Summary
I detta manuskript, ett protokoll presenteras för att utföra FACS-baserade mätningar av BK-polyomavirus transkriptionell aktivitet genom att använda HEK293T celler transfekterade med en dubbelriktad reporter plasmid uttrycker tdtomato och egfp. Denna metod gör det möjligt att kvantitativt bestämma påverkan av nya föreningar på viral transkription.
Abstract
Polyomaviruser, som BK-polyomavirus (BKPyV), kan orsaka allvarliga patologier hos patienter med nedsatt immunförsvar. Eftersom mycket effektiva antivirala läkemedel för närvarande inte är tillgängliga krävs dock metoder för att mäta effekten av potentiella antivirala medel. Här har en dubbel fluorescensreporter som gör det möjligt att analysera den icke-kodande kontroll region (NCCR) som är driven i början och slutet av promotorn för att kvantifiera effekten av potentiella antivirala läkemedel på virus genuttryck via tdTomato och eGFP Uttryck. Genom kloning av BKPyV-NCCR-amplikoner som i detta protokoll exemplärt har erhållits från det blodbaserade DNA hos immunsupprimerade njurtransplanterade patienter kan effekten av NCCR-omordningar på viral genuttryck bestämmas. Efter kloning av patienten härledda amplicons, HEK293T celler var transfekterade med rapportör-plasmider, och behandlas med potentiella antivirala medel. Därefter utsattes celler för FACS-analys för mätning av medelvärdet för fluorescensintensiteter 72 h efter transfektion. För att också testa analysen av läkemedel som har en potentiell cell cykelhämmande effekt, endast transfekterade och därmed fluorescerande celler används. Eftersom denna analys utförs i stora T antigen uttrycker celler, effekterna av tidigt och sent uttryck kan analyseras på ett ömsesidigt oberoende sätt.
Introduction
Polyomaviruses representerar en självständig familj av små dubbelsträngade DNA (dsDNA) virus med Simian virus 40 (SV40) som en prototyp art. Den primära infektionen uppstår främst under barndomen, som vanligtvis fortsätter utan sjukdomssymtom och oftast orsaka latent infektioner i immunförsvaret kompetenta värdar. BK-polyomavirus (BKPyV) består i huvudsak av njurtubuli celler utan att orsaka nefropatier, men i händelse av försämring av immun-kompetensen efter njurtransplantation kan viruset återaktivera och orsaka allvarliga skador och försämrad transplantat funktion när man når en hög viremia (1 x 104 bkpyv DNA kopior/ml)1,2. Hos cirka 10% av mottagarna av njurtransplantat, reaktivering av BK-polyomavirus (bkpyv) resulterar i en polyomavirus associerad nefropati (pyvan), som var upp till 80% förknippad med en hög risk för renal allograffel3,4 . Eftersom inga godkända antivirala medel finns tillgängliga, är nuvarande behandling baserad på reduktion av immunsuppression. Intressant, mTOR-hämmare verkar ha en antiviral effekt; Således, byta immunsuppressiv behandling till mTOR-baserad immunsuppression kan utgöra en alternativ metod för att förhindra progression av bkpyv viremia5,6,7. Men den mTOR-baserade antivirala mekanismen är för närvarande fortfarande ofullständigt förstådd. Därför krävs metoder för att mäta effekten av potentiella antivirala medel i kliniskt relevanta koncentrationer.
Den cirkulära genomet i BKPyV består av cirka 5 KB härbärga en icke-kodning kontroll region (NCCR) som fungerar som ett ursprung för replikering och samtidigt en dubbelriktad promotor kör uttrycket av tidiga och sena fas mRNA utskrifter. Eftersom spontant förekommande nccr-omordningar, borttagningar och dubbleringar påträffas i patogena bkpyv8 och ackumuleras signifikant hos patienter som lider av PVAN-5,9, en jämförelse av arketetypikal (WT) och omarrangerade (RR) NCCR-aktiviteter är till hjälp för att karakterisera viral replikativ kondition.
Som sammanfattas i figur 1, beskriver detta protokoll en metod som ofta används för att mäta BKPyV nccr-transkriptionsaktivitet genom att kvantifiera fluorescensen hos två fluorofomedel tdTomato och egfp som uttrycks från en reporter plasmid5, 9,10,11. Förfarandet utförs i närvaro av SV40 stora T-antigen (lTAg), som gör det möjligt att analysera effekterna av potentiella antivirala medel på tidig och sen NCCR-aktivitet separat5. Denna analys analyserar ytterligare effekten av omordningar på nccr-aktiviteten och jämförelse med WT-nccrs5,9. Reportern plasmid hamnar den SV40 sena polyadenylering signalen nedströms varje fluorophore öppen läsbild för att säkerställa jämförbar och effektiv bearbetning av båda avskrifter för tdTomato och eGFP, respektive. Jämfört med QRT-PCR-baserade metoder5,12, detta FACS-baserade tillvägagångssätt representerar en låg kostnad och hög genomströmning kompatibelt alternativ eftersom inga komplicerade utvinning protokoll för infekterade cellkulturen och inga dyra antikroppar mot immunfluorescens färgning behövs. Dessutom, eftersom en definierad mängd fluorescerande celler analyseras via flödescytometri, är analysen av cell cykelhämmande medel också möjligt på ett kvantitativt sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer de riktlinjer för mänsklig forskning som godkänts av etikkommittén för medicinska fakulteten vid universitetet i Duisburg-Essen (14-6028-BO).
