Summary
Il filtraggio della frammentazione diagnostica, implementato in MZmine, è un approccio elegante e post-acquisizione per lo schermo di DataSet LC-MS/MS per intere classi di prodotti naturali conosciuti e sconosciuti. Questo strumento ricerca gli spettri MS/MS per gli ioni prodotto e/o le perdite neutre che l'analista ha definito come diagnostica per l'intera classe di composti.
Abstract
I prodotti naturali sono spesso biosintetizzati come miscele di composti strutturalmente simili, piuttosto che un singolo composto. A causa delle loro caratteristiche strutturali comuni, molti composti all'interno della stessa classe subiscono una simile frammentazione MS/MS e hanno diversi ioni di prodotto identici e/o perdite neutre. Lo scopo del filtraggio della frammentazione diagnostica (DFF) è quello di rilevare in modo efficiente tutti i composti di una determinata classe in un estratto complesso, vagliando DataSet LC-MS/MS non mirati per gli spettri MS/MS che contengono ioni di prodotti specifici per classe e/o perdite neutre. Questo metodo è basato su un modulo DFF implementato all'interno della piattaforma MZmine open-source che richiede estratti campione essere analizzati da acquisizione dipendente dai dati su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione come quadrupolo Orbitrap o quadrupolo di massa di tempo di volo Analizzatori. La limitazione principale di questo approccio è l'analista deve prima definire quali ioni di prodotto e/o le perdite neutre sono specifici per la classe mirata di prodotti naturali. DFF consente la successiva scoperta di tutti i prodotti naturali correlati all'interno di un campione complesso, compresi i nuovi composti. In questo lavoro, dimostreremo l'efficacia del DFF mediante screening degli estratti di Microcystis aeruginosa, una prominente fioritura algale nociva che causa cianobatteri, per la produzione di microcistine.
Introduction
La spettrometria di massa tandem (MS/MS) è un metodo di spettrometria di massa ampiamente utilizzato che comporta l'isolamento di uno ione precursore e l'induzione della frammentazione tramite l'applicazione di energia di attivazione come la dissociazione indotta da collisione (CID)1. Il modo in cui un frammento di ioni è intimamente legato alla sua struttura molecolare. I prodotti naturali sono spesso biosintetizzati come miscele di composti strutturalmente simili piuttosto che come un unico chimico unico2. In quanto tali, i composti strutturalmente correlati che fanno parte della stessa classe biosintetica condividono spesso caratteristiche chiave di frammentazione MS/MS, tra cui ioni di prodotti condivisi e/o perdite neutre. La capacità di schermo campioni complessi per composti che possiedono ioni di prodotti specifici per classe e/o perdite neutre è una potente strategia per rilevare intere classi di composti, potenzialmente portando alla scoperta di nuovi prodotti naturali3, 4 , 5 il , 6. per decenni, metodi di spettrometria di massa come la scansione di perdita neutra e la scansione di ioni precursori eseguite su strumenti a bassa risoluzione hanno consentito agli ioni con la stessa perdita neutra o gli ioni di prodotto da rilevare. Tuttavia, gli ioni o le transizioni specifiche dovevano essere definite prima di eseguire gli esperimenti. Poiché gli spettrometri di massa ad alta risoluzione sono diventati più popolari nei laboratori di ricerca, i campioni complessi sono ora comunemente sottoposti a screening utilizzando metodi di acquisizione dipendenti dai dati non mirati (DDA). Contrariamente alla tradizionale perdita neutra e alla scansione a ioni precursori, i composti strutturalmente correlati possono essere identificati mediante l'analisi post-acquisizione7. In questo lavoro, si dimostra una strategia che abbiamo sviluppato definito filtraggio della frammentazione diagnostica (DFF)5,6, un approccio semplice e facile da usare per rilevare intere classi di composti all'interno di matrici complesse. Questo modulo DFF è stato implementato nella piattaforma open-source MZmine 2 e disponibile scaricando MZmine 2,38 o versioni più recenti. DFF consente agli utenti di seriare in modo efficiente i DataSet DDA per gli spettri MS/MS che contengono ioni di prodotto e/o perdite neutre (es) che sono diagnostiche per intere classi di composti. Una limitazione della DFF è la caratteristica degli ioni di prodotto e/o le perdite neutre per una classe di composti devono essere definite dall'analista.
