Summary
نقدم طريقة مفيدة للتوليف الأنزيمي على نطاق واسع وتنقية enantiomers محددة وregioisomers من ايبوكسيدات حمض الأراشيدونيك (AA)، وحمض الدوكوساهيكسانويك (DHA)، وحمض eicosapentaenoic (EPA) مع استخدام السيتوكروم البكتيرية P450 انزيم (BM3).
Abstract
الأيض epoxidized من مختلف الأحماض الدهنية غير المشبعة (PUFAs)، يطلق عليها الأحماض الدهنية الايبوكسي، لديها مجموعة واسعة من الأدوار في علم وظائف الأعضاء البشرية. يتم إنتاج هذه الأيض الذاتية من قبل فئة P450 السيتوكروم من الإنزيمات. بسبب آثارها البيولوجية المتنوعة والقوية، هناك اهتمام كبير في دراسة هذه الأيض. تحديد الأدوار الفريدة لهذه الأيض في الجسم مهمة صعبة, كما يجب أولاً الحصول على الأحماض الدهنية الايبوكسي بكميات كبيرة وعالية النقاء. الحصول على مركبات من المصادر الطبيعية غالباً ما تكون كثيفة العمالة، وثنائي أكسيد الذوبان (sEH) بسرعة hydrolyze الأيض. من ناحية أخرى، الحصول على هذه الأيض عن طريق التفاعلات الكيميائية غير فعالة للغاية، وذلك بسبب صعوبة الحصول على regioisomers النقي وenantiomers، وانخفاض الغلة، وواسعة النطاق (ومكلفة) تنقية. هنا، نقدم تخليق الأنزيمية كفاءةمن 19 (S)، 20 (R) - و 16 (S)، 17 (R) - الأحماض الايبوكسي (R)-الايبوكسيدوسابنتانويك (EDPs) من إدارة الشؤون الإنسانية عن طريق الايبكسيد مع BM3، وهو إنزيم CYP450 البكتيرية معزولة أصلا من عصية megaterium (التي يتم التعبير عنها بسهولة في القولونية الإشريكية). يتم إجراء التوصيف وتحديد النقاء باستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR)، والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)، والقياس الطيفي الكتلي (MS). يوضح هذا الإجراء فوائد التوليف الأنزيمي للأيضات الايبوكسي PUFA، وينطبق على الايبوكسيال الايبوكسي الأحماض الدهنية الأخرى، بما في ذلك حمض الأراشيدونيك (AA) وحمض eicosapentaenoic (EPA) لإنتاج الايبوكسيكوساتينويك المماثل الأحماض (EETs) وأحماض الايبوكسيكوساتراتينويك (EEQs)، على التوالي.
Introduction
كما نمت الاهتمام في الدور الذي الأحماض الدهنية غير المشبعة (وخاصة أوميغا 3 وأوميغا 6 الأحماض الدهنية غير المشبعة) في البيولوجيا البشرية في السنوات الأخيرة، وقد أحاط الباحثون علما مجموعة واسعة من الفوائد الجذابة التي الأيض بهم المعرض. على وجه الخصوص، الأيض الأحماض الدهنية الايبوكسي التي تنتجها فئة P450 السيتوكروم من الإنزيمات كانت نقطة تركيز كبيرة. على سبيل المثال، تلعب العديد من الايبوكسيات الايبوكسية ، بما في ذلك الأحماض الايبوكسيكوساترينيويك (EETs) ، الأحماض الايبوكسيدوسابنتينويك (EDPs) وأحماض الايبوكسيكوساتراتينويك (EEQs) ، دورا حاسما في تنظيم ضغط الدم والتهاب1،2 , 3 , 4 , 5. ومن المثير للاهتمام، ومن المعروف أن enantiomers محددة وregioisomers من أأ وإيبوكسيدات وكالة حماية البيئة أن لها آثار متفاوتة على مضيق الأوعية6،7. في حين تم توثيق الآثار الفسيولوجية للأنانتيومرات وregioisomers من EETs وEEJs، لا يعرف سوى القليل عن تأثير الأحماض الايبوكسي الايبوكسية المماثلة (EDPs) التي تشكلت من إدارة الشؤون الإنسانية. الاستخدام الواسع النطاق لزيت السمك8، وهو غني في كل من وكالة حماية البيئة وإدارة الشؤون الإنسانية ، كما أثار الاهتمام في EDPs9. ويعتقد أن فوائد هذه المكملات الغذائية جزئيا بسبب نواتج الأيض DHA المصب (16,17-EDP و 19,20-EDP كونها الأكثر وفرة) لأنه في مستويات الجسم الحي من EDPs تنسيق جيد جدا مع كمية من إدارة الشؤون الإنسانية في النظام الغذائي10, 11.