1. insamling av blod-eller urinprov och isolering av polyomavirus DNA
- Samla in minst 3 mL blod i EDTA-rör eller urin i inhämtande rör.
- Centrifugera provet på 2 500 x g i 15 min. Vid behov Pipettera plasma i ett nytt rör och förvara plasmaproverna vid 4 ° c i flera dagar eller frys vid-20 ° c för längre förvaring.
- Bered 40 μL av proteinas K i ett 1,5 mL microcentrifugerör och tillsätt 400 μL plasma genom pipettering.
- Lyse provet genom att tillsätta 400 μL lyseringsbuffert, Vortex för 15 s, och inkubera i 10 min vid 56 ° c.
- Isolera DNA med hjälp av ett kit för DNA-blodextraktion enligt tillverkarens anvisningar. Kort, tillsätt alkohol och ladda celllysat på en snurrande kolonn som innehåller en DNA-bindande kiseldioxidbaserat membran. Tvätta kolonnerna flera gånger för att ge rent DNA.
- Eluera det givna DNA i 30-50 μL TE-buffert.
2. förstärkning av den icke-kodande kontroll regionen (NCCR)
- Utför följande procedur i fysiskt avskilda rum. Använd ett isolerat rum för att förbereda reagenser och fördela blandningen till PCR-rören.
- Förbered Mastermixen för pre-PCR med primer pair A (tabell 1) i en total volym på 50 μl och Använd det tidigare isolerade DNA från steg 1,6. Pipettering systemet för beredning av Master Mix för pre och kapslade PCR skrivs ut i tabell 2.
- Fördela 45 μL av Mastermixen i PCR-rören.
- Tillsätt 5 μL av det isolerade DNA-värdet i PCR-rören.
Obs: Använd ett annat rum än det för förberedelse av Mastermix för att undvika kontaminering. - Kör PCR med reaktions förhållandena enligt illustrationen i tabell 3. Upprepad denaturering, glödgning och förlängning i 35 cykler.
- För den kapslade amplifieringsanvändningen primer par B hyser restriktionssajter för agei och SpeI (tabell 1).
- Kör den kapslade PCR med reaktions förhållanden som beskrivs i steg 2,2 till 2,5 med 5 μL av pre-PCR.
- Blanda 10 μL av PCR-produkten med 2 μL 6x gel laddnings färg. Ladda 10 μL av blandningen på en 1,5% aguppstod gel, och kör gelen i 30 min vid 60 mA.
- Visualisera gelen med ett lämpligt UV-dokumentationssystem.
Anmärkning: storleken på amplikon förväntas vara mellan 300-500 BP beroende på om omordningar (borttagningar, infogningar eller dubbleringar) inträffade (figur 2C). - Rena PCR-amplikonerna med hjälp av ett PCR-renings kit enligt tillverkarens anvisningar. Eluera PCR-amplikonerna i 30 μl elueringbuffert.
- Skicka amplikonerna för Sanger sekvensering med primer pair B.
3. kloning av nccr i Dual fluorescens reporter
- Smälta de renade amplikonerna (steg 2,10) med agei och SpeI för 2 h vid 37 ° c enligt beskrivningen i tabell 4.
- Upprepa steg 2,10 och rena de smälta amplicons.
- Parallellt, också smälta plasmid ryggraden (1,5 μg) med AgeI och SpeI för 2 h vid 37 ° c som beskrivs i tabell 5. Det här steget behöver bara utföras en gång. För efterföljande reaktioner, frys matsmältningen vid-20 ° c.
- Analysera smält plasmid ryggraden på en 0,8% låg smälta aguppstod gel.
Obs: kör inte gelen med en ström som är högre än 40 mA. Den förväntade insatsen av spacer regionen ursprungligen härrör från plasmid pEX-K4 2-LTR CD313 är 128 BP (figur 2C). - Visualisera DNA-fragment med hjälp av långvågig UV-ljus (320 nm) och klipp ut stamnäts bandet med en ren skalpell. Överför det låga smält gel-fragmentet till ett nytt 1,5 mL microcentrifugerör. Undvik långa UV-exponeringstider för att förhindra DNA-skador.
Obs: eftersom låg smält-Agreste används, är det inte nödvändigt att rena DNA innan ligering. - Värm ryggraden som innehåller den låg smälta aguppstod pjäs för 10 min vid 65 ° c för att smälta gel bit och blanda varje 2 min med mild vortexing. Den smälta gelen kan användas direkt för ligering.