Ad esempio, ognuna delle più di 60 diverse micotossine fumonisine identificate8,9 possiedono una catena laterale tricarballilico, che genera una m/z 157,0142 (C6H5O5-) prodotto ione su frammentazione della [M-H]- Ion4. Pertanto, tutte le fumonisine putativo in un campione possono essere rilevate utilizzando DFF mediante lo screening di tutti gli spettri MS/MS all'interno di un DataSet DDA che contengono lo ione di prodotto m/z 157,0142 prominente. Analogamente, i composti Solfatati possono essere rilevati mediante screening dei DataSet DDA per gli spettri MS/MS che contengono una perdita diagnostica neutra di 79,9574 da (SO3)3. Questo approccio è stato anche applicato con successo per la rilevazione di nuovi peptidi ciclici5 e prodotti naturali che contengono i residui di triptofano o fenilalanina6.
Per dimostrare l'efficacia del DFF e la sua facilità d'uso all'interno della piattaforma MZmine10, abbiamo applicato questo approccio all'analisi delle microcistine (MCS); una classe di oltre 240 tossine strutturalmente correlate prodotte da acqua dolce cianobatteri11,12,13.
Le cianotossine più comunemente segnalate sono MCs, con il congenitore MC-LR (leucina [L]/arginina [R]) più frequentemente studiato (Figura 1). Gli MCs sono heptapeptides monociclici non ribosomiali, biosintetizzati da diversi generi di cianobatteri tra cui Microcystis, Anabaena, Nostoc e Planktothrix12,13. Gli MCs sono composti da cinque residui comuni e due posizioni variabili occupate da aminoacidi L. Quasi tutti i MCs possiedono un residuo di acido β-aminoacido 3-ammino-9-metossi-2, 6, 8-trimetil-10-fenildeca-4, 6-dienoico (Adda) alla posizione 511. I percorsi di frammentazione MS/MS di MCS sono ben descritti14,15; il residuo di Adda è responsabile della prominente ione MS/MS, m/z 135,0803+ (c9h11O+) e di altri ioni di prodotto tra cui m/z 163,1114+ (c11h15 O+) (Figura 2). I DataSet DDA non mirati degli estratti cellulari Microcystis aeruginosa possono essere proiettati per tutte le microcistine presenti utilizzando questi ioni diagnostici, dato che le microcistine hanno un residuo di Adda.
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Protocol
1. preparazione di DataSet di cromatografia liquida non mirata (LC)-MS/MS
Nota: la DFF può essere eseguita utilizzando uno spettrometro di massa ad alta risoluzione e un metodo analitico ottimizzato per una classe di analiti target. Le condizioni LC-MS/MS ottimizzate per MC sullo spettrometro di massa Orbitrap sono elencate nella tabella dei materiali.
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Scaricamento di MZmine 2 (http://mzmine.github.io/)
Nota: i dati di esempio CPCC300. RAW possono essere trovati in https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0.- Nel menu a discesa metodi di dati RAW , selezionare l'opzione di importazione dei dati RAW .
- Scegliere il/i file di dati da analizzare. È possibile importare file singoli o multipli.
- Opzionale Se il formato dei dati del fornitore non è supportato da MZmine, utilizzare proteowizard16 per generare file di dati centroided. mzml.
- Scegliere il filtro di prelievo di picco per applicare l'algoritmo di centroiding fornito dal fornitore.
2. filtraggio della frammentazione diagnostica dei file DDA importati
- Utilizzando il cursore, selezionare ed evidenziare i file di dati nella colonna file di dati RAW della schermata principale di mzmine.
- Nel menu a discesa visualizzazione , selezionare l'opzione di filtraggio della frammentazione diagnostica .
- Nella finestra di dialogo DFF visualizzata (Figura 3), immettere le seguenti opzioni:
- Tempo di conservazione-utilizzare la gamma automatica o definire l'intervallo di tempi di ritenzione in minuti quando la classe mirata di analiti sarà elute.
- Precursore m/z -USA Auto Range o definire la gamma m/z della classe mirata di analiti, compresa la possibilità per più composti caricati quando appropriato.