وقد ثبت دراسة آليات وأهداف هذه الأحماض الدهنية الايبوكسي من قبل الميتابولوميك، البيولوجيا الكيميائية، وغيرها من الأساليب تحديا، ويرجع ذلك جزئيا إلى أنها موجودة كخليط من regio- وستيريو الايزومرات، وطريقة للحصول على كميات نقية من مطلوب انانتيومرات وregioisomers. وقد ثبت أن الوسائل التقليدية لتوليف هذه المركبات كيميائيا غير فعالة. استخدام peroxyacids مثل حمض ميتاكلوروبروكسي بنزويك للإبكسيدات له العديد من العيوب، ولا سيما عدم الانتقائية إبكسيدون، مما يتطلب تنقية مكلفة ومضنية من regioisomers الفردية وenantiomers. التوليف الكلي للإدارة ووكالة حماية البيئة المستقلات ممكن, ولكن يعاني أيضا من العيوب التي تجعل من غير العملي لتركيب على نطاق واسع مثل ارتفاع التكاليف وانخفاض الغلة12,13. يمكن تحقيق كفاءة الإنتاج العام مع التوليف الأنزيمي، كما ردود الفعل الأنزيمية هي regio- وstereoselective14. تظهر الدراسات أن الايبكسيد الأنزيمي لAA وEPA (مع BM3) هو على حد سواء regioselective وenantioselective15،16،17،18، ولكن هذا الإجراء لم يتم اختباره مع إدارة الشؤون الإنسانية ، أو على كبير نطاق. وكان الهدف العام من أسلوبنا لتوسيع وتحسين هذا الايبوكسيد chemoenzymatic لإنتاج كميات كبيرة بسرعة من الأحماض الدهنية الايبوكسي النقية كما enantiomers الفردية الخاصة بهم. باستخدام الطريقة المعروضة هنا، والباحثين الوصول إلى استراتيجية بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتركيب EDPs وغيرها من الأيض الايبوكسي بوفا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تحذير: يرجى الرجوع إلى جميع أوراق بيانات سلامة المواد ذات الصلة قبل استخدام المواد الكيميائية المدرجة.
1. التعبير عن البرية من نوع BM3
- التلقيح PBS-BM3 المصابة DH5α E. القولونية (تبرع سخي من الدكتور F. آن ووكر) في 5 مل من مرق LB معقمة مع 0.5 ملغ من الأمبيسلين وأضاف في أنبوب ثقافة 20 مل.
- احتضان ثقافة الخلية في شاكر في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في 200 دورة في الدقيقة. إضافة ثقافة بداية بين عشية وضحاها (5 مل) و 100 ملغ من الأمبليسلين إلى 1 لتر من مرق LB معقمة في قارورة فيرنباخ أو Erlenmeyer. هز عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعة عند 200 دورة في الدقيقة، ثم عند 30 درجة مئوية لمدة 18 ساعة عند 200 دورة في الدقيقة.
- جمع والطرد المركزي للخلية في 4 ° C لمدة 10 دقيقة في 1000 x ز. تخلص من supernatant وتخزين بيليه الخلية في -78 درجة مئوية حتى تنقية الإنزيم.
ملاحظة: يمكن تعقيم الـ supernatant كيميائياً عن طريق المعالجة بمادة التبييض أو تعقيمها باستخدام الأوتوكلاف ثم سكب هاوية.
2. تنقية BM3.
-
خلية الليسة
- قم بذوبان كريات الخلية على الجليد وإعادة تعليقها في 40 مل من الباردة الجليد (4 درجة مئوية) الذوبان العازلة (10 m تريس، 0.01 m فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF;)، 0.01 m EDTA؛ درجة الحموضة 7.8).
تحذير: PMSF سامة عن طريق الاتصال. - بينما على الجليد، سونيكيت الخلايا لمدة 1 دقيقة مع المجانسب بالموجات فوق الصوتية (إخراج السلطة الإعداد 10، واجب 100٪)، تليها كسر 1 دقيقة على الجليد من أجل lyse الخلايا. كرر هذا الإجراء 6 مرات. جهاز طرد مركزي للخلية في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في 11000 x ز إلى الحطام خلية بيليه.
- قم بذوبان كريات الخلية على الجليد وإعادة تعليقها في 40 مل من الباردة الجليد (4 درجة مئوية) الذوبان العازلة (10 m تريس، 0.01 m فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF;)، 0.01 m EDTA؛ درجة الحموضة 7.8).
-
اللوني
- إعداد عمود لوني تبادل أنيون قوي (انظر جدولالمواد؛ القطر: 2.8 سم x 6 سم، حجم العمود: 37 مل) عن طريق غسل مع 5 مجلدات العمود (CV) من العازلة A (10 mM تريس، ودرجة الحموضة 7.8) في 4 درجة مئوية.