- Ligera ryggraden och den smälta amplikon med T4 DNA Ligase över natten vid 16 ° c med hjälp av systemet som visas i tabell 6.
- Utför omvandling i E. coli med hjälp av värme chock metoden, tallrik bakterier på lb-amp plattor, och kultur vid 37 ° c över natten.
- På nästa dag, Välj tre positiva kloner och Förbered natten E. coli kulturer (5 ml lb-amp) och kultur vid 37 ° c.
- Isolera plasmid-DNA med hjälp av standardprotokoll som beskrivs på andra ställen14, utföra agei och SpeI matsmältningen för att kontrollera om positiva kloner och visualisera skära ut fragment på en 1% aguppstod gel. Distans bandet (128 BP) kommer att ersättas av den större NCCR-sekvensen (300-500 BP, se ovan).
- Skicka plasmid för Sanger-sekvensering med primer EGFP-N eller primer pair B (tabell 1).
- Eftersom mutationer kan spontant uppstå, jämföra sekvensering resultat med sekvensering resultat erhålls med amplicon. Använd endast klonerna som innehåller identiska sekvenser jämfört med amplicon.
- Använd en molekylär Workbench programvara (t. ex., freeware GENtle 1.9.4 eller andra sekvens redigeringsprogram) för att justera och redigera de erhållna sekvenser (figur 3).
- Starta GENtle 1.9.4 och importera DNA-sekvenser genom att klicka på knappen Importera (grön NEDPIL).
- Nästa klicka på verktyget och välj justering från menyn (Använd Ctrl + G som en genväg) och välj DNA-sekvenser för anpassning.
- Lägg till en sekvens till justeringen genom att klicka på Lägg till eller ta bort en sekvens genom att klicka på ta bort. Inkludera en arketetypical NCCR konsensus sekvens som JN19243815, Använd inte nccr-sekvensen från den vanligen använda Dunlop-stam16, eftersom det hamnar rearrangemang och dupliseringar andra än Arketetypical bkpyv Stammar.
Anmärkning: NCCR innehåller redan den translationella start kodon (figur 3). - Välj en metod för justeringen genom att klicka på algoritm i verktygsfältet och välj Clustal W. Ställ in justerings parametrarna så att de matchar 2; gap förlängning straff-1, Gap straff-2 och klicka på OK för att köra justeringen.
4. övergående transfektion av HEK293T celler med rapportören plasmid och behandling med potentiella antivirala medel
- För att förbereda tillräckliga mängder av plasmid DNA för efterföljande transfektion experiment förbereda en 150 mL över natten kultur. Isolera plasmid-DNA med hjälp av en Plasmid-isolerings sats. Alternativt kan andra plasmid renings satser användas.
- Utsäde 1 x 105 HEK293T celler i DMEM innehållande 10% FCS, penicillin och streptomycin (1x) per brunn av en 12-brunn tallrik 24 h före transfektion och inkubera över natten vid 37 ° c och 5% Co2 för att bibehålla aktiv proliferation under transfektion.
Obs: cellerna ska vara ungefär 80% konfluenta vid transfektion. - Placera 250 μL reducerat serum medium i ett sterilt rör och tillsätt 1 μg av varje rapportör-plasmid-DNA och blanda försiktigt genom pipettering.
- Tillsätt 3 μL av transfektionsreagenset till DNA-blandningen, blanda försiktigt genom pipettering och inkubera i 15 min. Förvärm transfektionsreagenset till omgivningstemperaturen 22 ° c och skaka försiktigt före användning.
- Tillsätt blandningen Drop-Wise till brunnarna och försiktigt fördela till brunnen.
- Efter 4 h, ersätta supernatanten med färskt medium som innehåller test agenter och lösningsmedels kontroll. Inkubera vid 37 ° c tills analysen. I det här exemplet användes mTOR-hämmarna INK128 (100 ng/mL) och rapamycin (100 ng/mL).
5. fluorescens mikroskopi och flödescytometri
- Kontrollera cellerna för den röda och gröna fluorescensen under fluorescensmikroskopet (figur 4).
Anmärkning: röd och grön fluorescens motsvarar det tidiga respektive sena BKPyV-genuttrycket. - Efter 72 h post transfektion, aspirera på supernatanten och tvätta cellerna två gånger med 1 mL kallt PBS.
- Tillsätt försiktigt 500 μL trypsin och vrid plattan något för att undvika för tidig avlossning av cellerna. Detta steg är viktigt att undvika cell doublets.
- Efter addition, ta bort trypsin direkt med samma pipett spets.
- Inkubera cellerna i minst 5 minuter vid 37 ° c.
- Omsuspendera trypsinized celler med 1 mL PBS innehållande 3% FCS och överför suspensionen i förmärkta FACS-rör.
- Tillsätt DAPI (1 μg/mL) före FACS-analysen.
- Analysera cellerna med hjälp av en flödescytometer. För varje prov, mät minst 10 000 levande celler, som är negativa för DAPI-färgning.
