Summary
Vi presenterar ett protokoll för att studera distributionen av mitokonlikers och endoplasmatiska Retikulum i hela celler efter genetisk modifiering med hjälp av korrelat ljus och volymelektronmikroskopi inklusive askorbat peroxidas 2 och pepparrotperoxidasfärgning, seriell snittning av celler med och utan målgenen i samma sektion, och seriell avbildning via elektronmikroskopi.
Abstract
Cellulära organeller, såsom mitokona och endoplasmatiska Retikulum (ER), skapa ett nätverk för att utföra en mängd olika funktioner. Dessa mycket böjda strukturer viks in i olika former för att bilda ett dynamiskt nätverk beroende på cell förhållandena. Visualisering av detta nätverk mellan mitokona och ER har försökt använda super-resolution fluorescens Imaging och ljus mikroskopi; den begränsade upplösningen är dock otillräcklig för att iaktta membranen mellan mitokonnorna och ER i detalj. Transmission elektronmikroskopi ger bra membran kontrast och nanometer-skala upplösning för observation av cellulära organeller; Det är dock exceptionellt tidskrävande när man bedömer den tredimensionella (3D) strukturen av högt böjda organeller. Därför observerade vi morfologin av mitokona och ER via korrelat ljus-elektronmikroskopi (CLEM) och volym elektronmikroskopi tekniker med hjälp av förstärkt askorbat peroxidas 2 och pepparrotperoxidas färgning. En Bloc-färgningsmetod, ultratunna Serial snittning (array tomography) och volymelektronmikroskopi tillämpades för att observera 3D-strukturen. I detta protokoll föreslår vi en kombination av CLEM och 3D elektronmikroskopi för att utföra detaljerade strukturella studier av mitokona och ER.
Introduction
Mitokonboen och endoplasmatiska Retikulum (ER) är membranbundna cellulära organeller. Deras anslutning är nödvändig för deras funktion, och proteiner relaterade till deras nätverk har beskrivits1. Avståndet mellan mitokontroen och ER har rapporterats som ca 100 nm med hjälp av ljusmikroskopi2; emellertid, senaste super-resolution mikroskopi3 och elektronmikroskopi (EM)4 studier har visat att det är betydligt mindre, vid cirka 10-25 nm. Den upplösning som uppnås i super-resolution mikroskopi är lägre än EM, och specifik märkning är nödvändig. EM är en lämplig teknik för att uppnå en tillräckligt högupplöst kontrast för strukturella studier av kopplingarna mellan mitokona och ER. En nackdel är dock den begränsade z-axelinformationen eftersom de tunna sektionerna måste vara ca 60 nm eller tunnare för konventionell transmissionselektronmikroskopi (TEM). För tillräcklig EM z-Axis Imaging, tredimensionell elektronmikroskopi (3DEM) kan användas5. Men detta innebär att förbereda hundratals tunna seriella delar av hela celler, vilket är mycket knepigt arbete som bara ett fåtal skickliga teknologer behärskar. Dessa tunna sektioner samlas på bräckliga formvar filmdragerade ett hål TEM galler. Om filma bryter på en GIRD, är seriell avbildning och volym rekonstruktion inte möjligheten. Serial block-Face scanning elektronmikroskopi (SBEM) är en populär teknik för 3DEM som använder destruktiva en Bloc snittning inuti scanning Electron Mikroskop (SEM) vakuumkammare med antingen en diamantkniv (Dik-SBEM) eller en fokuserad jonstråle (FIB-SEM) 6. men eftersom dessa tekniker inte är tillgängliga på alla anläggningar, föreslår vi array datortomografi7 med seriell snittning och SEM. I array-tomografi överförs serie sektioner med en ultramicrotome till ett glastäckslip istället för ett TEM-rutnät och visualiseras via ljusmikroskopi och SEM8. För att förbättra signalen för avbildning av Backscatter Electron (BSE) utnyttjade vi ett block EM-FÄRGNINGSPROTOKOLL som använde osmium tetroxid (OsO4)-fasta celler med osmiophilic thiocarbohydrazid (TCH)9, vilket gjorde det möjligt för oss att få bilder utan dubbel färgning efter inbäddning.
