Summary
Neste manuscrito, um protocolo é apresentado para executar a medida FACS-baseada da atividade transcricional de BK-Polyomavirus usando as pilhas HEK293T transfected com um plasmídeo bidirecional do repórter que expressa tdtomato e EGFP. Este método permite determinar quantitativamente a influência de novos compostos na transcrição viral.
Abstract
Os poliomavírus, como o BK-Polyomavirus (BKPyV), podem causar patologias severas em pacientes imunocomprometidos. No entanto, uma vez que os antivirais altamente eficazes não estão atualmente disponíveis, são necessários métodos que medem o impacto de potenciais agentes antivirais. Aqui, um repórter de fluorescência dupla que permite a análise do BKPyV não-codificação de controle-região (NCCR) impulsionado atividade precoce e tardia promotor foi construído para quantificar o impacto de potenciais medicamentos antivirais na expressão gênica viral via tdTomato e eGFP Expressão. Além, clonando os amplicões de bkpyv-nccr que neste protocolo foram obtidos exemplarmente do ADN sangue-derivado de pacientes transplantados renais imunocomprometidos, o impacto de nccr-rearranjos na expressão de gene viral pode ser determinado. Depois da clonagem dos amplicons derivados pacientes, as pilhas HEK293T foram transfected com o repórter-Plasmids, e tratadas com os agentes antivirais potenciais. Subseqüentemente, as pilhas foram sujeitadas a FACS-análise para medir as intensidades médias da fluorescência 72 h transfection do borne. Para testar também a análise de drogas que têm um potencial efeito inibidor do ciclo celular, apenas transfected e, portanto, as células fluorescentes são usadas. Desde que este ensaio é executado no grande antígeno de T que expressa pilhas, o impacto da expressão adiantada e atrasada pode ser analisado em uma maneira mutuamente independente.
Introduction
Os poliomavírus representam uma família independente de pequenos vírus de DNA duplo-encalhado (dsDNA) com o vírus Simian 40 (SV40) como uma espécie de protótipo. A infecção primária ocorre principalmente durante a infância, que geralmente prosseguem sem sintomas de doença e geralmente causam infecções latentes em hospedeiros competentes imunológicos. O BK-Polyomavirus (BKPyV) persiste principalmente em células tubulares renais sem causar nefropatologia, no entanto, em caso de comprometimento da imuno-competência após o transplante renal, o vírus pode reativar e causar danos graves e comprometimento do enxerto função ao atingir uma viremia alta (1 x 104 bkpyv DNA cópias/ml)1,2. Em aproximadamente 10% dos receptores de transplante renal, a reativação do BK-Polyomavirus (bkpyv) resulta em uma nefropatia associada ao poliomavírus (pyvan), que foi de até 80% associada a um alto risco de falhas renais do aloenxerto3,4 . Desde que nenhum agente antiviral aprovado está disponível, a terapia atual é baseada na redução do immunosuppression. Curiosamente, os inibidores de mTOR parecem ter um efeito antiviral; assim, comutar a terapia imunossupressores ao imunossupressão mTOR-baseado pôde representar uma aproximação alternativa para impedir a progressão do bkpyv viremia5,6,7. No entanto, o mecanismo antiviral baseado em mTOR é atualmente ainda incompletamente compreendido. Assim, são necessários métodos que medem o impacto de potenciais agentes antivirais em concentrações clinicamente relevantes.
O genoma circular do BKPyV consiste em aproximadamente 5 KB abrigando uma região de controle não-codificante (NCCR) que serve como uma origem de replicação e concomitantemente um promotor bidirecional dirigindo a expressão de transcrições de mRNA de fase precoce e tardia. Desde que ocorra espontâneamente nccr-rearranjos, deleções, e duplicações são encontrados no bkpyv patogénico8 e acumulado significativamente nos pacientes que sofrem de pvan5,9, uma comparação de arquetípico (WT) e Re-arranjado (RR) NCCR-atividades são úteis para caracterizar a aptidão replicativa viral.
Como resumido na Figura 1, este protocolo descreve um método comumente usado para medir a atividade transcricional de BKPyV nccr quantificando a fluorescência de dois fluoróforos tdTomato e EGFP expressos a partir de um repórter plasmídeo5, 9,10,11. O procedimento é realizado na presença do antígeno T SV40 grande (lTAg), que permite analisar o impacto de potenciais agentes antivirais na atividade de NCCR precoce e tardia separadamente5. Este ensaio analisa ainda mais o impacto dos rearranjos sobre a atividade da nccr e a comparação com o WT-nccrs5,9. O plasmídeo do repórter abriga o sinal atrasado da poliadenilação SV40 a jusante de cada frame de leitura aberto do fluoróforo para assegurar o processamento comparável e eficiente de ambos os transcritos para tdtomato e EGFP, respectivamente. Comparado aos métodos baseados em qRT-PCR5,12, esta aproximação FACS-baseada representa uma alternativa compatível do baixo custo e da taxa de transferência elevada desde nenhuns protocolos complicados da extração para a cultura de pilha contaminada e nenhum caro os anticorpos para a mancha imune da fluorescência são necessários. Além disso, uma vez que uma quantidade definida de células fluorescentes é analisada através da citometria de fluxo, a análise dos agentes inibidores do ciclo celular também é possível de forma quantitativa.