6. analys av data
- Importera data till programmet Flow flödescytometrianalys-analys och Lägg till exempel genom att Klicka och dra till arbetsytan.
- Dubbelklicka på den importerade filen och skapa en graf tomt. Välj FSC-a jämfört med SSC-A genom att klicka på x-och y-axeln. Grinden huvudsakliga cellpopulationen genom att klicka på polygon i verktygsfältet och Rama in cellpopulationen (figur 5). Namnge den valda cellpopulationen efter behov (till exempel "enstaka celler"). "Single cells" visas som en ny arbetsyta.
- Fortsätt med att gating "Single cells" för DAPI Negative (dvs "levande celler"). För att identifiera levande celler jämför cellpopulationen med och utan DAPI-färgning. I båda områdena väljer FSC-A kontra Pacific-Blue-A.
- Klicka på rektangeln och välj DAPI negativ cellpopulation, namnge den valda cellpopulationen "levande celler", och skapa en ny dot-Plot visar FITC (eGFP) kontra PE (tdTomato) som beskrivits tidigare.
- Lägg till kvadranter i "levande celler" genom att välja Quad från verktygsfältet. Grinden befolkningen genom att dra i mitten av kvadranten till kanten av varje population. Kvadranterna representerar 1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM +, 3) eGFP + tdTOM-, 4) eGFP + tdTOM +.
Anmärkning: på grund av spektralöverlagringen av emissions spektra mellan FITC och PE är initial kompensation nödvändig för att skilja mellan röda och gröna signaler och för att uppnå korrekta resultat. - Bestäm medelvärdet för fluorescensintensitet (MFI) genom att högerklicka på kvadranten och välja Lägg till statistik. Välj medelvärde och klicka på OK. Den genomsnittliga MFI visas nu under befolkningen i avsnittet "statistik". Kvadranter 2 och 4 motsvarar tidigt uttryck, medan kvadranter 3 och 4 representerar sena uttryck.
- Lägg till ytterligare replikat på samma sätt för statistisk kraft.
- För data tolkning Plot MFI värden tidigt och sent i en bar Plot:
- För att jämföra NCCR-aktiviteter som erhållits från olika givare eller virusstammar, Lägg till en arketetypical-kontroll eller Dunlop-stammen16 och Ställ in dess relativa mfi till 100% och beräkna de relativa monetära värdena. Upprepa med varje replikat och bestäm medelvärde och standardavvikelse.
- För att utvärdera en effekt av potentiella föreningar på transkriptionell aktivitet, Ställ in lösningsmedels kontrollen till 100% och plotta MFI för de behandlade cellerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta representativa experiment mättes BK-polyomavirus icke-kodande kontroll region driven transkriptionell aktivitet via flödescytometri. Dessutom testades en mTOR-hämmare, som kan användas för att behandla patienter efter reaktivering av BKPyV, för sin hämning av det virala tidiga genuttrycket. För detta ändamål användes en dual Fluorescence-reporter-analys som publicerades tidigare5. Det övergripande arbetsflödessystemet i den experimentella installationen illustreras i Figur 1. Först samlades blodprov från immunsupprimerade njurtransplanterade patienter enligt de riktlinjer för mänsklig forskning som godkänts av den institutionella etikkommittén. Blodet samlades in i EDTA-innehållande rör och faserna separerades genom centrifugering. Därefter användes 400 μL plasma för isolering av polyomavirus DNA. Den icke-kodnings kontroll region (NCCR) förstärkallades med hjälp av ett kapslade-PCR-protokoll som illustreras i figur 2A med hjälp av yttre primer paret BKV-CR-1fw och BKV-CR-1rv, förutom det inre PRIMERPARET BKV-CR-2Fw-agei (primer agei) och BKV-CR-2Rv-SpeI ( Primer SpeI)17, där den sistnämnda hamnar begränsnings platserna för agei och SpeI. Amplikon-verifieringen utfördes via agaros gel-elektrofores som visas i figur 2b. Medan amplikonerna härrör från arketetypical nccr sekvenser (WT) hade en homogen storleksfördelning i gelen, de som härrör från omarrangerade nccrs med infogningar (RRins) och borttagningar (RRdel) skilde sig i deras storlek (ca. 300-500 BP). Särskilt på grund av omordningar, den Dunlop NCCR referens sekvens16 (Dun), som ingick som en kontroll, var större än den nccr erhållits från arketetypical virus. Eftersom amplikonerna motsvarade de förväntade storlekarna, de renade PCR-produkterna skickades för Sanger sekvensering för senare jämförelse med de sekvenser klonas in i reportern plasmid för vidare analys.
