Summary
Wir beschreiben ein Protokoll, das fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) verwendet, um mehrere herpesvirale RNAs in lytisch infizierten menschlichen Zellen zu visualisieren, entweder in Suspension oder anhaftend. Dieses Protokoll enthält die Quantifizierung der Fluoreszenz, die ein nukleozytoplasmatisches Verhältnis erzeugt, und kann für die gleichzeitige Visualisierung von Wirts- und viralen Proteinen mit Immunfluoreszenz (IF) erweitert werden.
Abstract
Mechanistische Erkenntnisse stammen aus einer sorgfältigen Untersuchung und Quantifizierung bestimmter RNAs und Proteine. Die relativen Positionen dieser Biomoleküle in der Zelle zu bestimmten Zeiten können mit Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenz (IF) erfasst werden. Während einer lytischen Herpesvirus-Infektion entführt das Virus die Wirtszelle, um bevorzugt virale Gene auszudrücken, was zu Veränderungen in der Zellmorphologie und dem Verhalten von Biomolekülen führt. Lytische Aktivitäten konzentrieren sich auf Atomfabriken, die als Viralreplikationsfächer bezeichnet werden und nur mit FISH und IF erkennbar sind. Hier beschreiben wir ein anpassungsfähiges Protokoll von RNA FISH- und IF-Techniken für Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus-infizierte Zellen, sowohl anhaftend als auch in Suspension. Die Methode umfasst Schritte zur Entwicklung spezifischer Anti-Sense-Oligonukleotide, Doppel-RNA-FISH, RNA-FISH mit IF und quantitative Berechnungen von Fluoreszenzintensitäten. Dieses Protokoll wurde erfolgreich auf mehrere Zelltypen, nicht infizierte Zellen, latente Zellen, lytische Zellen, Zeitläufe und Zellen angewendet, die mit Inhibitoren behandelt wurden, um die räumlich-zeitlichen Aktivitäten bestimmter RNAs und Proteine sowohl vom menschlichen Wirt als auch von Proteinen aus dem menschlichen Wirt und KSHV.
Introduction
In ihrer lytischen (aktiven) Phase kapern Herpesviren die Wirtszelle, was zu Veränderungen in der Zellmorphologie und Lokalisierung biologischer Moleküle führt, um Virionen zu erzeugen. Die Operationsbasis ist der Kern, in dem das doppelsträngige DNA-Virusgenom repliziert undin eine Proteinhülle, Capsid 1, verpackt wird. Zu Beginn drückt das Virus seine eigenen Proteine aus, entführt Wirtsmaschinen und verhindert die Expression von nicht-essentiellen Wirtsgenen, ein Prozess, der als Wirtsabschalteffekt bezeichnet wird. Der Großteil dieser Aktivität ist lokalisiert auf spezifische 4-,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)-freie Kernregionen, die als Viralreplikationskompartimenten bezeichnet werden und aus Wirts- und Viralproteinen, RNAs und viraler DNA2bestehen. Die Zelle wird überholt, um Platz und Ressourcen für die Replikationsräume und damit die Montage von viralen Kapsiden bereitzustellen. Sobald das Capsid den Kern verlässt, ist unklar, wie das Capsid in das Zytoplasma eingehüllt wird, um ein membrangebundenes virales Teilchen zu produzieren, das auch als Virion bekannt ist. Das Verständnis der Lokalisierung und räumlichen Verschiebungen von Wirts- und viralen Biomolekülen während der lytischen Phase bietet tiefere mechanistische Einblicke in die Anordnung des Replikationsfachs, den Wirtsabschalteffekt, den Virion-Egress-Pfad und andere Prozesse im Zusammenhang mit herpesviralen Infektionen und Replikationen.
Derzeit ist die beste Methode, um diese Veränderungen zu erkennen und zu untersuchen, die Visualisierung von Proteinen und RNAs in infizierten Zellen mit Immunfluoreszenz (IF) bzw. fluoreszierender In-situ-Hybridisierung (FISH). Die Verwendung eines Zeitverlaufs mit diesen Techniken zeigt die Lokalisierung von Biomolekülen an zentralen Punkten der lytischen Phase oder einfach, raumzeitliche Daten. FISH und IF ergänzen andere biochemische Techniken, wie z. B. Hemmung eines zellulären Prozesses (z. B. Hemmung der viralen DNA-Replikation), RT-qPCR (Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion), RNA-Sequenzierung, Nordflecken, Massenspektrometrie, Western Blotting und Analyse der viralen DNA-Produktion, die ein globaleres Bild der zellulären Aktivitäten liefern kann.
Wir entwickelten RNA-FISH-Strategien, um die RNA-Produkte aus bestimmten Genen zu untersuchen, und eine Rechneranalyse, die das nukleozytoplasmatische Verhältnis eines bestimmten Genprodukts quantitativ berechnet. Die Probenvorbereitung, modifiziert aus früheren Veröffentlichungen von Steitz und Kollegen3,4, ist relativ einfach und kann sowohl für Haftzellen als auch für suspendierte Zellen verwendet werden. Das Protokoll ist auch für den gleichzeitigen Einsatz mehrerer RNA FISH-Strategien (Double RNA FISH) oder RNA FISH mit IF-Strategien anpassungsfähig. Die Entwicklung einer spezifischen FISH-Strategie ist eine Herausforderung, aber es werden Vorschläge zur Verbesserung des Erfolgs skizziert. Die hier beschriebene Datenanalyse ist quantitativ, wenn fluoreszierende Perlen und starke Marker von Fachgrenzen verwendet werden und bietet zusätzliche Einblicke in die Mikrographen, Erkenntnisse, die Beobachtungsverzerrungen entfernen. Das detaillierte Protokoll ist sowohl für latente als auch für lytische Zellen konzipiert, die mit dem Mit dem Kaposi-Sarkat-assoziierten Herpesvirus (KSHV) infiziert sind, und kann mit nicht infizierten Zellen oder Zellen verwendet werden, die mit anderen Herpesviren infiziert sind5. Die Methoden der Quantifizierung sind auf Studien über nukleozytoplasmatische Verschiebungen oder Relokalisierung zwischen subzellulären Kompartimenten in den meisten Zellen anwendbar.
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Protocol
1. Entwicklung von Fluoreszenz in situ (FISH) Anti-Sense-Oligonukleotide zum Nachweis einer spezifischen herpesviralen Transkription
- Wählen Sie 25 bis 40 nt Segmente aus der Sequenz der RNA von Interesse und konvertieren Sie, um Anti-Sinn zu sein. Eine erfolgreiche FISH-Strategie kann von einem bis zu zehn oder mehr verschiedenen Anti-Sense-Oligonukleotiden enthalten. Berücksichtigen Sie bei der Auswahl von Sequenzen Folgendes:
- Wenn die RNA von Interesse einen einzigartigen Wiederholungsbereich enthält, dann nutzen Sie dieses Feature und entwerfen Sie ein Anti-Sense-Oligonukleotid, um die Wiederholungssequenz zu zielen.