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Protocol
Este protocolo segue as diretrizes da pesquisa humana, conforme aprovado pelo Comitê de ética da faculdade de medicina da Universidade de Duisburg-Essen (14-6028-BO).
1. coleta de amostras de sangue ou urina e isolamento de DNA de poliomavirus
- Colete pelo menos 3 mL de sangue em tubos de EDTA ou urina em tubos de aquisição.
- Centrifugue a amostra a 2.500 x g durante 15 min. Se necessário, pipeta o plasma em um tubo novo e armazene as amostras do plasma em 4 ° c por diversos dias ou congele-se em-20 ° c para um armazenamento mais longo.
- Prepare 40 μL de proteinase K para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicione 400 μL de plasma por pipetagem.
- Lyse a amostra adicionando 400 μL de tampão de Lise, vortex por 15 s, e incubar por 10 min a 56 ° c.
- Isole o DNA usando um kit de extração de sangue de DNA, conforme descrito nas instruções do fabricante. Momentaneamente, adicione o álcool e carregue os lysates em uma coluna da rotação que contem uma membrana sílica-baseada de ligação do ADN. Lave as colunas várias vezes para produzir DNA puro.
- Elute o ADN rendido em 30-50 μL do tampão de TE.
2. amplificação da região de controlo não codificante (NCCR)
- Realize o procedimento a seguir em salas separadas fisicamente. Use uma sala isolada para preparar os reagentes e distribuir a mistura para os tubos de PCR.
- Prepare a mistura mestra para o pre-PCR usando o par da primeira demão A (tabela 1) em um volume total de 50 μl e use o ADN previamente isolado da etapa 1,6. O esquema de pipetagem para preparar a mistura mestra para a PCR pré e aninhada é impresso na tabela 2.
- Distribuir 45 μL da mistura mestra nos tubos de PCR.
- Adicionar 5 μL do DNA isolado nos tubos de PCR.
Nota: use outra sala do que a para a preparação do Mix mestre para evitar a contaminação. - Execute o PCR com as condições da reação como ilustrado na tabela 3. Repita a desnaturação, o recozimento, e a extensão em 35 ciclos.
- Para a amplificação aninhada use primer par B abrigando os locais de restrição para AgeI e SpeI (tabela 1).
- Execute o PCR aninhado com as condições da reação como descrito nas etapas 2,2 a 2,5 usando 5 μL do pre-PCR.
- Misturar 10 μL do produto PCR com 2 μL de corante de carregamento de gel 6x. Carregar 10 μL da mistura num gel de agarose de 1,5% e administrar o gel durante 30 min a 60 mA.
- Visualize o gel usando um sistema de documentação UV apropriado.
Nota: o tamanho do amplicon é esperado estar entre 300-500 BP dependendo se os rearranjos (deleções, inserções, ou duplicações) ocorreram (Figura 2C). - Purify os amplicões do PCR usando um jogo da purificação do PCR de acordo com as instruções do fabricante. Elute os amplicões do PCR em 30 μl do amortecedor da eluição.
- Envie os amplicões para sequenciamento de Sanger usando o par de primer B.
3. clonagem da NCCR para o repórter de fluorescência dupla
- Digerir os amplicões purificados (passo 2,10) com agei e Spei durante 2 h a 37 ° c, conforme descrito na tabela 4.
- Repita o passo 2,10 e purifique os amplicons digeridos.
- Paralelamente, também digerir a espinha dorsal plasmídeo (1,5 μg) com AgeI e SpeI para 2 h a 37 ° c, conforme descrito na tabela 5. Esta etapa só precisa ser executada uma vez. Para reações subsequentes, congele a digestão a-20 ° c.
- Analise o backbone plasmídeo digerido em um gel de agarose de baixo derretimento de 0,8%.
Nota: não execute o gel com uma corrente superior a 40 mA. A pastilha esperada da região espaçador originalmente derivada do plasmídeo pEX-K4 2-LTR CD313 é 128 BP (Figura 2C). - Visualize fragmentos de DNA usando luz UV de onda longa (320 nm) e recorte a banda de backbone usando um bisturi limpo. Transfira o fragmento de gel de baixa fusão para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Evite longos tempos de exposição UV para evitar danos ao DNA.
Nota: desde que o baixo Agarose do derretimento é usado, não é necessário purificar o ADN antes da ligadura. - Aqueça a espinha dorsal que contém a parte baixa do Agarose do derretimento por 10 minutos em 65 ° c a fim derreter a parte do gel e misturar cada 2 minutos pelo vortexing delicado. O gel derretido pode ser usado diretamente para a ligadura.