Dessutom, den mitokondriella markör SCO1 (cytokrom c oxidas Assembly protein 1) – askorbat peroxidas 2 (APEX2)10 molekylär tagg användes för att visualisera mitokondrier på EM-nivå. APEX2 är ungefär 28 kDa och härstammar från sojabönor askorbat peroxidas11. Det utvecklades för att visa den detaljerade placeringen av specifika proteiner på EM-nivå på samma sätt som grönt fluorescerande proteinmärkt protein används i ljusmikroskop. APEX2 omvandlar 3, 3 '-Diaminobenzidin (DAB) till en olöslig osmiophilic polymer på platsen för taggen i närvaro av kofaktor väteperoxid (H2O2). APEX2 kan användas som ett alternativ till traditionell antikropps märkning i EM, med en protein lokalisering genom hela djupet av hela cellen. Med andra ord, den APEX2-märkt protein kan visualiseras av specifika osmication11 utan immunogold märkning och depolarisering efter Ultra-kryosnittning. Pepparrot peroxidas (HRP) är också en känslig tagg som katalyserar H2O2-beroende polymerisation av DAB till en lokaliserad fällning, vilket ger EM-kontrast efter behandling med OSO4. ER Target peptid sekvens HRP-KDEL (Lys-ASP-GLU-Leu)12 applicerades för att visualisera er i en hel cell. För att utvärdera vårt protokoll att utnyttja genetiska Taggar och en Bloc-färgning med reducerad osmium och TCH (rOTO-metoden), med hjälp av osmication effekt på samma gång, jämförde vi membran kontrasten med och utan användning av varje genetisk tagg i rOTO en Bloc färgning. Även 3DEM med array tomografi och DAB färgning med APEX och HRP har, respektive, utnyttjats för andra ändamål, vårt protokoll är unikt eftersom vi har kombinerat array tomografi för 3DEM och DAB färgning för mitokonboen och ER märkning. Specifikt visade vi fem celler med och utan APEX-märkta gener i samma sektion, som hjälpte till att undersöka effekten av den genetiska modifieringen på celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cellkultur med mönstrade rutnät kultur skålen och cell transfektion med SCO1-APEX2 och HRP-KDEL plasmid vektor
- Utsäde 1 x 105 HEK293T celler genom att placera dem i 35-mm glas Grid-bottnade kultur rätter i en fuktad atmosfär som innehåller 5% Co2 vid 37 ° c i Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM) kompletteras med 10% foster bovint serum, 100 U/ml penicillin och 100 U/mL streptomycin.
- Dagen efter seedning cellerna, när de har vuxit till 50%-60% confluency, införa SCO1-APEX210 och HRP-kdel12 plasmid till cellerna med hjälp av transfektionsreagens enligt tillverkarens anvisningar (SCO1-APEX2 cDNA 0,5 μg + HRP-KDEL plasmid-DNA 0,5 μg per 3 μL transfektionsreagens).
2. ljus mikroskopi av celler som växer på mönstrade kultur rätter och DAB färgning för APEX2 och HRP
- Vid 16-24 h efter transfektion, ta bort alla odlingsmedier och tillsätt omedelbart 250 μL av den varma (30-37 ° c) fixeringslösningen (tabell 1) genom skonsam pipettering. Ta omedelbart bort fixeringslösningen och ersätt den med 1,5 mL ny Fixeringslösning. Inkubera på isen för 60 min, och tvätta sedan tre gånger för 10 min vardera i 1 mL iskall 0,1 M natrium cacodylate buffert (tabell 1).
FÖRSIKTIGHET: Aldehydångor är extremt giftiga. Utför allt arbete under ett ventilerat draghuv. - Tillsätt 1 mL kallt (0-4 ° c) 20 mM glycin lösning och inkubera i 10 min på isen följt av tre tvättar av 5 min vardera i 1 mL kallt 0,1 M natrium cacodylate buffert.