- إضافة lysates الخلية إلى عمود مُحَقَدّة ويغسل العمود مع 3 CV من العازلة الباردة A. Elute the BM3 عن طريق غسل العمود مع العازلة الباردة B (10 m Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).
- جمع جزء المحمر البني الإلوين. إذا لم يتم استخدام البروتين على الفور، ومزجه مع حجم متساو من الجلسرين وتجميد فلاش مع النيتروجين السائل. تخزين الحل المجمدة في -78 درجة مئوية.
3. الايبأكسد من إدارة الشؤون الإنسانية من BM3
- إعداد رد الفعل عن طريق إضافة 0.308 ز (0.940 مليمول) من إدارة الشؤون الإنسانية في 18.8 مل من ثنائي ميثيل سولفسيد (DMSO) إلى 2 لتر من التحريك العازلة رد فعل (0.12 M فوسفات البوتاسيوم، 5 mM MgCl2، ودرجة الحموضة 7.4) جنبا إلى جنب مع 20 طن من الإنزيم BM3 ذوبان. يمكن تحديد تركيز الإنزيم بواسطة أول أكسيد الكربون/طريقةالفحص الطيفي 19 .
- بينما الحل هو اثارة، تبدأ رد الفعل بإضافة 1 ما يعادل NADPH (نيكوتيناميد أدينين دينوكليوتيد الفوسفات خفض، ملح رباعي الصوديوم، 0.808 ز، 0.940 مليمول) إذا حل في العازلة رد الفعل. حرك رد الفعل لمدة 30 دقيقة بينما يُسكب الهواء من خلال خليط التفاعل مع منطاد مملوء بالهواء موصول بحقنة وإبرة.
- باستخدام مطياف (انظر جدولالمواد)، تحقق من امتصاص خليط التفاعل في 340 نانومتر لتحديد ما إذا كان قد استنفد NADPH. إذا لم يكن هناك امتصاص المتبقية تشير إلى استهلاك NADPH، رد فعل كامل.
ملاحظة: عادة، رد فعل كاملة بعد 30 دقيقة. - تُقَدّر مزيج التفاعل بإضافة حمض الأكساليك 1 م ببطء، وينخفض، حتى يصل درجة الحموضة للمحلول إلى 4.
4. استخراج EDPs
- استخراج محلول العازلة مروي مع 2 لتر من الأثير ثنائي الإيثيل (لامائية، بيروكسيد خالية) 3 مرات. جمع طبقة الأثير (6 لتر) والجافة مع كبريتات المغنيسيوم اللامائية (MgSO4).
- قم بتصفية MSO4 من المحلول وتركيز طبقة الأثير المجفف على المبخر الدوار لينتج بقايا EDP الخام.
- تنقية بقايا بواسطة الكروماتوغرافيا عمود فلاش (خرطوشة السيليكا 40 غرام كافية). ابدأ في خلات الإيثيل بنسبة 10% (EtOAc) في الهكسان ونزيد من نسبة الإياتوا كست إلى 60% في الهكسان خلال 22 دقيقة.
ملاحظة: يتم الحصول على ثلاث قمم رئيسية وجمعها، وeluting في ترتيب 1. غير رد فعل هيئة الصحة بدبي. 2. خليط من ايزوميرات EDP؛ و3. ثنائي الايبوكسيد (المنتجات العادية فوق الأكسدة (انظر الشكل1)). - الجمع بين الكسور وتركيزها على المبخر الدوار. من هذا المثال، 0.074 غرام، (24%) من DHA غير مردّة، 0.151 غرام (47%) من الأيزومرات EDP، و 0.076 غرام، (22٪ من ثنائي ايبوكسيد تم الحصول عليها.
5. استراتيشن من EDPs،فصل 16 (S)، 17 (R) - و 19 (S)، 20 (R)-EDP، وتصبب من استرات
تحذير: ثلاثي ميثيل سيلديازوميثان (TMS-ديازوميثان) سام جداً عن طريق كل من الاتصال والاستنشاق. استخدم فقط في غطاء الدخان مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
- تمييع الايبوكسيد (0.151 غرام، 0.435 مليمول) في قارورة مستديرة القاع أو قارورة صغيرة مع 2 مل من الميثانول اللامائي (MeOH) و 3 مل من التولوين اللامائية، إضافة شريط، وإضافة TMS-ديازوميثان (1.2 معادل الضرس، أو 0.26 مل من محلول 2 M في الأرجون) تحت الأرجون.
- انتظر 10 دقيقة وأضف المزيد من TMS-diazomethane (0.050 مل) حتى يبقى لون أصفر شاحب.