- Ligate a espinha dorsal e o amplicon digerido usando a ligase do ADN T4 sobre a noite em 16 ° c usando o esquema mostrado na tabela 6.
- Realize a transformação em E. coli usando o método de choque térmico, bactérias da placa em placas lb-amp, e cultura a 37 ° c durante a noite.
- No dia seguinte, selecione três clones positivos e prepare culturas de e. coli durante a noite (5 ml de lb-amp) e cultura a 37 ° c.
- Isole o Plasmid-DNA usando protocolos padrão como descrito em outro lugar14, realize a digestão de agei e de Spei para verific para ver se há clones positivos e visualize fragmentos cortados em um gel de agarose de 1%. A banda espaçador (128 BP) será substituída pela maior sequência de NCCR (300-500 BP, ver acima).
- Envie o plasmídeo para sequenciamento de Sanger usando primer EGFP-N ou primer par B (tabela 1).
- Como as mutações podem ocorrer espontaneamente, compare os resultados de sequenciamento com os resultados de sequenciamento obtidos com o amplicon. Utilize apenas os clones que contenham sequências idênticas em comparação com o amplicon.
- Use um software de bancada molecular (por exemplo, freeware GENtle 1.9.4 ou outros programas de edição de sequência) para alinhar e editar as sequências obtidas (Figura 3).
- Inicie o GENtle 1.9.4 e importe as sequências de DNA clicando no botão Import (seta verde para baixo).
- Em seguida, clique na ferramenta e selecione o alinhamento a partir do menu (use Ctrl + G como um atalho) e escolha as seqüências de DNA para o alinhamento.
- Adicione uma sequência ao alinhamento clicando em Adicionar ou remover uma sequência clicando em remover. Inclua uma seqüência arquetípico do consenso de nccr como JN19243815, não use a nccr-seqüência do Dunlop-tensão16comumente usada, desde que abriga rearranjos e duplicações outro do que o bkpyv arquetípico Cepas.
Nota: o NCCR já contém o Codon de início translacional (Figura 3). - Escolha um método para o alinhamento clicando no algoritmo na barra de ferramentas e escolha CLUSTAL W. defina os parâmetros de alinhamento para corresponder a 2; penalidade de extensão de Gap-1; penalidade de Gap-2 e clique em OK para executar o alinhamento.
4. transfecção transitória de células HEK293T com o plasmídeo repórter e tratamento com potenciais agentes antivirais
- Para preparar quantidades suficientes de DNA plasmídeo para experimentos subsequentes de transfecção, prepare uma cultura de 150 mL durante a noite. Isole o DNA plasmídeo usando um kit de isolamento plasmídeo. Alternativamente, outros kits de purificação de plasmídeo podem ser usados.
- Sementes 1 x 105 HEK293T células em DMEM contendo 10% FCS, penicilina e estreptomicina (1x) por poço de uma placa de 12 poços 24 h antes da transfecção e incubar durante a noite a 37 ° c e 5% co2 para manter a proliferação ativa durante a transfecção.
Nota: as células devem ser aproximadamente 80% confluentes na transfecção. - Coloque 250 μL de meios séricos reduzidos num tubo estéril e adicione 1 μg de cada ADN de plasmídeo de repórter e misture suavemente com pipetagem.
- Adicionar 3 μL do reagente de transfecção à mistura de ADN, misturar suavemente introduzindo pipetagem e incubar durante 15 min. pré aqueça o reagente de transfecção à temperatura ambiente de 22 ° c e vórtice suavemente antes de utilizar.
- Adicione a mistura gota-sábio para os poços e gentilmente distribuir para o poço.
- Após 4 h, substitua o sobrenadante por meio fresco contendo os agentes de teste e o controle do solvente. Incubar a 37 ° c até a análise. Neste exemplo, os inibidores de mTOR INK128 (100 ng/ml) e rapamicina (100 ng/ml) foram usados.
5. microscopia de fluorescência e citometria de fluxo
- Verificar as células para a fluorescência vermelha e verde o microscópio de fluorescência (Figura 4).
Nota: a fluorescência vermelha e verde corresponde à expressão genética inicial e tardia do BKPyV, respetivamente. - Após o transfection do borne de 72 h, aspirar o sobrenadante e lavar as pilhas duas vezes com 1 mL de PBS frio.
- Adicione suavemente 500 μL de tripsina e rode ligeiramente a placa para evitar o descolamento prematuro das células. Esta etapa é importante evitar doublets da pilha.
- Após a adição, remova o tripsina diretamente com a mesma ponta da pipeta.
- Incubar as células durante pelo menos 5 min a 37 ° c.
- Suspender as células tripsinizadas com 1 mL de PBS contendo 3% de FCS e transferir a suspensão em tubos de FACS pré-rotulados.
- Adicionar DAPI (1 μg/mL) antes da análise FACS.