- Bered en fräsch 1x DAB-lösning (3,33 mL 0,3 M cacodylate-lösning + 10 μL 30% H2O2 + 5,67 ml kallt vatten + 1 ml 10X DAB-lösning).
- Tillsätt 500 μL av den nyberedda 1x DAB-lösningen (steg 2,3) och inkubera på isen i cirka 5-45 minuter tills en ljusbrun fläck syns under ett inverterat ljusmikroskop (figur 1a).
- Ta försiktigt bort DAB-lösningen och skölj tre gånger med 1 mL kallt 0,1 M natrium cacodylate buffert för 10 min vardera.
- Använd en faskontrast inverterad Mikroskop (eller ett ljust fält ljusmikroskop) för att visualisera DAB färgning vid en förstoring av 100x eller högre. Använd en märkpenna för att markera botten av glaset där intresseregionen (ROI) finns (figur 1b, C).
3. provberedning för EM-blocket
- Utför cellodling och DAB-färgning enligt anvisningarna i steg 2.1-2.6.
- Efter fixera proverna med 1 mL 2% reducerad OsO4 för 1 h vid 4 ° c.
FÖRSIKTIGHET: OsO4 ångor är mycket giftiga. Utför allt arbete under ett ventilerat draghuv. - Förbered en ny TCH-lösning (tabell 1) under steg 3,2 och passera genom ett 0,22 μm-filter.
Varning: TCH rök är mycket giftiga. Utför allt arbete under ett ventilerat draghuv. - Ta bort fixativ och skölj tre gånger med 1 mL destillerat vatten i 5 minuter vardera vid rumstemperatur (RT).
- Placera cellerna i 1 mL av den tidigare beredda och filtrerade TCH-lösningen i 20 minuter vid RT.
- Skölj cellerna tre gånger med 1 mL destillerat vatten i 5 minuter vardera vid RT.
- Exponera cellerna en andra gång till 1 mL 2% osmium tetroxid i destillerat vatten i 30 minuter vid RT.
- Ta bort fixativ och skölj tre gånger med 1 mL destillerat vatten i 5 minuter vardera vid RT. Tillsätt 1 mL 1% uranylacetat (vatten) och lämna över natten vid 4 ° c i mörker.
- Tvätta cellerna tre gånger i 1 mL destillerat vatten i 5 minuter vardera vid RT.
- Pre-Warm Walton bly aspartatlösning (tabell 1) i en ugn vid 60 ° c i 30 min.
- Färga cellerna med Waltons bly aspartatlösning genom att tillsätta 1 mL av den förvärmda bly aspartatlösningen, och sedan placera i en ugn i 30 min vid 60 ° c.
- Skölj cellerna tre gånger med 1 mL destillerat vatten i 5 minuter vardera vid RT.
- Inkubera i en graderad serie med 2 mL etanol-aliquoter (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) för 20 min vardera vid RT.
- Dekantera etanolen och inkubera i 30 min i 1 mL 3:1 etanol: inbäddnings blandnings medium med låg viskositet vid RT.
- Ta bort mediet och tillsätt 1 mL 1:1 etanol: inbädda blandnings medium med låg viskositet. Inkubera i 30 minuter vid RT.
- Ta bort mediet och tillsätt 1 mL 1:3 etanol: inbädda blandnings medium med låg viskositet. Inkubera i 30 minuter vid RT.
- Ta bort mediet och tillsätt 1 mL 100% inbädda medium med låg viskositet och inkubera över natten.
- Bädda in provet i 100% inbäddnings blandning med låg viskositet och inkubera i 24 timmar vid 60 ° c.
- Förbered 90-nm tjocka sektioner med en ultramicrotome.
- Observera rutnätet under TEM på 200 kV.
