Summary
Vi presenterer en protokoll for å studere fordelingen av mitokondrier og endoplasmatiske retikulum i hele celler etter genetisk modifisering ved hjelp av correlative lys og volum elektron mikroskopi inkludert ascorbate peroksidase 2 og pepperrot peroksidase farging, seriell snitting av celler med og uten mål genet i samme avsnitt, og seriell avbildning via elektron mikroskopi.
Abstract
Mobil organeller, for eksempel mitokondrier og endoplasmatiske retikulum (ER), oppretter et nettverk for å utføre en rekke funksjoner. Disse svært buede strukturer er foldet inn i ulike former for å danne et dynamisk nettverk avhengig av cellulære forhold. Visualisering av dette nettverket mellom mitokondrier og ER har blitt forsøkt å bruke super-oppløsning fluorescens Imaging og lys mikroskopi; den begrensede oppløsningen er imidlertid utilstrekkelig for å observere membraner mellom mitokondrier og ER i detalj. Transmission Electron mikroskopi gir god membran kontrast og nanometer-skala oppløsning for observasjon av cellulære organeller; Det er imidlertid svært tidkrevende når man vurderer den tredimensjonale (3D) strukturen til svært buede organeller. Derfor observerte vi morfologi av mitokondrier og ER via correlative lys-elektron mikroskopi (CLEM) og volum elektron mikroskopi teknikker ved hjelp av forbedret ascorbate peroksidase 2 og pepperrot peroksidase farging. En en blokk Fargemetode, super tynn seriell snitting (array tomografi) og volum elektron mikroskopi ble brukt for å observere 3D-strukturen. I denne protokollen, foreslår vi en kombinasjon av CLEM og 3D elektron mikroskopi for å utføre detaljerte strukturelle studier av mitokondrier og ER.
Introduction
Mitokondrier og endoplasmatiske retikulum (er) er membran bundet cellulær organeller. Deres forbindelse er nødvendig for deres funksjon, og proteiner knyttet til deres nettverk har blitt beskrevet1. Avstanden mellom mitokondrier og ER har blitt rapportert som ca 100 NM ved hjelp av lys mikroskopi2; men nyere super-oppløsning mikroskopi3 og elektron MIKROSKOPI (EM)4 studier har avdekket det å være betydelig mindre, på ca 10-25 NM. Oppløsningen oppnådd i super-oppløsning mikroskopi er lavere enn EM, og spesifikke merking er nødvendig. EM er en egnet teknikk for å oppnå en tilstrekkelig høyoppløsnings kontrast for strukturelle studier av forbindelsene mellom mitokondrier og AKUTTEN. En ulempe er imidlertid den begrensede informasjonen for z-aksen fordi de tynne seksjonene må være omtrent 60 nm eller tynnere for konvensjonelle overførings elektron mikroskopi (TEM). For tilstrekkelig EM z-akse Imaging, tredimensjonale elektron mikroskopi (3DEM) kan brukes5. Men dette innebærer utarbeidelse av hundrevis av tynne serielle deler av hele celler, noe som er veldig vanskelig arbeid som bare noen få dyktige teknologer har mestret. Disse tynne seksjoner er samlet på skjøre formbar film-belagt ett hull TEM nett. Hvis filmen bryter på en bind omkring, seriell bildebehandling og volum rekonstruksjon er ikke mulig. Seriell blokk-ansikt skanning elektron mikroskopi (SBEM) er en populær teknikk for 3DEM som bruker destruktive en blokk snitting inne i skanning elektronmikroskop (SEM) vakuum kammer med enten en diamant kniv (dik-SBEM) eller en fokusert ion bjelke (LØGN-SEM) 6. men fordi disse teknikkene er ikke tilgjengelig på alle fasiliteter, foreslår vi array tomografi7 bruker SERIELL snitting og SEM. I array tomografi, seriell seksjoner kuttet ved hjelp av en ultramicrotome overføres til et glass dekkglass i stedet for en TEM rutenett og visualisere via lys mikroskopi og SEM8. For å forsterke signalet for Backscatter elektron (BSE), benyttet vi en Osmium-EM fargeprotokoll som sysselsetter tetroxide (OsO4)-faste celler med osmiophilic THIOCARBOHYDRAZIDE (TCH)9, slik at vi kan få bilder uten dobbel farging etter innebygging.
