Summary
Presentiamo un metodo utile per la sintesi e purificazione e depurazione esulla scala di specifici enantiomeri e regioisori di epossido di acido aracidonico (AA), acido docosaesaenoico (DHA) e acido eicosapentaeno (EPA) con l'uso di un citocromo batterico P450 enzima (BM3).
Abstract
I metaboliti epossidizzati di vari acidi grassi polinsaturi (PUFA), rititi acidi grassi epossidici, hanno una vasta gamma di ruoli nella fisiologia umana. Questi metaboliti sono prodotti endogenamente dalla classe citocromatica P450 degli enzimi. A causa dei loro effetti biologici diversi e potenti, c'è un notevole interesse nello studio di questi metaboliti. Determinare i ruoli unici di questi metaboliti nel corpo è un compito difficile, in quanto gli acidi grassi epossidici devono prima essere ottenuti in quantità significative e con alta purezza. Ottenere composti da fonti naturali è spesso laborioso, e idrolasi epossido solubili (sEH) rapidamente idrolizzare i metaboliti. D'altra parte, ottenere questi metaboliti tramite reazioni chimiche è molto inefficiente, a causa della difficoltà di ottenere regioisomeri e enantiomeri puri, bassi rendimenti e vaste (e costose) purifiche. Qui, presentiamo un'efficiente sintesi enzimatica di 19(S), 20 (R)- e 16(S), 17(R)-epoxydocosatrapaenoiche acids (EDP) da DHA via epossidazione con BM3, un enzima batterico CYP450 isolato originariamente da Bacillus megaterium (che è prontamente espresso in Escherichia coli). La caratterizzazione e la determinazione della purezza vengono eseguite con spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR), cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e spettrometria di massa (MS). Questa procedura illustra i benefici della sintesi enzimatica dei metaboliti PUFA epoxy ed è applicabile all'epossidazione di altri acidi grassi, tra cui l'acido aracidonico (AA) e l'acido eicosapentaenoico (EPA) per produrre l'analogo epoxyeicosanoico acidi (EET) e gli acidi epossidicosaetui (EEQ), rispettivamente.
Introduction
Come interesse per il ruolo che gli acidi grassi polinsaturi (in particolare gli acidi grassi polinsaturi omega-3 e omega-6) è cresciuto negli ultimi anni, i ricercatori hanno preso atto della vasta gamma di vantaggi interessanti che i loro metaboliti mostra. In particolare, i metaboliti dell'acido grasso epossidico prodotti dalla classe citocromatica P450 degli enzimi sono stati un grande punto focale. Ad esempio, molti epossido di PUFA, tra cui gli acidi epossieicosachichi (EET), gli acidi epoxydocosatrapaenoici (EDP) e gli acidi epossirossitetraenoici (EEQ), svolgono un ruolo critico nella regolazione della pressione sanguigna e dell'infiammazione1,2 , 3 (COM del nome , 4 DEL psu' , 5. È interessante notare che gli enantiomeri specifici e i regioisomeri degli epossido di AA e EPA sono noti per avere effetti variabili sull'vasoconstriction6,7. Mentre gli effetti fisiologici degli enantiomeri e dei regioisomeri degli EET e degli EEQ sono stati documentati, si sa poco sull'effetto degli analoghi acidi essidomiomiatori (EDP) formati dal DHA. L'uso diffuso dell'olio di pesce8, che è ricco sia di EPA che di DHA, ha suscitato interesse anche per gli EDP9. I benefici di questi integratori sono creduti per essere in parte a causa dei metaboliti DHA a valle (16,17-EDP e 19,20-EDP essendo il più abbondante) perché in vivo livelli di EDP si coordinano molto bene con la quantità di DHA nella dieta10, 11.