4. seriell snittning och montering på indium-Tin-Oxide belagda täckband för SEM Imaging
-
Substrat beredning
- Rengör indium-Tin-oxid (ITO)-belagda glas täckband (22 mm x 22 mm) genom mild agitation i isopropanol för 30-60 s.
- Ta bort täckglas, dränera överflödigt isopropanol och låt verka i en dammfri miljö tills den är torr.
- Behandla Ito-belagda glas täckband av glöd urladdning med hjälp av en plasma bestrykare för 1 min.
Obs: Plasmaaktiverande ger en hydrofila egenskap på substrat ytan. Det skapar en mycket tunn film av vatten på underlaget för att förhindra rynkbildning i avsnitten när avsnittet är fäst vid underlaget. - Sätt in de ITO-belagda glas täcksedlarna i substrat hållaren och placera dem i kniv båten.
-
Trimning av prov blocket och seriell snittning
- Sätt in prov blocket i provhållaren på ultramicrotomen och Ställ in det i trimnings blocket.
- Använd ett rakblad för att trimma bort all överflödig harts runt målpositionen (identifierad i steg 2,6, figur 1d-G). Formen på blocket ansiktet bör vara trapetsformad eller rektangulär. Framkant och bakre kant måste vara absolut parallella (figur 1H, I).
- Sätt in provhållaren på ultramicrotomen-armen och placera diamantkniven i knivhållaren. Sätt in ITO-glastäckslinjen i band hållaren och kläm fast hållaren med handtaget (figur 1J). Ställ in band hållaren i kniv båten och fyll kniv båten med filtrerat destillerat vatten (figur 1k).
- Justera hållaren med knivbladet genom att försiktigt trycka på hållarens handtag för att ställa in kanten på ITO-glaset nära kniven (figur 1L).
- Efter kapning avsnittet, stoppa snittning processen, och sakta öppna klämskruven på röret och dränera vatten båten (flödeshastighet en droppe vatten per sekund).
- Efter avslutad band-samling processen, ta bort underlaget med handtaget på kläm anordningen och torka bandet (figur 1m).
5. Imaging i SEM och anpassning av SEM-bildstacken
- Montera den ITO-belagda täckslip på aluminium-stubbar med klibbigt kol tejp. Försegla glasytan och ytan i stub med klibbigt kol band, och sedan päls med en 10-nm tjockt kol lager (figur 1N).
- Observera den ITO-belagda täckslip i ett fält utsläpp SEM vid en låg acceleration spänning på 5 kV och en lämplig arbetsavstånd för effektiv insamling av BSEs.
- Importera seriella bilder i bild J Software (Fiji)13 med alternativet Virtual stack. Öppna en ny TrakEM14, och importera bilden stacken till trakem. Klicka på höger musknapp och välj menyn Justera .
- Välj sedan bild intervallet (från den första bilden till den sista bilden). Slutför den automatiska justeringen, spara den justerade datamängden och välj Exportera för att kompilera en platt bild från det valda bild intervallet (från den första bilden till den sista bilden). Slutligen, spara de platta bilddata i AVI-format i bild J huvudmenyn.
Obs: kompletterande film 1 och kompletterande film 2 visar SEM bild stacken och beskurna bild stacken, respektive.
6. segmentering av mitokona och ER från seriella bilder
- Starta 3dmod i IMOD15 programvara och öppna bildfiler.
- I ZaP-fönstret, rita konturen av mitokonsten och ER med hjälp av mellersta musknappen.
