio por poço, e células de pipeta para cima e para baixo para dissociar as pelotas de célula em células individuais.
- Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL e centrifugue a 250 x g durante 3 min. Aspire o sobrenadante, resuspenda as células com o volume adequado de meio Insc pré-aquecido (37 ° c) de acordo com o número de células.
- Conte as células usando o método de exclusão azul de Tripan. Placa 5 x 103 células por 12 mm de lamínula de vidro em 24 poços e incubar a 37 ° c, 5% co2.
- Diferenciar iNSCs em neurônios dopaminérgicos.
- Comece a diferenciação 24 h após re-plating as pilhas em COVERSLIP PDL/laminin-revestidos. Aspirar meio de cultura, lavar as células uma vez com D-PBS e, em seguida, adicionar 600 μL de estágio de diferenciação pré-aquecido I médio por poço em placas de 24 poços e incubar a 37 ° c, 5% CO2.
- Mude o meio todos os dias do dia 1 para o dia 10 durante o primeiro estágio de diferenciação.
- No dia 10, aspirar o meio de cultura, e lavar as células uma vez com D-PBS. Adicionar 600 μL de meio de diferenciação pré-aquecido (37 ° c) estágio II por poço em placas de 24 poços e incubar a 37 ° c, 5% CO2.
- Mude o meio todos os dias do dia 11 para o dia 25 durante a segunda fase de diferenciação. As células diferenciadas podem ser fixadas por paraformaldeído em diferentes pontos temporais para análise.
- Para a coloração imunofluorescente, lave as células com D-PBS três vezes suavemente nos pontos de tempo escolhidos dentro do dia de diferenciação 11 a 25.
- Pipete 300 μL de surfactante não iônico (tabela de materiais) em 100 ml de PBS para fazer um surfactante não iônico de 0,3% em PBS.
Cuidado: o surfactante nonionic é tóxico pelo contato e pela inalação da pele. - Fixar as células com 4% paraformaldeído por 10 min em RT. Em seguida, lave com 0,3% em PBS três vezes.
Cuidado: o paraformaldeído é tóxico por contato com a pele e inalação. - Bloqueie as células em 3% de soro de burro por 2 h em RT.
- Diluir o anticorpo primário em 1% de soro de burro em uma concentração adequada e triturar suavemente para misturar. Adicionar 300 μL da solução de anticorpos primários a cada poço da placa de 24 poços. Incubar as células a 4 ° c durante a noite. Lave as células com 0,3% de surfactante não iônico em PBS três vezes.
- Diluir o anticorpo secundário em 1% de soro de burro em uma concentração apropriada e triturar suavemente para misturar. Adicionar 300 μL da solução de anticorpos secundários a cada poço da placa de 24 poços. Incubar as células em RT por 2 h, protegida da luz.
- Lave as células com 0,3% de surfactante não iônico em PBS três vezes. Diluir 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) com PBS com diluição 1:500. Incubar as células em cada poço da placa de 24 poços com 300 μL de DAPI diluída durante 15 min em RT, protegida da luz. Lave as células com 0,3% de surfactante não iônico em PBS três vezes.
- Retire suavemente as coberturas dos poços de placas com fórceps. Seque no escuro durante a noite no RT. Monte um microscópio de fluorescência.
4. estabelecimento de modelos unilaterais do rato do PD de 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned
- Para gerar modelos de mouse PD para transplante de células, use camundongos adultos machos SCID-bege pesando 20-25 g para injeção de 6 OHDA.
- Preparação de medicamentos para cirurgia
- Prepare uma solução de ácido ascórbico 0,2% dissolvendo 0,2 g de ácido ascórbico em 100 mL de soro fisiológico esterilizado (0,9%) e armazene em-80 ° c até o uso. No dia da cirurgia, diluir 0,2% de solução de ácido ascórbico em 10 vezes para obter uma solução de ácido ascórbico 0, 2%.
Nota: o ácido ascórbico é adicionado para evitar a oxidação de 6 OHDA para uma forma inativa. - Para preparar uma solução de 6 OHDA, pesar a quantidade apropriada de 6 OHDA em um tubo esterilizado de 1 mL e, em seguida, adicionar algum volume de ácido ascórbico de 0, 2% para fazer uma solução de 5 μg/μL 6-OHDA. Vortex a mistura até que seja dissolvido. Coloque o 6-OHDA no gelo até o uso.