För kloning av amplicons, matsmältningen utfördes med hjälp av de två restriktionsenzymer AgeI och SpeI. Efter kloning i Dual fluorescens-reportern, som utfördes med hjälp av standard klonings förfarandet, kontrollerades valet av positiva kloner som innehöll nccr av agei och SpeI-nedbrytning (figur 2C). Här ersattes den lilla distansen regionen (NC, 128 BP) med de större NCCR-fragmenten (ca. 300-500 BP) som indikerar positiva kloner. Plasmid DNA isolerat från kontrollerade kloner skickades för Sanger sekvensering och jämfört med de sekvenser som erhållits från amplikon sekvensering (visas inte). Endast de kloner som matchar amplikon sekvensen valdes för vidare bearbetning. Som avbildas i figur 3, sekvensering resultaten jämfördes med en arketetypical nccr sekvens (JN192438). I det här exemplet upptäcktes en borttagning i P-blocket och en ersättning i O-block.
För att därefter testa den transkriptionella aktiviteten hos de klonade nccr-sekvenserna i cellkulturen, var HEK293T celler transitivt transfekterade med respektive rapportör konstruktioner (figur 4a). Som visualiserats i figur 4bövervakades transfektionseffektiviteten och nccr-aktiviteten via fluorescens-mikroskopi. Röd och grön fluorescens motsvarade tidiga och sena BKPyV genuttryck, respektive5. Cellerna uttryckte både fluoroforer som indikerar effektiv tidig och sen promotor aktivitet. Som illustreras av de två exemplen, den första NCCR (NCCR1) visade ett starkt sent genuttryck, medan det andra exemplet (NCCR2) hade en relativt stark tidig men måttlig sena genuttryck (figur 4b). Proverna har därför förberetts för flödescytometrimätningen. Som beskrivs i protokoll avsnitt 6, DAPI negativa celler var gated (figur 5a, nedre panelen) och en punkt tomt skapades visar egfp kontra tdTomato. Prover som var negativa (Figur 5b) samt de positiva för tdTomato (figur5c) eller Egfp (figur 5D) ingick endast i analysen. Anmärkning, inledande kompensation utfördes, vilket är viktigt att skilja röda och gröna signaler och för att uppnå korrekta resultat18. Medelvärdet för fluorescensintensitet härrör från varje test klon. Här motsvarade tdTomato positiva celler till tidigt uttryck medan eGFP positiva celler representerade sena uttryck. I detta exempel behandlingen med den dubbla mTOR-hämmaren INK128 signifikant reducerad tdTomato MFI (figur 5E-F), vilket innebär att tidigt uttryck hämmas.
Figur 1 : Arbetsflödes schema för den experimentella installationen. 1) insamling av blod (alternativt urin) prover, 2) isolering av polyomavirus DNA 3) förstärkning av den icke-kodande kontroll regionen (nccr) med hjälp av ett kapslat-PCR-protokoll, 4) aguppa gel elektrofores och amplikon verifiering, 5) Sanger sekvensering av PCR-amplicon, 6) kloning av nccr i Dual fluorescens reporter med agei och SpeI, 7) val av positiva kloner, 8) Sanger sekvensering av plasmid DNA, 9) Övergående transfektion av HEK293T-celler med reportern plasmid och tillsats av föreningar som ska testas, 10) fluorescensmikroskopi för att verifiera effektiv transfektion, 11) flödescytometri, 12) gating och analys av eGFP tdTomato uttryck, 13) data tolkning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : KAPSLADE PCR och representativ analys av patientens härledda NCCR-amplicons. A) DNA som härrör från immunsupprimerade njurtransplanterade patienter utsattes för SEMIKAPSLAD PCR-förstärkning med hjälp av oligonukleotidprimrar kopplade till restriktionssajter agei och SpeI. Primer namn och längd (bas par) av arketyp-O, P, Q, R, och S-block från BKPyV stam JN192438 indikeras inom parentes. B) amplicons analyserades genom elektrofores i 1,5% aguppkom gel och visualiserades med DNA-färgning. M1 = 100 BP stege, WT = vildtyp (arketyp), RR = omordnad, ins = infogningar, del = BORTTAGNINGAR, Dun = Dunlop stam. C) plasmid matsmältning med agei och SpeI. Smält fragment analyserades genom elektrofores i 1,5% aguppkom gel och visualiserades med DNA-färgning. M1 = 100 BP stege, m2 = 2-log stege. NC = negativ kontroll (spacer). + = positiv klon. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Kloning och validering av nccr i Dual fluorescens reporter. Representativa resultat av plasmid-sekvensering. Amplicons renades med hjälp av en PCR-rening kit och utsattes för Sanger sekvensering. Respektive sekvenser var justerade till NCCR sekvens härrör från arketetypical BKPyV stam JN192438. Borttagningar och ersättningar är markerade med rött. Den AgeI och SpeI restriktioner platser, translationella start av eGFP öppen läsbild (tryckt i fetstil) samt NCCR block O-S indikeras. Respektive block och begränsnings platser markeras i färg. Längden på varje NCCR-block i bas paren skrivs ut inom parentes. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativ fluorescens mikroskopi analys av tidig och sen NCCR promotor aktivitet. A) gen karta över den dubbla fluorescensreportern under kontroll av den dubbelriktade promotorn. Som beskrivits tidigare5 plasmid PTA-tdTOM-nccr-egfp (6 009 BP) hamnar den SV40 sena polyadenylering signalen nedströms varje Expression kassett för att säkerställa jämförbar och effektiv behandling av båda avskrifter för tdTomato (tidig uttryck) respektive eGFP (sen uttryck). NCCR flankeras av AgeI och SpeI. Vektorn innehåller en ampicillin-resistenskassett för val under klonings proceduren. B) HEK293T celler transfekterade med Dual-Fluorescence reporter konstruerar var och en under kontroll av patientens härledda nccr sekvenser (NCCR1-2). Celler utsattes för brightfield och fluorescensmikroskopi analys 72 h post transfektion. Filtrera inställningar av mikroskopet användes i efter magnetiseringen spänner: gräsplan för tdTomato (515-560 nm) och blått för eGFP (450-490 nm). Skalstapeln (200 μm) indikeras i det nedre högra av varje fotografi. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Representativ FACS-analys. Visas är den enkla gating strategi som krävs för denna metod. Tvåparameterdensitet eller punktdiagram används. A) första, FSC är plottas mot Pacific Blue, medan endast DAPI negativa (dvs., levande celler) bearbetas vidare. B-F) FITC (eGFP) kontra PE (tdTomato) plottas. C-D) Tillsätt enbart gröna och röda fluorescerande celler för att justera kompensationen på flödescytometern. E-F) I detta exempel INK128 mTOR-hämmare och avsevärt minskar tdTomato MFI, vilket motsvarar en minskning av BKPyV tidiga genuttryck. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn på primer | Sekvens (5 ' → 3 ') |
| BK-CR-fwd1 | CCCAGGCAGCTCTTTCAAGGC |
| BK-CR-REV1 | CCTCTAACAAAATTCCAGCAAAAGC |
| BKV-CR-2-FW-AgeI | AAAAAAAccggtttttgcaaaaattgcaaaagaatagg |
| BKV-CR-2-RV-SpeI | TTTTTTActagtctggcgcagaaccatggcctt |
| EGFP-N | CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG |
Tabell 1: Oligonukleotides som används i detta protokoll. De understrukna grunderna indikerar restriktionsenzymplatserna för AgeI respektive SpeI.
| Komponent | Volym/reaktion (μl) | slutliga koncentrationen |
| RNase-fritt vatten | 32,8 μL | - |
| 10X PCR-buffert | 5 μL | 1x |
| dNTPs (10 mM vardera) | 1 μL | 0,2 mM för varje dNTP |
| FWD-primer (10 μM) | 3 μL | 0,3 μM |
| Rev-primer (10 μM) | 3 μL | 0,3 μM |
| Taq polymeras | 0,2 μL | 2 enhet/reaktion |
| Mall-DNA | 5 μL | < 0,5 μg/50 μL reaktion |
Tabell 2: Förberedelse protokoll för Master Mix. Instruktionen gäller för både pre-och kapslade PCR-reaktioner enligt beskrivningen i steg 2,2 respektive 2,7.
| Temperatur | Varaktighet | PCR-Step | Cykler |
| 95 ° c | 5 min | Initial denaturering | |
| 95 ° c | 30 SEK | Denaturering | |
| 55 ° c | 34 SEK | Glödgning | x35 |
| 72 ° c | 1 min | Förlängning | |
| 72 ° c | 10 min | Final extension | |
| 4 ° c | ∞ | Kylning |
Tabell 3: PCR-program som används för NCCR-amplifiering. Instruktionen gäller för både pre-och kapslade PCR-reaktioner.
| Reagens | Volym/reaktion (μl) | slutliga koncentrationen |
| DNase-gratis H20 | 6 | till 20 μl |
| 10X buffert | 2 | 1x |
| Ageî gällande | 1 | 10 enheter |
| SpeI | 1 | 10 enheter |
| renad PCR-amplikon | 10 | Variabel |
Tabell 4: Amplicon digestionsprotokoll. Instruktionen gäller för samtidig nedbrytning av amplikon DNA med två restriktionsenzymer som beskrivs i steg 3,1.
| Reagens | Volym/reaktion (μl) | slutliga koncentrationen |
| DNase-gratis H20 | 14,5 | till 20 μl |
| 10X buffert | 2 | 1x |
| Ageî gällande | 1 | 10 enheter |
| SpeI | 1 | 10 enheter |
| Plasmidryggrad (1 μg/μL) | 1,5 | 1,5 μg |
Tabell 5: Plasmid digestionsprotokoll. Instruktionen gäller för samtidig nedbrytning av plasmid DNA-stamnätet med två restriktionsenzymer beskrivna i steg 3,3.