- Om du vill visualisera den segmenterade volymen öppnar du fönstret modellvy (kompletterande film 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I bild 1 beskrivs schemat och arbetsflödet för det här protokollet. Protokollet kräver 7 dagar; beroende på den tid som tillbringas på SEM-avbildning kan detta dock öka. För cell transfektion, sammanlänkning av cellerna bör kontrolleras så att den inte täcker botten av hela rutnäts plattan (figur 1a). En hög celltäthet kan förhindra identifieringen av cellen av intresse under ljusmikroskop och EM observation. Vi använde genetiskt märkta plasmider som uttryckte APEX2 och HRP för att välja effektivt transfekterade celler bland de många odlade celler i kultur skålen. Vi odlade HEK293T celler och bekräftade uttrycket av SCO1-länkade APEX2 (mitokondriella intermembranrymden [IMS]) och HRP-konjugerat KDEL (ER) i Co-transfected celler. Under ljusmikroskopi, APEX2-transfected celler färgas en brun färg, medan celler utan transfektion förblev ofärgade (figur 1a och figur 2). Detta tillät identifiering av de transfekterade målcellerna, som sedan användes för korrelerade ljuselektronmikroskopi (Clem), med användning av DAB-färgning i en odlad cellpopulation (figur 3D-F och figur 4b). Det var bra att markera glasbotten (figur 1b, C) för att göra det enkelt att identifiera placeringen av målcellen under det platta inbäddnings steget (figur 1e, F). När HEK293T-cellerna behandlades med ett förbättrat "Double osmium"-Färgnings protokoll (rOTO) färgas hela celler med en mörk färg (figur 1d). Efter avlägsnande av inrutade täckglas från kultur skålen, identifierade vi målplatsen på blocket ytan under ett stereomikroskop (figur 1G). Vi trimmade cellerna i ROI i en Trapezoid form, och de ledande och avslutande kanterna gjordes parallellt (figur 1H, I). För att implementera mitokona-och ER-nätverkskommunikation använde vi en stor diamantkniv med en stor vatten båt för att seriellt dela upp SCO1-APEX2 och HRP-KDEL-uttrycker HEK293T celler (figur 1J-L). Serial 90-nm tjocka band sektioner var framgångsrikt knutna till ITO-belagda glas täckslip (figur 1m), och ytan var belagd med 10-nm tjockt kol för observation via SEM (figur 1N).
SCO1-APEX2 och HRP-KDEL proteiner genererar mycket täta elektroniska signaler som härstammar från DAB-omvandling som är detekterbara i TEM (figur 3) och SEM (figur 4). Den mörka fläcken som genereras av SCO1-APEX2 observerades uteslutande i IMS och inte i matrisen utrymme mitokona (figur 3D). Co-transfected celler (den vänstra cellen i figur 3D, E) med både SCO1-APEX2 och HRP-kdel plasmider uttryckte en mycket tät elektron signal i MITOKONDRIELLA IMS och er; men vi observerade ingen er färgning i celler som var transfekterade endast med SCO1-APEX2 (den högra cellen i figur 3D, F). För seriella bilder med SEM skapade vi först en överblick över hela arraybilden med hjälp av BSE-detektorn över ett stort område (figur 4a). För det andra placerades ROI i det första avsnittet och propagerade till alla andra sektioner (figur 4b). Slutligen visualiserade vi ROI som innehåller fem målceller med 5-NM bildpixlar (figur 4c). Inzoomade bilder avslöjade detaljerade subcellulära strukturer (figur 4D) såsom Golgi apparat, mitokona, kärnor och er. De seriella bilderna visade tydligt att ER-mitokona kontakter förekom på olika z-plan (kompletterande film 2 och kompletterande film 3).