I tillegg mitokondrie markør SCO1 (cytokrom c oksidase montering protein 1)-ascorbate peroksidase 2 (APEX2)10 molekylær tag ble brukt til å visualisere MITOKONDRIER på EM nivå. APEX2 er ca. 28 kDa og er avledet fra Soyabønne ascorbate peroksidase11. Den ble utviklet for å vise detaljert plassering av spesifikke proteiner på EM nivå på samme måte som grønne fluorescerende protein-Tagged protein brukes i lys mikroskopi. APEX2 konverterer 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB) til et uløselig osmiophilic polymer på stedet av koden i nærvær av kofaktor hydrogen peroxide (H2O2). APEX2 kan brukes som et alternativ til tradisjonelle antistoff merking i EM, med et protein lokalisering gjennom dybden av hele cellen. Med andre ord, det APEX2-merket protein kan visualisere etter spesifikk osmication11 uten immunogold merking og permeabilization etter ultra-kryosnitt. Pepperrot peroksidase (HRP) er også en følsom kode som katalyserer H2O2-avhengige polymerisering av DAB inn i en lokalisert UTFELLING, og gir dem kontrast etter behandling med OsO4. Er-målet peptid sekvens HRP-KDEL (lys-ASP-Glu-leu)12 ble brukt til å visualisere er i en hel celle. For å evaluere vår protokoll for å utnytte genetiske koder og en blokk farging med redusert Osmium og TCH (rOTO-metoden), ved hjelp av osmication effekt på samme tid, sammenlignet vi membranen kontrast med og uten bruk av hver genetisk kode i rOTO en Bloc farging. Selv om 3DEM med array-tomografi og DAB-farging med APEX og HRP har henholdsvis blitt benyttet til andre formål, er protokollen vår unik fordi vi har kombinert array-tomografi for 3DEM og DAB-farging for mitokondrier og ER-merking. Nærmere bestemt viste vi fem celler med og uten APEX-Tagged gener i samme avsnitt, som hjalp i å undersøke effekten av genetisk modifisering på celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cellekultur med mønstret rutenett kultur parabol og celle transfeksjoner med SCO1-APEX2 og HRP-KDEL plasmider vektor
- Seed 1 x 105 HEK293T celler ved å plassere dem i 35-mm glass Grid-bunn kultur retter i en fuktet atmosfære som inneholder 5% co2 ved 37 ° c i Dulbecco ' s modifiserte Eagle ' s medium (DMEM) supplert med 10% fosterets storfe serum, 100 U/ml penicillin og 100 U/mL Streptomycin.
- Dagen etter seeding cellene, når de har vokst til 50%-60% confluency, innføre SCO1-APEX210 og HRP-KDEL12 plasmider til cellene ved hjelp av transfeksjoner reagens i henhold til produsentens instruksjoner (SCO1-APEX2 cDNA 0,5 μg + HRP-KDEL plasmider DNA 0,5 mikrogram per 3 μL transfeksjoner reagens).
2. lett mikroskopi av celler som vokser på mønstrede kultur retter og DAB farging for APEX2 og HRP
- Ved 16-24 h etter transfeksjoner, Fjern alle kultur mediene og tilsett umiddelbart 250 μL av varm (30-37 ° c) fikserings løsning (tabell 1) ved milde pipettering. Fjern umiddelbart fikserings løsningen og Bytt den ut med 1,5 mL frisk fikserings løsning. Ruge på is for 60 min, og vask deretter tre ganger i 10 min hver i 1 mL iskald 0,1 M natrium cacodylate buffer (tabell 1).
FORSIKTIG: aldehyd gasser er svært giftige. Utfør alt arbeid under en ventilert avtrekks hette. - Tilsett 1 mL kulde (0-4 ° c) 20 mM Glycine oppløsning og ruge i 10 minutter på isen etterfulgt av tre vasker på 5 min hver i 1 mL kaldt 0,1 M natrium cacodylate buffer.