Nota: 6 OHDA é a temperatura e sensível à luz. Tenha cuidado para proteger a solução da luz e mantê-lo no gelo antes de usar.
- Prepare uma solução de ácido ascórbico 0,2% dissolvendo 0,2 g de ácido ascórbico em 100 mL de soro fisiológico esterilizado (0,9%) e armazene em-80 ° c até o uso. No dia da cirurgia, diluir 0,2% de solução de ácido ascórbico em 10 vezes para obter uma solução de ácido ascórbico 0, 2%.
- Prepare o equipamento cirúrgico esterilizado por autoclavagem antes da cirurgia. Limpe todos os equipamentos e áreas de superfície com etanol ao configurar o quadro estereotódico. Configurar uma gaiola de recuperação do mouse uma lâmpada de aquecimento.
- Conduza a cirurgia para estabelecer modelos unilaterais do rato de 6 OHDA-lesioned.
- Pesar cada rato, gravar o peso e calcular a quantidade de droga que precisa ser administrado. Cada rato recebe 0,5 mg/kg de atropina 20 min antes das operações. Anestesie o rato com 80 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina.
- Administrar 0,5 mg/kg de atropina por injecção intraperitoneal.
- Anestesie o rato com 80 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina por injecção intraperitoneal 20 min após a administração de atropina.
- Coloque o mouse em uma câmara fechada. Após 3-5 min, o mouse será profundamente anestesiado sem resposta à pinça da perna traseira.
Nota: espera-se que o rato que recebeu anestesia experimentaria um período de excitação. - Raspar a cabeça do mouse e aplique pomada olho eritromicina nos olhos do mouse para a proteção do desenvolvimento de úlceras corneanas.
- Coloque o mouse sobre o aparelho estereotódico. Fixe o rato com as barras do incisivo firstly. Insira os copos de ouvido corretamente para fazer a cabeça do mouse em uma posição plana e segura.
- Esterilizar a cabeça do rato com iodo povidona e álcool isopropílico. Corte uma incisão sagital (~ 1,5 cm) na pele da cabeça com uma lâmina de bisturi, e expor o crânio. Ajuste a barra do incisivo e as barras da orelha para reduzir a diferença da altura entre o Bregma e o lambda a menos de 0,1 milímetros.
Nota: o rato Bregma está localizado na interseção de suturas coronal e sagital, e lambda está na interseção de lambdóide e suturas sagital. - Mova lentamente e abaixe a ponta da agulha para Bregma e trate o Bregma como um ponto zero. Mova a ponta para uma posição com coordenadas de A/P + 0,5 mm, M/L-2,1 mm em relação à Bregma. Retrair a ponta e marcar o ponto. Burr um pequeno buraco no crânio.
- Extraia 2 μL de solução de 5 μg/μL 6-OHDA para a microseringa (tabela de materiais). Retorne a agulha ao ponto marcado, e insira a agulha em D/V-3,2 mm.
- Injete 2 μL de solução de 5 μg/μL 6-OHDA (total de 10 μg) a uma taxa de 1 μL/min. Após a injeção de 6 OHDA estiver concluída, deixe a agulha no lugar por mais 5 min. Em seguida, retrair a agulha de injecção lentamente.
- Feche a incisão com suturas e aplique a pomada do olho de eritromicina nos olhos do rato. Entregar 0,5 mL de soro fisiológico por via subcutânea para evitar a desidratação, e aplicar uma pomada antibiótica diretamente sobre a pele suturada.
- Retire o rato do aparelho estereotódico e coloque-o na gaiola de recuperação. Coloque o mouse para trás e permitir o acesso a alimentos e água até que recupere a consciência. Trate o rato com analgésico na água potável diária pós-cirurgia por 2-3 dias, e uma dosagem recomendada de ibuprofeno é 0, 3 mg/g de peso corporal por dia.
- Inspecione o rato diariamente após a cirurgia.
5. avaliação comportamental após lesioning unilateral de 6 OHDA
- De duas a três semanas após a cirurgia, realize a avaliação comportamental para estimar os sintomas de DP. Pesar cada rato, registar o seu peso e calcular a quantidade de droga que deve ser administrada (0,5 mg/kg de apomorfina antes da avaliação).