| Reagens | Volym/reaktion (μl) | slutliga koncentrationen |
| DNase-gratis H20 | 7 | till 20 μl |
| T4 DNA Ligase | 1 | 20 |
| 10X T4 DNA Ligase buffert | 2 | 1x |
| Renad plasmid stamnät Låg smälta utspädd 1/2 från steg 3,5 |
2 | Variabel |
| Smält och renad PCR-amplicon från steg 2,7 | 8 | Variabel |
Tabell 6: Plasmid ligering-protokollet. Instruktionen gäller för ligering av plasmid DNA-stamnätet med det smälta PCR-amplikon-DNA som beskrivs i steg 3,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den här artikeln presenteras en vanlig metod som gör det möjligt för analys av BKPyV icke-kodning Control-region (NCCR) driven tidig och sen promotor aktivitet. Nccr-aktiviteten kan mätas samtidigt och behöver inte lys av de transfekterade cellerna. Dessutom kan ett relativt stort antal celler analyseras och co-transfektion av ytterligare markörer för normalisering av fluorescensvärden är inte nödvändigt.
En kritisk del av denna metod är att den klonade nccr bör innehålla exakt samma sekvenser som identifierats av amplikon sekvensering, vilket motsvarar de majoritetsvarianter som finns i patientens plasma. För att uppnå korrekta resultat och för att minimera PCR-benägna fel rekommenderas det starkt att använda en polymeras med korrektur läsnings aktivitet. Alternativt kan sekvenser beställas av kommersiella gen syntes tjänster. De utsedda NCCR-sekvenserna kan beställas, inklusive flutande AgeI-och SpeI-begränsningsplatser för direkt kloning. I detta fall, smälta plasmid parallellt med ryggraden plasmid och ersätta spacer insatsen med motsvarande NCCR fragment från syntetiserade konstruera. DNA kan alternativt isoleras från urinprov. Eftersom BKPyV också utsöndras i urin av immunkompetenta individer och inte nödvändigtvis återspeglar aktiv replikation är den kliniska relevansen begränsad. Helst kan DNA också isoleras från njurbiopsier där tidigare PVAN kunde detekteras histologiskt (jämför med korth et al., 201919).
Genom att mäta medelvärdet för fluorescensintensiteten hos gröna och röda fluorescerande celler, gör denna metod det möjligt att kvantifiera NCCR-derived fluorescens/aktivitet utan bias av transfektion effektivitet och anti-proliferativa effekter av de testade agenterna (t. ex. dubbla mTOR hämmare INK128 eller PP242)5.
En annan tillämpning av reporter systemet är möjligheten att analysera konsekvenserna av infogningar, borttagningar, eller dubbleringar i NCCR finns i kliniska isolat på tidig och sen promotor aktivitet. I tidigare studier, immunsuppressiva medel har studerats för att modulera NCCR aktivitet; emellertid, inga mutationer eller NCCR rearrangemang hittades som påverkar känsligheten. Mutationer kan dock påverka responsen hos nya substanser som kan godkännas inom en snar framtid.
Detta kan vara relevant eftersom i motsats till de kodnings regioner stora T-antigen eller VP1 kapsid protein, den nccr som namnet antyder representerar en icke-kodande region och därmed inte ligger bakom selektiv tryck på aminosyran nivå.
I detta protokoll verifieras valet av positiva kloner som innehåller NCCR av AgeI och SpeI matsmältning. Men en koloni PCR kan representera en alternativ metod för att snabbt skärmen för NCCR infogar direkt från E. coli pläterade på agar plattor. För detta tillvägagångssätt, Använd primer pair BKV-CR-2-FW-AgeI och EGFP-N (tabell 1). Efter transfektion kontrolleras celler för röd och grön fluorescens med fluorescens-mikroskopi (figur 4). Alternativt kan celler fixeras med 3% PFA i 20 min vid 22 ° c. I detta fall, tvätta med PBS, tillsätt 0,2% icke-joniskt rengöringsmedel i PBS och inkubera i 10 min. fasta celler kan sedan färgas med DAPI i PBS (1 μg/mL) i 10 min vid 22 ° c och utsättas för fluorescensmikroskopi analys och visualiseras med UV-ljus (340-380 Nm).
Eftersom både fluorophores Harbor samma polyadenylation signaler, en effekt av polyadenylering effektivitet kan vara ute styrde. Men i jämförelse med egfp, tdtomato är en dimeriskt protein som måste på motsvarande sätt transkriberas till en längre mRNA (kodning sekvens: 745 jämfört med 1431 BP, respektive). Men eftersom aktiviteten hos initiativtagarna från cellerna som behandlas med störande ämnen alltid jämförs i förhållande till obehandlade (DMSO) celler, spelar denna skillnad liten roll. På grund av närvaron av ursprunget av replikering, transfektion av reportern plasmid i celler stabilt uttrycker SV40PyV stora T-antigen tillåter överföring av plasmider till dottercellerna. Det har visats att den SV40 härledda stora T-antigen kan transaktivera SV40 och bkpyv nccr och viral DNA-replikering20. Men eftersom en stor T-antigen också är inblandad i övergången från början till den sena fasen av infektionen, ges en konstgjord situation. Med hjälp av denna analys, måste det anses att den mest replikering begränsande steg är det tidiga uttrycket som leder till uttrycket av stora T-antigen. För att kunna mappa hela Replikeringscykeln bör de tidiga och sena mrnas-värdena mätas i infekterade celler med QRT-PCR enligt beskrivningen på annan plats5,12.