Figur 1 : S gott förberedelse arbetsflöde för SEM och tem. (A) en kultur rätt som innehåller inrutade täckblad var seedad med celler och FÄRGAS med DAB. (B,C) Efter DAB-färgning användes en märkpenna för att markera botten av glaset där målcellerna var placerade. (D) efter oso4 färgning blir cellerna en mörk färg. (E, F) Polymeras kedjereaktion (PCR) rör (eller någon typ av inbäddnings kapslar) användes för att enkelt göra ett EM-block som innehöll de markerade positionerna. (E) överst vy. (F) botten bild. (G) en stereomikroskopi-bild med låg förstoring av ytan på ett EM-block. (H) avkastningen är i mitten av den plana ytan. (I) en stereo mikroskopibild med högre förstoring av den rektangulära avkastningen. (J) Ito-belagda glas täckblad (vit asterisk) sätts in i band hållaren (blå pil), och bäraren är fastspänd genom att vrida handtaget medurs. (K, L) Handtaget på hållaren trycks försiktigt, och hållaren är justerad för att placera kanten på den ITO-belagda glas täckglaset nära kniven genom att skjuta. M) banden fästs på de Ito-belagda glas täcksedlarna. (N) den Ito-belagda glas täckband är knutna till SEM-stubbar, och resterande glas är förseglad med klibbiga kol tejp och belagda med ett 10-nm kol gäng skikt. Vita asterisker indikerar den ITO-belagda glas täckslip, och svarta asterisker indikerar koltejp. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: inverterad mikroskopi i faskontrast bild av odlade HEK293T celler färgade med DAB. A) färgning av celler med endast DAB (utan oso4 -färgning). Vita pilar indikerar ofärgade celler, och svarta pilar indikerar DAB-färgade celler. (B) högre förstoring bild av ROI. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Tem Imaging av HEK293T celler som uppvisar riktade mitokondrie IMS (SCO1-APEX2) och er (HRP-KDEL). (a-C) Untransfected HEK293T celler som visar dubbel membranet av mitokona (M) och endoplasmatiska Retikulum (ER). (D-F) APEX2 och HRP katalyserar polymerisation av DAB till en lokal fällning, som därefter färgas med elektron täta OsO4. En mörk kontrast syns i mitokondrie IMS (svart pilspets) och ER (svart pil); men celler som inte var transfekterade med HRP – kdel uppvisar ofärgade (vit pil). Skala staplar: 1 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: seriell SEM-avbildning av HEK293T-celler som uppvisar de riktade mitokondriella IMS (SCO1-APEX2) och er (HRP-KDEL). (A) Översikt över de serie avsnitt band som observerats med hjälp av BSE-detektorn. (B) korrelation av låg förstoring bild (infälld) med hög förstoring BSE-bild (vitprickig-line rutan indikerar ROI av DAB-färgade celler). (C) hög förstoring av ROI målceller med 5-NM bildpixlar. (D, E) En mörk kontrast är uppenbar i mitokondrierna IMS och ER men inte Golgi apparaten. (F-I) ER-mitokona kontakter (vit pil) förekommer på olika z-plan. N, kärna; M, mitokon ER, endoplasmatiska Retikulum; G, Golgi apparat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: lösnings recept.
Kompletterande film 1: SEM bildstapel. Fiji13 med trakem14 programvara användes för att anpassa 91 bilder. Den ursprungliga justerade datauppsättningen är 11 GB. Att trappa ner stacken, storlek och beskäras bilduppsättning användes. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Kompletterande film 2: beskurna bildstapel. För att visualisera mitokona, ER, och deras kontakt webbplatser i detalj, bilder var beskäras från ursprungliga datauppsättning (5 NM/pixel). Skala staplar: 1 μm. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Kompletterande film 3:3D rekonstruktion av mitokona och er. För 3D-visualisering, var konturen av mitokona och ER segmenterad och visualiseras med hjälp av IMOD15 programvara. Mitokonen visualiserades som långa tubulära strukturer (röd), och ER-nätverk (grön) visade sin komplicerade morfologi. Gult utgjorde en stor yta av kontakt plats mellan mitokona och ER i olika z-plan. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bestämning av cellernas lokalisering av specifika proteiner vid en nanometerupplösning med EM är avgörande för att förstå proteiners cellulära funktioner. Generellt finns det två tekniker för att studera lokalisering av ett målprotein via EM. En är den immunogold tekniken, som har använts i EM sedan 1960, och den andra är en teknik som använder nyligen utvecklat genetiskt kodade Taggar16. Traditionella immunogold tekniker har använt antikroppskonjugerade guld partiklar eller kvantprickar för att Visa placeringen av det märkta proteinet. Men på grund av kravet på högkvalitativa antikroppar och penetrationseffektiviteten hos antikroppar som påverkas av harts och fixativ, är denna teknik signifikant begränsad17. Specifikt, eftersom immunogold märkning är huvudsakligen begränsad till ytan av en ultratunna sektion utan en Bloc metall färgning och stark osmium fixering, denna teknik är inte direkt tillämplig på moderna 3DEM18. För att använda de senaste 3DEM-metoderna, inklusive SBEM och array Tomography, med protein märkning, utnyttjade vi genetiskt kodade EM-Taggar i detta protokoll. Genetiskt kodade Taggar kräver inte permeabilisering, tekniskt krävande Ultra-kryosektionering, och immunofärgning av enskilda sektioner eftersom de lokalisera till platsen av intresseföre fixering.