Lo studio dei meccanismi e degli obiettivi di questi acidi grassi epossidici mediante metabolomica, biologia chimica e altri metodi si è dimostrato impegnativo, in parte perché esistono come miscele di regio- e stereo-isomeri, e un metodo per ottenere quantità pure del anti-enantiomeri e regioisomers. I mezzi convenzionali per sintetizzare chimicamente questi composti si sono dimostrati inefficaci. L'uso di perossididi come l'acido meta-cloroperoxybenzoico per l'epossidica ha molti inconvenienti, in particolare la mancanza di selettività dell'epossidazione, che richiede una purificazione costosa e scrupolosa di singoli regiosori e enantiomeri. La sintesi totale dei metaboliti DHA ed EPA è possibile, ma soffre anche di inconvenienti che lo rendono poco pratico per la sintesi su larga scala come i costi elevati e le basse rese12,13. Una produzione complessiva efficiente può essere realizzata con sintesi enzimatica, poiché le reazioni enzimatiche sono regio- e stereoselettive14. Gli studi dimostrano che l'epossidizzazione epossimatica epossimatica di AA ed EPA (con BM3) è sia regiosesesese che enantiosese15,16,17,18, ma questa procedura non è stata testata con DHA, o su un grande scala. L'obiettivo generale del nostro metodo era quello di scalare e ottimizzare questa epossidazione chemiozimatica per produrre rapidamente quantità significative di acidi grassi epossidici puri come loro antiantiomeri individuali. Utilizzando il metodo qui presentato, i ricercatori hanno accesso a una strategia semplice ed economica per la sintesi di EDP e altri metaboliti epossidici PUFA.
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Protocol
AVVISO: Consultare tutte le schede tecniche di sicurezza dei materiali pertinenti (MSDS) prima di utilizzare le sostanze chimiche elencate.
1. Espressione di tipo selvaggio BM3
- Inoculare pBS-BM3 trasinfezione DH5 E. coli (una generosa donazione dal Dr. F. Ann Walker) in 5 mL di brodo LB sterile con 0,5 mg di ampicillina aggiunto in un tubo di coltura 20 mL.
- Incubare la coltura cellulare in uno shaker a 37 gradi centigradi per 24 h a 200 giri/min. Aggiungere la coltura di avviamento notturno (5 mL) e 100 mg di ampicillina a 1 L di brodo Sterile LB in un pallone Fernbach o Erlenmeyer. Agitare a 37 gradi centigradi per 6 h a 200 giri/min, quindi a 30 gradi centigradi per 18 h a 200 giri/min.
- Raccogliere e centrifugare la coltura cellulare a 4 gradi centigradi per 10 min a 1.000 x g. Scartare il supernatante e conservare il pellet cellulare a -78 gradi centigradi fino alla purificazione degli enzimi.
NOTA: Il supernatante può essere sterilizzato chimicamente con il trattamento con candeggina o sterilizzato utilizzando un autoclave e poi versato nello scarico.
2. Purificazione di BM3.
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Lisi cellulare
- Sbattere il pellet cellulare sul ghiaccio e risospendere in 40 mL di buffer di solubilizzazione a freddo ghiaccio (1m) (10 mM Tris, 0,01 mM fenilmetilmethylsulfonyl fluoride (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8).
AVVISO: il PMSF è tossico per contatto. - Mentre sul ghiaccio, sonicare le cellule per 1 min con un omogeneizzatore ad ultrasuoni (impostazione di potenza di uscita 10, dovere 100%), seguita da una rottura di 1 min sul ghiaccio al fine di lisizzare le cellule. Ripetere questa procedura 6 volte. Centrifugare la lisata cellulare a 4 gradi centigradi per 30 min a 11.000 x g per pellet detriti cellulari.
- Sbattere il pellet cellulare sul ghiaccio e risospendere in 40 mL di buffer di solubilizzazione a freddo ghiaccio (1m) (10 mM Tris, 0,01 mM fenilmetilmethylsulfonyl fluoride (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8).
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Cromatografia affinità
- Preparare una forte colonna di cromatografia di scambio di anioni (vedi Tabella dei materiali; diametro: 2,8 cm x 6 cm, volume della colonna: 37 mL) lavando con 5 volumi di colonne (CV) del buffer A (10 mM Tris, pH 7,8) a 4 gradi centigradi.
- Aggiungere le linguetta delle cellule alla colonna equilibrata e lavare la colonna con 3 CV di tampone freddo A. Elute il BM3 lavando la colonna con tampone freddo B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).
- Raccogliere la frazione eluente bruno-rossastro. Se la proteina non viene utilizzata immediatamente, mescolarla con un volume uguale di glicerolo e congelare il flash con azoto liquido. Conservare la soluzione congelata a -78 gradi centigradi.