HINWEIS: Tycowski und Kollegen5 liefern ein Beispiel für diese Strategie mit Rhesus rhadinovirus (RRV) polyadenylierte Kernkraft (PAN) RNA. - Wenn die RNA von Interesse eine bekannte Protein-Bindungsstelle oder Stammschleifenstruktur enthält, entwerfen Sie Oligonukleotide, die diese Regionen vermeiden.
- Je nach den Zielen der Experimente sollten Sie die intronische Reihenfolge berücksichtigen und prüfen, ob ein Anti-Sense-Oligonukleotid dafür entwirft wird.
- Wenn die RNA von Interesse einen einzigartigen Wiederholungsbereich enthält, dann nutzen Sie dieses Feature und entwerfen Sie ein Anti-Sense-Oligonukleotid, um die Wiederholungssequenz zu zielen.
- Führen Sie einfache Rechenanalysen an den ausgewählten Anti-Sense-Sequenzen durch, um die Bindungsspezifität zu gewährleisten und die Aggregation des Anti-Sense-Oligonukleotids zu reduzieren.
- Die Sequenzen müssen ca. 50% GC-reich (hoher Guanin- und Cytosingehalt) sein und eine Schmelztemperatur im Bereich von 60 bis 70 °C aufweisen.
- Verwenden Sie ein Sequenzanalysewerkzeug, um Sequenzen auszuwählen, die sich nicht selbst dimerisieren oder Haarnadeln mit Schmelztemperaturen über 37 °C bilden, die Hybridisierungstemperatur.
- Führen Sie eine NCBI BLASTn (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool for Nukleotide Alignments) durch, um die ausgewählten Sequenzen sowohl mit dem Host als auch mit viralen Transkriptomen unter Verwendung der Einstellung "etwas ähnlich" zu durchsuchen. Diese Suche identifiziert einzigartige Anti-Sense-Oligonukleotide, die wahrscheinlich nicht an andere Host- oder virale Transkripte binden.
HINWEIS: Wenn Transkriptome nicht verfügbar sind, führen Sie die BLAST-Suche mit den genomischen Sequenzen durch. Es ist ideal, wenn die Suchvorgänge auf die Sequenzen aus dem Virus durchgeführt werden, das von den infizierten Zellen isoliert wird, die im Experiment verwendet werden, da wilde Stämme dazu neigen, zu diversifizieren und eine Kombination von Sequenzen aus verschiedenen Laborstämmen enthalten.
- Order gereinigte DNA-Oligonukleotide entsprechend der Anti-Sinn-Sequenz, die rechnerisch verifiziert wurde, um eindeutig zu sein und wahrscheinlich an die Ziel-RNA zu binden. Es müssen keine besonderen Modifikationen in die Oligonukleotide eingeführt werden.
- Testen Sie die entworfenen Anti-Sense-Oligonukleotide auf Bindungsspezifität durch FISH und Northern Blot.
- Unter Verwendung einer nicht infizierten Zelllinie von der gleichen Wirtsart (z.B. 293T) und idealerweise desselben Zelltyps führen Sie eine Transfektion mit einem Plasmid durch, das die RNA von Interesse von einem robusten Promotor (CMV, Cytomegalievirus) und einer mit dem leeren Vektor (z. B. pcDNA3) ausdrückt. Verwenden Sie eine Positivkontrolle für die Transfektion, wie z. B. Die Kotransfektion mit einem GFP-Plasmid (grünefluoreszierende Proteine) (z. B. pmaxGFP) oder dem GfP-Vektor.
HINWEIS: Es ist wichtig, Zelllinien zu vermeiden, die mit dem Herpesvirus Epstein-Barr Virus (EBV) verewigt wurden, da es Sequenzähnlichkeiten zwischen Herpesviren gibt. - Führen Sie FISH wie in Abschnitt 3 beschrieben auf beiden Gruppen von Zellen mit den Anti-Sense-Oligonukleotiden, wie in diesem Protokoll beschrieben. Schließen Sie die erfolgreichen Kandidaten ab, indem Sie FISH-Experimente mit einzelnen, Paaren oder Sätzen der Anti-Sense-Oligonukleotide vergleichen. Verwenden Sie eine positive Kontrolle für das FISH-Protokoll wie U2 snRNA (kleine kernnukleare RNA) FISH, vorhanden bei 500.000 Kopien pro menschlichem Zellkern6 (Tabelle 1).
- Das fluoreszierende Signal sollte spezifisch und stark in der Zelle sein, die die RNA von Interesse enthält. Entwerfen Sie zusätzliche Anti-Sense-Oligonukleotide, um das Signal zu stärken und Anti-Sense-Oligonukleotide zu entfernen, die nicht spezifisch von der Betrachtung binden. Die Signalstärke muss über dem Hintergrund und der Autofluoreszenz liegen.
- Testen Sie die Bindungsspezifität durch Northern Blot.
- Unter Verwendung einer nicht infizierten Zelllinie von der gleichen Wirtsart (z.B. 293T) und idealerweise desselben Zelltyps führen Sie eine Transfektion mit einem Plasmid durch, das die RNA von Interesse von einem robusten Promotor (CMV, Cytomegalievirus) und einer mit dem leeren Vektor (z. B. pcDNA3) ausdrückt. Verwenden Sie eine Positivkontrolle für die Transfektion, wie z. B. Die Kotransfektion mit einem GFP-Plasmid (grünefluoreszierende Proteine) (z. B. pmaxGFP) oder dem GfP-Vektor.
2. Oligonukleotid und Zellzubereitung
- Verwenden Sie nach den Anweisungen des Herstellers die Anti-Sense-Oligonukleotide mit Dioxigenin(DIG)-dUTP oder, wenn sie stark bindend sind, direkt mit einem fluoreszierenden Nukleotid wie Alexa Fluor 594-5-dUTP. Nach der Etikettierung ist keine zusätzliche Reinigung erforderlich. Beschriftete Oligonukleotide bei -20 °C bis zu mehreren Jahren und in Zinnfolie lagern, wenn sie direkt beschriftet sind, um Photobleichmittel zu verhindern.
VORSICHT: Die Etikettierlösung enthält ein giftiges Material, Kaliumkokodylat. Behandeln Sie Etikettierreaktionen mit Handschuhen.
HINWEIS: Um Ressourcen zu schonen, können mehrere verschiedene Anti-Sense-Oligonukleotide in einer Reaktion gekennzeichnet werden. Dieses Protokoll verwendet 3'-End-Kennzeichnung. Die interne Kennzeichnung ist eine Herausforderung, da die chemische Gruppe (z. B. DIG oder das Fluorophor) gefangen wird oder nicht in die aktive Stelle einer DNA-Polymerase gelangen kann. Ein Experiment mit zwei verschiedenen RNAs kann mit direkt gekennzeichneten Anti-Sense-Oligonukleotiden und Anti-DIG-Immunfluoreszenz mit einem anderen Fluorophor (z. B. FITC (Fluorescein) oder Alexa Fluor 488 mit Alexa Fluor 594 durchgeführt werden. - Befestigen Sie die Zellen an den Achtkammer-Dias.