Förfarandena för provberedning i 3DEM omfattar i allmänhet en kombination av vanlig kemisk fixering och tungmetall färgning metoder eftersom cellerna består huvudsakligen av C, H, O och N, som kräver färgning med tungmetaller för att få kontrast under EM9 . Därför använde vi minskad osmium fixering och metall färgning för att förbättra kontrast och konduktivitet för seriell avbildning. Förfarandet för att fläcka prover innan snittning, känd som en Bloc färgning, har rapporterats som ett viktigt steg för 3DEM metoder såsom SBEM och FIB-SEM19. Vi bekräftade att de en Bloc-färgade celler i vårt protokoll visade tydliga SCO1-APEX2 och HRP-KDEL EM kontrast uteslutande i mitokondrie IMS och ER, respektive, i TEM (figur 3). Dessutom visade SEM-bilderna från 90-nm seriella sektioner en tydlig kontrast i båda organellerna (figur 4). I synnerhet skiljdes den förstärkta kontrasten genom en Bloc-färgning tydligt från DAB-signalen, och kontrasten och ledningsförmågan resulterade i seriebilder av god kvalitet (figur 4). Dessutom, denna hög Kontrasthjälpmedel underlättande av efterföljande uppgifter såsom anpassning och segmentering med tredimensionell (3D) bildprogram.
Under de senaste åren har volymelektronmikroskopi tekniker (Dik-SBEM, FIB-SEM, och array tomografi) svarat på biologiska frågor som krävde observation av ett stort synfält och en 3D-vy. Dik-SBEM och FIB-SEM innebär inte fysisk hantering av sektioner, så tidskrävande för anpassning av bilder kan minskas. Provet måste dock förstöras för att få seriella bilder och synfält är mindre än för Array tomography. Serial SEM Imaging använder array datortomografi används alltmer som ett alternativ till tem seriell snittning, och den stora fördelen med denna teknik är dess icke-förstörande sätt och stort synfält. Till skillnad från andra 3DEM tekniker som Dik-SBEM och FIB-SEM, kan sektioner lagras på en täckglas, en ITO-belagd täckglas, en kisel wafer, eller ett band och kan upprepade gånger avbildas7.