- Analise as células usando um citometro de fluxo. Para cada amostra, medir pelo menos 10.000 células vivas, que são negativas para a coloração DAPI.
6. análise de dados
- Importe os dados para o software de análise de citometria de fluxo e adicione amostras por clique e arraste para o espaço de trabalho.
- Clique duas vezes no arquivo importado e crie uma plotagem de gráfico. Escolha FSC-A versus SSC-A clicando no eixo x e y. Porta a população de células principal clicando em polígono na barra de ferramentas e enquadrar a população de células (Figura 5). Nomeie a população de células escolhida conforme necessário (por exemplo, "células simples"). As "células individuais" aparecerá como um novo espaço de trabalho.
- Prossiga com a gating "células individuais" para DAPI negativa (i.e., "células vivas"). Para identificar células vivas comparar a população celular com e sem coloração DAPI. Em ambas as parcelas escolha FSC-A versus Pacific-Blue-A.
- Clique no retângulo e escolha a população de células negativas DAPI, nomeie a população de célula escolhida "células vivas" e crie um novo gráfico de pontos mostrando FITC (eGFP) versus PE (tdTomato) como descrito anteriormente.
- Adicione quadrantes em "células vivas" escolhendo Quad na barra de ferramentas. Porta a população arrastando o centro do quadrante para a borda de cada população. Os quadrantes representam 1) EGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM +, 3) eGFP + tdTOM-, 4) eGFP + tdTOM +.
Nota: devido à sobreposição espectral de espectros de emissão entre FITC e PE, a compensação inicial é essencial para distinguir entre sinais vermelhos e verdes e para alcançar resultados precisos. - Determine a média de intensidades de fluorescência (IFM) clicando com o botão direito do mouse no quadrante e escolhendo adicionar estatísticas. Escolha média e clique em OK. O MFI médio é agora exibido abaixo da população na seção "Estatísticas". Os quadrantes 2 e 4 correspondem à expressão precoce, enquanto os quadrantes 3 e 4 representam a expressão tardia.
- Adicione réplicas adicionais da mesma maneira para poder estatístico.
- Para valores de MFI de plotagem de interpretação de dados de cedo e tarde em um gráfico de barras:
- Para comparar as atividades de NCCR obtidas de diferentes doadores ou cepas de vírus, adicione um controle arquetípico ou a cepa Dunlop16 e defina suas IFM relativas a 100% e calcule os valores de IFM relativos. Repita com cada repetição e determine a média e o desvio padrão.
- Para avaliar um efeito de potenciais compostos na atividade transcricional, definir o solvente-controle para 100% e traçar o IFM das células tratadas.
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Representative Results
Neste experimento representativo, a atividade transcricional da região de controle não-codificante BK-Polyomavirus foi mensurada via citometria de fluxo. Além, um inibidor de mTOR, que possa ser usado para tratar pacientes após o reactivation de BKPyV, foi testado para sua inibição da expressão adiantada viral do gene. Para tal, utilizou-se um ensaio de dupla fluorescência-repórter como publicado anteriormente5. O esquema de fluxo de trabalho geral da configuração experimental é ilustrado em Fgráfico 1. Primeiramente, amostras de sangue de pacientes transplantados renais imunocomprometidos foram coletadas de acordo com as diretrizes de pesquisa humana aprovadas pelo Comitê de ética institucional. O sangue foi coletado em tubos contendo EDTA e as fases foram separadas por centrifugação. Subseqüentemente, 400 μL do plasma foram usados para a isolação do ADN do Polyomavirus. A região de controle de não codificação (NCCR) foi amplificada utilizando-se o protocolo Nested-PCR, conforme ilustrado na Figura 2a , utilizando o par de primers externo BKV-CR-1FW e BKV-CR-1rv, bem como, o par de primer interno BKV-CR-2Fw-agei (primer agei) e BKV-CR-2Rv-Spei ( Primer SpeI)17, o último dos quais abriga os locais de restrição para agei e Spei. A verificação do amplicon foi realizada via eletroforese em gel de agarose, como mostra a Figura 2b. Quando os amplicões derivados das seqüências arquetípico de nccr (WT) tiveram uma distribuição homogênea do tamanho no gel, aqueles derivados dos nccrs rearranjados com inserções (RRins) e os exclusões (RRdel) diferiram em seu tamanho (aproximado. 300-500 BP). Notavelmente, devido a rearranjos, a sequência de referência da Dunlop NCCR16 (DUN), que foi incluída como um controle, foi maior do que a nccr obtida a partir de vírus arquetípico. Desde que os amplicões corresponderam aos tamanhos previstos, os produtos purified do PCR foram emitidos para o sequenciamento de Sanger para uma comparação mais atrasada com as seqüências clonadas no plasmídeo do repórter para uma análise mais adicional.
