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Chemistry

प्राकृतिक उत्पाद की खोज के साथ LC-MS/MS नैदानिक फ़्रेग्मेंटेशन फ़िल्टरिंग: Microcystin विश्लेषण के लिए आवेदन

Published: May 31, 2019 doi: 10.3791/59712
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2, 2
1Department of Chemistry, Carleton University Ottawa, 2London Research and Development Center, Agriculture and Agri-Food Canada

Summary

नैदानिक विखंडन फ़िल्टरिंग, mzmine में कार्यांवित, एक सुरुचिपूर्ण, पोस्ट अधिग्रहण दृष्टिकोण के लिए स्क्रीन LC-ms/दोनों ज्ञात और अज्ञात प्राकृतिक उत्पादों की पूरी कक्षाओं के लिए ms डेटासेट है । यह उपकरण उत्पाद आयनों और/या तटस्थ हानि के लिए MS/MS स्पेक्ट्रा की खोज करता है जिसे विश्लेषक ने यौगिकों के संपूर्ण वर्ग के लिए नैदानिक के रूप में परिभाषित किया है ।

Abstract

प्राकृतिक उत्पादों अक्सर एक ही यौगिक के बजाय संरचनात्मक रूप से इसी तरह के यौगिकों के मिश्रण के रूप में bioसंश्लेषित कर रहे हैं । उनकी आम संरचनात्मक विशेषताओं के कारण, एक ही वर्ग के भीतर कई यौगिकों समान MS/MS फ़्रेग्मेंटेशन गुजरना और कई समान उत्पाद आयनों और/या तटस्थ हानि है । नैदानिक फ़्रेग्मेंटेशन फ़िल्टरिंग (DFF) का उद्देश्य कुशलता से एक जटिल निकालने में दिए गए वर्ग के सभी यौगिकों का पता लगाने के लिए गैर-लक्षित LC-MS/ms डेटासेट MS/MS स्पेक्ट्रा कि वर्ग विशिष्ट उत्पाद आयनों और/या तटस्थ हानि होते हैं । इस विधि एक DFF मुक्त स्रोत MZmine मंच है कि नमूना निष्कर्षों की आवश्यकता है के भीतर लागू मॉड्यूल पर आधारित है डेटा पर निर्भर अधिग्रहण के द्वारा विश्लेषण किया जा एक उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमीटर जैसे चतुर्ध्रुव Analyzers. इस दृष्टिकोण की मुख्य सीमा है विश्लेषक पहले परिभाषित करना चाहिए जो उत्पाद आयनों और/या तटस्थ हानि प्राकृतिक उत्पादों के लक्षित वर्ग के लिए विशिष्ट हैं । DFF एक जटिल नमूना के भीतर सभी संबंधित प्राकृतिक उत्पादों के बाद की खोज के लिए अनुमति देता है, नए यौगिकों सहित. इस काम में, हम microcystis aeruginosa की स्क्रीनिंग के अर्क से dff की प्रभावशीलता का प्रदर्शन, एक प्रमुख हानिकारक शैवाल खिलने के कारण cyanobacteria, microcystis के उत्पादन के लिए.