APEX2 är lätt att använda och kan ge ett brett spektrum av färgning tätheter utan särskild utrustning, till skillnad från mini linne syre Generator20 eller fluorescerande protein21 tekniker, genererar DAB nederbörd via en fotooxidation. Dess varierande applicering har testats i flera cellulära organeller, inklusive kärna, plasmamembran, mitokondriematris, mitokondriell cristae, er, tubulin, och aktin i cos 7 och HEK293T cell22. Det finns dock vissa begränsningar och flera kontrollpunkter för användning av genetiskt kodad märkning i elektronmikrografer. Uttrycksnivåerna för de exogena generna bör kontrolleras för att uppnå rimlig färgning på EM-nivå, för om uttrycket av den genetiska etiketten är för högt, kan det framkalla falskt positiva signaler och stör den ultrastruktur av celler via membran bristning och subcellulära organell aggregation23. Ett annat möjligt problem är DAB överfärgning, som har rapporterats orsaka suddighet och membran förstörelse22. För att säkerställa ett lämpligt uttryck för gener jämfördes DAB-färgade celler med ofärgade celler med hjälp av både ljusmikroskopi och EM (figur 2 och figur 3). Dessutom bör fixeringsnivån vara väl reglerad för att säkerställa att endogena oxiaser är helt inaktiva. För att förhindra att artefakter från endogena oxiaser under bearbetningen, fixade vi en enskiktslager av celler istället för att använda fristående och pelleterade celler24. Detta bidrog också till att identifiera de celler av intresse när vi kollade DAB signalen under ljusmikroskopi. Därför visar våra resultat att färgning och fixering av cellmonolayers är användbara för CLEM med DAB-färgning (figur 2). Den seriella bilder med array tomografi och 3D-modell avslöjade att ER-mitokona kontakt platser förekommer på olika z-flygplan (kompletterande film 2 och kompletterande film 3). Bilden ger en komplett 3D-visualisering av mitokondrie och ER nätverk i hela celler (kompletterande film 1). Det föreslår 3D-volymanalys är viktigt för kvantitativ jämförelse av ER-mitokona kontakter. När man studerar de komplexa nätverken av intracellulära organeller, är detta en exceptionellt användbar teknik.
Sammanfattningsvis var detta protokoll en effektiv kombination av CLEM och 3DEM tekniker som tillät hel cells undersökning på EM-nivå. I synnerhet var två olika taggar på samma gång och DAB-signaler i två olika organeller synliga i en hel cell. Dessutom kan märkta celler och omärkta celler i samma sektion jämföras, på grund av storskaliga EM. I detta protokoll var en Bloc färgning och DAB signaler från genetiskt kodade Taggar användbara för att undersöka samspelet mellan membranös organeller i hela celler. Detta kan vara ett lämpligt program för storskaliga EM för att undersöka andra cellulära interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av KBRI grundläggande forskningsprogram genom Korea Brain Research Institute finansieras av ministeriet för vetenskap och IKT (19-BR-01-08), och National Research Foundation of Korea (NRF) Grant finansieras av Koreas regering (MSIT) (No. 2019R1A2C1010634). SCO1-APEX2 och HRP-KDEL plasmider var vänligt tillhandahålls av Hyun-Woo Rhee (Seoul National University). Data förvärvades vid hjärnforskning Core anläggningar i KBRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | Use only in fume hood |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | Use only in fume hood |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 4 % aqueous solution | EMS | 16320 | Use only in fume hood |
| Epon 812 | EMS | 14120 | EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml |
| Ultra-microtome Leica ARTOS 3D | Leica | ARTOS 3D | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| 35mm Gridded coverslip dish | Mattek | P35G-1.5-14-CGRD | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| Formvar carbon coated Copper Grid | Ted Pella | 01805-F | |
| Hydrochloric acid | SIGMA | 258148 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Glycine | SIGMA | G8898 | |
| 3,3′ -diaminobenzamidine (DAB) | SIGMA | D8001 | Hazardous chemical |
| 30% Hydrogen peroxide solution | Merck | 107210 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | SIGMA | P3289 | |
| 0.22 um syringe filter | Sartorius | 16534 | |
| Thiocarbonyldihydrazide | SIGMA | 223220 | Use only in fume hood |
| Potassium hydroxide | Fluka | 10193426 | |
| L-aspartic acid | SIGMA | A9256 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips | SPI | 06489-AB | fragil glass |
| Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP2618-1 | |
| Diamond knife | Leica | AT-4 | |
| Inveted light microscopy | Nikon | ECLipse TS100 | |
| Scanning electron microscopy | Zeiss | Auriga |
References
- Krols, M., et al. Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration. Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).
- Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians. International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623 (2017).
- Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).
- Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).
- Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
- Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
- Lee, S. Y., et al. APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest. Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons. Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS ONE. 7 (6), 38011 (2012).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
- Kijanka, M., et al. A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).
- Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX. Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).
- Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 7923 (2015).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
- Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein. PLOS ONE. 8 (5), 64764 (2013).
- Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