Para a clonagem dos amplicons, a digestão foi realizada usando as duas enzimas de restrição AgeI e SpeI. Após a clonagem no repórter de fluorescência dupla, que foi realizada por meio do procedimento de clonagem padrão, a seleção de clones positivos contendo o NCCR foi verificada pela digestão de AgeI e SpeI (Figura 2C). Aqui, a pequena região espaçador (NC, 128 BP) foi substituída pelos maiores fragmentos de NCCR (aprox. 300-500 BP), indicando clones positivos. O DNA plasmídeo isolado de clones verificados foi enviado para sequenciamento de Sanger e comparado com as sequências obtidas do sequenciamento do amplicon (não mostrada). Somente os clones que correspondem à sequência de amplicon foram escolhidos para processamento posterior. Conforme descrito na Figura 3, os resultados do sequenciamento foram comparados com uma seqüência de nccr arquetípica (JN192438). Neste exemplo, foi detectada uma exclusão no bloco-P e uma substituição no bloco O.
Para testar subseqüentemente a atividade transcricional das seqüências clonadas de nccr na cultura da pilha, as pilhas HEK293T foram transfected transiente com as construções respectivas do repórter (figura 4a). Como visualizado na Figura 4B, a eficiência de transfecção e a atividade da nccr foram monitoradas via microscopia de fluorescência. A fluorescência vermelha e verde correspondeu à expressão do gene do BKPyV adiantado e atrasado, respectivamente5. As pilhas expressaram ambos os fluoróforos que indicam a atividade adiantada e atrasada eficiente do promotor. Como ilustrado pelos dois exemplos, o primeiro NCCR (NCCR1) apresentou uma forte expressão gênica tardia, enquanto o segundo exemplo (NCCR2) teve uma expressão genética tardia comparativamente forte precoce mas moderada (Figura 4B). Assim, as amostras foram preparadas para a mensuração da citometria de fluxo. Conforme descrito na seção 6 do protocolo, as células negativas DAPI foram bloqueadas (Figura 5a, painel inferior) e um gráfico de pontos foi criado mostrando o EGFP versus tdTomato. Amostras que foram negativas (Figura 5b), bem como aquelas positivas para tdTomato (figura5C) ou EGFP (Figura 5D), foram incluídas na análise. Nota-se que a compensação inicial foi realizada, o que é essencial para distinguir sinais vermelhos e verdes e alcançar resultados precisos18. As intensidades médias de fluorescência foram derivadas de cada clone de teste. Aqui, as pilhas positivas de tdTomato corresponderam à expressão adiantada quando as pilhas positivas de eGFP representaram a expressão atrasada. Neste exemplo, o tratamento com o inibidor de mTOR duplo INK128 reduziu significativamente a tdTomato MFI (Figura 5E-F), o que significa que a expressão precoce foi inibida.
Figura 1 : Esquema de fluxo de trabalho para a configuração experimental. 1) coleta de amostras de sangue (Alternativamente urina), 2) isolamento de DNA de poliomavirus 3) amplificação da região de controle não-codificante (nccr) utilizando protocolo Nested-PCR, 4) eletroforese de gel de agarose e amplicon verificação, 5) sequenciamento de Sanger do amplicon do PCR, 6) clonagem do nccr no repórter duplo da fluorescência usando Agei e Spei, 7) seleção de clones positivos, 8) sequenciamento de Sanger do DNA do plasmídeo, 9) Transfecção transitória de células HEK293T com o plasmídeo repórter e adição de compostos a serem testados, 10) microscopia de fluorescência para verificar transfecção eficiente, 11) análise de citometria de fluxo, 12) gating e análise da expressão do eGFP tdTomato, 13) interpretação dos dados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Nested PCR e análise representativa de NCCR-amplicons derivados do paciente. A) o ADN derivado dos transplantedpatients renais imunocomprometidos foi sujeitado à amplificação semianinhada do PCR usando os primers do oligonucleotide lig com os locais da limitação agei e Spei. Nomes de primer e comprimento (pares de base) de O, P, Q, R e S-Blocks arquetípica da cepa BKPyV JN192438 são indicados entre colchetes. B) os amplicons foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 1,5% e visualizados com coloração de DNA. M1 = 100 BP escada, WT = tipo selvagem (arquetípico), RR = rearranjado, ins = inserções, del = deleções, Dun = Dunlop Strain. C) digestão de plasmídeo com agei e Spei. Fragmentos digeridos foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1,5% e visualizados com coloração de DNA. M1 = 100 BP escada, m2 = 2-log escada. NC = controle negativo (espaçador). + = clone