- Administrar 0,5 mg/kg de apomorfina por injecção subcutânea antes da avaliação e colocar o rato num cilindro de vidro.
- Após um período de 5 min de habituação, contar o número de rotações contralateral e ipsilateral em relação ao lado da lesão por minuto e registrar sua atividade com uma câmera de vídeo.
- Camundongos com rotação contralateral menos rotações ipsilaterais > 7 rpm/min são considerados lesionados com sucesso e selecionados como candidatos para experimentos de transplante celular. Retorne os ratos para as gaiolas de Habitação após um descanso de 30 min.
Nota: se o rato foi lesados com sucesso, o rato injetado 6 OHDA mostrará um viés maior em girar para o lado contralateral desde que o agonista da da ativa o estriado desnervado supersensitive do lado lesados predominantly. - Realizar a avaliação comportamental uma semana antes e 2, 4, 6, 8, 12, 16 semanas após o transplante de células.
6. transplante celular de precursores DA DA
- Prepare a suspensão celular para transplante. Para a Engraftment celular, suspender 2 x 105 precursores da misturado por precursores D10 e D13 da na proporção de 1:7 em 4 μL de 5 g L-1 de glicose em solução salina equilibrada (tabela de materiais) de tampão de transplante.
- Realize cirurgia de transplante celular seguindo os procedimentos descritos na seção 4,4, exceto que 6 OHDA é substituída pela suspensão ou tampão DA célula precursor DA DA.
- Realizar a avaliação comportamental 2, 4, 6, 8, 12, 16 semanas após o transplante celular de precursores da DA seguindo os procedimentos descritos na seção 5. Conte o número de rotações contralaterais induzidas pela apomorfina em relação ao lado da lesão por minuto e registre sua atividade com uma câmera de vídeo.
Nota: após o transplante, uma taxa reduzida de rotações contralaterais sugere uma função motora melhorada. - Em 4, 8, 12, e 16 semanas após a transplantação da pilha, perfuse o rato a anestesia profunda com o paraformaldeído de 4% até que o corpo do rato se torne duro e o fígado do rato se torne pálido.
- Separe o cérebro do mouse suavemente e colocar o cérebro em 4% paraformaldeído a 4 ° c durante a noite.
- No segundo dia, coloque o cérebro em 30% de sacarose para a desidratação até que o cérebro afunda para o fundo.
- Corte os cérebros a 40 μm de espessura usando um micrótomo congelante.
- Realize imunomarcação conforme descrito anteriormente nas etapas 3.4.5-3.4.12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aqui, nós relatamos um protocolo que cubra estágios diferentes da terapia da pilha de iNSC-DA para tratar modelos do paládio. Primeiramente, os PBMNCs foram isolados e expandidos, e reprogramados em iNSCs pela infecção de SeV. Uma representação esquemática dos procedimentos com expansão de PBMNC e indução de iNSC é mostrada na Figura 1. No dia-14, os PBMNCs foram isolados usando um meio de gradiente de densidade (tabela de materiais). Antes da centrifugação, o sangue diluído com PBS e o meio de gradiente de densidade foram separados em duas camadas. Após a centrifugação, apareceram quatro camadas de gradiente (de baixo para cima): a camada inferior continha granulócitos e eritrócitos; a segunda camada continha meio de gradiente de densidade; o terceiro continha PBMNCs (seta vermelha); a camada superior continha plasma rico em plaquetas (Figura 2a). Após 14 dias de expansão, os PBMNCs foram infectados com SeV como dia 0. No dia 1, o meio com SeV foi removido (Figura 2B). Conforme ilustrado na Figura 2B, espera-se que o número de células tenha sido reduzido gradualmente. As células foram submetidas a uma morte drástica (> 60%) até o dia 5 (Figura 2B). as colônias do iNSC emergiram no dia 12 no mais adiantado (Figura 2B). Após a colheita e transferência de clones de iNSC para expansão para um número de passagens, a morfologia das células é mostrada na Figura 2C. Os iNSCs mostraram boa morfologia e podem autorenovar estavelmente no meio do iNSC, seja em forma de monocamada ou como esferas (Figura 2C).