En jämförbar metod har redan använts av schweiziska och tyska grupper för att analysera arketetypical och omarrangerade bkpyv nccr-härledda promotor aktiviteter, om än med självständigt klonade vektorsystem5,9. Gosert och kollegor från Basel använt en liknande metod för att bestämma nccr promotorn aktivitet av bkpyv och jcpyv stammar9,10,11. Båda metoderna används eGFP för grön fluorescens; Baselgruppen använde dock RFP i det nuvarande protokollet tdTomato användes för röd fluorescens. Fördelen med tdTomato över RFP är den mycket högre foto stabiliteten; emellertid, den dimeriskt proteinet kodas av en sekvens som är dubbelt så lång som RFP21. Dessutom kan halveringstiden för proteinerna vara olika, vilket resulterar i ojämlik koncentration 72 h post transfektion. Det här problemet kan dock endast vara relevant när du direkt jämför fluorescensintensiteter. Gosert et al. används BamHI och meddelande som begränsnings platser medan i det nuvarande protokollet AgeI och SpeI är flanera NCCR sekvensen. Med båda metoderna gav referens Dunlop stam16 jämförbara fluorescensmönster med stark tidig men svag sen promotor aktivitet9,10. I ytterligare avtal, nccr-omordningar med införanden i P-regionen resulterade i en betydande ökning av tidig och sen promotor aktivitet jämfört med WT-nccr5,9.
Även om det har visats att den SV40 härledda stora t-antigen kan transaktivera SV40 och bkpyv härledda nccrs20, kan det vara intressant att använda mänskliga celler som stabilt uttrycker den stora t-antigen i bkpyv och inte prototyp viruset SV40 i framtida studier . I detta fall måste dock cell linjen vara lätt att transfect (t. ex. HEK293).
Eftersom NCCR initiativtagarna till polyomaviruses är mycket lika, denna metod kan också användas (med liten anpassning i primer sekvenser) för att undersöka promotorn aktivitet och påverkan av potenta antivirala medel på aktiviteten av JC-polyomavirus (JCPyV) härledda icke-kodnings kontrollområden11. Eftersom JCPyV är smittämnet för den progressiva multifokal leukoencefalopati (PML), en sällsynt sjukdom i centralanervsystemet som sällan kan förekomma hos patienter med immunbrist som leder till svår neuropatologi, finns det också ett trängande behov av att hitta direktverkande antivirala substanser för att behandla immunsupprimerade patienter. Intressant nog finns omordningar också i JC NCCRs11. Eftersom JCPyV har uttalat neurotropism och därmed stora mängder virus finns i sprit, prov förvärvet måste justeras till sprit-härledda DNA. Efterföljande steg kan dock enkelt anpassas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Johannes korth har erhållit bidrag för talarens arvode och resekostnader från ASTELLAS och Novartis. Marek Widera har erhållit konsultarvoden från Novartis. Oliver Witzke har erhållit stipendier för kliniska studier, Speaker ' s Fee, arvoden och resekostnader från Amgen, Alexion, ASTELLAS, Basilea, Biotest, Bristol-Myers-Squibb, correvio, chiesi, Gilead, Hexal, Janssen, Dr. F. Köhler Chemie, MSD, Novartis, Roche, Pfizer, Sanofi och TEVA.
Acknowledgments
Författarna tackar Barbara Bleekmann för utmärkt teknisk hjälp. Dessa studier stöttades av IFORES-programet av universitetar av Duisburg-Essen läkarundersökning skolar och RIMUREN-programet av Universitetaralliansen Ruhr och Mercator forskning centrerar Ruhr (MERCUR). Författarna tackar Jürgen-Manchot-Stiftungen för doktorat gemenskap av Helene Sertznig och konstant service. Insamling och användning av patientmaterial har godkänts av etikkommittén för den medicinska fakulteten vid universitetet Duisburg-Essen (14-6028-BO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
References
- Drachenberg, C. B., et al. Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load. American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).
- Korth, J., et al. Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function. Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).
- Hirsch, H. H., et al. European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation. Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).
- Masutani, K., et al. The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome. American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).
- Korth, J., et al. Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region. Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).
- Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12. Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).
- Sanchez Fructuoso, A. I., et al. Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients. Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).
- Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis. Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).
- Gosert, R., et al. Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology. Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).
- Bethge, T., et al. Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression. Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).
- Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate. Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).
- Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression. American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).
- Widera, M., et al. HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia. Medical Microbiology Immunology. , (2017).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).
- Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland. Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).
- Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals. Virology. 198 (1), 59-70 (1994).
- Teutsch, K., et al. Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy. Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).
- Korth, J., et al. The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation. Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).
- Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens. Virology. 152 (2), 459-465 (1986).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