3. Epossidazione del DHA da parte di BM3
- Preparare la reazione aggiungendo 0,308 g (0,940 mmol) di DHA in 18,8 mL di dimeilfossido (DMSO) a 2 L di buffer di reazione di agitazione (0,12 fosfato di potassio, 5 mM MgCl2, pH 7.4) insieme a 20 nM dell'enzima BM3 scongelato. La concentrazione di enzimi può essere determinata dal metodo di analisi spettrale monossido di carbonio/dithionite19.
- Mentre la soluzione si sta agitando, iniziare la reazione aggiungendo 1 equivalente di NADPH (nicotinamide adenina dinucleotide fosfato ridotto, sale tetrasodio, 0.808 g, 0.940 mmol) disciolto nel buffer di reazione. Mescolare la reazione per 30 min mentre l'aria bollente attraverso la miscela di reazione con un palloncino pieno d'aria attaccato a una siringa e ago.
- Utilizzando uno spettrofotometro (vedere Tabella deimateriali), controllare l'assorbimento della miscela di reazione a 340 nm per determinare se NADPH è esaurito. Se non vi è alcuna assorbimento rimanente che indica il consumo di NADPH, la reazione è completa.
NOTA: In genere, la reazione è completa dopo 30 min. - Spegnire la miscela di reazione aggiungendo lentamente 1 M di acido osalico, dropwise, fino a quando il pH della soluzione raggiunge 4.
4. Estrazione di EDP
- Estrarre la soluzione tampone spento con 2 L di etere dietillo (anidroso, privo di perossido) 3 volte. Raccogliere lo strato di etere (6 L) e asciugare con solfato di magnesio idroelettrico (MgSO4).
- Filtrare l'MgSO4 dalla soluzione e concentrare lo strato di etere essiccato su un evaporatore rotante per produrre il residuo EDP grezzo.
- Purificare il residuo mediante cromatografia a colonna flash (una cartuccia di silice da 40 g è sufficiente). Iniziare al 10% di acetato di etilico (EtOAc) in esagoni e rampa fino al 60% EtOAc in esagoni oltre 22 min.
NOTA: Tre picchi principali sono ottenuti e raccolti, eluindo nell'ordine di 1. DHA non reagito; 2. miscela di isomeri EDP; e 3. (normali prodotti di sovraossidazione (cfr. figura 1)). - Unire le frazioni e concentrarle sull'evaporatore rotativo. Da questo esempio, 0,074 g, (24%) DHA non reagito, 0,151 g (47%) di isomeri EDP, e 0,076 g, (22%) di-epossido sono stati ottenuti.
5. Esterificazione degli EDP, separazione di 16(S),17(R)- e 19(S),20(R)-EDP e saponificazione degli esteri
AGGIORNAMENTO: Il trimethylsilyldiazometathane (TMS-diazometae) è molto tossico sia per il contatto che per l'inalazione. Utilizzare solo in un cofano di fume con l'attrezzatura protettiva personale adeguata.
- Diluire gli epossido (0,151 g, 0,435 mmol) in una fiaschetta a fondo rotondo o piccola fiala con 2 mL di metanolo idrosotro (MeOH) e 3 mL di toluene anidride, aggiungere una barra di stir, e aggiungere TMS-diazometatano (1,2 semilari equivalenti, o 0,26 mL di una soluzione di 2 M in hexanes) sotto argon.
- Attendere 10 min e aggiungere ulteriore TMS-diazometano (0.050 mL) fino a quando non rimane un colore giallo pallido.
- Dopo 30 min, concentrare con cura la miscela utilizzando l'evaporatore rotante e purificare il residuo dalla cromatografia a colonna flash. Elute con 4% EtOAc in esagoni (utilizzando una colonna di gel di silice o cartuccia 40 g) per 22 min. In questo esempio, 19,20-EDP ester metil (0,116 g, 74%) e 16,17-EDP ester metile (0,029 g, 19%), sono stati ottenuti come oli chiari (rendimento totale, 93%).
- Raccogliere le frazioni contenenti i regioisomers edthyl ester purificati. 19(S), 20(R)-EDP metil ester eluise per prime, seguite da 16(S),17(R)-EDP ester metile.
- Se rimangono frazioni miste (contenenti entrambi gli isomeri; possono essere valutate mediante cromatografia a strato sottile (TLC) in 8:1 hexane/EtOAc e macchiate con permanganato di potassio (KMnO4)), ri-cromatografate con lo stesso sistema solvente di prima.
- Concentrare le frazioni contenenti i singoli regioisomers.