os iNSCs poderiam dar origem aos neurônios DA DA usando um método de duas etapas (Figura 1). Durante o estágio um que durou 10 dias, os inscs foram tratados com SAG1 e FGF8b para induzir a especificação de pilhas da placa de assoalho do VM com potenciais neurogênica. Em seguida, as células foram tratadas com ácido ascórbico, BDNF, GDNF, cAMP, DAPT, TGF-βIII na segunda etapa (Figura 1). Com este método de dois estágios, os precursores DA DA podem ser obtidos no final do primeiro estágio, e os neurônios mais maduros DA DA podem ser gerados no final do segundo estágio. Após 24 dias de diferenciação, os inscs poderiam ser eficientemente especificados para os neurônios da da como a maioria deles expressaram a caixa de empilhe a2 (FOXA2), a classe III β-tubulin do neurônio-específico (TUJ1) e o hidroxilase do tirosina (TH) (Figura 3).
Três semanas após o estabelecimento de modelos unilaterais do rato do PD 6-OHDA-lesioned, a avaliação comportável foi conduzida para estimar sintomas do paládio (Figura 4a). Em seguida, uma semana depois, os precursores dopaminérgicos foram transplantados para os modelos de camundongo PD (Figura 4a). A avaliação comportamental foi realizada uma semana antes e 2, 4, 6, 8, 12 semanas após o transplante celular (Figura 4A). Os camundongos que receberam transplante celular mostraram melhora significativa na função motora (Figura 4B). A extensão do lesioning 6-OHDA-induzido pode ser verificada pela mancha Immunofluorescent post-mortem para o th no striatum, no pacote medial do prosencéfalo (MFB) e no SNPC (Figura 4C). Os sinais TH-positivos em camundongos enenxertados foram muito recuperados no estriado onde as células foram implantadas e levemente recuperadas no SNpc (Figura 4C). Três meses após o transplante, cerca de 13,84% eram os neurônios TH+ da entre as células sobreviventes (Figura 4D, E). Cerca de 91,72% e 86,76% das células TH+ foram expressas como receptores nucleares órfãos (NURR1) e FOXA2, respectivamente (Figura 4D, e). Cerca de 98,77% das células TH+ foram comarcadas com potássio retificador interno acoplado à proteína G (GIRK2) (Figura 4D, E).
Figura 1 : Uma representação esquemática dos procedimentos referentes à expansão do PBMNC, indução do iNSC e diferenciação de iNSCs em precursores DA da. Os PBMNCs foram isolados e expandidos em meio de MNC por mais de 14 dias e, em seguida, infectados com SeV codificando SOX2 humano, OCT3/4, c-Myc e KLF4. as colônias de iNSC emergiram tão cedo quanto 12 dias após a infecção de SeV. Após 3-4 semanas, as colônias do iNSC foram colhidas e diferenciadas em precursores DA DA por um método de dois estágios. PBMNCs: células mononucleares do sangue periférico; MNC: células mononucleares; iNSCs: células-tronco neurais induzidas; SeV: vírus de Sendai; DA: dopaminérgico; PDL: poli-D-lisina; BDNF: fator neurotrófico derivado do cérebro; GDNF: fator neurotrófico derivado da linha celular glial; AA: ácido ascórbico; Acampamento: dibutyryladenosine monofosfato cíclico; TGF: fator de crescimento transformador. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Os Pbmncs são isolados e expandidos, e reprogramados então no iNSCs pela infecção de Sev. (A) um exemplo de PBMNCs antes e depois da centrifugação do gradiente. Antes da centrifugação, amostras de sangue diluídas e meio de gradiente de densidade foram separadas em duas camadas. Após a centrifugação, quatro camadas de gradiente de densidade formadas de baixo para cima: a camada inferior continha granulócitos e eritrócitos; a segunda camada continha o meio de gradiente de densidade; a terceira camada continha PBMNCs (seta vermelha); a camada superior continha plasma rico em plaquetas. (B) as imagens da morfologia típica das células após PBMNCs foram infectadas com Sev nos dias 1, 2, 5 e 12. Depois que os PBMNCs foram contaminados com SeV, algumas das pilhas morreram e o número de pilhas foi reduzido gradualmente. Um pequeno número de células permaneceu no dia 5. No dia 12, surgiram colônias iNSCs. Barra de escala, 100 μm. (C) a morfologia típica de inscs da passagem número 20 na cultura da monocamada e da esfera. Barra de