- بعد 30 دقيقة، ركز بعناية الخليط باستخدام المبخر الدوار وتنقية بقايا عن طريق الكروماتوغرافيا عمود فلاش. Elute مع 4٪ EtOAc في هيكسان (باستخدام 40 غرام هلام السيليكا العمود أو خرطوشة) لمدة 22 دقيقة. في هذا المثال، 19,20-EDP ميثيل استر (0.116 غرام, 74%) و 16,17-EDP-ميثيل إستر (0.029 غرام, 19%), تم الحصول على كزيوت واضحة (إجمالي الغلة, 93%).
- جمع الكسور التي تحتوي على REGIOISOMERS EDP استر الميثيل تنقية. 19(S)، 20 (R) - EDP ميثيل استر elutes أولا، تليها 16 (S)، 17 (R) - إدب استر الميثيل.
- إذا بقيت أي كسور مختلطة (تحتوي على كلا الأيزومرات؛ ويمكن تقييمها عن طريق الكروماتوغرافيا الرقيقة الطبقة (TLC) في8:1 الهكسان/EtOAc وملطخة ببرمنغنات البوتاسيوم (KMnO 4) )، إعادة كروماتوغراف لهم مع نفس نظام المذيبات كما كان من قبل.
- تركيز الكسور التي تحتوي على regioisomers الفردية.
ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تقييم الهوية والنقاء بواسطة NMR (باستخدام CDCl3 كمذيب؛ انظر وسيلة الإيضاح للشكل2). - لتحويل الجيويومرات إستر الميثيل EDP الفردية إلى أشكال حمضها، تمييع استر EDP في THF: المياه (حوالي 0.7 مل/0.1 مل مول من إستر). أضف 2 م ليوه مائي (3 مكافئات من الضرس) وحركبين بين عشية وضحاها.
ملاحظة: يمكن تقييم اكتمال رد الفعل بواسطة TLC، باستخدام 3:1 هيكسان/EtOAc، تلطيخ مع KMnO4؛ المنتج لديه معامل استبقاء 0.3~ . - تُروي ردّة الفعل ببطء بحمض الفورميك، حتى يصل درجة الحموضة في الخليط إلى 3-4. إضافة الماء وخلات الإيثيل (1-2 مل /0.100 مل مول من استر) وفصل الطبقات. استخراج طبقة المياه مع EtOAc (3 × 5 مل)، وغسل مع محلول ملحي مشبع (كلوريد الصوديوم) الحل، وتجفيف طبقة EtOAc على كبريتات الصوديوم اللامائية (نا2SO4).
- تركيز محلول خلات الإيثيل باستخدام المبخر الدوار، إضافة هيكسان (10 مل) والتركيز مرة أخرى. كرر مرتين لإزالة حمض الفورميك المتبقية. تنقية بقايا عن طريق الكروماتوغرافيا عمود فلاش، الاستخلاص مع 10-30٪ EtOAc أكثر من 15 دقيقة.
- تركيز الكسور المطلوبة وجافة في vacuo لتحمل حمض تنقية.
ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تقييم نقاء الأنانتيوميري (بواسطة chiral HPLC، انظر أساطير الشكل 3 - الشكل 4 للعمود والشروط). ويمكن تقييم النقاء الكيميائي بواسطة C18 (achiral) HPLC (انظر جدول المواد والمرجع 14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد في الشكل 1كروماتوغرام عمود الفلاش (الذي يتم تنفيذه باستخدام نظام تنقية الفلاش الآلي كما هو موضح أدناه) عند تنقية الخليط الخام من الأيبكسيد الأنزيمي . بعد استراتيشن وفصل regioisomers، نقية16 (S)، 17 (R)-EDP و 19 (S)، 20 (R) - EDP تم الحصول على استرات الميثيل. عادة، فهي موجودة في نسبة تقريبية 1:4 إلى 1:5، معالمنتج الرئيسي هو 19 (S)، 20 (R)-EDP. لا يتم الحصول على أي regioomers EDP أخرى (على سبيل المثال، 13،14 - أو 10،11-EDP). 1 H-NMR أطياف من 16 (S)، 17 (R) -EDP (الشكل2A)و 19 (S)، 20 (R)-EDP (الشكل2B)استرات الميثيل جنبا إلى جنب مع هياكلها مبينة أدناه، مما يدل على نقاء عالية من هذه مركبات؛ C18 (achiral) HPLC من أشكال حمض وأشار أيضا النقاء > 98٪. كما تأكدت هويتهم عن طريق التحليل الطيفي الكتلي عالي الاستبانة (كل من شكلي الأحماض والإستر)، مما أسفر عن نسب الكتلة/الشحن وأنماط التجزؤ بما يتفق مع المخططات الإلكترونية الإلكترونية المحددة. تم تحديد نقاء انانتيوميريك باستخدام الشيرال HPLC، بالمقارنة مع المعايير enantiopure أصيلة ومختلطة من EDPs (في شكلحمضها، الشكل 3A و الشكل 4A). كما يمكن ملاحظته في الشكل 3B و الشكل 4B، كل من EDPs التي تم الحصول عليها عن طريق الايبكسيد الأنزيمي هي enantiopure عالية بعد التصبين (> 99٪ enantiomer واحد). وقد سبق أن أبلغ عن هويات هذه الأنانتيومرات إلى 16 (S) و 17 (R) و 19 (S) و 20 (R) - EDP18.
