Summary
हम lytically संक्रमित मानव कोशिकाओं के भीतर कई दादवायरल आरएनए कल्पना करने के लिए situ संकरीकरण (FISH) में फ्लोरोसेंट का उपयोग एक प्रोटोकॉल का वर्णन, या तो निलंबन या अनुयायी में. इस प्रोटोकॉल में एक न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक अनुपात का उत्पादन करने वाले फ्लोरोसेंट का परिमाणीकरण शामिल है और इसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) के साथ मेजबान और वायरल प्रोटीन के एक साथ दृश्य के लिए बढ़ाया जा सकता है।
Abstract
यंत्रवादी अंतर्दृष्टि सावधान अध्ययन और विशिष्ट आरएनए और प्रोटीन के परिमाणीकरण से आता है। विशिष्ट समय पर सेल भर में इन जैव अणुओं के सापेक्ष स्थानों situ संकरीकरण (फिश) और इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) में फ्लोरोसेंट के साथ कब्जा किया जा सकता है। lytic हर्पीवायरस संक्रमण के दौरान, वायरस मेजबान सेल को वरीयता से वायरल जीनों को व्यक्त करने के लिए अपहरण करता है, जिससे कोशिका आकारिकी और जैव अणुओं के व्यवहार में परिवर्तन होता है। Lytic गतिविधियों परमाणु कारखानों में केंद्रित कर रहे हैं, वायरल प्रतिकृति डिब्बों कहा जाता है, जो केवल FISH और IF के साथ स्पष्ट कर रहे हैं. यहाँ हम आरएनए FISH के एक अनुकूलनीय प्रोटोकॉल का वर्णन और Kaposi के सार्कोमा संबद्ध हर्पसवायरस (KSHV) संक्रमित कोशिकाओं के लिए अगर तकनीक, दोनों अनुयायी और निलंबन में. विधि विशिष्ट विरोधी भावना ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स के विकास के लिए कदम भी शामिल है, डबल आरएनए मछली, आईएफ के साथ आरएनए मछली, और फ्लोरोसेंट तीव्रता की मात्रात्मक गणना. इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक कई सेल प्रकार, uninfected कोशिकाओं, गुप्त कोशिकाओं, lytic कोशिकाओं, समय पाठ्यक्रम, और कोशिकाओं को इनहिबिटोर के साथ इलाज के लिए दोनों मानव मेजबान से विशिष्ट आरएनए और प्रोटीन की spatioor गतिविधियों का विश्लेषण करने के लिए लागू किया गया है KSHV.
Introduction
उनके lytic (सक्रिय) चरण में, हर्पीवायरस मेजबान सेल का अपहरण, कोशिका आकृति विज्ञान और जैविक अणुओं के स्थानीयकरण में परिवर्तन के कारण, virions का उत्पादन करने के लिए. संचालन का आधार नाभिक है, जहां डबल-स्ट्रेंड डीएनए वायरल जीनोम को दोहराया जाता है और इसे प्रोटीन शेल में पैक किया जाता है, जिसे कैप्सिड1कहा जाता है। शुरू करने के लिए, वायरस अपने स्वयं के प्रोटीन व्यक्त करता है, मेजबान मशीनरी अपहरण और गैर जरूरी मेजबान जीन की अभिव्यक्ति को रोकने, एक प्रक्रिया मेजबान shutoff प्रभाव कहा जाता है. इस गतिविधि के बहुमत विशिष्ट 4 के लिए स्थानीयकृत है,6-diamidino-2-फेनिलिनोल (DAPI) मुक्त परमाणु क्षेत्रों वायरल प्रतिकृति डिब्बों कहा जाता है, दोनों मेजबान और वायरल प्रोटीन, आरएनए, और वायरल डीएनए2के शामिल. सेल प्रतिकृति डिब्बों के लिए अंतरिक्ष और संसाधन प्रदान करने के लिए ओवरहाल है और इस तरह वायरल capsids के विधानसभा. एक बार कैप्सिड नाभिक से बाहर निकलता है, कैसे capsid एक झिल्ली बाध्य वायरल कण का उत्पादन करने के लिए कोशिका द्रव्य में घिरा हुआ है, यह भी एक virion के रूप में जाना जाता है, स्पष्ट नहीं है. लिटिक चरण के दौरान मेजबान और वायरल जैव अणुओं दोनों के स्थानीयकरण और स्थानिक बदलावों को समझना प्रतिकृति डिब्बे की व्यवस्था में गहरी मशीनी अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, मेजबान शटऑफ़ प्रभाव, virion-egress मार्ग, और अन्य हर्पीवायरल संक्रमण और प्रतिकृति से संबंधित प्रक्रियाओं।
वर्तमान में इन परिवर्तनों का पता लगाने और अध्ययन करने के लिए सबसे अच्छा तरीका क्रमशः सिटू हाइब्रिडाइजेशन (फिश) में इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) और फ्लोरोसेंट के साथ संक्रमित कोशिकाओं में प्रोटीन और आरएनए का दृश्य है। इन तकनीकों के साथ एक समय पाठ्यक्रम का उपयोग lytic चरण के प्रमुख बिंदुओं पर जैव अणुओं के स्थानीयकरण का पता चलता है या बस, spatiotemporal डेटा. मछली और IF अन्य जैव रासायनिक तकनीकों के पूरक हैं, जैसे कि सेलुलर प्रक्रिया का निषेध (उदा., वायरल डीएनए प्रतिकृति का निषेध), आरटी-क्यूपीसीआर (वास्तविक समय पॉलिमरेज चेन रिएक्शन), आरएनए अनुक्रमण, उत्तरी दाग, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, पश्चिमी सोख्ता, और वायरल डीएनए उत्पादन का विश्लेषण, कि सेलुलर गतिविधियों की एक और अधिक वैश्विक तस्वीर प्रदान कर सकते हैं.
हमने विशिष्ट जीनों से आरएनए उत्पादों की जांच करने के लिए आरएनए फिश रणनीतियों का विकास किया है और एक संगणकीय विश्लेषण जो मात्रात्मक रूप से किसी विशिष्ट जीन उत्पाद के न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक अनुपात की गणना करता है। नमूना तैयारी, Steitz और उनके सहयोगियों द्वारा पहले प्रकाशनों से संशोधित3,4,अपेक्षाकृत आसान है और दोनों अनुयायी और निलंबित कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रोटोकॉल भी कई आरएनए FISH रणनीतियों (डबल आरएनए मछली) या आरएनए मछली के साथ एक साथ उपयोग के लिए अनुकूलनीय है IF रणनीतियों के साथ. एक विशिष्ट FISH रणनीति का विकास चुनौतीपूर्ण है, लेकिन सफलता में सुधार करने के लिए सुझाव रेखांकित कर रहे हैं. यहाँ वर्णित डेटा विश्लेषण मात्रात्मक है अगर फ्लोरोसेंट मोती और डिब्बे सीमाओं के मजबूत मार्करों का उपयोग किया जाता है और micrographs, अंतर्दृष्टि है कि अवलोकन पूर्वाग्रह को हटा में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान करता है. विस्तृत प्रोटोकॉल दोनों गुप्त और lytic कोशिकाओं Kaposi के सार्कोमा से जुड़े दाद वायरस (KSHV) से संक्रमित के लिए बनाया गया है और uninfected कोशिकाओं या अन्य दाद वायरस से संक्रमित कोशिकाओं के साथ इस्तेमाल किया जा सकताहै 5. परिमाणीकरण के तरीके अधिकांश कोशिकाओं में उपकोशिकीय डिब्बों के बीच न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक बदलाव या पुनर्स्थानन पर अध्ययन के लिए लागू होते हैं।
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Protocol
1. एक विशिष्ट दादवायरल प्रतिलिपि का पता लगाने के लिए situ में फ्लोरोसेंट का डिजाइन (फिश) विरोधी भावना ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स
- ब्याज के आरएनए के अनुक्रम से 25 से 40 nt खंडों का चयन करें और विरोधी भावना होने के लिए परिवर्तित. एक सफल FISH रणनीति एक से दस या अधिक अलग विरोधी भावना oligonucleotides शामिल हो सकते हैं. अनुक्रमों का चयन करते समय, निम्न पर विचार करें:
- यदि ब्याज की आरएनए एक अद्वितीय दोहराने क्षेत्र शामिल हैं, तो इस सुविधा पर कैपिटल और एक विरोधी भावना oligonucleotide डिजाइन दोहराने अनुक्रम को लक्षित करने के लिए.