escala, 100 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Diferenciação de iNSCs para neurônios dopaminérgicos. Coloração imunofluorescente para FOXA2, TH, TUJ1, DAPI e imagens mescladas no dia 24 em células diferenciadas de iNSCs. Barra de escala, 50 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Transplantação de precursores iNSC-diferenciados DA da em modelos unilaterais do rato do PD 6-OHDA-lesioned. (A) cronograma para transplante celular e testes comportamentais. (B) os resultados dos testes comportamentais em diferentes pontos temporais do grupo de células 6 OHDA + (n = 10), 6-OHDA + grupo tampão (n = 8) e grupo controle (n = 3). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (MEV). p < 0, 1 por análise de variância (ANOVA) bidirecional com o teste de comparação múltipla de Dunnett. (C) coloração imunofluorescente post-mortem para th no estriado, feixe do prosencéfalo medial (MFB) e substância negra nigra (SN) do hemisfério 6-OHDA-leisioned, do hemisfério 6-OHDA + das pilhas, e do grupo de controle. Barras de escala, 100 μm. (D) porcentagens de FOXA2/th, NURR1/th, GIRK2/TH, th/HNA em camundongos enenxertados 3 meses após o transplante. HNA: anticorpo de núcleos humanos. Os dados são apresentados como média ± SEM. (e) coloração imunofluorescente para FOXA2, NURR1, GIRK2, th e HNA em fatias cerebrais de camundongos PD 12 semanas após o transplante celular. HNA: anticorpo de núcleos humanos. Este número foi modificado de Yuan et al.11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui nós apresentamos um protocolo que cobria estágios diferentes da terapia da pilha de iNSC-DA para modelos do paládio. Os aspectos críticos deste protocolo incluem: (1) isolação e expansão de pbmncs e reprogramação de pbmncs em inscs pela infecção de Sev, (2) diferenciação de inscs aos neurônios de da, (3) estabelecimento de modelos unilaterais do rato do PD 6-OHDA-lesioned e comportamento avaliação e (4) transplante celular de precursores DA DA e avaliação comportamental.
Neste protocolo, a primeira parte envolve coletar e expandir pbmncs em um meio soro-livre (meio de MNC), que expanda preferencialmente eritroblastos e não apoie a proliferação do linfócito. Em estudos prévios, vários tipos de células somáticas foram reprogramados para iPSCs ou inscs12,13,14. Em comparação com outros tipos de células somáticas, PBMNCs possuem várias vantagens. A vantagem a mais significativa é seus testes padrões favoráveis da expressão de gene e perfis epigenéticas. Os PBMNCs são de vida curta in vivo e reabastecidos freqüentemente de células-tronco hematopoiéticas ativadas, e podem acumular menos mutações do que os fibroblastos da pele. Além disso, a forma de amostra de pbmncs é menos invasiva do que a dos fibroblastos, e leva um curto período de tempo para expandir pbmncs (cerca de 14 dias) versus fibroblastos (cerca de 28 dias)16,17. Após a centrifugação usando um meio de gradiente de densidade, quatro gradientes de densidade serão formados de baixo para cima; a camada inferior contém granulócitos e eritrócitos, a segunda camada inferior contém o meio de gradiente de densidade, a terceira camada contém MNCs, e a camada superior contém plasma. O rendimento dos PBMNCs varia normalmente entre os indivíduos, particularmente os de diferentes idades. Geralmente, as pessoas mais jovens tendem a ter um maior número de PBMNCs do que as pessoas idosas. Com o protocolo descrito, cerca de 1,8 − 3,4 x 107 pbmncs poderiam ser isolados de 15 ml de PB. Entre PBMNCs, as pilhas de haste hematopoietic de CD34+ são relativamente propensas a reprogramming, e o meio de MNC pode enriquecer pilhas de haste HEMATOPOIETIC de CD34+ até certo ponto. Espera-se que um número igual ou maior de células visíveis cultivadas com meio MNC permaneça após 14 dias de expansão. Sev, um vírus não integrativo de RNA, tem um genoma de sentido negativo, único, não segmentado que não se integra ao genoma do hospedeiro, mas apenas Replica no citoplasma das células infectadas18,19. Os fatores de reprogramação da codificação SeV recombinante OCT3/4, SOX2, KLF4 e c-Myc, podem ser gerados como um