Introduction

अनुबद्ध द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री (MS/MS) एक व्यापक रूप से प्रयुक्त मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधि है जिसमें एक पूर्वगामी आयन को अलग-थलग करना और सक्रियण ऊर्जा के अनुप्रयोग के माध्यम से विखंडन उत्प्रेरण करना शामिल है जैसे टक्कर प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी)1. एक आयन के टुकड़े को उसके आण्विक संरचना से परिचित करने का तरीका । प्राकृतिक उत्पादों अक्सर एक अद्वितीय रासायनिक2के रूप में के बजाय संरचनात्मक रूप से समान यौगिकों के मिश्रण के रूप में bioसंश्लेषित कर रहे हैं । इस प्रकार, संरचनात्मक रूप से संबंधित यौगिकों कि एक ही तब वर्ग का हिस्सा हैं अक्सर साझा उत्पाद आयनों और/या तटस्थ हानि सहित कुंजी ms/ वर्ग-विशिष्ट उत्पाद आयनों और/या तटस्थ हानि के अधिकारी यौगिकों के लिए जटिल नमूनों स्क्रीन करने की क्षमता यौगिकों के पूरे वर्गों का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली रणनीति है, संभावित रूप से नए प्राकृतिक उत्पादों की खोज करने के लिए अग्रणी3, 4 । , 5 । , 6. दशकों के लिए, तटस्थ हानि स्कैनिंग और अग्रदूत आयन स्कैनिंग कम संकल्प उपकरणों पर प्रदर्शन जैसे मास स्पेक्ट्रोमेट्री तरीकों का पता लगाया जा करने के लिए एक ही तटस्थ हानि या उत्पाद आयनों के साथ आयनों की अनुमति दी है. हालांकि, विशिष्ट आयनों या संक्रमण प्रयोग करने से पहले परिभाषित किया जाना चाहिए । चूंकि उच्च विभेदन वाले मास स्पेक्ट्रोमीटर अनुसंधान प्रयोगशालाओं में अधिक लोकप्रिय हो गए हैं, इसलिए अब गैर-लक्षित, डेटा-निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) विधियों का उपयोग करके जटिल नमूनों की जांच की जाती है । पारंपरिक तटस्थ हानि और पूर्वगामी आयन स्कैनिंग के विपरीत संरचनात्मक रूप से संबंधित यौगिकों की पहचान पोस्ट-अधिग्रहण विश्लेषण7द्वारा किया जा सकता है । इस काम में, हम एक रणनीति हम विकसित किया है प्रदर्शन के नैदानिक विखंडन फ़िल्टरिंग (dff)5,6, एक सीधे आगे और उपयोगकर्ता के अनुकूल दृष्टिकोण जटिल matrices के भीतर यौगिकों के पूरे वर्गों का पता लगाने के लिए । इस DFF मॉड्यूल खुला स्रोत, MZmine 2 मंच और MZmine २.३८ या नए रिलीज डाउनलोड करके उपलब्ध में लागू किया गया है. Dff उपयोगकर्ताओं को कुशलता से एमएस के लिए डीडीए डेटासेट स्क्रीन करने के लिए अनुमति देता है/एमएस स्पेक्ट्रा जो उत्पाद आयन (ओं) और/ DFF की एक सीमा विशेषता उत्पाद आयनों और/या यौगिकों के एक वर्ग के लिए तटस्थ नुकसान विश्लेषक द्वारा परिभाषित किया जाना चाहिए है ।

उदाहरण के लिए, अधिक से अधिक ६० अलग fumonisin माइकोटॉक्सिन की पहचानकी 8,9 एक tricarballलिलिक पक्ष श्रृंखला के अधिकारी, कि एक एम १५७.०१४२/ [एम-एच]- आयन4का विखंडन । इसलिए, एक नमूना में सभी ख्यात fumonisins का पता लगाया जा सकता है DFF का उपयोग कर एक डीडीए डाटासेट है कि प्रमुख एम १५७.०१४२/ इसी प्रकार, मैसर्स/एमएस स्पेक्ट्रा के लिए डीडीए डेटासेट की स्क्रीनिंग करके सल्फित यौगिकों का पता लगाया जा सकता है जिसमें ७९.९५७४ डीए (एसओ3)3का नैदानिक तटस्थ नुकसान होता है । इस प्रकिया को नए चक्रीय पेप्टाइड5 और प्राकृतिक उत्पादों का पता लगाने के लिए भी सफलतापूर्वक लागू किया गया है जिनमें ट्रिप्टोफान या फेनिल ऐलानिन अवशेष6हैं ।

DFF की प्रभावशीलता और MZmine मंच10के भीतर उपयोग की अपनी आसानी को प्रदर्शित करने के लिए, हम microcystins (MCs) के विश्लेषण के लिए इस दृष्टिकोण लागू किया है; २४० से अधिक संरचनात्मक रूप से संबंधित विषाक्त पदार्थों के एक वर्ग मीठे पानी साइनोबैक्टीरिया11,12,13द्वारा उत्पादित.