नोट: Tycowski और उनके सहयोगियों5 rhesus rhadinovirus (RRV) polyadenylated परमाणु (पैन) आरएनए के साथ इस रणनीति का एक उदाहरण प्रदान करते हैं. - यदि ब्याज की आरएनए एक ज्ञात प्रोटीन बाध्यकारी साइट या स्टेम पाश संरचना शामिल हैं, डिजाइन oligonucleotides कि इन क्षेत्रों से बचने.
- प्रयोगों के लक्ष्यों पर निर्भर करता है, intronic अनुक्रम पर विचार करें और चाहे या नहीं इसके लिए एक विरोधी भावना oligonucleotide डिजाइन करने के लिए.
- यदि ब्याज की आरएनए एक अद्वितीय दोहराने क्षेत्र शामिल हैं, तो इस सुविधा पर कैपिटल और एक विरोधी भावना oligonucleotide डिजाइन दोहराने अनुक्रम को लक्षित करने के लिए.
- बंधन विशिष्टता सुनिश्चित करने और विरोधी भावना ओलिगोन्यूक्लिओटाइड के एकत्रीकरण को कम करने के लिए चयनित विरोधी भावना अनुक्रमों पर सरल गणना विश्लेषण प्रदर्शन.
- अनुक्रम लगभग 50% जीसी समृद्ध (उच्च ग्वानीन और साइटोसिन सामग्री) होना चाहिए और 60 से 70 डिग्री सेल्सियस की सीमा में पिघलने का तापमान होना चाहिए।
- दृश्यों का चयन करने के लिए एक अनुक्रम विश्लेषक उपकरण का उपयोग करें जो 37 डिग्री सेल्सियस, हाइब्रिडेशन तापमान से ऊपर के तापमान के साथ स्वयं-डिमेराइज़ या हेयरपिन नहीं बनाते हैं।
- एक NCBI BLASTn प्रदर्शन (जैव प्रौद्योगिकी सूचना के लिए राष्ट्रीय केंद्र बुनियादी स्थानीय संरेखण खोज उपकरण न्यूक्लिओटाइड संरेखण के लिए) दोनों मेजबान और वायरल transcriptomes के खिलाफ चयनित दृश्यों की खोज 'कुछ समान' सेटिंग का उपयोग कर. इस खोज अद्वितीय विरोधी भावना oligonucleotides है कि संभावना अन्य मेजबान या वायरल प्रतिलिपि करने के लिए बाध्य नहीं होगा की पहचान करेगा.
नोट: transcriptomes उपलब्ध नहीं हैं, तो जीनोमिक दृश्यों के साथ BLAST खोज प्रदर्शन. यह आदर्श है अगर खोजों वायरस से दृश्यों पर प्रदर्शन कर रहे हैं प्रयोग में इस्तेमाल संक्रमित कोशिकाओं से अलग क्योंकि जंगली उपभेदों विविधता और विभिन्न प्रयोगशाला उपभेदों से दृश्यों का एक संयोजन होते हैं.
- आदेश शुद्ध डीएनए oligonucleotides विरोधी भावना अनुक्रम है कि computationally अद्वितीय होने के लिए सत्यापित किया गया है और लक्ष्य आरएनए के लिए बाध्य करने की संभावना के लिए इसी. कोई विशेष संशोधनों ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स में पेश करने की आवश्यकता है।
- FISH और उत्तरी दाग द्वारा बाध्यकारी विशिष्टता के लिए डिजाइन विरोधी भावना ओलिगोन्यूक्लिओटाइड का परीक्षण करें।
- एक ही मेजबान प्रजातियों से एक uninfected सेल लाइन का उपयोग करना (जैसे, 293T) और आदर्श रूप से एक ही सेल प्रकार, एक मजबूत प्रमोटर (CMV, साइटोमेगावायरस) और खाली वेक्टर (जैसे, pcDNA3) से ब्याज की आरएनए व्यक्त एक प्लाज्मिड के साथ एक transfection आचरण. ट्रांसफेक्शन के लिए सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करें जैसे कि GFP (हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के साथ सह-रूपांतरण (उदा., pmaxGFP) या GFP युक्त वेक्टर।
नोट: यह सेल लाइनों कि दाद वायरस एपस्टीन-बार वायरस (EBV) का उपयोग कर अमर कर दिया गया है से बचने के लिए महत्वपूर्ण है के बाद से वहाँ दादवायरस के बीच अनुक्रम समानताएं हैं. - इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में विरोधी भावना oligonucleotides के साथ कोशिकाओं के दोनों सेट पर खंड 3 में वर्णित के रूप में FISH प्रदर्शन. व्यक्तिगत, जोड़े, या विरोधी भावना ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स के सेट के साथ FISH प्रयोगों की तुलना करके सफल उम्मीदवारों को कम करें। FISH प्रोटोकॉल के लिए धनात्मक नियंत्रण का उपयोग करें जैसे उ2 एनआरएनए (छोटे नाभिक आरएनए) फिश, जो मानव कोशिका नाभिक6 (सारणी1) प्रति 500,000 प्रतियां पर उपस्थित होते हैं।
- फ्लोरोसेंट संकेत विशिष्ट और ब्याज की आरएनए युक्त सेल में मजबूत होना चाहिए. संकेत को मजबूत बनाने और विरोधी भावना ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स को हटाने के लिए अतिरिक्त एंटी-सेंस ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स डिज़ाइन करें जो विचार से गैर-विशेष रूप से बांधते हैं। सिग्नल की शक्ति पृष्ठभूमि और ऑटोफ्लोरेसेंस से ऊपर होनी चाहिए।
- उत्तरी दाग द्वारा परीक्षण बाध्यकारी विशिष्टता.
- एक ही मेजबान प्रजातियों से एक uninfected सेल लाइन का उपयोग करना (जैसे, 293T) और आदर्श रूप से एक ही सेल प्रकार, एक मजबूत प्रमोटर (CMV, साइटोमेगावायरस) और खाली वेक्टर (जैसे, pcDNA3) से ब्याज की आरएनए व्यक्त एक प्लाज्मिड के साथ एक transfection आचरण. ट्रांसफेक्शन के लिए सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करें जैसे कि GFP (हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के साथ सह-रूपांतरण (उदा., pmaxGFP) या GFP युक्त वेक्टर।
2. ओलिगोन्यूक्लिओटाइड और सेल तैयारी
- निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, टर्मिनल transferase का उपयोग करने के लिए विरोधी भावना oligonucleotides के साथ diaxigenin (DIG)-DUTP या, अगर दृढ़ता से बाध्यकारी, एलेक्सा फ्लोर 594-5-dUTP की तरह एक फ्लोरोसेंट न्यूक्लिओटाइड के साथ सीधे. लेबलिंग के बाद, अतिरिक्त शुद्धिकरण आवश्यक नहीं है। स्टोर कई वर्षों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर oligonucleotides लेबल और टिन पन्नी में अगर सीधे photobleaching को रोकने के लिए लेबल.
चेतावनी: लेबलिंग समाधान में एक विषाक्त सामग्री, पोटेशियम कोडीलेट होता है। दस्ताने के साथ लेबलिंग प्रतिक्रियाओं को संभालें।
नोट: संसाधनों के संरक्षण के लिए, कई अलग अलग विरोधी भावना oligonucleotides एक प्रतिक्रिया में लेबल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल 3'-end लेबलिंग का इस्तेमाल करता है. आंतरिक लेबलिंग चुनौतीपूर्ण है क्योंकि रासायनिक समूह (जैसे, डीआईजी या फ्लोरोफोर) पकड़ा जाता है या डीएनए पॉलिमरेज की सक्रिय साइट में प्रवेश करने में असमर्थ होता है। दो अलग RNAs के साथ एक प्रयोग सीधे लेबल विरोधी भावना ओलिगोन्यूक्लिओटाइड और एक अलग फ्लोरोफोर के साथ विरोधी डीआईजी इम्यूनोफ्लोरेसिस (जैसे, FITC (fluorescein) या Alexa Fluorescein 488 एलेक्सा फ्लोर 594 के साथ किया जा सकता है. - आठ-चैम्बर स्लाइड्स के लिए कक्षों का पालन करें.