- m/z tolleranza – introdurre l'accuratezza di massa MS/MS ottenibile del MSinstrument; 0,01 m/z o 3,0 ppm è appropriato per una piattaforma Orbitrap. Se verranno esaminati solo gli ioni del prodotto diagnostico, immettere 0,0 nell'opzione valore di perdita neutra di diagnostica (da) . Viceversa, se verranno esaminate solo le perdite neutre diagnostiche, immettere 0,0 nell'opzione ioni prodotto diagnostico (m/z) .
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Ioni di prodotti diagnostici (m/z) – immettere il/i prodotto/i specifico/i di classe m/z. Separare gli ioni di prodotti multipli con una virgola.
Nota: l'immissione di più ioni di prodotti visualizzerà gli spettri che contengono tutti gli ioni di prodotti elencati. -
Valore di perdita neutra diagnostica (da) – immettere la perdita neutra specifica della classe (es). Separa più perdite neutre con una virgola.
Nota: l'immissione di più perdite neutre visualizzerà gli spettri che contengono tutte le perdite neutre elencate. L'introduzione di entrambi gli ioni di prodotto diagnostico e le perdite neutrali visualizzeranno spettri che soddisfano tutti i criteri. - Intensità minima di ioni diagnostiche (% picco base) – in% del picco di base degli spettri MS/MS, definire l'intensità minima per gli ioni di prodotto diagnostico e/o le perdite neutre da considerare.
- File di output Peaklist : selezionare un percorso e un nome per l'output dei risultati.
- Fare clic sul pulsante OK per avviare l'analisi DFF. Un grafico DFF apparirà dopo aver completato con successo i passaggi precedenti
Nota: verranno generati due file di dati. csv. {File di output Peaklist}. csv contiene il precursore m/z, i numeri di scansione e i tempi di conservazione delle scansioni. Questo può essere utilizzato nei moduli MZmine esistenti, compresi i metodi di dati grezzi ≫ rilevamento picco > rilevamento di picco mirato per generare cromatogrammi ionici estratti di precursori che soddisfano i criteri di DFF definiti. {File di output Peaklist} _ data. csv contiene il precursore m/z, il prodotto Ion m/z e i tempi di ritenzione per consentire la generazione di trame DFF al di fuori di mzmine.
3. esempio di uso di DFF per l'analisi di microcistina
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Preparazione del campione
- Sterilizzare 250 mL di flaconi Erlenmeyer contenenti 30 mL di supporti sterili MA da17 o altri supporti di crescita di cianobatteri (BG-11) dotati di tappo in schiuma.
- Inoculare i mezzi di crescita sterilizzati con una coltura di cianobatteri a circa 5 × 105 cellule ml-1 in condizioni asettiche. Monitorare la densità delle cellule con un hemocytometer. In questo esempio, crescere M. aeruginosa ceppo CPCC300 fotoautotrophically a 27 ° c, illuminato con luce fluorescente bianca fredda (30 μe M-2 s-1) utilizzando un 12 h luce: 12 h regime scuro. Swirl le cellule una volta al giorno.
- Separare le cellule dal mezzo di coltura dopo 26 giorni di filtrazione sottovuoto utilizzando 47 mm di diametro in fibra di vetro GF/C carta filtro in microfibra.
- Aggiungere 3 mL di 80% di metanolo (AQ) alle cellule raccolte in 14 ml di provetta (e).
- Vortex e successivamente Sonicare la provetta (s) contenente le cellule di cianobatteri per 30 s ciascuno. Conservare la provetta (e) a-20 ° c per 1 h. riportare la provetta a temperatura ambiente e lasciar scongelare il campione (s) per 15 min.
- Ripetere il passo 3.1.5 due ulteriori volte per lizzare efficacemente le cellule.
- Filtrare l'Estratto (i) di cellule cianobatteri risultanti attraverso un filtro per siringa in PTFE da 0,22 μm.
- Estratto secco (s) con un evaporatore ad una temperatura di 30 ° c utilizzando un flusso delicato di azoto gassoso. Conservare l'Estratto secco a-20 ° c fino all'analisi LC-MS/MS.
- Ricostituire il residuo essiccato con 500 μL di 90% di metanolo (AQ) e Vortex per 30 s in un flaconcino di HPLC ambrato prima dell'analisi.
- Analizzare l'Estratto di cianobatteri utilizzando un metodo di acquisizione DDA su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.
Nota: le condizioni LC-MS ottimizzate per l'analisi MC qui utilizzate sono elencate nella tabella dei materiali. - Preparare i DataFile DDA e importarli in MZmine seguendo i passaggi 1,1 e 1,2.