सबसे अधिक सूचित किया सायनोटॉक्सिन MCs हैं, MC-LR के साथ (leucine [L]/arginine [R]) congener अक्सर अध्ययन (चित्रा 1) । एमसीएस, माइक्रोसिस्टिस, ऐनाबीना, नोस्तोक , और प्लकटॉथ्रिक्स12,13सहित बहु सायनोबैक्टीरिया जेनेरा द्वारा बायोसंश्लेषित मोनोसाइक्लिक नॉन राइबोसोमल हेप्टापेप्टाइड हैं । एमसीएस एल-अमीनो अम्ल के पांच सामान्य अवशेष तथा दो परिवर्ती पदों से निर्मित हैं। लगभग सभी MCs एक विशेषता β-अमीनो एसिड 3-अमीनो-9 methoxy-2, 6, 8-trimethyl-10-phenyldeca-4, 6-dienoic एसिड (Adda) की स्थिति 511में अवशेषों के अधिकारी ।  एमसीएस की एमएस/एमएस फ़्रेग्मेंटेशन मार्ग14,15में भली-भांति वणत हैं; एडीडीए अवशेष प्रमुख एमएस/एमएस उत्पाद आयन, एम/जेड १३५.०८०३+ (सी9एच11ओ+) के साथ-साथ अन्य उत्पाद आयनों के लिए उत्तरदायी है जिसमें एम/जेड १६३.१११४+ (सी11एच15 O+) (चित्र 2) । Microcystis aeruginosa सेलुलर निष्कर्षों के गैर लक्षित डीडीए डेटासेट इन नैदानिक आयनों का उपयोग कर मौजूद सभी microcystis के लिए जांच की जा सकती है, दी है कि microcystis एक adda अवशेष है ।

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Protocol

1. गैर लक्षित तरल क्रोमेटोग्राफी (एलसी) की तैयारी-एमएस/

नोट: DFF किसी भी उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर और विश्लेषणात्मक विधि analytes का एक लक्ष्य वर्ग के लिए अनुकूलित का उपयोग कर किया जा सकता है । MC अनुकूलित LC-MS/MS शर्तों पर ऑर्करैप मास स्पेक्ट्रोमीटर सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध हैं ।

  1. डाउनलोडिंग MZmine 2 (http://mzmine.github.io/)
    नोट: उदाहरण डेटा CPCC300. raw https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0 पर पाया जा सकता है ।
    1. Raw डेटा विधियाँ ड्रॉप डाउन मेनू के अंतर्गत, raw डेटा आयात विकल्प का चयन करें ।
    2. विश्लेषण किया जा करने के लिए डेटा फ़ाइल (फ़ाइलें) चुनें । एकल या एकाधिक फ़ाइलें आयात की जा सकती हैं ।
  2. वैकल्पिक विक्रेता डेटा स्वरूप MZmine द्वारा समर्थित नहीं है, तो centroided. mzmine डेटा फ़ाइलें जनरेट करने के लिए Proteowizard16 का उपयोग करें ।
    1. विक्रेता द्वारा प्रदान किए गए centroiding एल्गोरिथ्म लागू करने के लिए पीक खरीदना फ़िल्टर चुनें ।