- Forbered en frisk 1x DAB-løsning (3,33 mL 0,3 M cacodylate oppløsning + 10 μL 30% H2O2 + 5,67 ml kaldt vann + 1 ml 10x DAB-oppløsning).
- Tilsett 500 μL av den nylagde 1x DAB-løsningen (trinn 2,3) og ruge på is i ca. 5-45 min til en lys brun flekk er synlig under et omvendt lys mikroskop (figur 1a).
- Fjern forsiktig DAB-løsningen og skyll tre ganger med 1 mL kaldt 0,1 M natrium cacodylate buffer i 10 minutter hver.
- Bruk et invertert mikroskop med fase kontrast (eller et lys mikroskop med lyse felt) for å visualisere DAB-farging med en forstørrelse på 100 eller høyere. Bruk en markør penn til å markere bunnen av glasset der regionen av interesse (ROI) er plassert (figur 1B, C).
3. prøveklargjøring for EM-blokken
- Utfør cellekultur og DAB farging som beskrevet i trinn 2.1-2.6.
- Etter reparasjon av prøvene med 1 mL 2% reduserte OsO4 for 1 time ved 4 ° c.
FORSIKTIG: OsO4 gasser er svært giftig. Utfør alt arbeid under en ventilert avtrekks hette. - Klargjør en ny TCH-løsning (tabell 1) i trinn 3,2, og gå gjennom et 0,22-μm-filter.
FORSIKTIG: TCH røyk er svært giftige. Utfør alt arbeid under en ventilert avtrekks hette. - Fjern bindemiddel og skyll tre ganger med 1 mL destillert vann i 5 minutter hver ved romtemperatur (RT).
- Plasser cellene i 1 mL tidligere forberedt og filtrert TCH løsning for 20 min ved RT.
- Skyll cellene tre ganger med 1 mL destillert vann i 5 minutter hver på RT.
- Utsett cellene en gang til 1 mL 2% Osmium tetroxide i destillert vann i 30 min ved RT.
- Fjern bindemiddel og skyll tre ganger med 1 mL destillert vann i 5 minutter hver på RT. Tilsett 1 mL 1% uranylnitratet acetate (vandig), og la over natten ved 4 ° c i mørket.
- Vask cellene tre ganger i 1 mL destillert vann i 5 minutter hver på RT.
- Pre-Warm Walton bly aspartate løsning (tabell 1) i en ovn ved 60 ° c i 30 min.
- Stain cellene med Walton bly aspartate løsning ved å legge 1 mL av den pre-varmet bly aspartate løsning, og deretter plassere i en ovn i 30 min ved 60 ° c.
- Skyll cellene tre ganger med 1 mL destillert vann i 5 minutter hver på RT.
- Ruge i en gradert serie på 2-mL etanol alikvoter (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) 20 minutter hver på RT.
- Dekanter etanol og ruge i 30 min i 1 mL 3:1 etanol: Embedding av lav viskositet blanding medium ved RT.
- Fjern mediet og tilsett 1 mL 1:1 etanol: Embedding med lav viskositet blanding medium. Ruge i 30 minutter ved RT.
- Fjern mediet og tilsett 1 mL 1:3 etanol: Embedding med lav viskositet blanding medium. Ruge i 30 minutter ved RT.
- Fjern mediet og tilsett 1 mL 100% lav viskositet innebygging medium og ruge over natten.
- Embed prøven i 100% lav viskositet embedding blanding og ruge for 24 h ved 60 ° c.
- Forbered 90 NM tykke seksjoner ved hjelp av en ultramicrotome.
- Observer rutenettet under TEM ved 200 kV.
4. seriell snitting og montering på Indium-tinn-oksid belagt coverslips for SEM Imaging
-
Substrat forberedelse
- Rengjør Indium (ITO)-belagt glass coverslips (22 mm x 22 mm) ved skånsom omrøring i isopropanol for 30-60 s.