- Selezionare i dati e avviare i moduli DFF seguendo i passaggi 2.1-2.2.
- Per l'analisi MC, utilizzare le seguenti impostazioni all'interno del modulo DFF (Figura 3).
- Tempo di ritenzione – inserire l'intervallo di 2,00 a 6,00 min.
- Precursore m/z – ingresso m/z gamma da 430,00 a 1200,00.
- m/z tolleranza – applicare la tolleranza m/z di 0,01 m/z o 3,0 ppm.
- Ioni prodotto diagnostico (m/z) – ingresso m/z di 135,0803 a 163,1114, come gli ioni del prodotto diagnostico
- Valore di perdita neutra diagnostica (da) – input 0,0 per definire che non vengono utilizzate perdite diagnostiche neutre.
- Intensità minima di ioni diagnostiche (% picco base) – utilizzare 15,00 come soglia minima di intensità
- File di output Peaklist : definire il file di output come putative_MCs. csv.
- Fare clic sul pulsante OK per avviare l'analisi DFF. Un grafico DFF (Figura 4) apparirà dopo aver completato con successo i passaggi precedenti
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Representative Results
Il grafico DFF generato in seguito all'analisi di M. aeruginosa CPCC300 è mostrato in Figura 4. L'asse xdi questa trama è la m/z degli ioni precursori che SODDISFACEVANO i criteri di DFF definiti mentre l'asse yMostra la m/z di tutti gli ioni di prodotto all'interno degli spettri MCS MS/MS. Per questa analisi, i criteri per il rilevamento MC includevano ioni precursori all'interno della gamma m/z di 440-1200, tempi di ritenzione tra 2,00 – 6,00 min. Soprattutto, questi spettri MS/MS contengono sia m/z 135,0803 che 163,1114 (± 3 ppm) al di sopra della soglia di intensità di basepeak del 15% definita. In queste condizioni, sono stati acquisiti un totale di 4116 spettri MS/MS durante l'analisi di LC-MS/MS DDA. Di questi, 26 spettri soddisfatti i criteri DFF sono stati rilevati nell'estratto di M. aeruginosa CPCC300. Tuttavia, più spettri MS/MS possono essere acquisiti sullo stesso composto, in particolare per ioni ad alta intensità. In questo estratto, solo 18 precursore unico m/z sono stati trovati. Il più piccolo ione (m/z 497,2746, [m + 2h]2 +) è il complemento doppiamente caricato del [m + H]+ precursore m/z 993,5389, che è stato rilevato anche da DFF. Sulla base di studi pubblicati in precedenza su questo ceppo M. aeruginosa 18, i principali MCS rilevati possono essere assegnati con fiducia come MC-LR e [D-ASP3] MC-LR. Investigando gli spettri di massa del rimanente putativo MCs ha rivelato che due erano isotopi 13C di altri MCS rilevati (m/z 993,5389, 1025,5343) e un altro era un addotto di e MC di m/z 993,5389. Dei 12 restanti MCs putativi, quattro corrispondevano alle masse di MCs noti, e otto erano composti in precedenza non segnalati (file supplementare. Tabella S1).