2. आयातित डीडीए फाइलों की नैदानिक विखंडन फ़िल्टरिंग

  1. कर्सर का उपयोग करना, का चयन करें और मुख्य MZmine स्क्रीन के रॉ डेटा फ़ाइलें स्तंभ में डेटा फ़ाइल (ओं) पर प्रकाश डाला ।
  2. विज़ुअलाइज़ेशन ड्रॉप डाउन मेनू के अंतर्गत, नैदानिक फ़्रेग्मेंटेशन फ़िल्टरिंग विकल्प का चयन करें ।
  3. (चित्रा 3) प्रकट होता है कि dff संवाद बॉक्स में, इनपुट निम्न विकल्प:
    1. प्रतिधारण समय- ऑटो रेंज का उपयोग करें या जब analytes के लक्षित वर्ग elute होगा मिनटों में प्रतिधारण समय की सीमा को परिभाषित ।
    2. प्रीकर्सर m/z - ऑटो रेंज का उपयोग करें या जब उपयुक्त कई आवेशित यौगिकों के लिए संभावना सहित analytes के लक्षित वर्ग के एम/जेड रेंज को परिभाषित ।
    3. एम/जेड सहिष्णुता -MSinstrument की प्राप्त करने योग्य एमएस/ ०.०१ m/z या ३.० पीपीएम एक ऑर्करैप प्लेटफॉर्म के लिए उपयुक्त है । यदि केवल नैदानिक उत्पाद आयनों की जांच की जाएगी, नैदानिक तटस्थ हानि मूल्य (डीए) विकल्प में इनपुट ०.० । इसके विपरीत, यदि केवल नैदानिक तटस्थ हानि की जांच की जाएगी , इनपुट ०.० नैदानिक उत्पाद आयनों (m/z) विकल्प में ।
    4. नैदानिक उत्पाद आयनों (m/z) -वर्ग विशिष्ट उत्पाद आयन (s) m/zइनपुट । एक अल्पविराम के साथ एक से अधिक उत्पाद आयनों अलग ।
      नोट: एकाधिक उत्पाद आयनों Inputting स्पेक्ट्रा कि सभी सूचीबद्ध उत्पाद आयनों शामिल कल्पना करेंगे ।
    5. नैदानिक तटस्थ हानि मूल्य (डीए) -इनपुट वर्ग विशिष्ट तटस्थ हानि (es) । एक अल्पविराम के साथ एकाधिक तटस्थ नुकसान अलग ।
      नोट: Inputting एकाधिक तटस्थ नुकसान स्पेक्ट्रा कि सभी सूचीबद्ध तटस्थ नुकसान शामिल कल्पना करेंगे । दोनों नैदानिक उत्पाद आयनों और न्यूट्रल्स घाटा inputting स्पेक्ट्रा है कि सभी मानदंडों को संतुष्ट कल्पना करेंगे ।
    6. न्यूनतम नैदानिक आयन तीव्रता (% आधार पीक) – MS/ms स्पेक्ट्रा के आधार शिखर के एक% के रूप में, नैदानिक उत्पाद आयनों और/या तटस्थ हानि के लिए विचार किया जा करने के लिए न्यूनतम तीव्रता को परिभाषित.
    7. Peaklist आउटपुट फ़ाइल – परिणाम आउटपुट के लिए कोई पथ और फ़ाइल नाम का चयन करें ।
    8. DFF विश्लेषण प्रारंभ करने के लिए ठीक बटन क्लिक करें । एक DFF प्लॉट ऊपर दिए गए चरणों को सफलतापूर्वक पूरा करने पर दिखाई देगा
      नोट: दो. csv डेटा फ़ाइलें जनरेट की जाएंगी । {Peaklist आउटपुट फ़ाइल}. csv में प्रीकर्सर m/z, स्कैन संख्याएं, और स्कैन का अवधारण समय होता है । यह मौजूदा mzmine मॉड्यूल में इस्तेमाल किया जा सकता है कच्चे डेटा तरीकों > चोटी का पता लगाने > लक्षित चोटी का पता लगाने के लिए निकाले गए उत्पंन करने के लिए व्यापारियों कि निर्धारित dff मापदंड से मुलाकात की chromatograms । {Peaklist आउटपुट फ़ाइल} _ data. csv में प्रिकर्सर m/z, उत्पाद आयन m/z और अवधारण बार mzmine के बाहर dff भूखंडों के उत्पादन की अनुमति देने के लिए ।