الشكل 1 . الكروماتوغرام من تنقية الخليط الخام التي تم الحصول عليها من الايبكسيد الأنزيمي DHA (جنبا إلى جنب مع الهياكل ذات الصلة). تحتوي القمة الوسطى (مونوبأوكسيد) على الـ EDPs المطلوبة. تم تنفيذ عملية التنقية باستخدام نظام تنقية الفلاش الآلي (انظر جدولالمواد). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 . مثال 1H-NMR أطياف نقية 16(S)،17(R)- EDP ميثيل إستر (2A) و 19(S)،20(R)- EDP ميثيل استر (2B). تم تسجيل الأطياف في 500 ميغاهيرتز في CDCl3 (المذيبات مرئية في 7.26 جزء في المليون والمياه المتبقية في 1.6 جزء في المليون). التحولات الكيميائية هي كما يلي: 16 (S)، 17 (R) - EDP ميثيل إستر: 1H-NMR (500 ميغاهيرتز؛ 100 MHz; CDCl3): δ 5.57-5.35 (م، 10 H)، 3.68 (ق، 3 ح)، 2.99-2.95 (م، 2 ح)، 2.87-2.83 (م، 6 ح)، 2.47-2.37 (م، 6 ح)، 2.29-2.21 (م، 2 ح)، 2.11-2.05 (م، 2 ح)، 0.99 (t، ياء = 7.5 هرتز، 3 ح)؛ 19(S)، 20 (R) - EDP -إستر الميثيل: 1H-NMR (500 ميغاهيرتز؛ CDCl3): δ 5.54-5.35 (m, 10 H), 3.68 (ق, 3 H), 2.97 (td, J = 6.4, 4.2 هرتز، 1 ح)، 2.91 (td، J = 6.3، 4.2 هرتز، 1 ح)، 2.85-2.82 (م، 8 ح)، 2.44-2.36 (م، 5 ح)، 2.27-2.21 (م، 1 ح)، 1.65-1.51 (م، 3 ح)، 1.06 (t، J = 7.5 هرتز 3 ح) الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 تشير تشير شيرال HPLC إلى انانتيبور 16,17-EDP (شكل حمضي) تنتجه BM3. الشكل 3A يظهر chromatogram HPLC شيرال من "راسيميك" 16،17-EDP (خليط اصطناعي من المعايير الأصيلة من كل من enantiomers14)،في حين أن الشكل 3B يظهر chromatogram HPLC شيرال من enantiopure 16 (S)، 17(R ) - EDP التي تنتجها إبكسيدون من إدارة الشؤون الإنسانية مع BM3، وتقييمه على أنها > 99٪ S، R أيزومير. العمود يستند إلى السليلوز (انظر جدول المواد، 250 × 4.6 مم، 5 ميكرومتر، 1000 أمبير) مع متساوي ة 45٪ 50 ملي م بيكربونات الأمونيوم (NH4HCO3)في الميثانول (30 دقيقة)، مع تركيز عينة من 0.5 m M ومعدل تدفق 1 مل/ دقيقة الرجاء. انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 تشير تشير شيرال HPLC إلى انانتيبور 19,20-EDP (شكل حمضي) تنتجه BM3. الشكل 4 ألف يظهر chromatogram HPLC شيرال من "راسيميك" 19،20-EDP (خليط اصطناعي من المعايير الأصيلة من كل من enantiomers14)،في حين أن الشكل 4B يظهر شيرال HPLC كروماتوغرام من enantiopure 19 (S)، 20 (R) - EDP المنتجة بواسطة الايبوكسي من إدارة الشؤون الإنسانية مع BM3، تقييمها على أنها >99٪ S،R أيزومر (الطريقة كما هو موضح للشكل 3). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 . مخطط تفاعل الايبكسيدات الأنزيمية والهياكل ذات الصلة من AA، وكالة حماية البيئة، EETs، وEEQs التي تنتجها هذه الطريقة يرجى انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6 . تشير شيرال HPLC إلى انانتيبور ية 17,18-EEQ (شكل حمضي) تنتجه BM3. الشكل 6A يظهر chromatogram HPLC شيرال من "راسيميك" 17،18-EEJ (خليط اصطناعي من المعايير الأصيلة من كل من enantiomers14)،في حين أن الشكل 6B يظهر chromatogram HPLC شيرال من enantiopure 17 (S)، 18(R ) - EEQ التي تنتجها إبكسيدون من وكالة حماية البيئة مع BM3، تقييمها على أنها > 99٪ S،R أيزومر (الطريقة كما هو موضح للشكل 3). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن نقدم هنا طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة من الناحية التشغيلية لإعداد اثنين من الأيض الايبوكسي الأكثر وفرة من إدارة الشؤون الإنسانية - 19،20 و 16،17-EDP. هذه الأحماض الدهنية الايبوكسي يمكن إعدادها في enantiopure للغاية (كما S، R-isomers) باستخدام الإنزيم BM3 من نوع البرية. ويرد أدناه وصف العديد من النقاط الحرجة التي يمكن استخدامها لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها، وتوسيع أسلوبنا لإعداد المستقلبات الإبوكسي enantiopure AA وEPA.