NOTA: a questo punto, l'identità e la purezza possono essere valutate da NMR (utilizzando CDCl3 come solvente; vedere la legenda per la figura 2). - Per convertire i singoli regioisomers di ester metile EDP alle loro forme acide, diluire l'ester EDP in THF:water (circa 0,7 mL/0,1 mmol di ester). Aggiungere 2 M aqueous LiOH (3 equivalenti molare) e mescolare durante la notte.
NOTA: la completezza della reazione può essere valutata da TLC, utilizzando 3:1 exanes/EtOAc, colorazione con KMnO4; il prodotto ha un fattore di ritenzione di 0,3 USD. - Spegnire lentamente la reazione con l'acido formico, fino a quando il pH della miscela raggiunge 3-4. Aggiungere acqua ed acetato etilico (1-2 mL/0,100 mmol di ester) e separare gli strati. Estrarre lo strato d'acqua con EtOAc (3 x 5 mL), lavare con soluzione salamoia satura (NaCl) e asciugare lo strato EtOAc sopra anhydrous solfato di sodio (Na2SO4).
- Concentrare la soluzione di acetato etiliato utilizzando un evaporatore rotante, aggiungere esanei (10 mL) e concentrarsi di nuovo. Ripetere due volte per azeotropicale rimuovere l'acido formica residuo. Purificare il residuo dalla cromatografia a colonna flash, eluindo con 10-30% EtOAc oltre 15 min.
- Concentrare le frazioni desiderate e asciugare in vacuo per permettersi l'acido purificato.
NOTA: In questa fase, la purezza enantiomerica può essere valutata (da HPLC chirale, vedere le leggende per Figura 3 - Figura 4 per colonna e condizioni). La purezza chimica può essere valutata da C18 (achiral) HPLC (vedi Tabella dei materiali e riferimento 14).
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Representative Results
Il cromatogramma della colonna flash (eseguito utilizzando un sistema di purificazione flash automatizzato come descritto di seguito) ottenuto dopo la purificazione della miscela grezza dall'epossidiva esossimatica ezimatica è mostrato nella Figura 1. Dopo l'esterificazione e la separazione dei regioisori, sono stati ottenuti i puri 16(S),17(R)-EDP e 19(S),20(R)-EDP esters metil. In genere, sono presenti in un rapporto approssimativo da 1:4 a 1:5, con il prodotto principale 19(S), 20(R)-EDP. Non si ottengono altri regioisomer EDP (ad esempio, 13,14 o 10,11 EDP). Di seguito sono riportati i 1spettri H-NMR di 16(S), 17(R)-EDP (Figura 2A) e 19(S), 20 (R)-EDP (Figura2B)insieme alle loro strutture, indicando l'elevata purezza di questi esteri. composti; C18 (achiral) HPLC delle forme acide indicato anche purities >98%. La loro identità è stata ulteriormente confermata dalla spettroscopia di massa ad alta risoluzione (sia delle forme acide che di quelle estere), che ha prodotto rapporti di massa/carica e modelli di frammentazione coerenti con gli EPP identificati. La purezza enantiomerica è stata determinata utilizzando l'HPLC chirale, rispetto agli autentici standard enantiopure e misti degli EDP (nella loro forma acida, Figura 3A e Figura 4A). Come si può osservare nella Figura 3B e nella Figura 4B, entrambi gli EDP ottenuti dall'epossidica esulmatica esulmatica sono altamente enantiopure dopo la saponificazione (>99% un enantiomer). Le identità di questi enantiomeri sono state precedentemente segnalate come 16(S), 17(R)- e 19(S), 20(R)-EDP18.