3. उदाहरण के लिए का उपयोग करें DFF microcystin विश्लेषण के लिए

  1. नमूना तैयारी
    1. जीवाणुरहित २५० मिलीलीटर erlenmeyer फ्लैक्स MA मीडिया17 या अंय साइनोबैक्टीरिया विकास मीडिया (BG-11) एक फोम डाट के साथ फिट के 30 मिलीलीटर युक्त ।
    2. एक साइनोबैक्टीरिया संस्कृति के साथ लगभग 5 × 105 कोशिकाओं एमएल-1 के लिए असैप्टिक शर्तों के साथ रोगाणुरहित विकास मीडिया inoculate । एक hemocytometer साथ सेल घनत्व की निगरानी । इस उदाहरण में, बढ़ाएँ M. aeruginosa तनाव CPCC300 photoautotrophically पर 27 ° c, शांत सफेद फ्लोरोसेंट प्रकाश के साथ प्रबुद्ध (30 μe M-2 s-1) एक 12 एच प्रकाश का उपयोग: 12 ज अंधेरे शासन । हर दिन एक बार कोशिकाओं भंवर ।
    3. ४७ मिमी व्यास GF/सी ग्लास microfiber फिल्टर कागज का उपयोग वैक्यूम छानने का काम द्वारा 26 दिनों के बाद संस्कृति माध्यम से कोशिकाओं को अलग.
    4. 14 मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब (ओं) में काटा कोशिकाओं को ८०% मेथनॉल (aq) के 3 मिलीलीटर जोड़ें ।
    5. भंवर और बाद में 30 एस प्रत्येक के लिए साइनोबैक्टीरिया कोशिकाओं युक्त टेस्ट ट्यूब (s) sonicate । परीक्षण नली को 1 ज के लिए-20 ° ब् पर भंडारित करें । परीक्षण ट्यूब को कमरे के तापमान पर लौटाएं और 15 मिनट के लिए नमूने को पिघलाने की अनुमति दें ।
    6. दोहराएं कदम 3.1.5 दो अतिरिक्त बार प्रभावी ढंग से कोशिकाओं lyse करने के लिए ।
    7. एक ०.२२ μm ptfe सिरिंज फिल्टर (s) के माध्यम से परिणामी साइनोबैक्टीरिया कोशिका निकालने (ओं) को फ़िल्टर ।
    8. नाइट्रोजन गैस की कोमल धारा का उपयोग करके 30 ° सेल्सियस के तापमान पर एक वाष्पक के साथ शुष्क सत्व । स्टोर पर सूखी निकालें-20 डिग्री सेल्सियस तक LC-MS/
    9. विश्लेषण करने से पहले एंबर HPLC शीशी में 30 एस के लिए ९०% मेथनॉल (aq) और भंवर के ५०० μl के साथ सूखे अवशेषों का पुनर्गठन ।
  2. एक उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमीटर पर एक डीडीए अधिग्रहण विधि का उपयोग साइनोबैक्टीरिया निकालने का विश्लेषण ।
    नोट: एम सी विश्लेषण के लिए अनुकूलित LC-MS शर्तें यहां प्रयुक्त सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं ।
  3. डीडीए datafile (s) तैयार करने और MZmine में आयात कदम १.१ और १.२ के बाद ।
  4. का चयन करें datafiles और DFF मॉड्यूल चरणों 2.1-2.2 निंन प्रारंभ करें ।
  5. MC विश्लेषण के लिए, निम्न सेटिंग्स DFF मॉड्यूल के भीतर का उपयोग करें (चित्रा 3).
    1. प्रतिधारण समय -इनपुट २.०० की सीमा ६.०० मिनट के लिए ।
    2. प्रीकर्सर एम/जेड -इनपुट एम/जेड रेंज ४३०.०० से १२००.००।
    3. एम/जेड सहिष्णुता - ०.०१ एम/जेड या ३.० पीपीएम की एम/जेड सहिष्णुता लागू करें ।
    4. नैदानिक उत्पाद आयन (m/z) – इनपुट m/z के १३५.०८०३, १६३.१११४ नैदानिक उत्पाद आयनों के रूप में
    5. नैदानिक तटस्थ हानि मूल्य (डीए) – इनपुट ०.० कि कोई नैदानिक तटस्थ नुकसान का उपयोग किया जा रहा है परिभाषित करने के लिए ।
    6. न्यूनतम नैदानिक आयन तीव्रता (% आधार पीक) – न्यूनतम तीव्रता थ्रेशोल्ड के रूप में १५.०० का उपयोग करें
    7. Peaklist आउटपुट फ़ाइल – putative_mcs. csvके रूप में आउटपुट फ़ाइल को परिभाषित करें ।
  6. DFF विश्लेषण प्रारंभ करने के लिए ठीक बटन क्लिक करें । एक DFF प्लॉट (चित्रा 4) सफलतापूर्वक ऊपर कदम को पूरा करने पर दिखाई देगा