- Fjern coverslips, Tapp av overflødig isopropanol, og la i et støvfritt miljø til det er tørt.
- Unn den ITO-belagte glass coverslips ved å gløde ut ved hjelp av en plasma elektrostatisk i 1 min.
Merk: plasma aktivering gir en hydrofile eiendom på underlaget. Det skaper en svært tynn film av vann på underlaget for å hindre rynker dannelse i seksjonene når delen er festet til underlaget. - Sett den ITO-belagte glass coverslips inn i substrat holde ren, og plasser den i kniv båten.
-
Trimming av prøveblokken og serie snitting
- Sett prøveblokken inn i prøveholderen på ultramicrotome og sett den inn i beskjærings blokken.
- Bruk et barberblad til å trimme bort all overflødig harpiks rundt målposisjonen (identifisert i trinn 2,6, figur 1d-G). Formen på blokken ansiktet bør være trapes eller rektangulær. Forkanten og den bakre kanten må være helt parallell (figur 1h, I).
- Sett prøveholderen på ultramicrotome arm og plasser diamant kniven i knivholderen. Sett inn ITO glass coverslips i bånd stativet og klem holderen med håndtaket (figur 1j). Sett bånd bæreren i kniv båten og fyll kniv båten med filtrert destillert vann (figur 1k).
- Juster bære posisjonen med raset på kniven ved å trykke forsiktig på håndtaket på holderen for å sette kanten på ITO-glasset nær kniven (figur 1L).
- Etter å ha kuttet delen, stopp skjære prosessen, og åpne forsiktig stramme skruen på røret og Tøm vann båten (strømningshastighet på en dråpe vann per sekund).
- Etter å ha fullført båndet-samlingen prosessen, fjerne underlaget med håndtaket på spennanordningen og tørk båndet (figur 1m).
5. Imaging i SEM og justering av SEM bildet stabelen
- Monter ITO-belagte dekkglass på aluminiums stubber med klebrig karbon tape. Forsegle glassoverflaten og overflaten i spire med klebrig karbon tape, og deretter frakk med en 10-NM tykt karbon lag (figur 1N).
- Observer ITO-belagte dekkglass i et felt utslipp SEM ved en lav akselerasjon spenning på 5 kV og en passende arbeidsavstand for effektiv samling av BSEs.
- Import fortsettelsene profilen inn i image J programvare (Fiji)13 benytter det virkelig stabel valgmuligheten. Åpne en ny TrakEM14, og importere bildet stabelen i TrakEM. Klikk høyre museknapp og velg Juster -menyen.
- Deretter velger du bildeområdet (fra det første bildet til det siste bildet). Fullfør den automatiske justeringen, lagre det justerte datasettet, og velg Eksporter for å kompilere et flatt bilde fra det valgte bildeområdet (fra det første bildet til det siste bildet). Til slutt, bevare det leilighet image data inne AVI formatter inne bildet J hovedavdeling meny.
Merk: tilleggs film 1 og tilleggs film 2 viser henholdsvis SEM-bildes stabel og beskåret bildestakk.
6. segmentering av mitokondrier og ER fra serielle bilder
- Start 3dmod i IMOD15 programvare og åpne bildefiler.
- I ZaP-vinduet tegner du konturen til mitokondrier og ER ved hjelp av midtre museknapp.