mutante sensível à temperatura, que poderia ser facilmente removido a 39 ° c20. Com este protocolo, nós derivamos 8-20 colônias do iNSC reprogramando PBMNCs de um voluntário ou de um paciente saudável usando 15 mL do PB. Em seguida, os pesquisadores poderiam selecionar colônias com boas morfologias para maior de e estabelecimento de linha. No relato publicado, os iNSCs dos números de passagem 10, 20 e 30 apresentaram taxas de proliferação semelhantes, e poderiam ser transitados mais de 50 vezes, demonstrando uma boa autorenovação e capacidade proliferativa11. os iNSCs podem ser caracterizados por ensaios de diferenciação e imunocoloração para marcadores de células-tronco neurais SOX2, PAX6, NESTIN e OLIG2, e o marcador proliferativo de 67. os inscs devem expressar aqueles marcadores neurais da pilha de haste e possuir uma habilidade da diferenciação de tornar-se TUJ1+, map2+ neurônios (após 6 semanas), GFAP+ astrócitos (após 6 semanas) e OLIG2+, O1+ oligodendrócitos (após 7-8 semanas)11. Entretanto, uma limitação deste protocolo é que o meio de MNC é preferencialmente favorável à expansão do erythroblast, que pode o tornar não apropriado para gerar iNSCs dos pacientes que são deficientes no desenvolvimento do erythroblast. Além disso, a eficiência da reprogramação de PBMNCs para o iNSCs não é alta. Pode-se aumentar a eficiência de reprogramação usando certas moléculas pequenas ou aumentando o rendimento usando mais PBMNCs de partida23.
O método sobre a diferenciação de iNSCs em neurônios DA DA descrita aqui se baseia em um grande número de protocolos para diferenciação neural. Como o PD é causado principalmente pela degeneração dos neurônios da da localizados no midbrain1,2, o objetivo dos protocolos é focado na derivação de neurônios da VM especializados, que surgem das células da placa de piso durante o desenvolvimento24. A indução de células da placa de assoalho de VM com potenciais neurogênica depende de dois morphogens chaves, shh e FGF8b6,25,26. Shh é um morfogênio ventralizante, secretado por notochord26,27. Aqui nós substituímos SHH com a pequena molécula SAG1, um agonista do caminho SHH que é mais econômico do que SHH. Além disso, o meio de cultura neural básico e o suplemento (tabela de materiais) são importantes para a sobrevivência e diferenciação neuronal. Com este protocolo, os precursores DA DA foram obtidos no final do primeiro estágio, e os neurônios mais maduros DA DA foram gerados no final do segundo estágio. Aumentar o período de tempo da segunda fase para 40-55 dias poderia aumentar ainda mais a proporção de neurônios maduros DA cultura. Incluídos no segundo estágio, estão o ácido retinóico, BDNF, GDNF, TGF-βiii, dapt e Camp, que demonstraram ser capazes de promover a maturação e a sobrevida da neurônio da. Para testar a eficiência de iNSCs em diferenciação em neurônios DA DA, as células diferenciadas foram examinadas para expressão de marcadores NURR1, FOXA2, GIRK2 e TH. Em estudo prévio, no final do estágio I (dia 10), 87,76% e 65,33% das células expressaram NURR1 e FOXA2, respectivamente11. No final do estágio II (dia 24), o percentual de células NURR1+ atingiu 95,58% e a proporção de FOXA2+ células atingiu 77,33%11. Neste momento, 57,23% e 28,55% das células foram positivas para TH e GIRK2, respectivamente11. Semelhante ao observado para diferenciação do iPSC em relação aos neurônios DA DA, também existe uma variação de lote/linha para linha para diferenciação do iNSC, que é influenciada por fatores como o estado celular, a atividade de pequenas moléculas utilizadas e a plasticidade de células-tronco de diferentes pessoas. Destaca-se também que um determinante fundamental da eficiência de diferenciação é a densidade celular. Recomenda-se uma densidade de semeadura de 5 x 103 células por uma lamínula de vidro de 12 mm em placas de 24 poços. Na verdade, os iNSCs exibem uma boa taxa proliferativa durante a fase de diferenciação I. Os iNSCs semeados em um poço de uma placa de 24 poços daria origem a um número suficiente de precursores DA DA diferenciação dia 10 − 13 para transplante em um mouse (2 x 105 para cada mouse).