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Representative Results

M. aeruginosa CPCC300 के विश्लेषण के बाद जनरेट किया गया dff प्लॉट 4 चित्रमें दिखाया गया है । इस प्लॉट के x-अक्ष के एम/जेड अग्रगामी आयनों का है जो परिभाषित डीएफएफ मापदंड को संतुष्ट करता है जबकि y-अक्ष MCs MS/ms स्पेक्ट्रा के भीतर सभी उत्पाद आयनों के m/z को दिखाता है । इस विश्लेषण के लिए, MC का पता लगाने के लिए मापदंड 440-1200 की m/z श्रेणी में पूर्वगामी आयनों शामिल, 2.00-6.00 मिनट के बीच अवधारण समय । सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि इन MS/MS स्पेक्ट्रा में दोनों m/z १३५.०८०३ और १६३.१११४ (± 3 पीपीएम) परिभाषित 15% बेसपीक तीव्रता दहलीज के ऊपर होते हैं । इन शर्तों के तहत, एलसी-एमएस/एमएस डीडीए विश्लेषण के दौरान कुल ४११६ एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा का अधिग्रहण किया गया था । उनमें से, 26 स्पेक्ट्रा संतुष्ट DFF मापदंड M. aeruginosa CPCC300 निकालने में पाया गया । हालांकि, एक से अधिक MS/MS स्पेक्ट्रा विशेष रूप से उच्च तीव्रता आयनों के लिए, एक ही यौगिक पर प्राप्त किया जा सकता है । इस निकालने में केवल 18 यूनिक प्रिकर्सर एम/जेड पाया गया । सबसे छोटा आयन (m/z ४९७.२७४६, [m + 2h]2 +) डबल चार्ज पूरक है [m + h]+ अग्रदूत m/z ९९३.५३८९, जो भी dff द्वारा पता लगाया गया था । इस M. aeruginosa तनाव18पर पहले प्रकाशित अध्ययनों के आधार पर, प्रमुख MCs का पता लगाया आत्मविश्वास से mc-lr और [डी-Asp3] mc-lr के रूप में सौंपा जा सकता है । शेष ख्यात MCs के द्रव्यमान स्पेक्ट्रा की जांच करने से पता चला कि दो अन्य खोजे गए एमसीएस (एम/जेड ९९३.५३८९, १०२५.५३४३) के 13सी आइसोटोप थे और दूसरा एम/जेड ९९३.५३८९ का एक अभिवाहिनी और एमसी था । 12 शेष ख्यात एमसीएस में से चार, ज्ञात एमसीएस की जनता के लिए पत्राचार किया गया था और आठ पहले से सूचित नहीं किए गए यौगिक (अनुपूरक फाइल) थे । तालिका S1) ।

Figure 1
चित्रा 1: MC-LR के रासायनिक संरचना। एडीडीए अवशेष ज्ञात एमसीएस के एक बड़े हिस्से में आम है और एम/जेड १३५.०८०३ और १६३.१११४ पर नैदानिक उत्पाद आयनों का उत्पादन करता है । अंय MC वेरिएंट है कि एक dimethyl-Adda और एसिटाइलडेमेथिल-Adda 5 स्थान पर अवशेष होते है और एक ही उत्पाद आयनों का उत्पादन नहीं होगा । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एम सी-LR के एमएस/ एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा एक ऑर्करैप मास स्पेक्ट्रोमीटर पर अधिग्रहित किया गया जिसमें प्रमुख उत्पाद आयन को एडीडीए अवशेषों से प्राप्त एम/जेड १३५.०८०३ पर दर्शाया गया है | M/z १६३.१११४ पर एक अतिरिक्त उत्पाद आयन भी adda अवशेषों से प्राप्त होता है और dff विश्लेषण की चयनशीलता बढ़ जाती है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: MZmine के भीतर DFF संवाद बॉक्स. उत्पाद आयनों और/या तटस्थ हानि है कि यौगिकों के लक्षित वर्ग के लिए निदान कर रहे है inputted । प्रतिधारण समय और पूर्वगामी आयन फिल्टर विश्लेषण की चयनात्मकता को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. न्यूनतम नैदानिक आयन तीव्रता नैदानिक उत्पाद आयनों की थ्रेशहोल्ड तीव्रता और तटस्थ हानि को संदर्भित करता है जिसे डीएफएफ मापदंड को संतुष्ट करने के लिए स्पेक्ट्रा के लिए प्राप्त किया जाना चाहिए । इस मान को कम करने का परिणाम गलत धनात्मक हिट्स हो सकते हैं. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एम aeruginosa सेलुलर निकालनेके MC विश्लेषण के लिए dff प्लॉट । एम aeruginosa CPCC300 निकालने के dff विश्लेषण 26 स्पेक्ट्रा है कि परिभाषित dff मापदंड से मुलाकात मिली, 18 अद्वितीय एम/ सही भूखंड पर क्लिक करने के लिए उपयोगकर्ता "बाहर ज़ूम करने के लिए अनुमति देता है" डोमेन और/ एक दोहरे आवेशित पूर्वगामी आयन का पता एम/जेड ४९७.२७४६ में लगाया गया था और उसे [m + H]+ ९९३.५३८९ में एक अज्ञात MC के साथ पत्राचार किया गया था । दो ज्ञात CPCC300 तनाव से उत्पादित MCs रहे है [D-Asp3] MC-LR और MC-lr 18। कुल मिलाकर, आठ ख्यात एमसीएस ज्ञात एमसीएस के एम/जेड के अनुरूप नहीं थी, चार एमसीएस कई कन्जनर्स के एम/जेड में संगत थी और तीन अन्य एमसीएस के आइसोटोप/एडीडक्ट पाए गए थे। तालिका S1) ।  यहां दिखाया गया DFF प्लॉट मैंयुअल रूप से Excel में "putative_mcs_data. csv" से जनरेट किया गया था जो dff मॉड्यूल निष्पादित करने पर स्वचालित रूप से बनाया गया था । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक फ़ाइल । एम aeruginosa निष्कर्षों के LC-MS/MS विश्लेषण के लिए अनुकूलित शर्तें । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