नोट: आठ कक्ष स्लाइड एंटीबॉडी की तरह कीमती संसाधनों को कम करते हुए कई एक साथ प्रयोगों की अनुमति देते हैं। आठ कक्ष स्लाइड के लिए एक विकल्प मानक coversps के साथ एक छह अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट है (22 मिमी x 22 मिमी) कि दोनों बाँझ हैं. एक ऐसी ही व्यवस्था परिपत्र coversps और एक 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के साथ संभव है. दोनों के लिए, इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित मात्राओं को क्रमशः 10-15x (उदा., 1.75 एमएल संकरण समाधान) और 4x (उदा., 600 डिग्री सेल्सियस विलयन समाधान) द्वारा बढ़ाइए।- अनुयायी लाइटिक कोशिकाओं के लिए, कोशिकाओं को निलंबित करने और 60% संगम को पतला करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 1x ट्रिप्स का उपयोग करें।
नोट: FISH प्रयोगों में प्रयुक्त अनुलग्न सेल लाइनों में 293T, iSLK.2197,और iSLK-BAC36 कक्ष8शामिल हैं। - बाँझ आठ कक्ष स्लाइड के प्रत्येक कक्ष के लिए सेल निलंबन के 200 डिग्री सेल्सियस लागू करें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर 12-24 एच के लिए बीज की वृद्धि की अनुमति देते हैं। धीमी या तेजी से बढ़ रही कोशिकाओं के लिए और आसानी से trypsin द्वारा क्षतिग्रस्त कर रहे हैं कि कोशिकाओं के लिए के रूप में आवश्यक समायोजित करें।
नोट: उद्देश्य समान रूप से स्लाइड से जुड़ी कोशिकाओं को स्थान देना है। यदि लाइटिक कोशिकाएं नाजुक हैं तो आसंजन के बाद लाइटिक चरण को प्रेरित करने पर विचार करें। ISLK कोशिकाओं के साथ प्रयोगों से तैयार निष्कर्ष सीमित हैं9. - lytic निलंबन कोशिकाओं के लिए, ऊतक संस्कृति हुड के तहत 5 मिनट के लिए 1:10 पाली एल-lysine के साथ पूर्व इलाज आठ कक्ष स्लाइड. फिर स्लाइड को कमरे के तापमान पर रात को सुखाने के लिए छोड़ दें या 65 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच। 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल की सांद्रता में 800 डिग्री सेल्सियस की सांद्रता में 30 मिनट से 1 घंटा तक 37 डिग्री सेल्सियस तथा 5% ब्व्22 के लिए कक्षित स्लाइडों के साथ इनक्यूबेट 800 डिग्री सेल्सियस कोशिकाओं का उपयोग किया गया है।
नोट: निलंबन कोशिकाओं एक monolayer में व्यवस्थित हो जाएगा, पाली एल-lysine से चिपके हुए और इस तरह अतिरिक्त कोशिकाओं का पालन कोशिकाओं की तुलना में एक चिंता का विषय नहीं हैं. Lytic कोशिकाओं है कि अंगूर समूहों फार्म, यदि संभव हो तो, कोमल भंवर या रासायनिक मतलब से अलग किया जाना चाहिए. बेशक, लेखकों lytic BJAB-RRV-GFP कोशिकाओं के मामले में ऐसी सिफारिशों के साथ ज्यादा सफलता नहीं मिली है. यदि निलंबन-कोशिकाएं अच्छी तरह से पालन नहीं करती हैं, तो पॉली एल-लाइसाइन ऊष्मायन के समय या एकाग्रता को बढ़ाने पर विचार करें।
- अनुयायी लाइटिक कोशिकाओं के लिए, कोशिकाओं को निलंबित करने और 60% संगम को पतला करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 1x ट्रिप्स का उपयोग करें।
3. फिक्सेशन, इम्यूनोफ्लोरेसेंस (वैकल्पिक), हाइब्रिडाइजेशन, और वायरल आरएनए का दृश्य
- मीडिया और अतिरिक्त कक्षनिकालें. इस प्रोटोकॉल के दौरान, समाधान और समाधान जोड़ने के लिए कोमल माइक्रोपाइपिंग को हटाने के लिए वैक्यूम चूषण का उपयोग करें।
नोट: एक वैक्यूम की ताकत कांच Pasteur piette पर एक 200 $L micropipette टिप रखकर कम किया जा सकता है. संदूषण को रोकने के लिए धोने के चरणों के बीच माइक्रोपिपेट टिप को बदलें। प्रत्येक धोने कदम जल्दी से किया जाना चाहिए क्योंकि यह जरूरी है कि कोशिकाओं को बाहर सूखी कभी नहीं है. - इसके तुरंत बाद, 30 मिनट के लिए बर्फ पर पूर्व-चिल्ड 4% फार्मेल्डिहाइड/पीबीएस (फॉस्फेट-बफर्ड नमकीन) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। कोशिकाओं को 200 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के साथ तीन बार धोएं 4 डिग्री सेल्सियस और कमरे के तापमान पर या बर्फ पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
- पूर्व ठंडा 0.5% Triton-X/PBS (फॉस्फेट बफर नमकीन) के 200 डिग्री सेल्सियस के साथ निश्चित कोशिकाओं permebilize बर्फ पर 10 मिनट के लिए या पूर्व ठंडा 70% इथेनॉल के 750 $L के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 1 एच (न्यूनतम) के लिए 7 डी (अधिकतम).।
नोट: छवियों और जैव रासायनिक परख के बीच स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए निर्धारण के बिंदु पर प्रोटीन, कुल आरएनए, और जीनोमिक डीएनए नमूने लीजिए। इस प्रोटोकॉल में सभी washes एक ही तरीके से किया जाता है जब तक अन्यथा निर्दिष्ट. 70% इथेनॉल कक्षों और स्लाइड, जो बाद में जुदाई eases के बीच गोंद ढीला, और भी प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण ठहराव प्रदान करता है. फिर भी, वाष्पीकरण को कम करने और प्रत्येक कक्ष में इथेनॉल के स्तर की जांच करने के लिए चैम्बर स्लाइड के चारों ओर पैराफिन फिल्म का उपयोग करें हर 8 एच 70% इथेनॉल भी कोशिकाओं को समतल करता है, एक कुरकुरा छवि बना रही है, जबकि Triton-X कोशिकाओं को निर्जलित नहीं करता है और परिवर्तन सेल के आयाम.
- पूर्व ठंडा 0.5% Triton-X/PBS (फॉस्फेट बफर नमकीन) के 200 डिग्री सेल्सियस के साथ निश्चित कोशिकाओं permebilize बर्फ पर 10 मिनट के लिए या पूर्व ठंडा 70% इथेनॉल के 750 $L के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 1 एच (न्यूनतम) के लिए 7 डी (अधिकतम).।
- स्लाइड खुर को रोकने के लिए ध्यान से कक्षों निकालें। यदि प्रयोग में पॉलीक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ वायरल या होस्ट प्रोटीन का इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) शामिल है, तो आरएनए फिश को आगे बढ़ने से पहले नीचे वर्णित IF करें. यदि इम्यूनोफ्लोरेसींस एक मोनोक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करता है, तो चरण 3.3.1 में वर्णित के रूप में इम्यूनोफ्लोरेसेंस करें चरण 3.11 के बाद।
नोट: एक ताजा हटाने डिवाइस या निर्माता द्वारा प्रदान की बहुत कम बचे चिपकने वाला के साथ एक का उपयोग करें और धीरे खुर से स्लाइड को रोकने के लिए बंद कक्षों को कम। 4 एच के लिए permeabilizing अभिकर्मक के रूप में 70% इथेनॉल का उपयोग बहुत खुर की संभावना कम कर देता है. एक दरार के मामले में, दरार से प्रभावित नहीं कक्षों पर प्रोटोकॉल जारी रखने और अपूर्ण रूप से सील स्लाइड (यानी कम भंडारण जीवन) के उच्च ऑक्सीकरण दर के प्रति जागरूक हो।- पूर्व ठंडा 1x पीबीएस और पूर्व ठंडा 4% बीएसए (बोवाइन सीरम एल्बुमिन) के साथ ब्लॉक के साथ कुल्ला कोशिकाओं /
नोट: इस प्रोटोकॉल के दौरान बीएसए का उपयोग nonspecific लेबलिंग सीमा. - अवरुद्ध समाधान निकालें और कोशिकाओं को 1:200 या अन्य पॉलीक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 0.1% बीएसए/1x पीबीएस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट करें। फिर 1x PBS के साथ तीन बार धो लें.