positivo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Clonagem e validação da NCCR para o repórter de fluorescência dupla. Resultados representativos da sequenciação de plasmídeo. Os amplicons foram purificados usando um kit de purificação de PCR e submetidos a sequenciamento de Sanger. As respectivas sequências foram alinhadas com a sequência de NCCR derivada da estirpe arquetípica BKPyV JN192438. As eliminações e substituições são marcadas em vermelho. Os locais de restrição AgeI e SpeI, o início translacional do quadro de leitura aberto do eGFP (impresso em negrito), bem como os blocos NCCR O-S são indicados. Os respectivos blocos e os locais de restrição são destacados em cores. O comprimento de cada bloco NCCR em pares de base é impresso entre colchetes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Análise de microscopia de fluorescência representativa da atividade precoce e tardia do promotor NCCR. A ) mapa genético do repórter de fluorescência dupla o controle do promotor bidirecional. Como descrito previamente5 o plasmídeo pTA-tdtom-nccr-EGFP (6.009 BP) abriga o sinal atrasado da poliadenilação SV40 a jusante de cada gaveta da expressão para assegurar o processamento comparável e eficiente de ambos os transcritos para tdtomato (cedo expressão) e eGFP (expressão tardia), respectivamente. A NCCR é ladeada por AgeI e SpeI. O vetor contem uma gaveta da resistência da ampicilina para a seleção durante o procedimento do clonagem. B) as células HEK293T foram transfectadas com os constructos de dupla fluorescência, cada um o controle de sequências nccr derivadas do paciente (NCCR1-2). As células foram submetidas à análise de brightfield e microscopia de fluorescência 72 h pós-transfecção. As configurações de filtro do microscópio foram utilizadas nas seguintes faixas de excitação: verde para tdTomato (515-560 nm) e azul para eGFP (450-490 nm). A barra de escala (200 μm) é indicada no canto inferior direito de cada fotografia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Análise representativa do FACS. Mostrado é a estratégia de gating simples necessária para este método. São usadas densidade de dois parâmetros ou plotagens de pontos. A) primeiro, o FSC é plotado contra Pacific Blue, enquanto apenas DAPI negativo (ou seja, células vivas) são processados. B-F) FITC (eGFP) versus PE (tdTomato) são plotados. C-D) Adicione exclusivamente células fluorescentes verdes e vermelhas para ajustar a compensação no citometro de fluxo. E-F) Neste exemplo, os inibidores de mTOR INK128 e reduzem significativamente o tdTomato MFI, que corresponde a uma redução da expressão de gene adiantada de BKPyV. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome da cartilha | Sequência (5 ' → 3 ') |
| BK-CR-fwd1 | CCCAGGCAGCTCTTTCAAGGC |
| BK-CR-REV1 | O CCTCTAACAAAATTCCAGCAAAAGC |
| BKV-CR-2-FW-AgeI | AAAAAAAccggtttttgcaaaaattgcaaaagaatagg |
| BKV-CR-2-RV-SpeI | TTTTTTActagtctggcgcagaaccatggcctt |
| EGFP-N | CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG |
Tabela 1: Oligonucleotides utilizados neste protocolo. As bases sublinhadas indicam os sítios enzimáticos de restrição para AgeI e SpeI, respetivamente.
| Componente | Volume/reacção (μL) | concentração final |
| Água RNase-livre | 32,8 μL | - |
| Tampão do PCR 10x | 5 μL | 1x |
| dNTPs (10 mM de cada) | 1 μL de | 0,2 mM de cada dNTP |
| FWD-Primer (10 μM) | 3 μL | 0,3 μM |
| Rev-Primer (10 μM) | 3 μL | 0,3 μM |
| Polimerase de Taq | 0,2 μL | 2 unidade/reação |
| Modelo de DNA | 5 μL | < 0,5 μg/50 μL de reacção |
Tabela 2: Master mix Preparação protocolo. A instrução aplica-se às reações pre-e aninhadas do PCR como descritas nas etapas 2,2 e 2,7, respectivamente.
| Temperatura | Duração | PCR-Step | Ciclos |
| 95 ° c | 5 min | Desnaturação inicial | |
| 95 ° c | 30 seg. | Desnaturação | |
| 55 ° c | 34 seg | Recozimento | x35 |
| 72 ° c | 1 minuto | Extensão | |
| 72 ° c | 10 min | Extensão final | |
| 4 ° c | ∞ | Refrigeração |
Tabela 3: Programa de PCR utilizado para amplificação de NCCR. A instrução aplica-se às reações pre-e aninhadas do PCR.
| Reagente | Volume/reacção (μL) | concentração final |
| DNase-livre H20 | 6 | a 20 μl |
| 10x tampão | 2 | 1x |
| AgeI | 1 | 10 unidades de |
| SpeI | 1 | 10 unidades de |
| PCR-amplicon purificada | 10 | Variável |
Tabela 4: Protocolo de digestão de amplicon. A instrução aplica-se para a digestão simultânea do ADN do amplicon com as duas enzimas da limitação descritas em etapa 3,1.