Figura 1 . Cromatogramma dalla purificazione della miscela grezza ottenuta dall'epossidazione epossimatica del DHA (insieme alle strutture pertinenti). Il picco medio (monoepossido) contiene gli EDP desiderati. La purificazione è stata eseguita utilizzando un sistema automatico di purificazione del flash (vedere Tabella dei materiali). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Esempio 1Spettri H-NMR di puro 16(S),17(R)-EDP metil ester (2A) e 19(S),20(R)-EDP metil ester (2B). Gli spettri sono stati registrati a 500 MHz in CDCl3 (il solvente è visibile a 7,26 ppm e l'acqua residua a 1,6 ppm). Gli spostamenti chimici sono i seguenti: 16(S),17(R)-EDP metil ester: 1H-NMR (500 MHz; CDCl3): 5,57-5,35 (m, 10 H), 3,68 (s, 3 H), 2,99-2,95 (m, 2 H), 2,87-2,83 (m, 6 H), 2,47-2,37 (m, 6 H), 2,29-2,21 (m, 2 H), 2.11-2.05 (m, 2 H), 0.99 (t, J - 7.5.) 19(S), 20(R)-EDP ester metilico: 1H-NMR (500 MHz; CDCl3): che è stata di fatto 5,54-5,35 (m, 10 H), 3,68 (s, 3 H), 2,97 (td, J 4,2 Hz, 1 H), 2,91 (td, J - 6,3, 4,2 Hz, 1 H), 2,85-2,82 (m, 8 H), 2,44-2,36 (m, 5 H), 2,27-2,21 (m, 1 H), 1,65-1,51 (m, 3 H), 1,06 (t, J - 7,5,5,5 , 3 H). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. HPLC chirale che indica l'enantiopurezza di 16,17-EDP (forma acida) prodotta da BM3. La figura 3A mostra un cromatogramma chirale HPLC di "racemic" 16,17-EDP (una miscela artificiale di standard autentici di entrambi gli enantiomeri14), mentre la figura 3B mostra un cromatogramma CHIrale HPLC di enantiopure 16(S,17(R )-EDP prodotto dall'epossidazione del DHA con BM3, valutato come >99% S,R isomer. La colonna è a base di cellulosa (cfr. Tabella dei materiali, 250 x 4,6 mm, 5 m, 1.000) che si eluisce con velocità isocratica 45% 50 m di ammonio bicarbonato (NH4HCO3) in metanolo (30 min), con una concentrazione campione di 0,5 mm e velocità di flusso di 1 mL/min Please. clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. KLC chirale che indica l'enantiopurezza di 19,20 EDP (forma acida) prodotta da BM3. Figura 4A mostra un cromogramma chirale HPLC di "racemic" 19,20-EDP (una miscela artificiale di standard autentici di entrambi gli enantiomeri14), mentre la figura 4B mostra un cromatogramma chirale HPLC di enantiopure 19(S),20(R)-EDP prodotto per epossidazione del DHA con BM3, valutato come >99% S,R isomer (metodo come descritto per Figura 3). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Schema generale di reazione all'epossidazione enzimatica e strutture rilevanti di AA, EPA, EET ed EEQ prodotti da questo metodo Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
Figura 6 . HpLC chirale che indica l'enantiopurezza di 17,18-EEQ (forma acida) prodotta da BM3. Figura 6A mostra un cromatogramma chirale HPLC di "racemic" 17,18-EEQ (una miscela artificiale di standard autentici di entrambi gli enantiomeri14), mentre Figura 6B mostra un cromatogramma chirale HPLC di enantiopure 17(S,18(R )-EEQ prodotto dall'epossidazione dell'EPA con BM3, valutato come >99% S,R isomer (metodo come descritto per la figura 3). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Vi presentiamo qui un metodo operativamente semplice ed economico per preparare i due metaboliti epossidici più abbondanti del DHA - 19,20 e 16,17-EDP. Questi acidi grassi epossidici possono essere preparati in forma altamente enantiopure (come il loro S,R-isomers) utilizzando l'enzima BM3 di tipo selvatico. Diversi punti critici che possono essere utilizzati per la risoluzione dei problemi, e l'estensione del nostro metodo per la preparazione di metaboliti epossidi enantiopure di AA ed EPA, sono descritti di seguito.
Linee guida per l'archiviazione BM3
Conservare l'enzima BM3 purificato è possibile mescolando la soluzione proteica con lo stesso volume di glicerolo e il congelamento flash con azoto liquido prima dello stoccaggio in un congelatore -78 gradi centigradi. Una volta che l'enzima è congelato, può essere conservato per un massimo di un anno. L'enzima può essere scongelato solo una volta, deve essere scongelato sul ghiaccio e può essere lasciato sul ghiaccio solo per 4 h. Congelamento di nuovo, e permettendo all'enzima di scongelarsi senza un bagno di ghiaccio disattiverà l'enzima.
Linee guida per l'immagazzinamento chimico
Molti dei composti necessari per la procedura sono sensibili all'aria. Questi includono DHA e altri PUFA, EDP e altri metaboliti epossidici, e NADPH. Per prevenire la perossidazione (e altri processi ossidativi) di questi composti, lavare sempre i contenitori in cui sono immagazzinati con argon o azoto e conservarli a -78 gradi centigradi.