नोट: एसएसबी/ORF6 (वायरल एकल-स्लेडेड डीएनए बाइंडिंग प्रोटीन) का पता लगाने केलिए एक एंटीबॉडी 10 का उपयोग 1:200 कमजोर पड़ने पर किया गया था। - 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए FISH-डिटेक्टिंग एंटीबॉडी के साथ संगत फ्लोरोफोर के साथ एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। 1x पीबीएस के साथ तीन बार धो लें. फिर 10-15 मिनट के लिए 4% formaldehyde/1x पीबीएस के साथ ठीक करें और या तो Triton-X या 70% इथेनॉल के साथ permeabilize के रूप में पहले FISH करने के लिए आगे बढ़ने से पहले वर्णित. फ्लोरोसेंट संकेत को बनाए रखने और photobleaching को रोकने के लिए टिन पन्नी के साथ कवर स्लाइड।
- पूर्व ठंडा 1x पीबीएस और पूर्व ठंडा 4% बीएसए (बोवाइन सीरम एल्बुमिन) के साथ ब्लॉक के साथ कुल्ला कोशिकाओं /
- 2x एसएससी (सैलीन सोडियम साइट्रेट) के साथ कोशिकाओं को एक बार धोएं और फिर 50% फॉर्मामाइड, 10% डेक्सट्रन सल्फेट, 2x एसएससी, 0.1% बीएसए, 500 डिग्री/एमएल सामन शुक्राणु डीएनए, 125 डिग्री/ परिसरों. एक आर्द्रता कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट जो नम बाँझ पोंछे के साथ 150 मिमी पेट्री डिश हो सकता है।
नोट: उपयोग करने से कम से कम एक घंटे पहले ताज़ा हाइब्रिडेशन समाधान तैयार करें। पहले पानी में डेक्सट्रन सल्फेट को भंग करें, अक्सर भंवर और 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में इनक्यूबेटिंग। - प्रति कक्ष 35-uL संकरण समाधान में 25 डिग्री सेल्सियस ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स की सुझाई गई सांद्रता की गणना कीजिए। विरोधी भावना ओलिगोन्यूक्लिओटाइड की एकाग्रता को समायोजित करें जैसा कि आवश्यक है। ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स में आसुत जल जोड़ें ताकि विकृतीकरण की मात्रा को 10 डिग्री सेल्सियस तक ले जाया जा सके।
नोट: लेबलिंग प्रतिक्रिया के बाद, ओलिगोन्यूक्लिओटाइडों को शंकायुक्त समाधान में संग्रहीत किया जाता है जिसमें 0.18 एम पोटेशियम कैकोडाइलेट, 23 एम ट्राइस-एचसीएल, 0.23 एमजी/एमएल बीएसए, 4.5 एमएम सीसीएल2, 18 एमएम ईडीसीएल, 2.7 एम के-फॉस्फेट, और 6.8 एम एम केसीएल, 45 एम एम सी एल, 45 एम एम सी एल, 45 एम सीसीएल, 45 एम-एम-सी.एल. 0.02% Triton एक्स-100, और 2% ग्लिसरोल. सांद्रता काफी अधिक है कि पानी के साथ कमजोर पड़ने 1x TE (10 एमएम Tris-HCl और 1 एमएम EDTA), एक मानक oligonucleotide विकृति बफर के पास सांद्रता के लिए विकृतीकरण समाधान लाएगा रहे हैं. - DIG- और/या एलेक्सा फ्लोर 594-लेबल ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स को 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृत करें। फिर विकृत ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स के लिए इच्छित कक्ष प्रति 35 डिग्री एल ताजा संकरण समाधान जोड़ें। यदि डबल फिश प्रदर्शन, विरोधी भावना oligonucleotides के दोनों सेट विकृत और एक साथ संकरित किया जा सकता है.
- पूर्व-हाइब्रिडेशन समाधान निकालें और फिर कक्षों में लेबल किए गए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड वाले हाइब्रिडेशन समाधान जोड़ें. फ्लोरोफोर-लेबल ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स की रक्षा के लिए टिन पन्नी के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रता कक्ष में रात भर इनक्यूबेट करें।
नोट: इनक्यूबेशन कम से कम 10 ज और 24 ज से अधिक नहीं होना चाहिए। - अगले दिन, 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2x एसएससी के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें और फिर 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1x एसएससी के साथ दो बार।
- बर्फ पर 10-15 मिनट के लिए पूर्व ठंडा 4% formaldehyde/1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। फिर तीन बार पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो एंबर लैस करें और 1 एच के लिए पूर्व-चिल्ड 70% इथेनॉल के साथ या 10 मिनट के लिए प्री-चिल्ड 0.5% ट्राइटन-एक्स/1एक्स पीबीएस के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर।
- कोशिकाओं को 1:200 एंटी-डीआईजी FITC के साथ 1:200 एंटी-DIG FITC के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए 0.1% बीएसए/ एंटीबॉडी समाधान निकालें और 1x पीबीएस के साथ तीन बार धो लें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10-15 मिनट के लिए पूर्व ठंडा 4% formaldehyde/1x पीबीएस के साथ फिक्स और फिर 1x पीबीएस के साथ तीन बार धो लें। यदि मोनोक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ एक मेजबान या वायरल प्रोटीन के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रदर्शन करते हैं, तो कोशिकाओं को पार करने और फिर चरण 3.3.1 में उल्लिखित IF प्रोटोकॉल को निष्पादित करें। अन्यथा DAPI धुंधला करने के लिए आगे बढ़ें.
- बर्फ पर 15 मिनट के लिए 0.4 डिग्री/एमएल डीएपीआई के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें 0.5% ट्राइटन-एक्स/1एक्स पीबीएस में और फिर 1x पीबीएस के साथ तीन बार धो लें।
- फ्लोरोसेंट मोती (वैकल्पिक) और एक बढ़ते माध्यम के साथ स्लाइड माउंट. फिर स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ स्लाइड करने के लिए कवरस्लिप सील करें।
- एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, 630x आवर्धन पर प्रोटोकॉल प्रदर्शन के एक सप्ताह के लिए एक घंटे के भीतर नमूनों की छवियों को इकट्ठा. कवर स्लिप को सील करने के लिए और ऑक्सीकरण की दर को कम करके फ्लोरोफोर जीवन को लम्बा करने के लिए नेल पॉलिश के कई कोट लागू करें।
नोट: एक DAPI युक्त बढ़ते माध्यम का उपयोग न करें। जब छवियों का संग्रह, बाद में परिमाणीकरण के लिए प्रत्येक छवि पर पैमाने पर पट्टी शामिल हैं. फ्लोरोसेंट मोती स्लाइड और नमूना तैयारी11के बीच फ्लोरोसेंट तीव्रता के नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं। चरण 4 में द्वि-आयामी (2D) परिमाणीकरण के लिए सेल के मध्य खंड पर छवियों को प्राप्त करें।
4. FISH और IF छवियों की मात्रा उपकोशिकीय स्थानीयकरण को उजागर करने के लिए और फ्लोरोसेंट के न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक अनुपात निर्धारित करने के लिए
- स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न फ्लोरोसेंट दाग और विलय छवियों के एक इकट्ठे ढेर पर छवि विश्लेषण प्रदर्शन करते हैं। जब छवियों को एकत्र किए गए थे शामिल पैमाने पट्टी का उपयोग कर छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के पैमाने सेट करें।
- कई चैनलों में और परमाणु DAPI दाग के संदर्भ में फ्लोरोसेंट तीव्रता मात्रा निर्धारित करने के लिए, एक लाइन उपकरण और एक साजिश प्रोफ़ाइल समारोह का उपयोग करें. फिर मार्कर का उपयोग करके छवि की एक प्रति पर स्थायी रूप से रेखा को इंगित करें जो दर्शक के निर्णय को बाधित या प्रभावित नहीं करते हैं.