HINWEIS: Achtkammer-Dias ermöglichen mehrere gleichzeitige Experimente bei gleichzeitiger Minimierung wertvoller Ressourcen wie Antikörper. Eine Alternative zu Achtkammer-Dias ist eine sechswellige Gewebekulturplatte mit Standard-Abdeckungen (22 mm x 22 mm), die beide steril sind. Eine ähnliche Anordnung ist mit kreisförmigen Abdeckungen und einer 24-Well-Gewebekulturplatte möglich. Erhöhen Sie für beide die in diesem Protokoll genannten Volumina um das 10-15-fache (z. B. 1,75 ml Hybridisierungslösung) bzw. die 4x (z. B. 600 L Hybridisierungslösung).- Für anhaftende lytische Zellen 1x Trypsin/PBS bei 37 °C und 5% CO2 für 10 min verwenden, um Zellen auszusetzen und auf 60% Konfluenz zu verdünnen.
HINWEIS: In FISH-Experimenten verwendete Haftzellen umfassten 293T, iSLK.2197und iSLK-BAC36-Zellen8. - Tragen Sie 200 l Zellsuspension auf jede Kammer der sterilen Achtkammerschlitten auf und lassen Sie das Saatgutwachstumfür 12-24 h bei 37 °C und 5% CO2 zu. Passen Sie bei Bedarf für langsam e0er oder schnell wachsende Zellen und für Zellen, die leicht durch Trypsin beschädigt werden.
HINWEIS: Das Ziel besteht darin, gleichmäßig verteilte Zellen fest an der Folie befestigt zu haben. Erwägen Sie, eine lytische Phase nach der Adhäsion zu induzieren, wenn die lytischen Zellen zerbrechlich sind. Die Schlussfolgerungen aus Experimenten mit iSLK-Zellen sind begrenzt9. - Für lytische Suspensionszellen achtkammerige Dias mit 1:10 Poly-L-Lysin für 5 min unter der Gewebekulturhaube vorbehandeln. Dann lassen Sie die Rutschen über Nacht bei Raumtemperatur oder 1 h bei 65 °C trocknen. Inkubieren Sie 800 l lytische Zellen in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml mit den kammergefilterten Dias für 30 min bis 1 h bei 37 °C und 5% CO2 .
HINWEIS: Suspensionszellen setzen sich in einer Monoschicht ab, kleben an dem Poly-L-Lysin und daher sind überschüssige Zellen im Vergleich zu anhaftenden Zellen kein Problem. Lytische Zellen, die Traubenhaufen bilden, sollten, wenn möglich, durch sanfteWirbel oder chemische Mittel getrennt werden. Zwar hatten die Autoren bei lytischen BJAB-RRV-GFP-Zellen wenig Erfolg mit solchen Empfehlungen. Wenn Suspensionszellen nicht gut haften, sollten Sie entweder die Zeit oder Konzentration der Poly-L-Lysin-Inkubation erhöhen.
- Für anhaftende lytische Zellen 1x Trypsin/PBS bei 37 °C und 5% CO2 für 10 min verwenden, um Zellen auszusetzen und auf 60% Konfluenz zu verdünnen.
3. Fixierung, Immunfluoreszenz (optional), Hybridisierung und Visualisierung viraler RNAs
- Entfernen Sie Medien und überschüssige Zellen. Verwenden Sie während dieses Protokolls Vakuumabsaugung, um Lösungen und sanftes Mikropipetting zu entfernen, um Lösungen hinzuzufügen.
HINWEIS: Die Festigkeit eines Vakuums kann reduziert werden, indem eine 200-L-Mikropipette-Spitze über die glasgläserne Pasteurpipette platziert wird. Ersetzen Sie die Mikropipettespitze zwischen den Waschstufen, um eine Kontamination zu verhindern. Jeder Waschschritt muss schnell durchgeführt werden, da es zwingend notwendig ist, dass die Zellen nie austrocknen. - Fixieren Sie die Zellen mit vorgekühlten 4% Formaldehyd/PBS (Phosphat-gepufferte Saline) 30 min auf Eis. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 200 l 1x PBS auf 4 °C abgekühlt und 5 min bei Raumtemperatur oder auf Eis inkubieren.
- Permeabilisieren Sie die festen Zellen mit 200 l vorgekühlten 0,5% Triton-X/PBS (Phosphat gepufferte Saline) für 10 min auf Eis oder 750 l vorgekühltem 70% Ethanol bei 4 °C für 1 h (min) bis 7 d (max).
HINWEIS: Sammeln Sie Protein-, RNA-Gesamt- und genomische DNA-Proben am Fixierungspunkt, um die Konsistenz zwischen Bildern und biochemischen Assays zu gewährleisten. Alle Wässerungen in diesem Protokoll werden auf die gleiche Weise ausgeführt, sofern nicht anders angegeben. 70% Ethanol lockert den Kleber zwischen den Kammern und dem Schlitten, was die spätere Trennung erleichtert und auch eine signifikante Pause im Protokoll ermöglicht. Verwenden Sie jedoch Paraffinfolie um die Kammerrutsche, um die Verdunstung zu reduzieren und den Gehalt des Ethanols in jeder Kammer etwa alle 8 h zu überprüfen. 70% Ethanol glättet auch die Zellen, wodurch ein knackigeres Bild entsteht, während Triton-X die Zellen nicht dehydriert und die Abmessungen der Zelle.
- Permeabilisieren Sie die festen Zellen mit 200 l vorgekühlten 0,5% Triton-X/PBS (Phosphat gepufferte Saline) für 10 min auf Eis oder 750 l vorgekühltem 70% Ethanol bei 4 °C für 1 h (min) bis 7 d (max).
- Entfernen Sie die Kammern vorsichtig, um risse am Schlitten zu verhindern. Wenn das Experiment die Immunfluoreszenz (IF) eines viralen oder Wirtsproteins mit einem polyklonalen Primärantikörper enthält, führen Sie das IF wie unten beschrieben durch, bevor Sie mit RNA FISH fortfahren. Wenn die Immunfluoreszenz einen monoklonalen Primärantikörper verwendet, führen Sie die Immunfluoreszenz gemäß Schritt 3.3.1 nach Schritt 3.11 durch.