- Hvis du vil visualisere segmentert volum, åpner du modell visnings vinduet (tilleggs film 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 beskriver tidsplanen og arbeidsflyten for denne protokollen. Protokollen krever 7 dager; Men, avhengig av tid brukt på SEM Imaging, dette kan øke. For celle transfeksjoner, bør confluency av cellene styres slik at de ikke dekker bunnen av hele gitter platen (figur 1a). En høy celle tetthet kan hindre identifisering av cellen av interesse under lys mikroskop og EM observasjon. Vi brukte genetisk merkede plasmider som uttrykte APEX2 og HRP å velge effektivt transfekterte celler blant de mange kultivert celler i kultur parabolen. Vi kultivert HEK293T celler og bekreftet uttrykk for SCO1-koblet APEX2 (mitokondrie intermembrane Space [IMS]) og HRP-bøyd KDEL (ER) i co-transfekterte celler. Under lette mikroskopi var APEX2-transfekterte-celler flekkete en brun farge, mens celler uten transfeksjoner forble unstained (figur 1a og figur 2). Dette tillot identifisering av transfekterte målceller, som deretter ble brukt til correlative lys-elektron mikroskopi (CLEM), ved hjelp av DAB flekker i en kultivert celle befolkning (figur 3D-F og figur 4b). Det var nyttig å merke glass bunnen (figur 1B, C) for å gjøre det enkelt å identifisere plasseringen av målcellen under det flate bygge trinnet (figur 1e, F). Når HEK293T cellene ble behandlet med en forbedret "dobbel Osmium" farging protokollen (rOTO), var hele celler farget en mørk farge (figur 1d). Etter å ha fjernet gridded dekkglass fra kultur fatet, identifiserte vi målplasseringen på blokk flaten under et stereo mikroskop (figur 1g). Vi trimmet cellene i AVKASTNINGEN i en trapesform, og de ledende og bakre kantene ble gjort parallelle (figur 1h, i). Å iverksette mitokondrier og ER nettverk rekonstruksjon, vi anvendt en stor diamant kniven med en stor vann skipet å serielt avdeling SCO1-APEX2 og HRP-KDEL-uttrykker HEK293T celler (skikkelsen 1j-L). Serial 90-NM tykt bånd seksjoner ble vellykket festet til ITO-belagt glass dekkglass (figur 1m), og overflaten var belagt med 10-NM tykt karbon for OBSERVASJON via SEM (figur 1N).
SCO1-APEX2 og HRP-KDEL proteiner genererer svært tette elektroniske signaler avledet fra DAB konvertering som er synlig i TEM (Figur 3) og SEM (Figur 4). Den mørke flekken generert av SCO1-APEX2 ble observert utelukkende i IMS og ikke i matrisen plass av mitokondrier (figur 3D). Co-transfekterte celler (venstre celle i figur 3D, E) med både SCO1-APEX2 og HRP-KDEL plasmider uttrykt et svært tett elektron signal i mitokondrie IMS og er; Men, observerte vi ingen ER flekker i celler som ble transfekterte bare med SCO1-APEX2 (høyre celle i figur 3D, F). For serielle bilder ved hjelp av SEM, først, skapte vi en oversikt over hele array bildet ved hjelp av BSE detektor over et stort område (figur 4a). For det andre ble AVKASTNINGEN plassert i den første seksjonen og overført til alle andre seksjoner (figur 4b). Til slutt, vi visualisere AVKASTNINGEN inneholder fem målceller med 5-NM bildepunkter (figur 4c). Zoomet inn bilder avdekket detaljerte subcellulære strukturer (figur 4d) som Golgi apparater, mitokondrier, kjerner, og er. Fortsettelsene profilen tydelig viste det ER-mitokondrier kontaktene var hender opp på annerledes z-plan (ekstra film 2 og ekstra film 3).