Este protocolo apresenta um método para o estabelecimento de modelos unilaterais reprodutíveis e estáveis do rato do PD 6-OHDA-lesioned. A extensão da lesão de 6 OHDA pode ser estimada pela avaliação comportamental que mede as rotações contralaterais após a injeção de apomorfina. Além disso, o grau de lesão induzida por 6 OHDA pode ser quantificado pela coloração imunofluorescente pós-morte para TH no SNpc. Outro tipo de neurotoxina utilizada na modelagem do PD é 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tertaidropiridina (MPTP), que também interrompe as vias dopaminérgicas. Comparado com o MPTP, 6-OHDA pode ser administrado uni-ou bilateralmente. Além disso, o método MPTP é mais sensível à idade animal, gênero e estirpe e, assim, pode mostrar um maior grau de variação entre os animais28. Os fatores críticos incluem a seleção de camundongos com peso correspondente, injetando solução de 6 OHDA preparada na hora e realizando cirurgia com precisão e rapidez.
Os procedimentos da transplantação da pilha de precursores do da no estriado de ratos lesados são basicamente os mesmos que os procedimentos para a geração de modelos do rato do PD de 6 OHDA-lesados, exceto que 6 OHDA é substituído por precursores da da injeção etapa. O fator-chave nesta parte é Pesquisar a janela de tempo ideal de diferenciação de células DA para transplante. Demonstrou-se que um grau mais elevado de células correlaciona com uma taxa de sobrevivência mais elevada mas um potencial mais baixo da especificação em neurônios maduros da da11. No entanto, um estágio mais maduro das células neurais é mais vulnerável e mostra uma menor taxa de sobrevida após o transplante11. Portanto, encontrar uma janela de tempo adequada que equilibra a capacidade de maturação e sobrevivência é de importância. Em um estudo prévio, transplantamos células de diferenciação dia 10 e 13 no estriado de camundongos SCID-bege imunodeficientes11. Um mês após o Engraftment, os resultados imunofluorescentes da mancha revelaram que aproximadamente 88,63% e 93,13% eram TUJ1-positive para o dia 10 e os grupos do dia 13, respectivamente, e algumas pilhas do TH+ (5,30%) foram detectados a partir do dia 13 grupo, mas poucos TH+ células do grupo dia 10. Não obstante, comparado às pilhas do dia 13, as pilhas do dia 10 deram origem a uma taxa de sobrevivência total ligeiramente mais elevada11. Os resultados revelaram que o dia 10 ao dia 13 é uma janela de tempo óptima das pilhas para o Engraftment11. Neste protocolo, utilizou-se uma mistura de células da da diferenciação dia 10 e dia 13 em uma proporção de 1:7 para o Engraftment, que mostrou um bom resultado de sobrevida e diferenciação11. Usando uma mistura de células do dia 10 e dia 13 foi baseado em uma hipótese de que as células neurais relativamente imaturos e maduros, quando colocados juntos, podem apoiar uns aos outros, reminiscente da situação in vivo em camundongos onde células-tronco neurais são cercados por neurônios maduros.
Este protocolo apresenta o método de geração de iNSCs a partir de PBMNCs por infecção por SeV, diferenciando iNSCs em neurônios DA DA, e transplantando precursores DA DA em modelos de mouse PD 6-OHDA-lesionados. Usando este protocolo, pode-se gerar iNSCs com potenciais não só para o tratamento da DP, mas também de outras doenças neurodegenerativas. Uma vez que os iNSCs representam um estágio NSC primitivo, eles podem ser especificados em diferentes células neurais específicas da região, como neurônios da medula espinhal ou neurônios motores, que podem ser de utilidade promissora para o tratamento da esclerose lateral amiotrófica ou lesão medular. Além disso, os iNSCs derivados de pacientes com doença familiar oferecem uma plataforma para estudar mecanismos subjacentes ao início e desenvolvimento da doença e realizar testes de triagem de drogas.