إرشادات التخزين BM3
تخزين إنزيم BM3 النقي ممكن عن طريق خلط محلول البروتين مع حجم متساو من الجلسرين وتجميد فلاش مع النيتروجين السائل قبل التخزين في -78 درجة مئوية الفريزر. بمجرد تجميد الإنزيم، يمكن تخزينه لمدة تصل إلى عام. يمكن ذوبان الإنزيم مرة واحدة فقط، ويجب أن يذوب على الجليد، ويمكن أن تترك فقط على الجليد لمدة 4 ح. تجميد مرة أخرى، والسماح للإنزيم لذوبان الجليد دون حمام الجليد سوف تعطيل الإنزيم.
إرشادات التخزين الكيميائي
العديد من المركبات اللازمة لهذا الإجراء حساسة للهواء. وتشمل هذه DHA وغيرها من PUFAs, EDPs وغيرها من الأيض الايبوكسي, وNADPH. لمنع بيروكسيدون (والعمليات التأكسدية الأخرى) من هذه المركبات، دائما ً ً امسح الحاويات التي يتم تخزينها مع الأرغون أو النيتروجين وتخزينها عند -78 درجة مئوية.
ملاحظة هامة أخرى هي الحل الذي يتم تخزين DHA. على الرغم من أن DHA ليست مستقرة جدا في DMSO، BM3 غير متوافق مع الإيثانول والميثانول، لذلك يجب استخدام DMSO. لمواجهة استقراره المنخفض، يجب إعداد خليط DHA طازجًا في نفس اليوم الذي يتم فيه تحضير الأيبكسيد. يجب أن تبقى النسبة المئوية الإجمالية للـ DMSO في خليط التفاعل تحت 1% لتجنب تعطيل الإنزيم. بالإضافة إلى ذلك، لأن NADPH له فترة صلاحية قصيرة، يجب فحص التركيز مع مطياف قبل إضافة إلى رد الفعل. وهذا يضمن أن ما يعادل 1 من NADPH هو دائما تضاف إلى خليط التفاعل.
المبادئ التوجيهية لتفاعل الايبوكسي
يجب الحفاظ على تدفق الهواء من البالون إلى خليط التفاعل من أجل الحفاظ على تفاعل الأكسجين كما الأكسجين ضروري للإبكسيد. الخليط يجب أيضا أن يحرك بسرعة، منذ PUFAs ليست قابلة للذوبان جدا في الماء (الذوبان من إدارة الشؤون الإنسانية هو ≤125 μM في المخزن المؤقت رد فعل). يتم إخماد رد الفعل مع حمض الأكساليك لتشوه البروتين (كما أنه يشيط المعادن ويزيل العوامل المساعدة) وحمض يبقي DHA شكلها المحايد، وهو أمر ضروري لاستخراج الأثير ثنائي الإيثيل. يجب أن يتم تبريد خليط التفاعل ببطء لتجنب تحلل حمضية من EDPs.
إرشادات الاستخلاص وتنقية EDP
تم اختيار الأثير على وجه التحديد كما مذيب الاستخراج لأسباب متعددة. ثنائي كلورو الميثان يمكن أن يعجل البروتين من الحل، مما يعقد استخراج. EtOAc مقتطفات الجلسرين (إضافة مع محلول الأسهم انزيم)، والتي من الصعب إزالة وتتداخل مع الكروماتوغرافيا فلاش.