Figur 1 : S god forberedelse arbeidsflyt for SEM og tem. (A) en kultur parabol inneholder gridded coverslips ble sådd med celler og BEISET med DAB. (B,C) Etter DAB farging, en markør pennen ble brukt til å markere bunnen av glasset der målet cellene var plassert. (D) etter Oso4 flekker, cellene blir en mørk farge. (E, F) Polymerase kjedere reaksjon (PCR) rør (eller noen form for innebygging kapsler) ble brukt til å enkelt lage en EM blokk som inneholdt de markerte posisjoner. (E) topp visning. (F) bunn visning. (G) en lav forstørrelse stereo mikroskopi bilde av overflaten av en EM blokk. (H) avkastningen er i midten av den flate overflaten. (I) en høyere forstørrelse stereo mikroskopi bilde av rektangulære avkastningen. (J) Ito-belagt glass coverslips (hvit asterisk) er satt inn i båndet carrier (blå pil), og transportøren er klemt ved å dreie håndtaket med klokken. (K, L) Håndtaket på holderen er nøye skjøvet, og transportøren er justert til å posisjonere kanten av ITO-belagt glass dekkglass nær kniven ved å skyve. (M) båndene er festet til Ito-belagt glass coverslips. (N) den Ito-belagt glass coverslips er festet til SEM stubber, og det resterende glasset er forseglet med klebrig karbon tape og belagt med en 10-NM karbon tråd lag. Hvite stjerner angir at ITO-belagte glass dekkglass, og svarte stjerner indikerer karbon tapen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: invertert fase-kontrast mikroskopi bilde av KULTIVERT HEK293T celler beiset med DAB. (A) farging av celler med DAB bare (uten oso4 farging). Hvite piler angir de unstained cellene, og svarte piler angir DAB-fargede celler. (B) høyere-forstørrelse bilde av avkastningen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Tem-avbildning av HEK293T-celler viser den målrettede MITOKONDRIE IMS (SCO1-APEX2) og er (HRP-KDEL). (A-C) Untransfected HEK293T celler som viser dobbel membran av mitokondrier (M) og endoplasmatiske retikulum (ER). (D-F) APEX2 og HRP katalysere polymerisering av DAB inn i en lokal utfelling, som senere er farget med elektron tette OsO4. En mørk kontrast er synlig i mitokondrie IMS (svart pil spiss) og ER (svart arrow); Imidlertid, celler det var ikke transfekterte med HRP – KDEL forevise unstained ER (hvit pilen). Skala stolper: 1 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Serial SEM Imaging av HEK293T celler viser målrettede MITOKONDRIE IMS (SCO1-APEX2) og er (HRP-KDEL). (A) oversikt over de serielle snitt båndene som er observert ved bruk av BSE-detektoren. (B) korrelasjon med lav forstørrelse bilde (innfelt) med høy forstørrelse BSE bilde (hvit prikket linje boks indikerer AVKASTNINGEN av DAB-farget celler). (C) høy forstørrelse av avkastningen målceller med 5-NM bildepiksler. (D, E) En mørk kontrast er synlig i mitokondrie IMS og ER, men ikke Golgi apparatet. (F-I) ER-mitokondrier-kontakter (hvit pil) forekommer på forskjellige z-plan. N, Nucleus; M, mitokondrier; ER, endoplasmatiske retikulum; G, Golgi apparater. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: løsnings oppskrifter.
Supplerende film 1: SEM bilde stabel. Fiji13 med TrakEM14 programvare ble brukt til å justere 91 bilder. Det opprinnelige justerte datasettet er 11 GB. For å downsize bunken ble bilde settet med endret størrelse og beskåret brukt. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Tilleggs film 2: beskåret bildestakk. For å visualisere mitokondrier, ER og deres kontaktområder i detalj, ble bildene beskåret fra det opprinnelige datasettet (5 NM/piksel). Skala stolper: 1 μm. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Tilleggs film 3:3D-rekonstruksjon av mitokondrier og er. For 3D visualisering, konturen av mitokondrier og ER ble segmentert og visualisere ved hjelp IMOD15 programvare. Mitokondrier ble vist seg som lange rørformede strukturer (rød), og ER nettverk (grønn) viste sin kompliserte morfologi. Gult representerte et stort areal på kontaktområdet mellom mitokondrier og ER i forskjellige z-fly. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bestemme mobilnettet lokalisering av spesifikke proteiner på en nanometer oppløsning ved hjelp av EM er avgjørende for å forstå cellulære funksjoner av proteiner. Vanligvis er det to teknikker for å studere lokalisering av et mål protein via EM. Den ene er immunogold teknikk, som har vært brukt i EM siden 1960, og den andre er en teknikk som bruker nylig utviklede genetisk kodede koder16. Tradisjonelle immunogold teknikker har brukt antistoff-bøyd gull partikler eller Quantum prikker for å vise plasseringen av merket protein. Men på grunn av behovet for høy kvalitet antistoffer og penetrasjon effektiviteten av antistoffer påvirket av harpiks og bindemiddel, denne teknikken er betydelig begrenset17. Nærmere bestemt, fordi immunogold merking er overveiende begrenset til overflaten av en super tynn seksjon uten en blokk metall flekker og sterk Osmium fiksering, er denne teknikken ikke direkte gjelder for moderne 3DEM18. For å bruke nyere 3DEM metoder, inkludert SBEM og array tomografi, med protein merking, benyttet vi genetisk kodet EM-koder i denne protokollen. Genetisk kodede koder krever ikke permeabilization, teknisk krevende ultra-kryosnitt, og immunostaining av individuelle seksjoner fordi de lokalisere til stedet av interesse før fiksering.