HINWEIS: Verwenden Sie eine frische Entnahmevorrichtung oder eine mit sehr wenig Restkleber vom Hersteller zur Verfügung gestellt und sanft die Kammern zu erleichtern, um zu verhindern, dass der Schlitten risse. Die Verwendung von 70% Ethanol als permeabilisierendes Reagenz für 4 h reduziert die Wahrscheinlichkeit von Rissen erheblich. Im Falle eines Risses, setzen Sie das Protokoll über Kammern, die nicht durch den Riss betroffen sind, fort und achten Sie auf die höhere Oxidationsrate von unvollkommen versiegelten Dias (d. h. verminderte Lagerdauer).- Zellen mit vorgekühlten 1x PBS spülen und mit vorgekühlten 4% BSA (Rinderserumalbumin)/1x PBS für 30 min bei 4 °C blockieren.
HINWEIS: Die Verwendung von BSA in diesem Protokoll schränkt die unspezifische Kennzeichnung ein. - Entfernen Sie die Blockierlösung und inkubieren Sie die Zellen mit 1:200 oder einem anderen polyklonalen Primärantikörper in 0,1% BSA/1x PBS für 1 h bei 4 °C. Dann dreimal mit 1x PBS waschen.
HINWEIS: Bei 1:200 Verdünnung wurde ein Antikörper10 zum Nachweis von SSB/ORF6 (virales einsträngiges DNA-Bindungsprotein) verwendet. - Inkubieren Sie die Zellen mit einem sekundären Antikörper mit Fluorophor, der mit dem FISH-detektierenden Antikörper für 1 h bei 4 °C kompatibel ist. Dreimal mit 1x PBS waschen. Dann fixieren Sie mit 4% Formaldehyd/1x PBS für 10-15 min und permeabilisieren sie entweder mit Triton-X oder 70% Ethanol, wie zuvor beschrieben, bevor Sie zu FISH gehen. Abdeckung Sauge mit Zinnfolie, um fluoreszierendes Signal zu erhalten und Photobleichmittel zu verhindern.
- Zellen mit vorgekühlten 1x PBS spülen und mit vorgekühlten 4% BSA (Rinderserumalbumin)/1x PBS für 30 min bei 4 °C blockieren.
- Waschen Sie die Zellen einmal mit 2x SSC (Salin-Natriumcitrat) und wenden Sie dann 45 l Hybridisierungslösung an, die aus 50% Formamid, 10% Dextransulfat, 2x SSC, 0,1% BSA, 500 g/ml Lachssperma-DNA, 125 g/ml E. coli tRNA und 1 mM Vanadylribonucleosid Komplexe. Inkubieren Sie für 1 h bei 37 °C in einer Feuchtigkeitskammer, die eine 150 mm Petrischale mit befeuchteten sterilen Tüchern sein kann.
HINWEIS: Bereiten Sie eine neue Hybridisierungslösung mindestens eine Stunde vor Gebrauch vor. Lösen Sie das Dextransulfat zuerst in Wasser, wirbeln häufig und in einem 37 °C-Wasserbad. - Berechnen Sie eine empfohlene Konzentration von 25 -M Oligonukleotiden in 35-uL-Hybridisierungslösung pro Kammer. Stellen Sie die Konzentration von Anti-Sense-Oligonukleotid nach Bedarf ein. Fügen Sie destilliertes Wasser zu den Oligonukleotiden hinzu, um das Denaturierungsvolumen auf 10 l zu erhöhen.
HINWEIS: Nach der Etikettierungsreaktion werden die Oligonukleotide in der abgeschreckten Lösung mit 0,18 M Kaliumcacodylat, 23 mM Tris-HCl, 0,23 mg/mL BSA, 4,5 mM CoCl2, 18 mM EDTA, 2,7 mM K-Phosphat und 6,8 mM KCl, 45 mM 2-Mercaptoethanol, 0,02% Triton X-100 und 2% Glycerin. Die Konzentrationen sind hoch genug, dass die Verdünnung mit Wasser die Denaturierungslösung in Konzentrationen nahe 1x TE (10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA), einem Standard-Oligonukleotid-Denaturierungspuffer, bringt. - Denaturieren Sie die DIG- und/oder Alexa Fluor 594-markierten Oligonukleotide bei 95 °C für 5 min. Dann fügen Sie die denaturierte Oligonukleotide pro vorgesehener Kammer mit einer frischen Hybridisierungslösung von 35 l ein. Bei doppelter FISH-Ausführung können beide Sätze von Anti-Sense-Oligonukleotiden denaturiert und hybridisiert werden.
- Entfernen Sie die Vorhybridisierungslösung, und fügen Sie dann den Zellen eine Hybridisierungslösung hinzu, die die markierten Oligonukleotide enthält. Über Nacht in der Feuchtigkeitskammer bei 37 °C mit Zinnfolie inkubieren, um die fluorophor-markierten Oligonukleotide zu schützen.
HINWEIS: Die Inkubation sollte mindestens 10 h und nicht mehr als 24 h betragen. - Am nächsten Tag die Zellen zweimal mit 2x SSC für 10 min bei 37 °C und dann zweimal mit 1x SSC für 10 min bei 25 °C waschen.
- Fixieren Sie die Zellen mit vorgekühlten 4% Formaldehyd/1x PBS für 10-15 min auf Eis. Dann waschen Sie die Zellen mit PBS dreimal und permeabilisieren für 1 h mit vorgekühltem 70% Ethanol oder für 10 min mit vorgekühlten 0,5% Triton-X/1x PBS bei 4 °C.
- Inkubieren Sie die Zellen mit 1:200 Anti-DIG FITC in vorgekühlten 0,1% BSA/1x PBS für 1 h bei 4 °C. Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie sie dreimal mit 1x PBS.
- Mit vorgekühlten 4% Formaldehyd/1x PBS für 10-15 min bei 4 °C fixieren und dann dreimal mit 1x PBS waschen. Wenn Sie die Immunfluoreszenz für ein Wirt oder virales Protein mit einem monoklonalen Primärantikörper durchführen, permeabilisieren Sie die Zellen und führen Sie dann das in Schritt 3.3.1 beschriebene IF-Protokoll durch. Fahren Sie andernfalls mit der DAPI-Färbung fort.
- Inkubieren Sie die Zellen mit 0,4 g/ml DAPI in vorgekühlten 0,5% Triton-X/1x PBS für 15 min auf Eis und waschen Sie dann dreimal mit 1x PBS.
- Montieren Sie Rutschen mit fluoreszierenden Perlen (optional) und einem Montagemedium. Dann versiegeln Sie den Deckelrutsch mit klarem Nagellack an die Rutsche.
- Sammeln Sie mit einem konfokalen Mikroskop innerhalb einer Stunde bis zu einer Woche Bilder der Proben, wenn Sie das Protokoll bei 630-facher Vergrößerung durchführen. Tragen Sie mehrere Schichten Nagellacke auf, um den Deckelschlupf zu versiegeln und die Lebensdauer des Fluorophors zu verlängern, indem Sie die Oxidationsrate reduzieren.