Há mais de uma maneira de obter células neurais DA DA para estudos de transplante. As células DA podem também ser geradas a partir de iPSCs ou por conversão direta29. Comparado com iPSCs, os inscs são inerentes com risco reduzido da formação do tumor, um período mais curto de reprogramação e estabelecimento da linha, e a plasticidade linhagem-comprometida-somente capaz de diferenciar-se em neurônios e em glia11. Comparado com a conversão direta, diferenciando precursores DA da iNSCs dá origem a um maior rendimento e eficiência30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O trabalho foi apoiado pelas seguintes subvenções: célula-tronco e tradução do projeto chave nacional (2016YFA0101403), Fundação Nacional de ciências naturais da China (81661130160, 81422014, 81561138004), Fundação Municipal de ciência natural de Pequim (5142005), Fundação dos talentos de Beijing (2017000021223TD03), projeto da sustentação de professores de nível elevado em universidades municipais de Beijing no período do 13º plano do cinco-ano (CIT & TCD20180333), concessão de talento de nível elevado do sistema médico de Beijing (2015-3-063), Beijing Fundo da Comissão Municipal de saúde (PXM 2018_026283_000002), Pequim 100, mil e 10000 fundo de talentos (2018A03), administração municipal de Pequim de hospitais de medicina clínica desenvolvimento de apoio especial de financiamento (ZYLX201706), e os Royal Society-Newton bolsa avançada (NA150482).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15-ml conical tube | Corning | 430052 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic for inhalation and skin contact |
| 24-well plate | Corning | 3337 | |
| 50-ml conical tube | Corning | 430828 | |
| 6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Cell dissociation reagent |
| Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A92902 | Toxic with skin contact |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | Brain derived neurotrophic factor |
| Blood collection tubes containing sodium heparin | BD | 367871 | |
| BSA | yisheng | 36106es60 | Fetal bovine serum |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dibutyryladenosine cyclic monophosphate |
| CellBanker 2 | ZENOAQ | 100ml | Used as freezing medium for PBMNCs |
| Chemically defined lipid concentrate | Invitrogen | 11905031 | |
| CHIR99021 | Gene Operation | 04-0004 | |
| Coverslip | Fisher | 25*25-2 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417-10mg | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915-100MG | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11330 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320 | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| EPO | Peprotech | 100-64-50UG | Human Erythropoietin |
| FGF8b | Peprotech | 100-25 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | P=1.077, density gradient medium |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | Glial derived neurotrophic factor |
| GlutaMAX | Invitrogen | 21051024 | 100 × Glutamine stock solution |
| Ham's-F12 | Gibco | 11765-054 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175079 | Balanced salt solution |
| Human leukemia inhibitory factor | Millpore | LIF1010 | |
| Human recombinant SCF | Peprotech | 300-07-100UG | |
| IGF-1 | Peprotech | 100-11-100UG | Human insulin-like growth factor |
| IL-3 | Peprotech | 200-03-10UG | Human interleukin 3 |
| IMDM | Gibco | 215056-023 | Iscove's modified Dulbecco's medium |
| Insulin | Roche | 12585014 | |
| ITS-X | Invitrogen | 51500-056 | Insulin-transferrin-selenium-X supplement |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | Serum free basal medium |
| Laminin | Roche | 11243217001 | |
| Microsyringe | Hamilton | 7653-01 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| NEAA | Invitrogen | 11140050 | Non-essential amino acid |
| Neurobasal | Gibco | 10888 | Basic medium |
| PDL | Sigma-Aldrich | P7280 | Poly-D-lysine |
| SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
| SB431542 | Gene Operation | 04-0010-10mg | Store from light at -20? |
| Sendai virus | Life Technologies | MAN0009378 | |
| Sucrose | baiaoshengke | ||
| TGFβ? | Peprotech | 100-36E | Transforming growth factor β? |
| Transferrin | R&D Systems | 2914-HT-100G | |
| Triton X 100 | baiaoshengke | Nonionic surfactant | |
| Trypan blue | Gibco | T10282 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 |
References
- Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson's disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, Pt 11 2958-2969 (2009).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).
- Chen, Z. Cell Therapy for Parkinson's Disease: New Hope from Reprogramming Technologies. Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Doi, D., et al. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S.
- Tang, X., et al. Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors. Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).
- Yuan, Y., et al. Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson's disease model. Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).
- Bazley, F. A., et al. Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells. Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).
- Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method. Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).
- Zhu, S., et al. Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds. Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).
- Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).
- Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson's disease. Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).
- Sheng, C., et al. Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors. Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).
- Prasad, A., et al. A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation. Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).