Prosedyrene for prøve utarbeidelse i 3DEM generelt inkluderer en kombinasjon av felles kjemisk fiksering og heavy metal farging metoder fordi cellene er sammensatt i hovedsak av C, H, O, og N, som krever farging med tungmetaller for å oppnå kontrast under EM9 . Derfor har vi benyttet redusert Osmium fiksering og metall flekker for å forbedre kontrasten og ledningsevne for seriell bildebehandling. Prosedyren for å beis prøver før snitting, kjent som en blokk farging, har blitt rapportert som et viktig skritt for 3DEM metoder som SBEM og liten LØGN-SEM19. Vi bekreftet at en Bloc-beiset celler i vår protokoll demonstrerte klar SCO1-APEX2 og HRP-KDEL EM kontrast utelukkende i mitokondrie IMS og ER henholdsvis i TEM (Figur 3). Videre, det SEM profilen fra 90-NM føljetong avdelinger avsløre en helt kontrasten inne begge to organeller (skikkelsen 4). Den forbedrede kontrasten ved en blokk farging ble tydelig gjenkjennelig fra DAB-signalet, og kontrasten og konduktivitet resulterte i serielle bilder med god kvalitet (Figur 4). I tillegg bidrar denne høye kontrasten til tilrettelegging av påfølgende oppgaver som justering og segmentering med tredimensjonal (3D) bildeprogramvare.
I de senere årene, volum elektron mikroskopi teknikker (dik-SBEM, liten LØGN-SEM, og array tomografi) har besvart biologiske spørsmål som krevde observasjon av et stort synsfelt og en 3D-visning. Dik-SBEM og liten LØGN-SEM ikke involverer den fysiske håndteringen av seksjoner, så tidkrevende for justering av bilder kan reduseres. Prøven må imidlertid ødelegges for å få serie bilder, og synsfeltet er mindre enn matrisen tomografi. Seriell SEM Imaging bruker array tomografi er ansatt i økende grad som et alternativ til TEM seriell snitting, og den store fordelen med denne teknikken er den ikke-destruktive måte og stort synsfelt. I motsetning til andre 3DEM teknikker som dik-SBEM og liten LØGN-SEM, kan seksjoner lagres på en dekkglass, en ITO-belagt dekkglass, en silisium wafer, eller en tape og kan være gjentatte ganger avbildet7.