[إدب] [رجيوسوميومرس] في هم حرّة حامضة ليس بسهولة قابل للعزل, أيّ يكون لما ال [رجيوسوميوميرس] يكون مزجت داخل قمة وحيد في الأولى ومضة عمود كروماتوغرافيا. وبمجرد تحويلها إلى استرات الميثيل، فإن regioisomers قابلة للعزل بسهولة. بالإضافة إلى ذلك، تكون الاسترات عموما أكثر استقرارا من الأحماض المقابلة للتخزين على المدى الطويل إذا لم تكن هناك حاجة إلى شكل حمض على الفور.
أهمية الطريقة فيما يتعلق بالأساليب القائمة/البديلة
توفر طريقة عملنا طريقة بسيطة وفعالة للحصول على EDPs enantiopure، والتي لها العديد من المزايا على الأساليب القائمة والبديلة. أولاً، إن الإكأكسدة الكيميائية للحمض الدوائي ومشتقاته الأخرى ومشتقاتها ليست انتقائية أو انتقائية، وغالباً ما يتم الحصول على الخلائط المعقدة. أعمدة متعددة الكروماتوغرافية فلاش وPrepative HPLC، بما في ذلك HPLC prepative chiral، ولذلك ضرورية لتنقية الأحماض الدهنية الإبوكسي enantiopure من هذه الخلائط، والتي هي كثيفة العمالة ويمكن أن تنتج سوى كميات صغيرة جدا من المطلوب الايضات. ويمكن أيضا أن تستخدم توليف مجموع لإنتاج الأحماض الدهنية الايبوكسي، لكنه صارم، وتستغرق وقتا طويلا، يتطلب خطوات متعددة، ويعطي غلة إجمالية منخفضة، في حين أن الإنزيم BM3 من السهل التعبير عنه وتنقية، والإكسيد الكامل في غضون فترة قصيرة من الوقت. كما أن أسلوبنا فعال من حيث التكلفة: مصدر تجاري20 يقدم حالياً 16,17- و19,20-EDP (كما زملائهم في السباق) مقابل 528 دولار أمريكي /0.5 ملغ. 1 غرام من NADPH يمكن أيضاً شراؤها مقابل 500-800 دولار أمريكي، ويمكن استخدامها لإنتاج أكثر من مائتي ضعف مبلغ 19,20- عرضت EDP (ونحو خمسين مرة كمية 16,17-EDP) تجاريا لسعر مماثل - وفي أشكال enantiopure، والتي هي حاليا غير متوفرة تجاريا.
قيود الأسلوب
بما أنّ هذا أنزيم [بإكستينيلي] [إيبإكسيديزس] السندات متأخّرة مزدوجة من [ده], المنتوج كبريات 19,20-[إدب] (رغم أنّ 16,17-[إدب] يكون أيضا أنتجت). ولذلك، لا يمكن إنتاج الإيزوميرات الأخرى DHA التي قد تكون مطلوبة (على سبيل المثال، 13،14-EDP، 10،11-EDP) عن طريق الايبزيمات الأنزيمية مع BM3 البرية من النوع. أيضا، كما يتم إنتاج فقط منقبل شركة SR -enantiomers، وRS -enantiomers لا يمكن الوصول إليها، على الرغم من أن لدينا سابقا نشر طريقة انعكاس الكيميائية14 يمكن استخدامها لتجميعها. وبالإضافة إلى ذلك، وبسبب انخفاض قابلية الذوبان في السوائل الدهنية الدهنية في حاجز التفاعل، سيكون من الضروري توفير كميات كبيرة جداً من العازلة للإنتاج الواسع النطاق (ما بين 500 و000 1 ملغم تقريباً) من الـ EDPs، مما قد يجعل الاستخراج مستهلكاً للوقت أو مانعاً.