| Reagente | Volume/reacção (μL) | concentração final |
| DNase-livre H20 | 14,5 | a 20 μl |
| 10x tampão | 2 | 1x |
| AgeI | 1 | 10 unidades de |
| SpeI | 1 | 10 unidades de |
| Espinha dorsal do plasmídeo (1 μg/μL) | 1,5 | 1,5 μg |
Tabela 5: Protocolo de digestão de plasmídeo. A instrução aplica-se para a digestão simultânea da espinha dorsal do ADN do plasmídeo com as duas enzimas da limitação descritas em etapa 3,3.
| Reagente | Volume/reacção (μL) | concentração final |
| DNase-livre H20 | 7 | a 20 μl |
| Ligase do ADN T4 | 1 | 20 |
| tampão do ligase do ADN de 10x T4 | 2 | 1x |
| Backbone plasmídeo purificado Baixa fusão diluída 1/2 da etapa 3,5 |
2 | Variável |
| PCR-amplicon digerido e purificado da etapa 2,7 | 8 | Variável |
Tabela 6: Protocolo de ligadura de plasmídeo. A instrução aplica-se para a ligadura da espinha dorsal do ADN do plasmídeo com o ADN digerido do amplicon do PCR descrito na etapa 3,7.
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Discussion
Neste artigo, um método comumente usado é apresentado que permite a análise do BKPyV não-codificação controle-região (NCCR) impulsionado atividade promotor precoce e tardia. A atividade da NCCR pode ser medida simultaneamente e não precisa de Lise das células transfectadas. Além disso, um número relativamente grande de pilhas pode ser analisado e o co-transfection de marcadores adicionais para a normalização dos valores da fluorescência não é necessário.
Uma parte crítica deste método é que o NCCR clonado deve conter exatamente as mesmas seqüências que identificadas pelo seqüenciamento do amplicon, que corresponde às variações da maioria atuais no plasma paciente. Para conseguir resultados exatos e para minimizar erros PCR-prone recomenda-se altamente usar um polymerase com atividade da leitura da prova. Alternativamente, as sequências podem ser ordenadas por serviços comerciais de síntese genética. As sequências designadas de NCCR podem ser ordenadas incluindo sites de restrição AgeI e SpeI para clonagem direta. Neste caso, digerir o plasmídeo paralelo ao plasmídeo da espinha dorsal e substituir o inserto espaçador com o fragmento NCCR correspondente da construção sintetizada. O ADN pode alternativamente ser isolado das amostras de urina. No entanto, uma vez que o BKPyV também é secretado na urina por indivíduos imunocompetentes e não necessariamente refletir a replicação ativa, a relevância clínica é limitada. Idealmente, o DNA também pode ser isolado de biópsias renais nas quais previamente a PVAN poderia ser detectada histologicamente (comparar com Korth et al., 201919).
Medindo a intensidade média da fluorescência de pilhas fluorescentes verdes e vermelhas, este método permite quantificar a fluorescência/atividade derivado NCCR sem o viés da eficiência do transfection e dos efeitos antiproliferativos dos agentes testados (por exemplo, mTOR duplo inibidores INK128 ou PP242)5.
Outra aplicação do sistema de repórter é a possibilidade de analisar as conseqüências das inserções, deleções ou duplicações no NCCR encontrados em isolados clínicos sobre a atividade precoce e tardia do promotor. Em estudos prévios, os agentes imunossupressores têm sido estudados para modular a atividade da NCCR; no entanto, não foram encontradas mutações ou rearranjos de NCCR que afetem a suscetibilidade. No entanto, as mutações podem afetar a resposta de novas substâncias que podem ser aprovadas em um futuro próximo.
Isto pôde ser relevante desde que no contraste às regiões codificando o grande antígeno de T ou a proteína do capsídeo VP1, o nccr como o nome implica representa uma região não codificante e assim não fundamentam a pressão seletiva a nível do aminoácido.
Neste protocolo, a seleção de clones positivos contendo o NCCR é verificada pela digestão de AgeI e SpeI. Entretanto, um PCR da colônia pôde representar uma aproximação alternativa para rapidamente tela para inserções de NCCR diretamente do E. coli chapeado em placas do ágar. Para essa abordagem, use o par de primers BKV-CR-2-FW-AgeI e EGFP-N (tabela 1). Após o transfection, as pilhas são verific para a fluorescência vermelha e verde usando a microscopia de fluorescência (Figura 4). Alternativamente, as células podem ser fixadas com 3% de PFA por 20 min a 22 ° c. Neste caso, lave com PBS, adicione 0,2% de detergente não iônico em PBS e incubar por 10 min. as células fixas podem então ser manchadas com DAPI em PBS (1 μg/mL) por 10 min a 22 ° c e submetidas à análise de microscopia de fluorescência e visualizadas com luz UV (340-380 Nm).