DFF यौगिकों की पूरी कक्षाओं का पता लगाने के लिए एक सीधे आगे और तेजी से रणनीति है, विशेष रूप से प्राकृतिक उत्पाद यौगिक खोज के लिए प्रासंगिक. डीएफएफ का सबसे महत्वपूर्ण पहलू विशिष्ट एमएस/एमएस विखंडन संबंधी मानदंडों को लक्षित वर्ग के यौगिकों के लिए परिभाषित करना है । इस प्रतिनिधि उदाहरण में, DFF एक एम aeruginosa सेलुलर निकालने में मौजूद MCs युक्त सभी adda अवशेषों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । हालांकि MCs के विशाल बहुमत एक Adda अवशेष होते हैं, इस स्थिति में अंय अवशेषों ज्ञात किया गया है, विशेष रूप से demethyl-और एसिटाइलडेएथिल-Adda वेरिएंट19। इन अवशेषों वाले किसी भी MCs का पता निर्धारित मापदंड का उपयोग करके नहीं लगाया जाएगा । हालांकि, के रूप में DFF एक के बाद अधिग्रहण दृष्टिकोण है, अतिरिक्त नैदानिक टुकड़े आसानी से सरल कदम दर कदम प्रोटोकॉल यहां उल्लिखित का उपयोग कर एक ही डेटासेट पर जांच की जा सकती है । यह भी विश्लेषक के लिए काल्पनिक संशोधनों के साथ यौगिकों का पता लगाने की अनुमति देता है कि नैदानिक उत्पाद आयनों और/

Adनलिकाओं और में-स्रोत टुकड़े भी DFF मापदंड को पूरा कर सकते हैं और गलत तरीके से अनन्य analytes के रूप में व्याख्या की । झूठी सकारात्मक उत्पन्न हो सकता है जब अन्य यौगिकों निकालने में मौजूद एक ही उत्पाद आयनों और/या तटस्थ हानि प्रदर्शन. दोनों ही मामलों में, यह अतिरिक्त उत्पाद आयनों और तटस्थ नुकसान है कि विधि चयनशीलता में वृद्धि का उपयोग करके क्रमशः समाप्त किया जा सकता है ।