HINWEIS: Verwenden Sie kein DAPI-haltiges Montagemedium. Wenn Sie die Bilder sammeln, fügen Sie die Maßstabsleiste für die spätere Quantifizierung auf jedem Bild ein. Fluoreszierende Perlen dienen als Steuerung der Fluoreszenzintensität zwischen Dias und Probenpräparaten11. Erfassen Sie Bilder am Mittelteil der Zelle für die zweidimensionale (2D) Quantifizierung in Schritt 4.
4. Quantifizierung von FISH- und IF-Bildern zur Hervorhebung der subzellulären Lokalisation und zur Bestimmung des nukleozytoplasmatischen Fluoreszenzverhältnisses
- Führen Sie eine Bildanalyse auf einem zusammengebauten Stapel der verschiedenen fluoreszierend gefärbten und zusammengeführten Bilder durch, um konsistenzfähig zu sein. Legen Sie den Maßstab der Bildanalysesoftware mithilfe der Maßstabsleiste fest, die bei der Erfassung der Bilder enthalten war.
- Um die Fluoreszenzintensität über mehrere Kanäle und in Bezug auf den nuklearen DAPI-Fleck zu quantifizieren, verwenden Sie ein Linienwerkzeug und eine Plotprofilfunktion. Geben Sie dann die Zeile dauerhaft auf einer Kopie des Bildes mit Markern an, die das Urteil des Betrachters nicht behindern oder beeinflussen.
- Legen Sie Kriterien fest, um zu steuern, wo die Linie gezeichnet wird, z. B. eine Spur, die eine Vielzahl von topographischen Merkmalen, Gipfeln und Tälern entlang einer zentralen Achse oder einer Linie erfasst, die keine übersättigten Bereiche durchquert.
HINWEIS: Diese Linienspuren zeigen rohe Fluoreszenz in einer Zelle und beschränken sich daher auf Vergleiche der Positionen eines Flecks, nicht der Intensität. Um Die Intensitäten desselben Flecks zwischen Dias, Behandlungen oder Zubereitungen zu vergleichen, fügen Sie dem Dia in Schritt 3.13 eine fluoreszierende Perle als interne Kontrolle hinzu. Die leuchtstoffzierende Perle muss während des Montageprozesses zugegeben und mit den gleichen Einstellungen am Anregungslaser und Photomultiplierrohr (konfokad) erfasst werden.
- Legen Sie Kriterien fest, um zu steuern, wo die Linie gezeichnet wird, z. B. eine Spur, die eine Vielzahl von topographischen Merkmalen, Gipfeln und Tälern entlang einer zentralen Achse oder einer Linie erfasst, die keine übersättigten Bereiche durchquert.
- Um eine Verschiebung der subzellulären Lokalisation zu quantifizieren, berechnen Sie die nukleozytoplasmatischen Verhältnisse von Zellen, die verschiedenen Behandlungen unterzogen werden.
- Messen Sie die Fläche und die Rohefluoreszenzintensität sowohl des Kerns als auch des Zytoplasmas mithilfe des nuklearen DAPI-Flecks, um die innere Grenze festzulegen. Umfassen Sie kerntechnische und zytoplasmatische Kontrollen wie eine kernnukleare RNA (z. B. KSHV PAN RNA) und zytoplasmatische RNA (z. B. Host GAPDH mRNA). Berechnen Sie außerdem die Hintergrundintensität für drei zellähnliche Bereiche und durchschnittlich die Werte pro Pixel oder2.
HINWEIS: Intensitätswerte neigen dazu, Einheiten zu fehlen, und daher wird der Begriff "Einheiten" verwendet. - Normalisieren Sie sowohl nukleare als auch zelluläre Rohintensitätswerte, indem Sie zunächst den durchschnittlichen Hintergrund für denselben Bereich bestimmen und dann diesen individualisierten Wert von der Rohintensität des Bereichs subtrahieren.
- Zum Beispiel hat ein Kern einer lytischen B-Zelle eine Fläche von 133,4 m2 und eine Rohe intensität von 75976 Einheiten, während die Hintergrundintensität für dasselbe fluoreszierende Signal auf 0,67 Einheiten pro m2bestimmt wurde. Die normalisierte nukleare Intensität würde
- Zum Beispiel hat ein Kern einer lytischen B-Zelle eine Fläche von 133,4 m2 und eine Rohe intensität von 75976 Einheiten, während die Hintergrundintensität für dasselbe fluoreszierende Signal auf 0,67 Einheiten pro m2bestimmt wurde. Die normalisierte nukleare Intensität würde
- Geben Sie die Werte in der folgenden Gleichung ein.
HINWEIS: Diese Berechnung steuert Änderungen im subzellulären Bereich. Lytische Induktion und medikamentöse Behandlungen können den Zellkern vergrößern bzw. die Größe der Zelle verändern. - Um die Ergebnisse zu interpretieren, erstellen Sie ein Box-Whisker-Plot. Eine gleichmäßige Verteilung des fluoreszierenden Signals wäre nahe Null, während eine kerntechnische Verteilung einen positiven Verhältniswert begünstigen würde und eine zytoplasmatische Verteilung zu einem negativen Verhältniswert tendieren würde.
- Messen Sie die Fläche und die Rohefluoreszenzintensität sowohl des Kerns als auch des Zytoplasmas mithilfe des nuklearen DAPI-Flecks, um die innere Grenze festzulegen. Umfassen Sie kerntechnische und zytoplasmatische Kontrollen wie eine kernnukleare RNA (z. B. KSHV PAN RNA) und zytoplasmatische RNA (z. B. Host GAPDH mRNA). Berechnen Sie außerdem die Hintergrundintensität für drei zellähnliche Bereiche und durchschnittlich die Werte pro Pixel oder2.
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Representative Results
Die in diesem Manuskript beschriebenen FISH- und IF-Methoden sind in Abbildung 1 zusammen mit der Quantifizierung der Ergebnisse durch Linienspuren der fluoreszierenden Intensität dargestellt. Die hier vorgestellten Ergebnisse sind semiquantitativ und bieten Einblicke in die Lokalisation und nicht in Vergleiche zwischen Intensitäten verschiedener fluoreszierender Flecken, da Experimente keine fluoreszierende Perle in die Diavorbereitung einbeziehen. Abbildung 1 zeigt auch, dass die zytoplasmatischen und nuklearen Bereiche und ihre Verhältnisse für latente und lytische KSHV-infizierte Zellen unterschiedlich sind. Somit wird die Fläche im nukleozytoplasmatischen Verhältnis kontrolliert, das in Abbildung 2dargestellt ist. Abbildung 2 bestätigt die in diesem Manuskript beschriebene Berechnung für ein nukleozytoplasmatisches Verhältnis unter Verwendung einer nuklearen Kontrolle, der viralen polyadenylierten Kern-RNA (PAN) und einer zytoplasmatischen Kontrolle, der Host GAPDH mRNA. Abbildung 3 zeigt, dass, wenn die KSHV-DNA-Replikation in der lytischen Phase durch die Verwendung von Phosphonoessigsäure (Doxy + PAA) oder Cidofovir (Doxy + Cido) gehemmt wird, sich die frühe ORF59-58-Transkription auf eine überwiegend zytoplasmatische Lokalisation verlagert. Die Mikrographen und die beiden Quantifizierungsmethoden in Abbildung 3 unterstützen dieses Ergebnis und zeigen, dass PAN-RNA trotz hemmung der viralen DNA-Replikation und der Veränderung, die für die frühe ORF59-58-Transkription beobachtet wurde, auf bestimmte Kernstandorte lokalisiert.