تطبيقات أخرى للأسلوب
ومن دواعي السرور أن بروتوكول الأيبكسيد الأنزيمي هذا ينطبق أيضاً على وكالة حماية البيئة وAA (تظهر الهياكل ذات الصلة في الشكل5). التركيزات، العازلة، ووقت رد الفعل المطلوبة للأكسدة من الأحماض الدهنية الثلاثة كلها هي نفسها. وبالنسبة لوكالة حماية البيئة، يستخدم أيضاً إنزيم BM3 من النوع البري، ويتم الحصول على جزء EEQ من وكالة حماية البيئة (56% من الإفرازات أحادية الأكسيد)، بعد أن يبلغ الإسطنطن 14:1 17،18-EEQ:14،15-EEQ. وعلى غرار الملاحظات التي تم تقديمها لـ EDPs، فإن 17,18-EEQ التي تم الحصولعليها هي enantiopure بدرجة عالية (>99% 17(S) و18 (R)-EEQ، انظر الشكل 6)كما تم تقييمها من قبل chiral HPLC (انظر الشكل 3 أسطورة وجدولالمواد). تم الإبلاغ عن هوية الأنانتيومرات سابقا17. لAA, ومع ذلك, يجب أن تستخدم متحولة Bm3 F87V بدلا من ذلك كما البرية من نوع BM3 هو هيدروكسيلاز لAA21. التعبير وتنقية هذا المسخ يستخدم أيضا البروتوكول أعلاه، ويتم تنفيذ إبكسيدون بطريقة مماثلة. وبهذه الطريقة، يتم الحصول على 14،15-EET كما regioisomer الوحيد. كما 14,15-حمض الحرة EET لا يمكن فصلها عن AA غير رد فعل بعد إبكسيدسون, استيريفيج ضروري; 14,15-يتم الحصول على استر الميثيل في 52% من الغلة AA. تشير شيرال HPLC (انظر الشكل 3 أسطورة وجدولالمواد) من حمض يشير إلى enantiopure للغاية (> 99٪) 14(S),15 (R)-EET (كما سبق الإبلاغ)15. التحولات الكيميائية لهذه الأيض وكالة حماية البيئة وAA هي كما يلي: 17(S),18(R)-EEQإستر الميثيل:1H-NMR (500 ميغاهيرتز; CDCl3): δ 5.53-5.34 (m, 8 H), 3.67 (ق, 3 H), 2.96 (td, ياء = 6.4، 4.2 هرتز، 1 ح)، 2.90 (td، J = 6.3، 4.2 هرتز، 1 H)، 2.85-2.79 (م، 6 ح)، 2.44-2.38 (م، 1 ح)، 2.32 (طن، ياء = 7.5 هرتز، 2 ح)، 2.26-2.20 (م، 1 ح) ، 2.11 (q، J = 6.7 هرتز، 2 ح)، 1.71 (خماسي، J = 7.4 هرتز، 2 ح)، 1.66-1.50 (م، 2 ح)، 1.05 (طن، ياء = 7.5 هرتز، 3 ح)؛ 14(S)،15(R)--إسترالميثيل: 1 H-NMR (500 ميغاهيرتز; CDCl3): δ 5.53-5.33 (m, 6 H), 3.67 (s, 3 ح)، 2.95-2.92 (م، 2 ح)، 2.81 (dt، J = 17.8، 5.8 هرتز، 4 ح)، 2.40 (dt، J = 14.1، 6.8 هرتز، 1 H)، 2.32 (t، J = 7.5 هرتز، 2 H)، 2.23 (dt، J = 14.1، 6.8 هرتز، 1 H) ، 2.11 (ف، ياء = 6.8 هرتز، 2 ح)، 1.71 (خماسي، J = 7.4 هرتز، 2 ح)، 1.56-1.41 (م، 4 ح)، 1.38-1.30 (م، 4 ح)، 0.90 (طن، ياء = 7.1 هرتز، 3 ح).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
ويمول هذا العمل من قبل R00 ES024806 (المعاهد الوطنية للصحة)، DMS-1761320 (المؤسسة الوطنية للعلوم) وصناديق بدء التشغيل من جامعة ولاية ميشيغان. يرغب المؤلفون في شكر الدكتور جون يانغ (جامعة كاليفورنيا في ديفيس) ولاليتا كرشالا (جامعة ولاية ميتشيغان) على مساعدتهم في تحسين التفاعل الأنزيمي، والدكتور توني شيلميلر (مرفق قياس الطيف الكتلي وMetabolomics) للحصول على المساعدة في الحصول على بيانات إدارة الموارد البشرية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
References
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
- Ulu, A., et al. An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).
- Ye, D., et al. Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).
- Imig, J. D. Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury. Hypertension. 65, 476-682 (2015).
- Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation. Scientific Reports. 6, 39211 (2016).
- Zou, A. P., et al. Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity. American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).
- Lauterbach, B., et al. Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators. Hypertension. 39, 609-613 (2002).
- Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , National Center for Health Statistics. Hyattsville, MD. (2015).
- Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease. Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).
- Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters. Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).
- Ostermann, A. I., Schebb, N. H. Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids. Food & Function. 8, 2355-2367 (2017).
- Khan, M. A., Wood, P. L. Method for the synthesis of DHA. , WO2012126088A1 (2012).
- Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).
- Cinelli, M. A., et al. Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids. Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).
- Falck, J. R., et al. Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid). Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).
- Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium. Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).
- Capdevila, J. H., et al. The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3. Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).
- Lucas, D., et al. Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450. Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).
- Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase. Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).
- Cayman Chemical, 19,20-EpDPA. , https://www.caymanchem.com/product/10175 (2019).
- Graham-Lorence, S., et al. An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase. Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).