- जहां रेखा एक ट्रेस है कि स्थलाकृतिक सुविधाओं, चोटियों और घाटियों की विविधता, एक केंद्रीय अक्ष या एक लाइन है कि supersaturated क्षेत्रों पार नहीं करता है के साथ कब्जा के रूप में इस तरह के एक ट्रेस के रूप में तैयार की है मार्गदर्शन करने के लिए मानदंड स्थापित करें.
नोट: इन लाइन निशान एक सेल में कच्चे फ्लोरोसेंट को दर्शाती है और इस प्रकार एक दाग, नहीं तीव्रता के स्थानों की तुलना करने के लिए सीमित हैं. स्लाइड, उपचार, या तैयारी के बीच एक ही दाग की तीव्रता की तुलना करने के लिए, चरण 3.13 के दौरान एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में स्लाइड में फ्लोरोसेंट मनका जोड़ें। फ्लोरोसेंट मनका बढ़ते प्रक्रिया के दौरान जोड़ा जाना चाहिए और उत्तेजना लेजर और photopliplier ट्यूब (confocal) पर एक ही सेटिंग्स के साथ पता चला.
- जहां रेखा एक ट्रेस है कि स्थलाकृतिक सुविधाओं, चोटियों और घाटियों की विविधता, एक केंद्रीय अक्ष या एक लाइन है कि supersaturated क्षेत्रों पार नहीं करता है के साथ कब्जा के रूप में इस तरह के एक ट्रेस के रूप में तैयार की है मार्गदर्शन करने के लिए मानदंड स्थापित करें.
- उपकोशिकीय स्थानीयकरण में बदलाव की मात्रा निर्धारित करने के लिए, विभिन्न उपचारों से गुजर ने होने वाले कोशिकाओं के न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक अनुपातों की गणना करें।
- आंतरिक सीमा निर्धारित करने के लिए परमाणु DAPI दाग का उपयोग कर दोनों नाभिक और कोशिका द्रव्य के क्षेत्र और कच्चे फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने। परमाणु और कोशिकाद्रव्यी नियंत्रण जैसे नाभिकीय आरएनए (जैसे, केएसएचवी पैन आरएनए) और कोशिकाद्रव्यी आरएनए (जैसे, मेजबान जीएपीडीएच एमआरएनए) शामिल करें। इसके अतिरिक्त, तीन सेल जैसे क्षेत्रों के लिए पृष्ठभूमि तीव्रता की गणना करें और प्रति पिक्सेल या $m2मानों का औसत करें।
नोट: तीव्रता मूल्यों इकाइयों की कमी के लिए करते हैं और इसलिए शब्द 'इकाइयों' प्रयोग किया जाता है। - पहले एक ही क्षेत्र के लिए औसत पृष्ठभूमि का निर्धारण और फिर क्षेत्र के कच्चे तीव्रता से उस individualized मूल्य घटाना द्वारा दोनों परमाणु और सेलुलर कच्चे तीव्रता मूल्यों को सामान्य.
- उदाहरण के लिए, लिटिक बी-सेल के नाभिक का क्षेत्रफल 133ण्4 उउ2 तथा 75976 इकाइयों की कच्ची तीव्रता होती है जबकि उसी फ्लोरोसेंट संकेत की पृष्ठभूमि तीव्रता 0ण्67 युत प्रति उ2होती है। सामान्यीकृत परमाणु तीव्रता होगी
- उदाहरण के लिए, लिटिक बी-सेल के नाभिक का क्षेत्रफल 133ण्4 उउ2 तथा 75976 इकाइयों की कच्ची तीव्रता होती है जबकि उसी फ्लोरोसेंट संकेत की पृष्ठभूमि तीव्रता 0ण्67 युत प्रति उ2होती है। सामान्यीकृत परमाणु तीव्रता होगी
- निम्न समीकरण में मान दर्ज करें.
नोट: यह गणना subcellular क्षेत्र में परिवर्तन के लिए नियंत्रण. Lytic प्रेरण और दवा उपचार नाभिक विस्तार या सेल के आकार को बदल सकते हैं, क्रमशः. - परिणामों की व्याख्या करने के लिए, एक बॉक्स व्हिस्की प्लॉट बनाएँ। फ्लोरोसेंट संकेत का एक समान वितरण शून्य के करीब होगा, जबकि एक परमाणु वितरण एक सकारात्मक अनुपात मूल्य के पक्ष में होगा और एक कोशिकाद्रव्यी वितरण एक नकारात्मक अनुपात मूल्य की ओर प्रवृत्ति होगी.
- आंतरिक सीमा निर्धारित करने के लिए परमाणु DAPI दाग का उपयोग कर दोनों नाभिक और कोशिका द्रव्य के क्षेत्र और कच्चे फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने। परमाणु और कोशिकाद्रव्यी नियंत्रण जैसे नाभिकीय आरएनए (जैसे, केएसएचवी पैन आरएनए) और कोशिकाद्रव्यी आरएनए (जैसे, मेजबान जीएपीडीएच एमआरएनए) शामिल करें। इसके अतिरिक्त, तीन सेल जैसे क्षेत्रों के लिए पृष्ठभूमि तीव्रता की गणना करें और प्रति पिक्सेल या $m2मानों का औसत करें।
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Representative Results
इस पांडुलिपि में विस्तृत FISH और IF विधियों को फ्लोरोसेंट तीव्रता के रेखा निशानद्वारा परिणामों के परिमाणीकरण के साथ चित्र 1 में दर्शाया गया है। यहाँ प्रस्तुत परिणाम अर्द्ध मात्रात्मक हैं और स्थानीयकरण में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, बजाय विभिन्न फ्लोरोसेंट दाग की तीव्रता के बीच तुलना में क्योंकि प्रयोगों स्लाइड तैयारी में एक फ्लोरोसेंट मनका शामिल नहीं था. चित्र 1 यह भी पता चलता है कि कोशिकाद्रव्यी और नाभिकीय क्षेत्रों और उनके अनुपात गुप्त और lytic KSHV संक्रमित कोशिकाओं के लिए अलग हैं. अतः चित्र 2में प्रदर्शित न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक अनुपात में क्षेत्र को नियंत्रित किया जाता है। चित्र 2 परमाणु नियंत्रण, वायरल पॉलीडेनीलेटाहुआ नाभिकीय (पैन) आरएनए, और एक साइटोप्लाज्मिक नियंत्रण, मेजबान जीएपीडीएच एमआरएनए के उपयोग के साथ न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक अनुपात के लिए इस पांडुलिपि में विस्तृत गणना की पुष्टि करता है। चित्रा 3 से पता चलता है कि जब KSHV डीएनए प्रतिकृति या तो फॉस्फोनोऐसीटिक एसिड (Doxy + पीएए) या cidofovir (Doxy + Cido) के उपयोग से lytic चरण में बाधित है, जल्दी ORF59-58 प्रतिलिपि एक मुख्य रूप से कोशिका द्रव्यीय स्थानीयकरण के लिए बदलाव. चित्र ाालों के दो परिमाणीकरण विधियों का सूक्ष्माकरण इस परिणाम का समर्थन करता है और यह प्रकट करता है कि पैन आरएनए विशिष्ट नाभिकीय स्थलों को वायरल डीएनए प्रतिकृति के निषेध और शीघ्र ORF59-58 प्रतिलिपि के लिए देखे गए परिवर्तन के बावजूद स्थानीयकृत करता है।