Abbildung1: Linienspuren fluoreszierender Intensität zeigen Feinheiten bei der Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) von KSHV-Transkripten und Immunfluoreszenz (IF) von KSHV-Replikationsräumen. (A-B) Konfokale Bilder von TREx RTA (Tetracyclin induzierbare Virusreplikation und Transkriptionsaktivatorprotein) BCBL-1-Zellen12, die mit Doxycyclin (Doxy) 24 h in die lytische Phase induziert wurden. Der Maßstabsbalken zeigt 10 m (A) Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) für virale RNAs (grün) und Immunfluoreszenz (IF) für virales einsträngiges DNA-Bindungsprotein (ORF6/SSB) (rot), eine Komponente der KSHV-Replikationskompartimente, Virale Transkripte lokalisieren sich im Zytoplasma, ImNuzund und in Kernbrennpunkten außerhalb von ORF6/SSB-angereicherten Bereichen, auch Replikationskompartimenten genannt. Der Anti-SSB-Antikörper10 wurde auf 1:200 in 0,4% BSA/1x PBS verdünnt und mit 1:500 Anti-Kaninchen Alexa Fluor 594 Sekundärantikörper in 0,4% BSA/1x PBS nachgewiesen. Alle in dieser Studie verwendeten Anti-Sense-Oligonukleotide sind in Tabelle 1aufgeführt. Der Nachweis von ORF59-58 mRNA umfasst sowohl die bicistronischen als auch monocistronischen Transkripte. In KSHV-infizierten JSC-1-Zellen ist die monocistronische mRNA jedoch mindestens 18-fach weniger reichlich vorhanden als das bizitronische Transkript und trägt wahrscheinlich nur einen geringen Teil des gesamten beobachteten Fluoreszenzsignalsbei 13. Darüber hinaus kann eines der PAN-RNA-Oligonukleotide (SB88) auch das virale Transkript für K7 detektieren. Das Signal eines K7-Nachweises wird nicht so signifikant sein wie der Signalnachweis ksHV PAN RNA, der bei fast 80% aller polyadenylierten RNA in einer lytischen KSHV-infizierten Zelle14vorhanden ist. Zusätzlich ist eines der vier Anti-Sense-Oligonukleotide (tkv13) beim Nachweis der K8.1 mRNA in der Lage, an mehrere Isoformen von K8.1 und anderen Isoformen nahegelegener offener Leserahmen (ORF) zu binden. Das FISH-Signal nur von Oligonukleotid tkv13 ist unzureichend (Daten nicht angezeigt). Die kombinierte Hybridisierung der vier Oligonukleotide und deren Bindung an ein und dieselbe Transkription liefert wahrscheinlich das beobachtete starke Signal. Weiße Linien, die Zellen in (A) flankieren, stellen den Linienpfad der Fluoreszenzintensitäten für die IN (C) geplotteten FISH- und IF-Signale dar. (B) Digital gezoomte Bilder von Zellen in (A) flankiert von weißen Linien. Der Einfachheit halber wird der blaue DAPI-Kanal weggelassen. (C) Die Diagramme zeigen die relativen fluoreszierenden Intensitäten für jeden Fleck entlang der gleichen Linie: SSB (rot), virale Transkripte (grün; Transkript auf der Parzelle angegeben) und DAPI (blau). Schattierte Bereiche weisen auf DAPI-reduzierte Regionen hin, die Viralreplikationskompartimenten oder SSB/ORF6-angereicherten Bereichen entsprechen. (D) Das Verhältnis von Kernfläche zu Zellfläche ändert sich und damit das durchgängig verwendete Fluoreszenzintensitätsverhältnis wurde für die Fläche normalisiert. (E) Kern- und Zellbereiche, gemessen für TREx RTA BCBL-1-Zellen mit und ohne lytische Aktivierung. Statistisch signifikante Veränderungen sind im Vergleich zu nicht induzierten Zellen zu beobachten. Die Box- und Schnurrhaare stellen die 10 und 90 Perzentile dar. Figur mit leichten Änderungen von Vallery, Withers und Kollegen15 unter einer Creative Commons Attribution-Lizenz nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Kontroll-Kern- und zytoplasmatische FISH-Strategien validieren die Berechnungsmethode des Nukleozytoplasma-Verhältnisses. (A) FISH für den Wirt GAPDH mRNA (rot) und für die virale polyadenylierte Kernkraft (PAN) lncRNA (grün) und DAPI-Kernfärbung (blau) sind positive FISH-Kontrollen für die Berechnungsmethode zur Bestimmung des Nukleozytoplasma-Verhältnisses. Host GAPDH mRNA ist ein kanonisches Ziel des Wirtshutoff-Effekts des KSHV und wird aufgrund der lytischen Induktion abgebaut, wie hier gezeigt. (B) Fluoreszenzintensitäten entlang einer Linie, die durch weiße Linien angezeigt wird, die lytische Zellen in (A) flankieren. DAPI (blau), PAN RNA (grün) und GAPDH mRNA (rot). Schattierte Bereiche sind wie in Abbildung 1definiert. (C) Quantifizierung der Fluoreszenzintensitäten von Zellen, dargestellt durch (A) (n = 150 für jede GAPDH-Probe, n = 75 für die ORF59-58- oder K8.1-Proben) wurden für drei biologische Replikationen von Zellen in Abbildung 2 und Abbildung 3 durchgeführt. . P-Werte: >0,05 (ns), <0,05 (*), <0,005 (**) und <0,0005 (***). (D) Repräsentativer nördlicher RNA-Blot aus TREx RTA BCBL-1-Zellen 24 h nach Doxy. Die Box- und Schnurrhaare stellen das 10- und 90-Perzentil dar. Figur mit leichten Änderungen von Vallery, Withers und Kollegen15 unter einer Creative Commons Attribution-Lizenz nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Linienspuren und die Berechnung der nukleozytoplasmatischen Verhältnisse zeigen eine starke Verschiebung zum Zytoplasma für die frühe lytische ORF59-58-Transkription bei