Desde que ambos os fluoróforos abrigam os mesmos sinais da poliadenilação, um efeito da eficiência do poliadenilação pode ser governado para fora. No entanto, em comparação com o eGFP, tdTomato é uma proteína dimérica que deve ser correspondentemente transcrita em um mRNA mais longo (seqüência de codificação: 745 versus 1431 BP, respectivamente). No entanto, uma vez que a atividade dos promotores das células tratadas com substâncias interferentes são sempre comparadas em relação às células não tratadas (DMSO), essa diferença desempenha pouco papel. Devido à presença da origem da replicação, o transfection do plasmídeo do repórter nas pilhas que expressam estàvel o antígeno grande de SV40PyV T permite a transferência dos plasmídeos às pilhas da filha. Demonstrou-se que o antígeno T de grande SV40 derivado pode transacionar SV40 e BKPyV NCCR e replicação viral do DNA20. No entanto, uma vez que um grande antígeno T também está envolvido na transição do início para a fase tardia da infecção, uma situação artificial é dada. Usando este ensaio, deve-se considerar que a maioria de etapa limitando da replicação é a expressão adiantada que conduz à expressão do grande antígeno de T. A fim mapear o ciclo completo da replicação os mRNAs adiantados e atrasados devem ser medidos em pilhas contaminadas por qRT-PCR como descrito em outra parte5,12.
Um método comparável já foi usado por grupos suíços e alemães para analisar as atividades arquetípica e reorganizada do promotor de bkpyv nccr, embora com sistemas vetoriais clonados independentemente5,9. Gosert e os colegas de Basileia usaram um método similar para determinar a atividade do promotor de nccr de estirpes de bkpyv e de jcpyv9,10,11. Ambos os métodos utilizaram o eGFP para fluorescência verde; Entretanto, o grupo de Basileia usou o RFP quando no protocolo atual tdTomato foi usado para a fluorescência vermelha. A vantagem de tdTomato sobre RFP é a fotoestabilidade muito maior; no entanto, a proteína dimérica é codificada por uma seqüência que é duas vezes mais do que RFP21. Além disso, a meia-vida das proteínas pode ser diferente, resultando em uma concentração desigual 72 h pós-transfecção. No entanto, esta questão só pode ser relevante quando se compara directamente ambas as intensidades de fluorescência. Gosert et al. usaram BamHI e NotI como locais de restrição enquanto no protocolo atual AgeI e SpeI estão flanqueando a sequência de NCCR. Usando ambos os métodos, a referência Dunlop cepa16 rendeu padrões de fluorescência comparáveis com forte precoce,mas fraco atividade promotor tardio9,10. Em outro acordo, os rearranjos de nccr com inserções na região P resultaram em um aumento significativo na atividade precoce e tardia do promotor quando comparados com o WT-nccr5,9.
Embora tenha sido demonstrado que o SV40 derivado grande antígeno T pode transacionar SV40 e BKPyV derivado NCCRs20, pode ser interessante usar células humanas que estavelmente expressar o antígeno t grande do bkpyv e não o protótipo de vírus SV40 em estudos futuros . No entanto, neste caso, a linha celular tem que ser fácil de transfecção (por exemplo, HEK293).
Como os promotores NCCR de poliomavírus são muito semelhantes, este método também pode ser usado (com pequena adaptação nas sequências de primer) para investigar a atividade do promotor e a influência de potentes agentes antivirais na atividade de JC-Polyomavirus (JCPyV) regiões de controle de codificação não derivadas11. Desde que JCPyV é o agente causal da leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), uma doença rara do sistema nervoso central que possa raramente ocorrer nos pacientes com as imunodeficiências que resultam na neuropatologia severa, há igualmente uma necessidade urgente de encontrar substâncias antivirais de ação direta para tratar pacientes imunológicos comprometidos. Curiosamente, os rearranjos também são encontrados no JC NCCRs11. Desde que JCPyV pronunciou o neurotropismo e assim grandes quantidades de vírus são encontrados no licor, a aquisição da amostra tem que ser ajustada ao ADN licor-derivado. No entanto, as etapas subsequentes podem ser facilmente adaptadas.
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Disclosures
Johannes Korth recebeu subsídios para a taxa do orador e despesas de viagem de Astellas e Novartis. Marek Widera recebeu honorários de consultoria da Novartis. Oliver Witzke recebeu subsídios para estudos clínicos, taxa do orador, honorários e despesas de viagem de Amgen, Alexion, Astellas, Basilea, Biotest, Bristol-Myers-Squibb, Correvio, Chiesi, Gilead, Hexal, Janssen, Dr. F. Köhler Chemie, MSD, Novartis, Roche, Pfizer, Sanofi e TEVA.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Barbara Bleekmann pela excelente assistência técnica. Estes estudos foram apoiados pelo IFORES-programa da Universidade de Duisburg-Essen Medical School e do RIMUR-programa da Universidade Alliance Ruhr e Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). Os autores agradecem a Jürgen-Manchot-Stiftung pela bolsa de doutorado de Helene Sertznig e apoio constante. A coleta e uso do material do paciente foi aprovada pelo Comitê de ética da faculdade de medicina da Universidade Duisburg-Essen (14-6028-BO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
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