हालांकि अग्रदूत आयन विश्लेषक द्वारा परिभाषित dff मापदंड के सभी को पूरा कर सकते हैं और लक्षित वर्ग के भीतर यौगिकों का प्रतिनिधित्व करते हैं, उनकी पूर्ण पहचान अभी भी ख्यात हो जाएगा. पहचान विश्वास स्तर का प्रयोग, schymanski द्वारा प्रस्तावित (२०१४), MCs इस ms/ms दृष्टिकोण का उपयोग कर पाया एक ' स्तर 3 ' पहचान विश्वास है जब अग्रदूत आयन के स्पष्ट आणविक फार्मूला सटीक द्रव्यमान और आइसोटोप द्वारा सौंपा जा सकता है प्रोफाइल20।  इस उदाहरण में आठ ख्यात एमसीएस में जनसमूह था जो अनेकाधिक, आइसोबेरिक एमसीएस11से संगत था । निरपेक्ष पहचान एक प्रामाणिक मानक के साथ अवधारण समय और MS/MS स्पेक्ट्रा के या तो तुलना द्वारा प्राप्त किया गया होगा या शुद्धि के बाद एनएमआर और अन्य स्पेक्ट्रोस्कोपिक तरीकों से पुष्टि की. ख्यात यौगिकों कि लक्षित वर्ग के किसी भी ज्ञात सदस्यों की जनता के अनुरूप नहीं हैं, जैसे आठ ख्यात MCs यहां पता चला, नए प्राकृतिक उत्पादों की खोज के लिए ठोस लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

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Disclosures

लेखकों को प्रकट करने के लिए कुछ भी नहीं है

Acknowledgments

लेखक हीथ roshon (कनाडा phyकोलोन संस्कृति केंद्र, साइनोबैक्टीरिया संस्कृति का अध्ययन प्रदान करने के लिए waterloo के विश्वविद्यालय का शुक्र है और (carleton विश्वविद्यालय) तकनीकी सहायता के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyanobacteria
Microcystis aeruginosaCPCC300 CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE CPCC300 https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/
Software
Proteowizard (software) software http://proteowizard.sourceforge.net/
Mzmine 2 software http://mzmine.github.io/
LC-MS
Q-Exactive Orbitrap Thermo - Equipped with HESI ionization source
1290 UHPLC Agilent Equipped with binary pump, autosampler, column compartment
C18 column Agilent 959757-902 Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm)
Solvents
Optima LC-MS grade Methanol Fisher A456-4
OptimaLC-MS grade Acetonitrile Fisher A955-4
OptimaLC-MS grade Water Fisher W6-4
LC-MS grade Formic Acid Fisher A11710X1-AMP
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-0236
Centrifuge Sorvall Micro 21 Thermo Scientific 75-772-436
Other
Amber HPLC vials 2 mL/caps Agilent 5182-0716/5182-0717
0.2-μm PTFE syringe filters Pall Corp. 4521
Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters Sigma-Aldrich WHA1820047
Media
MA media (pH 8.6) ( quantity / L) Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
Ca(NO3)·4H2O, 50 mg Sigma-Aldrich C2786
KNO3, 100 mg Sigma-Aldrich P8291
NaNO3, 50 mg Sigma-Aldrich S5022
Na2SO4, 40 mg Sigma-Aldrich S5640
MgCl2·6H20, 50 mg Sigma-Aldrich M2393
Sodium glycerophosphate, 100 mg Sigma-Aldrich G9422
H3BO3, 20 mg Sigma-Aldrich B6768
Bicine, 500 mg Sigma-Aldrich RES1151B-B7
P(IV) metal solution, 5 mL
Bring the following to 1 L with ddH2O
NaEDTA·2HO Sigma-Aldrich E6635
FeCl3 ·6H2O Sigma-Aldrich 236489
MnCl2·4H2O Baker 2540
ZnCl2 Sigma-Aldrich Z0152
CoCl2·6H2O Sigma-Aldrich C8661
Na2MoO4·2H2O Baker 3764
Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution Sigma-Aldrich C3061-500mL

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References

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रसायन विज्ञान मुद्दा १४७ MZmine LC-MS/MS अर्द्ध लक्षित विश्लेषण डेटा पर निर्भर अधिग्रहण प्राकृतिक उत्पाद की खोज ऑर्करैप microcystins
प्राकृतिक उत्पाद की खोज के साथ LC-MS/MS नैदानिक फ़्रेग्मेंटेशन फ़िल्टरिंग: Microcystin विश्लेषण के लिए आवेदन
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McMullin, D. R., Hoogstra, S.,… More

McMullin, D. R., Hoogstra, S., McDonald, K. P., Sumarah, M. W., Renaud, J. B. Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis. J. Vis. Exp. (147), e59712, doi:10.3791/59712 (2019).

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