APEX2 er enkel å bruke og kan gi et bredt spekter av flekker tetthet uten spesialutstyr, i motsetning til mini singlet oksygen generator20 eller fluorescerende protein21 teknikker, genererer DAB nedbør via en photooxidation. Den variable søknaden har blitt testet i flere mobilnettet organeller inkludert nucleus, plasma membran, mitokondrier matrise, mitokondrie cristae, ER, tubulin, og utgangen i COS 7 og HEK293T celle22. Det er imidlertid noen begrensninger og flere kontrollpunkter for bruk av genetisk kodet merking i elektron micrographs. Uttrykket nivåer av eksogene gener bør styres for å oppnå rimelig flekker på EM nivå fordi hvis uttrykket av den genetiske koden er for høy, kan det indusere falske positive signaler og forurolige Ultrastructure av celler via membran brudd og subcellulære organelle aggregering23. Et annet mulig problem er DAB-overstaining, som har blitt rapportert å forårsake uskarphet og membran ødeleggelse22. For å sikre riktig uttrykk for gener, ble DAB-farget celler sammenlignet med unstained celler ved hjelp av både lys mikroskopi og EM (figur 2 og Figur 3). I tillegg bør fikserings nivået være godt regulert for å sikre at de endogene oksidaser er helt inaktive. For å hindre at noen gjenstander fra endogene oksidaser under behandling, fikset vi en monolag av celler i stedet for å bruke frittliggende og pelleted celler24. Dette bidro også til å identifisere cellene av interesse når vi sjekket DAB-signalet under lys mikroskopi. Derfor viser våre resultater at farging og fiksering av celle monolagere er nyttige for CLEM ved hjelp av DAB farging (figur 2). Den serielle bilder med array tomografi og 3D-modell avslørte at ER-mitokondrier kontaktnett steder oppstå på ulike z-fly (supplerende Movie 2 og supplerende Movie 3). Bildet gir en komplett 3D-visualisering av mitokondrie-og ER-nettverkene i hele celler (tilleggs film 1). Det tyder på 3D-volum analyse er avgjørende for kvantitativ sammenligning av ER-mitokondrier kontakter. Når du studerer komplekse nettverk av intracellulære organeller, er dette en usedvanlig nyttig teknikk.
Avslutningsvis var denne protokollen en effektiv kombinasjon av CLEM og 3DEM teknikker som tillot hel celle etterforskning på EM nivå. Spesielt, to forskjellige koder på samme tid og DAB-signaler i to forskjellige organeller var synlige i en hel celle. I tillegg kan merket celler og umerkede celler i samme seksjon sammenlignes, på grunn av stor skala EM. I denne protokollen var en blokk farging og DAB-signaler fra genetisk kodede koder nyttige for å undersøke samspillet mellom membranous organeller i hele celler. Dette kan være et egnet program for stor skala EM å undersøke andre cellulære interaksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av KBRI grunnleggende forskningsprogram gjennom Korea Brain Research Institute finansiert av departementet for vitenskap og IKT (19-BR-01-08), og National Research Foundation of Korea (NRF) Grant finansiert av Korea-regjeringen (MSIT) (nr. 2019R1A2C1010634). SCO1-APEX2 og HRP-KDEL plasmider var vennlig levert av Hyun-Woo Rhee (Seoul National University). TEM data ble anskaffet ved Brain Research Core fasiliteter i KBRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | Use only in fume hood |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | Use only in fume hood |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 4 % aqueous solution | EMS | 16320 | Use only in fume hood |
| Epon 812 | EMS | 14120 | EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml |
| Ultra-microtome Leica ARTOS 3D | Leica | ARTOS 3D | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| 35mm Gridded coverslip dish | Mattek | P35G-1.5-14-CGRD | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| Formvar carbon coated Copper Grid | Ted Pella | 01805-F | |
| Hydrochloric acid | SIGMA | 258148 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Glycine | SIGMA | G8898 | |
| 3,3′ -diaminobenzamidine (DAB) | SIGMA | D8001 | Hazardous chemical |
| 30% Hydrogen peroxide solution | Merck | 107210 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | SIGMA | P3289 | |
| 0.22 um syringe filter | Sartorius | 16534 | |
| Thiocarbonyldihydrazide | SIGMA | 223220 | Use only in fume hood |
| Potassium hydroxide | Fluka | 10193426 | |
| L-aspartic acid | SIGMA | A9256 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips | SPI | 06489-AB | fragil glass |
| Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP2618-1 | |
| Diamond knife | Leica | AT-4 | |
| Inveted light microscopy | Nikon | ECLipse TS100 | |
| Scanning electron microscopy | Zeiss | Auriga |
References
- Krols, M., et al. Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration. Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).
- Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians. International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623 (2017).
- Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).
- Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).
- Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
- Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
- Lee, S. Y., et al. APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest. Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons. Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS ONE. 7 (6), 38011 (2012).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
- Kijanka, M., et al. A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).
- Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX. Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).
- Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 7923 (2015).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
- Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein. PLOS ONE. 8 (5), 64764 (2013).
- Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