Un'altra nota importante è la soluzione in cui è memorizzato il DHA. Anche se il DHA non è molto stabile in DMSO, BM3 è incompatibile con etanolo e metanolo, quindi dMSO deve essere utilizzato. Per contrastare la sua bassa stabilità, la miscela DHA deve essere preparata fresco lo stesso giorno dell'epossidazione. La percentuale totale di DMSO nella miscela di reazione deve essere mantenuta al di sotto dell'1% per evitare di disattivare l'enzima. Inoltre, poiché NADPH ha una breve durata di conservazione, la concentrazione deve essere controllata con lo spettrofotometro prima dell'aggiunta alla reazione. Questo assicura che 1 equivalente del NADPH venga sempre aggiunto alla miscela di reazione.
Linee guida per la reazione all'epossidazione
Il flusso d'aria dal palloncino nella miscela di reazione deve essere mantenuto al fine di mantenere la reazione ossigenata come ossigeno è necessario per l'epossidazione. La miscela deve anche essere mescolata rapidamente, dal momento che i PUFA non sono molto solubili in acqua (la solubilità del DHA è di 125 M nel buffer di reazione). La reazione viene spenta con acido ossalico alla proteina denaturata (in quanto mastica il metallo e rimuove i cofattori) e l'acido mantiene la DHA la sua forma neutra, che è necessaria per l'estrazione dell'etere dietilico. Lo spegnimento della miscela di reazione deve essere fatto lentamente per evitare l'idrolisi acido-catalizzata degli EDP.
Linee guida per l'estrazione e la depurazione EDP
Ether è stato scelto specificamente come solvente di estrazione per molteplici motivi. Dichlorometano può far precipitare la proteina fuori soluzione, il che complica l'estrazione. EtOAc estrae glicerolo (aggiunto con la soluzione di stock enzimatico), che è difficile da rimuovere e interferisce con la cromatografia flash.
I regioisomeri EDP nel loro stato di acido libero non sono facilmente separabili, motivo per cui i regioisori sono mescolati in un unico picco nella prima cromatografia della prima colonna flash. Una volta convertiti agli esteri metile, i regioisomeri sono facilmente separabili. Inoltre, gli esteri sono generalmente più stabili degli acidi corrispondenti per lo stoccaggio a lungo termine se la forma acida non è necessaria immediatamente.
Significato del metodo rispetto ai metodi esistenti/alternativi
Il nostro metodo fornisce un metodo semplice ed efficace per ottenere EDP enantiopure, che ha molti vantaggi rispetto ai metodi esistenti e alternativi. In primo luogo, l'epossidazione chimica di DHA e altri PUFA e dei loro derivati non è né regioseselettiva né enantiosese, e spesso si ottengono miscele complicate. Colonne di cromatografia flash multipli e preparativa HPLC, tra cui cedimento chirale preparativo HPLC, sono quindi necessari per purificare gli acidi grassi epossidici enantiopure da queste miscele, che sono laboriosi e possono produrre solo piccole quantità di desiderato Metaboliti. La sintesi totale può anche essere impiegata per produrre acidi grassi epossidici, ma è rigorosa, richiede tempo, richiede più passaggi e dà una bassa resa complessiva, mentre l'enzima BM3 è facile da esprimere e purificare e l'epossidazione è completa entro un breve periodo di ora. Il nostro metodo è anche conveniente: una fonte commerciale20 attualmente offre 16,17 e 19,20-EDP (come loro compagni di gara) per 528 USD / 0,5 mg. 1 g di NADPH può anche essere acquistato per 500-800 USD, e può essere utilizzato per produrre oltre duecento volte la quantità di 19,20- EDP (e circa cinquanta volte la quantità di 16,17-EDP) offerto commercialmente per un prezzo simile - e in forme enantiopure, che attualmente non sono disponibili in commercio.