चित्रा 1: फ्लोरोसेंट तीव्रता के रेखाएँ अंश KSHV प्रतिलिपि और KSHV प्रतिकृति डिब्बों के situ संकरीकरण (फिश) में फ्लोरोसेंट में बारीकियों को प्रकट करते हैं। (ए-बी) TREx RTA (टेट्रासाइक्लिन inducible वायरल प्रतिकृति और प्रतिलेखन उत्प्रेरक प्रोटीन) BCBL-1 कोशिकाओं12 कि doxycycline (Doxy) के साथ 24 एच के लिए lytic चरण में प्रेरित किया गया है की Confocal छवियों. स्केल बार इंगित करता है10 m. (क ) वायरल RNAs के लिए situ संकरीकरण में फ्लोरोसेंट (FISH) और इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) वायरल एकल-प्रवाही डीएनए बाइंडिंग प्रोटीन के लिए (ORF6/SSB) (लाल), KSHV प्रतिकृति डिब्बों के एक घटक, पता चलता है कि वायरल टेप कोशिका द्रव्य, नाभिक में स्थानीयता, और ORF6/SSB समृद्ध क्षेत्रों के बाहर परमाणु foci में, भी प्रतिकृति डिब्बों के रूप में जाना जाता है. विरोधी एसएसबी एंटीबॉडी10 0.4% बीएसए/1x पीबीएस में 1:200 करने के लिए पतला किया गया था और 1:500 विरोधी Rabbit Alexa Fluor 594 माध्यमिक एंटीबॉडी में 0.4% बीएसए / इस अध्ययन के दौरान प्रयुक्त सभी प्रति-सेंस ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स तालिका 1में प्रदान किए गए हैं। ORF59-58 MRNA का पता लगाने दोनों bicistronic और monocistronic प्रतिलिपि शामिल हैं. हालांकि, KSHV संक्रमित JSC-1 कोशिकाओं में, monocistronic MRNA कम से कम 18 गुना bicistronic प्रतिलिपि की तुलना में कम प्रचुर मात्रा में है और संभावना कुल फ्लोरोसेंट संकेत का केवल एक छोटा सा हिस्सा योगदान देता है13मनाया . इसके अलावा पैन आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स (एसबी88) में से एक भी K7 के लिए वायरल प्रतिलिपि का पता लगा सकता है। K7 का पता लगाने से संकेत के रूप में महत्वपूर्ण नहीं होगा संकेत का पता लगाने KSHV पैन आरएनए, जो एक lytic KSHV संक्रमित सेल14में सभी polyadenylated आरएनए के लगभग 80% पर मौजूद है. इसके अतिरिक्त K8.1 MRNA का पता लगाने में चार विरोधी भावना oligonucleotides (tkv13) में से एक K8.1 और पास के खुले पढ़ने फ्रेम (ORF) के अन्य isoforms के कई आइसोफॉर्म्स के लिए बाध्य करने में सक्षम है. FISH संकेत से केवल oligonucleotide tkv13 अपर्याप्त है (डेटा नहीं दिखाया गया है). चार ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स का संयुक्त संकरीकरण और एक ही प्रतिलिपि पर उनमें से बाइंडिंग की संभावना मनाया मजबूत संकेत प्रदान करता है। (क) में कोशिकाओं के बगल वाली सफेद रेखाएँ FISH और IF संकेतों के लिए फ्लोरोसेंट तीव्रता के रेखा पथ को चित्रित करती हैं, जिन्हें (C) में प्लॉट किया गया है। (ख) में कक्षों की डिजिटल रूप से ज़ूम की गई छवियों (क) सफेद रेखाओं से घिरी हुई। सादगी के लिए, नीले DAPI चैनल छोड़ दिया जाता है। (ग) भूखंडों में एक ही पंक्ति के साथ प्रत्येक दाग के लिए सापेक्ष फ्लोरोसेंट तीव्रता दर्शाती है: $SSB (लाल), वायरल ट्रांसक्रिप्ट्स (हरे; प्लॉट पर इंगित प्रतिलिपि), और डीएपीआई (नीला)। छायांकित क्षेत्र DAPI-कम क्षेत्रों को इंगित करते हैं जो वायरल प्रतिकृति डिब्बों या SSB/ORF6-समृद्ध क्षेत्रों से मेल खाते हैं. (छ) नाभिकीय क्षेत्र से कोशिकीय क्षेत्र का अनुपात बदलता रहता है और इस प्रकार पूरे क्षेत्र में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंट तीव्रता अनुपात को क्षेत्र के लिए सामान्यीकृत किया गया था। (ई) परमाणु और सेलुलर क्षेत्रों TREx RTA BCBL-1 कोशिकाओं के लिए मापा के साथ और lytic सक्रियण के दौर से गुजर के बिना. सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण परिवर्तन अप्रेरित कोशिकाओं की तुलना में देखे जाते हैं। बॉक्स और मूंछ भूखंडों 10 और 90 प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं. चित्रा एक क्रिएटिव कॉमन्स रोपण लाइसेंस के तहत Vallery, मुरझाए, और सहयोगियों15 से मामूली संशोधनों के साथ reprinted. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : नियंत्रण परमाणु और कोशिकाद्रव्यी FISH रणनीतियों न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक अनुपात की गणना विधि मान्य. (ए) मेजबान गैपडीएच एमआरएनए (लाल) के लिए और वायरल पॉलीडेनीलेटायड न्यूक्लियर (पैन) एलएनएनआरएनए (हरी) और डीएपीआई नाभिकीय अभिरंजन (नीला) के लिए न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक अनुपात का निर्धारण करने वाली गणना विधि के लिए सकारात्मक फिश नियंत्रण हैं। मेजबान GAPDH MRNA KSHV के मेजबान शटऑफ़ प्रभाव का एक विहित लक्ष्य है और यहाँ दिखाए गए के रूप में lytic प्रेरण पर अपमानित किया जाता है. (ख) (ए) में लिटिक कोशिकाओं के बगल में सफेद रेखाओं द्वारा दर्शाई गई रेखा के साथ फ्लोरोसेंट तीव्रता। डीएपीआई (नीला), पैन आरएनए (हरा), और GAPDH MRNA (लाल)। छायांकित क्षेत्र चित्र 1में परिभाषित किए गए हैं। (ग ) चित्र 2 और चित्र 3 में दर्शाए गए कक्षों के तीन जैविक प्रतिकृतियों के लिए (क) (ं) द्वारा प्रतप्रदर्श कक्षों की प्रतिकता का परिमाणीकरण (ं 150 प्रत्येक जीएपीडीएच नमूने के लिए , द र्5-58 या के8.1 नमूने के लिए n ] 75) का प्रदर्शन किया गया था। . P-मान: gt;0.05 (ns), [lt;0.05 (*), और lt;0.005 (*), और lt;0.0005 (**). (डी) TREx RTA BCBL-1 कोशिकाओं से आरएनए के प्रतिनिधि उत्तरी दाग 24 ज Doxy के बाद. बॉक्स और मूंछ भूखंडों 10 और 90 शतमक का प्रतिनिधित्व करते हैं. चित्रा एक क्रिएटिव कॉमन्स रोपण लाइसेंस के तहत Vallery, मुरझाए, और सहयोगियों15 से मामूली संशोधनों के साथ reprinted. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र3: रेखा निशान और न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक अनुपात की गणना वायरल डीएनए प्रतिकृति के निषेध पर जल्दी lytic ORF59-58 प्रतिलिपि के लिए कोशिका द्रव्य के लिए एक मजबूत बदलाव प्रकट करते हैं. TREx RTA BCBL-1 कोशिकाओं के लिए इलाज किया गया 24 एच कोई दवा के साथ (यूनिंड), doxycycline केवल (Doxy), या doxycycline और दादवायरल डीएनए प्रतिकृति के एक अवरोधक के साथ, फॉस्फोनोऐसीटिक एसिड (Doxy + पीएए) या cidofovir (Doxy + Cido). पैनल (ए-सी) तीन जैविक प्रतिकृति से एकत्र नमूनों से डेटा दिखाते हैं। (क) वायरल डीएनए प्रतिकृति के निषेध के दौरान वायरल इंट्रासेल्यूलर डीएनए के लिए ुपीसीआर मूल्यों को मेजबान-सेल जीएपीडीएच जीन के प्रवर्तक डीएनए की मात्रा में सामान्यीकृत किया गया था। (बी) उत्तरी दाग (बाएं) और परिमाणीकरण (दाएं) वायरल डीएनए प्रतिकृति के निषेध के दौरान कुल आरएनए स्तर दिखाते हैं। सभी RNAs के अप्रेरित स्तर undetectable थे. (सी) वायरल डीएनए प्रतिकृति के निषेध पर वायरल ORF59-58 प्रतिलिपियों (हरा) और पैन आरएनए (लाल) के लिए प्रतिनिधि FISH छवियों. डीएपीआई (नीला) परमाणु दाग था। (घ) जैव त्रिफला पर (ग) (द र् 75 प्रत्येक) द्वारा प्रप्रदर्शित कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट तीव्रता का परिमाणीकरण किया गया था। (ई) सफेद रेखाओं द्वारा दर्शाई गई कोशिकाओं के साथ फ्लोरोसेंट तीव्रता (सी) दर्शाई गई है: डीएपीआई (नीला), पैन आरएनए (लाल) और ORF59-58 MRNA (हरा)। P-मान: gt;0.05 (ns), [lt;0.05 (*), और lt;0.005 (*), और lt;0.0005 (**). इस अध्ययन में सभी ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स के अनुक्रम सारणी 1में दिए गए हैं। बॉक्स और मूंछ भूखंडों 10 और 90 प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं. चित्रा एक क्रिएटिव कॉमन्स रोपण लाइसेंस के तहत Vallery, मुरझाए, और सहयोगियों15 से पुनर्मुद्रण. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| उत्तरी ओलिगोस | |||||||
| ओलिगो नं. | जीन | अनुक्रम | जीन के भीतर स्थिति | संदर्भ NC009333.1 जीनोम के साथ स्थिति (संख्या दिशा या किनारा को प्रतिबिंबित नहीं करते) | |||
| KORF50 | KSHV आरटीए/ | CGCATTGCGGGTTGAATTGCTGG | 1284 से 1309 | 73936 से 73961 | |||
| जेबीडब्ल्यू249 | KSHV SOX/ORF37 | तात्यागटगावच्या काकाकासीगगटीसी | 262 से 291 | 57633 से 57662 | |||
| tkv379 | KSHV ORF59-58 | टीजीजीजीटीसीजीजीजीटीएजीटीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीएसीटी | 941 से 967 (ORF59 ORF) | 95879 से 95905 | |||
| tkv13 | KSHV K8.1 | अगागतगगगगगगगगगटगटगटगगगगगगगगगटगगगगगगगगटगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगग | 16 से 57 | 76029 से 76070 | |||
| एसबी 2 | KSHV पैन आरएनए | ACAAATGCCTCTCTGTCGC | 664 से 687 | 29496 से 29519 | |||
| रेनसे पी | मानव RNase पी | टी.जी.जी.जी.जी.जी.जी.गगगगटटीजी | 319 से 339 | एन/ए | |||
| FISH जांच | |||||||
| ओलिगो नं. | जीन | अनुक्रम | |||||
| एसबी 2 | KSHV पैन आरएनए | ACAAATGCCTCTCTGTCGC | 664 से 687 | 29496 से 29519 | |||
| एसबी85 | KSHV पैन आरएनए | CGCTGCTTCTCTCACATT | 373 से 392 | 29205 से 29224 | |||
| एसबी88 | KSHV पैन आरएनए | GTGAAGCGGCAGCAAGGTGACTGG | 1 से 22 | 28830 से 28854 | |||
| tkv13 | KSHV K8.1 | अगागतगगगगगगगगगटगटगटगगगगगगगगगटगगगगगगगगटगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगग | 16 से 57 | 76029 से 76070 | |||
| टी.के.वी.14 | KSHV K8.1 | TGATATAGATCGGTCGTTTGTGGGCCTGGGA | 377 से 414 | 76390 से 76427 | |||
| टी.के.वी.15 | KSHV K8.1 | GTAAGGTACGCTTCTACACCGACGGTTACCC | 461 से 500 | 76474 से 76513 | |||
| टी.के.वी.16 | KSHV K8.1 | ग्रामगातसीसीच्या कागद-यापैकी एका गटात | 688 से 725 | 76701 से 76738 | |||
| tkv376 | KSHV ORF59-58 | TAATGTGTCATGCCCCTGATT | 54 से 79 | 96767 से 96792 | |||
| tkv377 | KSHV ORF59-58 | GCCGATCCGTGCACTTCCGGTT | 93 से 122 | 96724 से 96753 | |||
| tkv378 | KSHV ORF59-58 | AAGGCTATGCCGTCGAGTACTACTCGCA | 300 से 329 | 96517 से 96546 | |||
| tkv379 | KSHV ORF59-58 | टीजीजीजीटीसीजीजीजीटीएजीटीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीएसीटी | 941 से 967 | 95879 से 95905 | |||
| टी.के.वी. | KSHV ORF59-58 | AAAGAGTGAGATACTACGAGGCCTT | 1289 से 1315 | 95531 से 95557 | |||
| टी.के.वी. | KSHV ORF59-58 | AAACACTGCTGACGCGCAGATCCCC | 1423 से 1450 | 95396 से 95423 | |||
| टी.के.वी. | KSHV ORF59-58 | TACCTGTGTACATGCGGCGCCTGATACAC | 1571 से 1602 | 95244 से 95275 | |||
| tkv383 | KSHV ORF59-58 | GGGTCGAGATCAGATTAGGCGAAACTCACAAGG | 2136 से 2173 | 94673 से 94710 | |||
| तारकीय | जीएपीडीएच | तारकीय द्वारा पूर्वनिर्मित | एन/ए | एन/ए | |||
| क्यूपीसीआर प्राइमर्स | |||||||
| टी.के.वी. | GAPDH प्रमोटर | CTGCACCAACTGCTTAG | एन/ए | एन/ए | |||
| टी.के.वी. | GAPDH प्रमोटर | GTCTCTGGGGCAGTGAT | एन/ए | एन/ए | |||
| tkv319 | KSHV ORF39 (जी.एम.) | GTGAGGTGCTTCGGTGAGTT | एन/ए | 60075 से 60094 | |||
| टी.के.वी. | KSHV ORF39 (जी.एम.) | सीसीटीजीजीटीसीएएजीटीजीटीटीटीटी | एन/ए | 60218 से 60237 | |||
| आरटी-पीसीआर प्राइमर्स | |||||||
| टी.के.वी. 455 | K8/K-BZIP फॉरवर्ड आरटी QPCR प्राइमर | कागदागागागागाग | 655 से 673 | 75603 से 75621 | |||
| टी.के.वी. 456 | K8/K-BZIP रिवर्स आरटी QPCR प्राइमर के लिए unspliced | जीसीकैटजीटीसीसीसीटीटीजीटीजीटी | 755 से 774 | 75703 से 75722 | |||
| टी.के.वी. 457 | K8/K-BZIP रिवर्स आरटी QPCR प्राइमर spliced के लिए | कैटागकैटCGCGAAG | 871 से 888 | 75819 से 75836 | |||
| जेबीडब्ल्यू479 | मानव RNase पी फॉरवर्ड | एजीसीटीजीएजीएजीजी | 238 से 257 | एन/ए | |||
| जेबीडब्ल्यू480 | मानव RNase पी रिवर्स | जी.सी.जी.जी.गागगटगटगगा | 317 से 336 | एन/ए | |||
तालिका 1: इस प्रकाशन के विश्लेषण में प्रयुक्त सभी ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स। तालिका 1 Vallery एट अल से एक क्रिएटिव कॉमन्स रोपण लाइसेंस के तहत माइक्रोबायोलॉजी के लिए अमेरिकन सोसायटी से अनुमति के साथ पुनरुत्पादित किया गया था15.