Hemmung der viralen DNA-Replikation. TREx RTA BCBL-1-Zellen wurden für 24 h ohne Medikament (Unind), doxycyclin (Doxy) oder mit Doxycyclin und einem Inhibitor der herpesviralen DNA-Replikation, Phosphonoessigsäure (Doxy + PAA) oder Cidofovir (Doxy + Cido) behandelt. Panels (A-C) zeigen Daten aus Proben, die aus drei biologischen Repliken entnommen wurden. (A) qPCR-Werte für virale intrazelluläre DNA während der Hemmung der viralen DNA-Replikation wurden auf die Menge der promotorisierenden DNA des GAPDH-Gens der Wirtszelle normalisiert. (B) Nördlicher Fleck (links) und Quantifizierung (rechts) zeigen den gesamten RNA-Spiegel während der Hemmung der viralen DNA-Replikation. Nicht induzierte Konzentrationen aller RNAs waren nicht nachweisbar. (C) Repräsentative FISH-Bilder für virale ORF59-58-Transkripte (grün) und PAN-RNA (rot) bei Hemmung der viralen DNA-Replikation. DAPI (blau) war der nukleare Fleck. (D) Die Quantifizierung der Fluoreszenzintensitäten von Zellen, dargestellt durch (C) (n = je 75), erfolgte auf biologischen Triplicaten. (E) Fluoreszenzintensitäten entlang linienlinien, die über Zellen gezeichnet werden, die durch weiße Linien in (C) angezeigt werden: DAPI (blau), PAN RNA (rot) und ORF59-58 mRNA (grün). P-Werte: >0,05 (ns), <0,05 (*), <0,005 (**) und <0,0005 (***). Die Sequenzen aller Oligonukleotide in dieser Studie sind in Tabelle 1aufgeführt. Die Box- und Schnurrhaare stellen die 10 und 90 Perzentile dar. Figur von Vallery, Withers und Kollegen15 unter einer Creative Commons Attribution Lizenz nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Nördliche Oligos | |||||||
| Oligo Nr. | gen | folge | Position innerhalb des Gens | Position mit dem Referenz-Genom NC009333.1 (Zahlen spiegeln keine Richtung oder Strang wider) | |||
| KORF50 | KSHV RTA/ORF50 | CGCATTGCGGTGGTTGAAATTGCTGG | 1284 bis 1309 | 73936 bis 73961 | |||
| JBW249 | KSHV SOX/ORF37 | TAACCTGACACCACCAACaCACGGTCCAC | 262 bis 291 | 57633 bis 57662 | |||
| tkv379 | KSHV ORF59-58 | TGGAGTCCGGTATAGAATCGGGAACCT | 941 bis 967 (ORF59 ORF) | 95879 bis 95905 | |||
| tkv13 | KSHV K8.1 | AAGGCATAGGATTAGGAGCGCCACAGGGATTTCTGTGCGAAT | 16 bis 57 | 76029 bis 76070 | |||
| SB2 | KSHV PAN RNA | ACAAATGCCACCTCACTTTGTCGC | 664 bis 687 | 29496 bis 29519 | |||
| Rnase P | Menschliche Rnase P | TGGGCGGAGGAGAGTAGTCTG | 319 bis 339 | N/A | |||
| FISH-Sonden | |||||||
| Oligo Nr. | gen | folge | |||||
| SB2 | KSHV PAN RNA | ACAAATGCCACCTCACTTTGTCGC | 664 bis 687 | 29496 bis 29519 | |||
| SB85 | KSHV PAN RNA | CGCTGCTTTCCTTTCACATT | 373 bis 392 | 29205 bis 29224 | |||
| SB88 | KSHV PAN RNA | GTGAAGCGGCAGCCAAGGTGACTGG | 1 bis 22 | 28830 bis 28854 | |||
| tkv13 | KSHV K8.1 | AAGGCATAGGATTAGGAGCGCCACAGGGATTTCTGTGCGAAT | 16 bis 57 | 76029 bis 76070 | |||
| tkv14 | KSHV K8.1 | TGATATTAAGGCATCGGTCAGTTCTGTGGTGGCCTGGA | 377 bis 414 | 76390 bis 76427 | |||
| tkv15 | KSHV K8.1 | GTAAGGTTACGCTTTATCCCTACACACCGACGGTTTACCC | 461 bis 500 | 76474 bis 76513 | |||
| tkv16 | KSHV K8.1 | GGACAAGTCCCAGCAATAAACCCACAGCCCATAGTATG | 688 bis 725 | 76701 bis 76738 | |||
| tkv376 | KSHV ORF59-58 | TAATGTGTTCATTGACCCTCCTGATT | 54 bis 79 | 96767 bis 96792 | |||
| tkv377 | KSHV ORF59-58 | GCCGATCCGTGCACTTGCACTACTCCGGTT | 93 bis 122 | 96724 bis 96753 | |||
| tkv378 | KSHV ORF59-58 | AAGGCTATGCGCGCGCGTCGAGTACATTCGCA | 300 bis 329 | 96517 bis 96546 | |||
| tkv379 | KSHV ORF59-58 | TGGAGTCCGGTATAGAATCGGGAACCT | 941 bis 967 | 95879 bis 95905 | |||
| tkv380 | KSHV ORF59-58 | AAAGAGTGTGAACGAGTACGGCCTT | 1289 bis 1315 | 95531 bis 95557 | |||
| tkv381 | KSHV ORF59-58 | AAACACTGCGCGCGCAGATCCATTCC | 1423 bis 1450 | 95396 bis 95423 | |||
| tkv382 | KSHV ORF59-58 | TACCTGTGTACTATTGGCGGCGCCTGATACAC | 1571 bis 1602 | 95244 bis 95275 | |||
| tkv383 | KSHV ORF59-58 | GGGTCGAGATTCAGCTAATTAGGCGAAAACTCCACAGG | 2136 bis 2173 | 94673 bis 94710 | |||
| Stellaris | GAPDH | Vorgefertigt von Stellaris | N/A | N/A | |||
| qPCR Primer | |||||||
| tkv458 | GAPDH-Promoter | CTGCACCACCAACTGCTTAG | N/A | N/A | |||
| tkv459 | GAPDH-Promoter | GTCTTCTGGGGGGCAGTGAT | N/A | N/A | |||
| tkv319 | KSHV ORF39 (gM) | GTGAGGTGCGCGCTGAGTT | N/A | 60075 bis 60094 | |||
| tkv320 | KSHV ORF39 (gM) | CCTGGGTCAAGCTGTTGTTT | N/A | 60218 bis 60237 | |||
| RT-qPCR Primer | |||||||
| tkv 455 | K8/K-bZIP Vorwärts RT qPCR Primer | CGAAAGCAAGGCAGATACG | 655 bis 673 | 75603 bis 75621 | |||
| tkv 456 | K8/K-bZIP Reverse RT qPCR Primer für ungefärbt | GCCATTGTTCCCATTTGAGT | 755 bis 774 | 75703 bis 75722 | |||
| tkv 457 | K8/K-bZIP Reverse RT qPCR Primer für gespleißt | CATCAGCATGTCGCGAAG | 871 bis 888 | 75819 bis 75836 | |||
| JBW479 | Menschliche Rnase P Vorwärts | AGCTTGGAACAGACTCACGG | 238 bis 257 | N/A | |||
| JBW480 | Menschliche Rnase P Reverse | GCGGAGGAGAGTAGTCTGAA | 317 bis 336 | N/A | |||
Tabelle 1: Alle Oligonukleotide, die in den Analysen dieser Veröffentlichung verwendetwerden. Tabelle 1 wurde mit Genehmigung der American Society for Microbiology unter einer Creative Commons Attribution Lizenz von Vallery et al.15reproduziert.