Figura 1: struttura chimica di MC-LR. Il residuo di Adda è comune in una grande proporzione di MCs noti e produce ioni di prodotti diagnostici a m/z 135,0803 e 163,1114. Altre varianti di MC che contengono un residuo di dimetil-Adda e acetildemetil-Adda nella posizione 5 sono conosciute e non produrrebbero gli stessi ioni di prodotto. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2: spettri MS/MS di MC-LR. Gli spettri MS/MS acquisiti su uno spettrometro di massa Orbitrap mostrano il prominente ione del prodotto a m/z 135,0803 derivato dal residuo di Adda. Un ulteriore ione di prodotto a m/z 163,1114 deriva anche dal residuo di Adda e aumenta la selettività dell'analisi DFF. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3: finestra di dialogo DFF all'interno di MZmine. Gli ioni di prodotto e/o le perdite neutre che sono diagnostiche per la classe mirata di composti sono immessi. Il tempo di ritenzione e i filtri a ioni precursori possono essere utilizzati per aumentare la selettività dell'analisi. L'intensità minima di ioni diagnostiche indica l'intensità di soglia degli ioni del prodotto diagnostico e le perdite neutre che devono essere raggiunte affinché gli spettri soddisfino i criteri del DFF. L'abbassamento di questo valore può comportare risultati falsi positivi. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 4: grafico DFF per l'analisi MC dell' estratto cellulare M. aeruginosa. L'analisi DFF dell'estratto di m. aeruginosa CPCC300 ha trovato 26 spettri che soddisfacevano i criteri di DFF definiti, comprendenti 18 valori M/z unici. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla trama consente all'utente di "ridurre" gli assi di dominio e/o intervallo. Uno ione precursore doppiamente caricato è stato rilevato a m/z 497,2746 e corrispondeva a un MC sconosciuto a [m + H]+ 993,5389. I due MCs noti prodotti dal ceppo CPCC300 sono [D-ASP3] MC-LR e MC-LR 18. In totale, otto MC putativi non corrispondevano alla m/z dei MCS noti, quattro MCS corrispondono alla m/z di più conconenti e tre sono stati trovati come isotopi/addotti di altri MCS (file supplementare. Tabella S1). Il grafico DFF mostrato qui è stato generato manualmente in Excel dal "putative_MCs_data. csv" che è stato fatto automaticamente all'esecuzione del modulo DFF. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
File complementare. Condizioni ottimizzate per l'analisi LC-MS/MS degli estratti di M. aeruginosa. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
DFF è una strategia diretta e rapida per la rilevazione di intere classi di composti, particolarmente rilevanti per la scoperta di composti naturali di prodotti. L'aspetto più importante della DFF è la definizione dei criteri specifici di frammentazione MS/MS per la classe mirata di composti. In questo esempio rappresentativo, DFF è stato utilizzato per rilevare tutti i residui di Adda contenenti MCs presenti in un estratto cellulare M. aeruginosa . Sebbene la stragrande maggioranza dei MCs contenga un residuo di Adda, sono stati conosciuti altri residui in questa posizione, in particolare le varianti di demetil-e acetildemetil-Adda19. Eventuali MCs con questi residui non verrebbero rilevati utilizzando i criteri definiti. Tuttavia, poiché la DFF è un approccio post-acquisizione, è possibile esaminare facilmente ulteriori frammenti diagnostici sullo stesso DataSet utilizzando il semplice protocollo passo-passo descritto qui. Ciò consente inoltre all'analista di rilevare i composti con modifiche ipotetiche che altererebbero gli ioni del prodotto diagnostico e/o la perdita neutra.
Gli addotti e i frammenti in-source possono anche soddisfare i criteri DFF ed essere interpretati erroneamente come analiti univoci. Falsi positivi possono sorgere quando altri composti presenti nell'estratto mostrano gli stessi ioni di prodotto e/o perdite neutre. In entrambi i casi, questo può essere alleviato utilizzando ulteriori ioni di prodotto e perdite neutre che aumentano la selettività del metodo.
Anche se gli ioni precursori possono soddisfare tutti i criteri DFF definiti dall'analista e rappresentare composti all'interno della classe mirata, la loro identità assoluta sarà ancora putativa. Utilizzando i livelli di confidenza di identificazione, proposti da SCHYMANSKI (2014), i MCs rilevati utilizzando questo approccio MS/MS hanno una confidenza di identificazione di livello 3 quando una formula molecolare inequivocabile dello ione precursore può essere assegnata da una massa accurata e l'isotopo il profilo20. In questo esempio, otto putativo MCS avevano masse che corrispondevano a più isobarici MCS11. L'identità assoluta sarebbe stata ottenuta confrontando il tempo di ritenzione e gli spettri MS/MS con uno standard autentico o confermati da NMR e altri metodi spettroscopici dopo la purificazione. Composti putativi che non corrispondono a masse di tutti i membri conosciuti della classe mirata, come gli otto putativi MCs rilevati qui, rappresentano obiettivi tangibili per la scoperta di nuovi prodotti naturali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Heather Roshon (centro di cultura Phycologica canadese, Università di Waterloo per aver fornito la coltura di cianobatteri studiata e Sawsan Abusharkh (Carleton University) per l'assistenza tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanobacteria | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | - | Equipped with HESI ionization source |
| 1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
| C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
| Solvents | |||
| Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
| OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| Other | |||
| Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) metal solution, 5 mL | |||
| Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
| Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
References
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