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Discussion
इस रिपोर्ट में वर्णित प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार के सेल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और इसमें मोनोक्लोनल और पॉलीक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी दोनों का उपयोग करके डबल आरएनए फिश और आरएनए फिश के लिए चरण शामिल हैं। हालांकि तैयार स्लाइड आम तौर पर एक confocal माइक्रोस्कोप के साथ छवि रहे हैं, इमेजिंग वृद्धि हुई एंटीबॉडी एकाग्रता और एक अलग बढ़ते माध्यम के संशोधनों के बाद एक STED (उत्तेजित उत्सर्जन कमी) माइक्रोस्कोप के साथ किया जा सकता है. अलग-अलग कोशिकाओं के एन्हांस्ड विश्लेषण के लिए, इस प्रोटोकॉल के साथ तैयार किए गए नमूनों को भी सॉर्ट किया जा सकता है, छविबद्ध किया जा सकता है, और मामूली परिवर्तनों के साथ सेल सॉर्टर या फ्लो साइटोमीटर द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, जैसा कि बोरा और सहयोगियों द्वारा दिखाया गयाहै 16। तथापि, लाइव सेल इमेजिंग के लिए इस प्रोटोकॉल को अपनाया नहीं जा सकता है।
परिमाणीकरण विधियां विस्तृत अवलोकन पूर्वाग्रह को खत्म करने और एक संभावित न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक बदलाव को मान्य करने के लिए सेवा करते हैं। नाभिककोशिकाद्रव्यी अनुपात तब भी इंगित करता है जब एक जैव अणु एक विशिष्ट उपकोशिकीय डिब्बे में स्थानीयकरण के लिए समान रूप से छितरी हुई होने से समायोजित हो जाता है। यहाँ प्रस्तुत परिणाम अर्द्ध मात्रात्मक हैं, जबकि प्रोटोकॉल परिमाणीकरण को मजबूत करने के तरीकों की रूपरेखा. न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक अनुपात और रेखा निशान की ताकत (चरण 4) तीव्रता नियंत्रण के रूप में फ्लोरोसेंट मोती के उपयोग पर निर्भर (चरण 3.13) और स्पष्ट subcellular मार्करों के उपयोग, जैसे परमाणु Lamin A/ इस समय, KSHV वायरल प्रतिकृति डिब्बों के लिए एक स्पष्ट सीमा मार्कर मौजूद नहीं है। भले ही, इस गणना उचित मार्करों के उपयोग के साथ अन्य subcellular डिब्बों के लिए बढ़ाया जा सकता है.
इस रिपोर्ट में विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए बड़ी बाधा विशिष्ट प्रतिलिपि (चरण 1) के लिए FISH रणनीतियों का विकास है। सफलता बहुतायत और विरोधी भावना oligonucleotides की बाध्यकारी शक्ति पर निर्भर करता है. विशेष रूप से प्रतिलिपि के लिए विशिष्टता वायरल जीनोम में ओवरलैपिंग ओपन रीडिंग फ्रेम (ORFs) की उपस्थिति से और भी अधिक कठिन बना दिया है। इस प्रकार, वायरल प्रतिलिपि अक्सर एक ही जीनोमिक क्षेत्र से अन्य वायरल प्रतिलिपि के साथ अनुक्रम समानता17 है, विशेष रूप से दाद के मामले में. अक्सर एक FISH रणनीति के विकास और अधिक प्रचुर मात्रा में प्रतिलिपि का लाभ लेना चाहिए. FISH संकेत की कमी का निवारण करने के लिए, उपयोगकर्ताओं को मानव कोशिकाओं में तकनीक और अभिकर्मकों की तैयारी पर्याप्त हैं कि पुष्टि करने के लिए U2 snRNA FISH रणनीति के साथ FISH प्रोटोकॉल प्रदर्शन करना चाहिए. इसी तरह, KSHV पैन आरएनए फिश रणनीति KSHV संक्रमित कोशिकाओं में lytic सक्रियण की पुष्टि कर सकते हैं. विरोधी भावना oligonucleotides द्वारा बाध्यकारी समस्या निवारण करने के लिए, लेखकों कई विरोधी भावना oligonucleotides विकसित करने की सलाह देते हैं. यदि सब कुछ विफल रहता है, एक वाणिज्यिक विकल्प के रूप में चित्र 2 में GAPDH FISH रणनीति के उपयोग के द्वारा और Vallery, मुरझाए, और सहयोगियों द्वारा प्रदर्शित उपलब्ध है15.
मजबूत एल्गोरिदम सेलुलर और subcellular सीमाओं को परिभाषित करने के लिए आगे परिमाणीकरण पूर्वाग्रह को खत्म होगा. कुछ विश्लेषणात्मक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर सेल, नाभिक, और अधिक के लिए सीमाओं सेट कर सकते हैं, लेकिन निश्चित मार्करों की आवश्यकता होती है। वायरल प्रतिकृति डिब्बों जैसे असामान्य सेल morphologies ऐसे सॉफ्टवेयर के लिए मुश्किल कर रहे हैं - भविष्य के विकास के लिए एक चुनौती है. इसके अलावा यहाँ वर्णित परिमाणीकरण विधियों एक सेल (2 डी छवि विश्लेषण) के एक ऑप्टिकल टुकड़ा करने के लिए सीमित कर रहे हैं. जबकि 3 डी छवि अधिग्रहण संभव है18, एक मात्रात्मक 3 डी छवि विश्लेषण के भविष्य के विकास वायरल प्रतिकृति डिब्बों के spatiotemporal विनियमन में और अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं.
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Disclosures
लेखकों के हित का कोई संघर्ष नहीं है खुलासा करने के लिए.
Acknowledgments
हम जोनाथन Rodenfels, Kazimierz Tycowski, और जोहाना बी डेटा विश्लेषण पर सलाह के लिए withers धन्यवाद. हम एसएसबी विरोधी एंटीबॉडी के लिए जी हेवर्ड को भी धन्यवाद देते हैं। यह कार्य राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (टीकेवी) और एनआईएच अनुदान (सीए16038) (जेएएस) से टी 32जीएम007223 और टी 32एआई055403 द्वारा समर्थित किया गया था। जेएएस हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट का एक अन्वेषक है। आंकड़े 1-3 और तालिका 1 निम्नलिखित प्रकाशन से एक क्रिएटिव कॉमन्स रोपण लाइसेंस के तहत माइक्रोबायोलॉजी के लिए अमेरिकन सोसायटी से अनुमति के साथ पुनरुत्पादित किया गया: Vallery, टी के, मुरझाए, जे बी, Andoh, जे ए, Steitz, जे ए Kaposi के Sarcoma-एसोसिएटेड न्यूक्लियर फॉसी में हर्पीवायरस एमआरएनए संचय वायरल डीएनए प्रतिकृति और वायरल Noncoding Polyadenylated परमाणु आरएनए से प्रभावित है। जर्नल ऑफ वायरोलॉजी. 92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlexaFluor594-5-dUTP | Life Technologies | C1100 | |
| anti-DIG FITC | Jackson Lab Immunologicals | 200-092-156 | |
| Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody | Invitrogen | A-11037 | Goat |
| Anti-SSB Antibody | N/A | N/A | Ref. Chiou et al. 2002 |
| BLASTn | NIH NCBI | N/A | Free Sequence Alignment Software |
| Dextran Sulfate | Sigma Aldrich | D8906 | Molecular Biology Grade |
| DIG-Oligonucleotide Tailing Kit | Sigma Roche | #03353583910 | 2nd Gen |
| Eight-Chamber Slides | Nunc Lab Tek II | #154453 | Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. |
| Formamide | Sigma Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| GAPDH Probes | Stellaris | SMF-2019-1 | Compatible with protocol, Quasar 670 |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | N/A | Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/] |
| OligoAnalyzer | IDT | N/A | Free Oligonucleotide Analyzer |
| pcDNA3 | Invitrogen | A-150228 | |
| pmaxGFP | Amaxa | VDF-1012 | |
| Poly L-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 | |
| Terminal Transferase | Sigma Roche | #003333574001 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | NEB | S1402S | |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. |
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