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Discussion
Das in diesem Bericht beschriebene Protokoll kann an verschiedene Zelltypen angepasst werden und enthält Schritte für doppel-RNA-FISH und RNA-FISH mit IF, wobei sowohl monoklonale als auch polyklonale Primärantikörper verwendet werden. Obwohl vorbereitete Dias in der Regel mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet werden, kann die Bildgebung mit einem STED-Mikroskop (stimulierte Emissionserschöpfung) nach Modifikationen der erhöhten Antikörperkonzentration und einem anderen Montagemedium durchgeführt werden. Zur verbesserten Analyse einzelner Zellen können Proben, die mit diesem Protokoll erstellt wurden, auch mit einem Zellsortierer oder Durchflusszytometer mit bescheidenen Änderungen sortiert, abgebildet und analysiert werden, wie Borah und Kollegen16zeigen. Dieses Protokoll kann jedoch nicht für die Bildgebung von Lebenden Zellen übernommen werden.
Die detaillierten Quantifizierungsmethoden eliminieren Beobachtungsverzerrungen und dienen dazu, eine mögliche nukleozytoplasmatische Verschiebung zu validieren. Das nukleozytoplasmatische Verhältnis zeigt auch, wann sich ein Biomolekül von der gleichmäßigen Dispergierung zur Lokalisierung in einem bestimmten subzellulären Fach anpasst. Die hier vorgestellten Ergebnisse sind semiquantitativ, während das Protokoll Wege aufzeigt, wie die Quantifizierung gestärkt werden kann. Die Stärke des nukleozytoplasmatischen Verhältnisses und der Linienspuren (Schritt 4) hängt von der Verwendung von fluoreszierenden Perlen als Intensitätskontrolle (Schritt 3.13) und der Verwendung klarer subzellulärer Marker ab, wie z. B. eines für nukleares Lamin A/C. Derzeit gibt es keine klare Grenzmarkierung für KSHV-Virusreplikationsfächer. Unabhängig davon kann diese Berechnung mit geeigneten Markern auf andere subzelluläre Fächer ausgedehnt werden.
Die größte Hürde für das in diesem Bericht beschriebene Protokoll ist die Entwicklung von FISH-Strategien für spezifische Transkripte (Schritt 1). Der Erfolg beruht auf der Fülle und Bindungskraft von Anti-Sense-Oligonukleotiden. Die Spezifität bestimmter Transkripte wird durch das Vorhandensein überlappender offener Leserahmen (ORFs) in viralen Genomen noch erschwert. So weisen virale Transkripte oft Sequenzähnlichkeit17 mit anderen viralen Transkripten aus derselben genomischen Region auf, insbesondere bei Herpesviren. Oft muss die Entwicklung einer FISH-Strategie von reichlicheren Transkripten profitieren. Um das Fehlen eines FISH-Signals zu beheben, sollten Benutzer das FISH-Protokoll mit der U2 snRNA FISH-Strategie durchführen, um zu bestätigen, dass Techniken in menschlichen Zellen und die Herstellung von Reagenzien ausreichend sind. Ebenso kann die KSHV PAN RNA FISH-Strategie die lytische Aktivierung in KSHV-infizierten Zellen bestätigen. Um die Bindung durch die Anti-Sense-Oligonukleotide zu beheben, empfehlen die Autoren die Entwicklung mehrerer Anti-Sense-Oligonukleotide. Wenn alles fehlschlägt, steht eine kommerzielle Option zur Verfügung, wie die Verwendung der GAPDH-FISH-Strategie in Abbildung 2 und von Vallery, Withers und Kollegen15zeigt.
Stärkere Algorithmen zur Definition der zellulären und subzellulären Grenzen würden die Quantifizierungsverzerrung weiter beseitigen. Einige analytische Bildverarbeitungssoftware kann Grenzen für die Zelle, den Zellkern und mehr festlegen, erfordert jedoch definitive Marker. Ungewöhnliche Zellmorphologien wie Viralreplikationsfächer sind für solche Software schwierig – eine Herausforderung für die zukünftige Entwicklung. Darüber hinaus sind die hier beschriebenen Quantifizierungsmethoden auf ein optisches Zellsegment beschränkt (2D-Bildanalyse). Während die 3D-Bildaufnahme18möglich ist, kann die zukünftige Entwicklung einer quantitativen 3D-Bildanalyse weitere Einblicke in die raumzeitliche Regulierung von Virusreplikationsfächern liefern.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken Jonathan Rodenfels, Kazimierz Tycowski und Johanna B. Withers für die Beratung zur Datenanalyse. Wir danken auch G. Hayward für den Anti-SSB-Antikörper. Diese Arbeit wurde durch die Stipendien T32GM007223 und T32AI055403 von den National Institutes of Health (an TKV) und NIH Grant (CA16038) (an JAS) unterstützt. JAS ist ein Forscher des Howard Hughes Medical Institute. Die Abbildungen 1-3 und Tabelle 1 wurden mit Genehmigung der American Society for Microbiology unter einer Creative Commons Attribution Lizenz der folgenden Publikation reproduziert: Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi es Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Akkumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA. Journal of Virology. 92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlexaFluor594-5-dUTP | Life Technologies | C1100 | |
| anti-DIG FITC | Jackson Lab Immunologicals | 200-092-156 | |
| Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody | Invitrogen | A-11037 | Goat |
| Anti-SSB Antibody | N/A | N/A | Ref. Chiou et al. 2002 |
| BLASTn | NIH NCBI | N/A | Free Sequence Alignment Software |
| Dextran Sulfate | Sigma Aldrich | D8906 | Molecular Biology Grade |
| DIG-Oligonucleotide Tailing Kit | Sigma Roche | #03353583910 | 2nd Gen |
| Eight-Chamber Slides | Nunc Lab Tek II | #154453 | Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. |
| Formamide | Sigma Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| GAPDH Probes | Stellaris | SMF-2019-1 | Compatible with protocol, Quasar 670 |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | N/A | Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/] |
| OligoAnalyzer | IDT | N/A | Free Oligonucleotide Analyzer |
| pcDNA3 | Invitrogen | A-150228 | |
| pmaxGFP | Amaxa | VDF-1012 | |
| Poly L-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 | |
| Terminal Transferase | Sigma Roche | #003333574001 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | NEB | S1402S | |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. |
References
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