Limitazioni del metodo
Poiché questo enzima epossidica preferibilmente l'ultimo doppio legame di DHA, il prodotto principale è 19,20-EDP (anche se viene prodotto anche 16,17-EDP). Pertanto, altri regioisomer DHA che potrebbero essere desiderati (ad esempio, 13,14-EDP, 10,11-EDP) non possono essere prodotti da epossidizione ezimatica con bM3 di tipo selvatico. Inoltre, poiché solo gli enantiomeri SRsono prodotti da BM3, gli enantiomeri RSsono inaccessibili, anche se il nostro metodo di inversione chimica pubblicato in precedenza14 può essere utilizzato per sintetizzarli. Inoltre, a causa della bassa solubilità dei PUFA lipofilici nel buffer di reazione, sarebbero necessarie grandi quantità di buffer per la produzione su larga scala (ca. 500-1.000 mg) di EDP, che potrebbero potenzialmente rendere l'estrazione lunga o proibitiva.
Altre applicazioni del metodo
In modo gradevole, questo protocollo di epossidazione eposmatica è applicabile anche all'EPA e all'AA (le strutture rilevanti sono mostrate nella Figura5). Le concentrazioni, il buffer e il tempo di reazione necessari per l'epossidazione di tutti e tre gli acidi grassi sono gli stessi. Per l'EPA, viene utilizzato anche l'enzima BM3 di tipo selvatico e la frazione EEQ ottenuta da EPA (56% di rendimento di monoepossido), dopo l'esterificazione è di 14:1 17,18-EEQ:14,15-EEQ. Analogamente alle osservazioni fatte per gli EDP, il 17,18-EEQ ottenuto è altamente enantiopure (>99% 17(S), 18(R)-EEQ, vedi Figura 6) come valutato da chirale HPLC (vedere Figura 3 legenda e Tabella dei materiali). Identità degli enantiomeri è stata precedentemente riportata17. Per AA, tuttavia, il mutante F87V BM3 deve essere utilizzato invece come BM3 di tipo selvaggio è un idrossilasi per AA21. L'espressione e la purificazione di questo mutante utilizza anche il protocollo di cui sopra, e l'epossidazione viene eseguita in modo analogo. Con questo metodo, 14,15-EET si ottiene come unico regioisomer. Poiché 14,15-EET acido libero è inseparabile da AA non reagito dopo l'epossidazione, l'esterificazione è necessaria; 14,15-EET ester metile ottiene in 52% rendimento da AA. Chirale HPLC (vedi legenda 3 e tabella dei materiali) dell'acido indica altamente enantiopure (>99%) 14(S),15(R)-EET (come precedentemente riportato)15. Gli spostamenti chimici per questi metaboliti EPA e AA sono i seguenti: 17(S),18(R)-EEQ ester metilico:1H-NMR (500 MHz; CDCl3): che è stata di fatto a 5,53-5,34 (m, 8 H), 3,67 (s, 3 H), 2,96 (td, J : 6,4, 4,2 Hz, 1 H), 2,90 (td, J - 6,3, 4,2 Hz, 1 H), 2,85-2,79 (m, 6 H), 2,44-2,38 (m, 1 H), 2,32 (t, J - 7,5 Hz, 2 H), 2,26-2,20 (m, 1 H) , 2,11 (q, J - 6,7 Hz, 2 H), 1,71 (quintetto, J - 7,4 Hz, 2 H), 1,66-1,50 (m, 2 H), 1,05 (t, J - 7,5 Hz, 3 H); 14(S),15(R)-EET ester metilico: 1 : il nome del H-NMR (500 MHz; CDCl3): 5,53-5,33 (m, 6 H), 3,67 (s, 3 H), 2,95-2,92 (m, 2 H), 2,81 (dt, J - 17,8, 5,8 Hz, 4 H), 2,40 (dt, J - 14,1, 6,8 Hz, 1 H), 2,32 (t, J - 7,5 Hz, 2 H), 2,23 (dt, J - 14,1, 6,8 Hz, 1 H) , 2,11 (q, J - 6,8 Hz, 2 H), 1,71 (quintetto, J - 7,4 Hz, 2 H), 1,56-1,41 (m, 4 H), 1,38-1,30 (m, 4 H), 0,90 (t, J - 7,1 Hz, 3 H).
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è finanziato da R00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) e fondi di avvio dalla Michigan State University. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Jun Yang (Università della California a Davis) e Lalitha Karchalla (Michigan State University) per l'assistenza con l'ottimizzazione della reazione enzimatica, e il Dr. Tony Schilmiller (MSU Mass Spectromometria e Metabolomics Facility) per assistenza con l'acquisizione dei dati HRMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
References
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