Summary
Vi presenterer en metode nyttig for storstilt enzymatisk syntese og rensing av spesifikke enantiomerer og regioisomers av epoksider av arachidonic syre (AA), dokosaheksaensyre syre (DHA), og eikosapentaensyre acid (EPA) med bruk av en bakteriell cytokrom P450 enzym (BM3).
Abstract
De epoxidized metabolitter av ulike flerumettede fettsyrer (Fuf), kalt epoxy fettsyrer, har et bredt spekter av roller i menneskets fysiologi. Disse metabolitter produseres endogenously av cytokrom P450 klasse av enzymer. På grunn av deres mangfoldige og potente biologiske virkninger, er det stor interesse for å studere disse metabolitter. Fastsettelse av de unike rollene til disse metabolitter i kroppen er en vanskelig oppgave, som epoxy fettsyrer må først fås i betydelige mengder og med høy renhet. Innhenting av forbindelser fra naturlige kilder er ofte arbeidsintensiv, og løselig epoxide hydrolases (sEH) raskt hydrolyserer metabolitter. På den annen side er innhenting av disse metabolitter via kjemiske reaksjoner svært ineffektiv, på grunn av vanskelighetene med å skaffe ren regioisomers og enantiomerer, lav avkastning, og omfattende (og dyre) rensing. Her presenterer vi en effektiv enzymatisk syntese av 19 (s), 20 (r)-og 16 (s), 17 (r)-epoxydocosapentaenoic syrer (EDPs) fra DHA via epoxidation med BM3, en bakteriell CYP450 enzym isolert opprinnelig fra Bacillus megaterium (som er lett uttrykt i Escherichia coli). Karakterisering og bestemmelse av renhet er utført med kjernefysisk magnetisk resonans spektroskopi (NMR), høy ytelse flytende kromatografi (HPLC), og masse massespektrometri (MS). Denne prosedyren illustrerer fordelene ved enzymatisk syntese av PUFA epoxy metabolitter, og gjelder for epoxidation av andre fettsyrer, inkludert arachidonic syre (AA) og eikosapentaensyre acid (EPA) til å produsere den analoge epoxyeicosatrienoic syrer (EETs) og epoxyeicosatetraenoic syrer (EEQs), henholdsvis.
Introduction
Som interesse i rollen som flerumettede fettsyrer (spesielt Omega-3 og Omega-6 flerumettede fettsyrer) spille i menneskets biologi har vokst de siste årene, har forskerne tatt notis av det store utvalget av tiltalende fordeler at deres metabolitter Utstillingen. Spesielt, epoxy fettsyrer metabolitter produsert av cytokrom P450 klasse av enzymer har vært et stort fokuspunkt. For eksempel, mange PUFA epoksider, inkludert epoxyeicosatrienoic syrer (EETs), epoxydocosapentaenoic syrer (EDPs) og epoxyeicosatetraenoic syrer (EEQs), spille en avgjørende rolle i regulering av blodtrykk og betennelse1,2 , 3 andre priser , 4 andre priser , 5. interessant, den spesifikke enantiomerer og regioisomers av AA og EPA epoksider er kjent for å ha varierende effekt på vasokonstriksjon6,7. Mens fysiologiske effekter av enantiomerer og regioisomers av EETs og EEQs har blitt dokumentert, er lite kjent om effekten av den analoge epoxydocosapentaenoic syrer (EDPs) dannet fra DHA. Utbredt bruk av fiskeolje8, som er rik på både EPA og DHA, har også rørt interesse for EDPs9. Fordelene med disse kosttilskudd antas å være delvis på grunn av nedstrøms DHA metabolitter (16, 17-EDP og 19, 20-EDP er den mest tallrike) fordi in vivo nivåer av EDPs koordinere veldig godt med mengden av DHA i dietten10, 11i.
Å studere mekanismene og målene til disse epoxy fettsyrene ved Plantemetabolomikk, kjemisk biologi og andre metoder har vist seg å være utfordrende, delvis fordi de eksisterer som blandinger av Regio-og stereo-isomerene, og en metode for å oppnå rene mengder enantiomerer og regioisomers er nødvendig. Konvensjonelle midler for kjemisk syntetisere disse forbindelsene har vist seg ineffektive. Bruk av peroksysyrer som meta-chloroperoxybenzoic acid for epoxidation har mange ulemper, særlig mangelen på epoxidation selektivitet, som nødvendiggjør dyrt og omhyggelig rensing av individuelle regioisomers og enantiomerer. Total syntese av DHA og EPA metabolitter er mulig, men også lider av ulemper som gjør det upraktisk for stor skala syntese som høye kostnader og lav avkastning12,13. Effektiv total produksjon kan oppnås med enzymatisk syntese, som enzymatisk reaksjoner er Regio-og stereoselektiv14. Studier viser at enzymatisk epoxidation av AA og EPA (med BM3) er både regioselektive og enantioselective15,16,17,18, men denne prosedyren har ikke blitt testet med DHA, eller på en stor Skala. Det overordnede målet med vår metode var å skalere opp og optimalisere denne chemoenzymatic epoxidation til raskt å produsere betydelige mengder ren epoxy fettsyrer som deres individuelle enantiomerer. Ved hjelp av metoden som presenteres her, har forskerne tilgang til en enkel og kostnadseffektiv strategi for syntese av EDPs og andre PUFA epoxy metabolitter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
FORSIKTIG: ta kontakt med alle relevante Material sikkerhetsdatablad (muskel-og skjelettlidelser) før du bruker de oppførte kjemikaliene.
1. uttrykk for vill-type BM3
- Vaksinere pBS-BM3 transfekterte DH5α E. coli (en generøs donasjon fra Dr. F. Ann Walker) i 5 ml steril lb buljong med 0,5 mg Ampicillin lagt inn i en 20 ml kultur tube.
- Ruge celle kulturen i en shaker ved 37 ° c i 24 timer ved 200 rpm. Tilsett natten starter kulturen (5 mL) og 100 mg Ampicillin til 1 L av sterile LB buljong i en fernbach eller Erlenmeyer kolbe. Rist ved 37 ° c i 6 timer ved 200 RPM, deretter ved 30 ° c i 18 timer ved 200 rpm.
- Samle og sentrifuger celle kulturen ved 4 ° c i 10 min ved 1 000 x g. Kast supernatanten og oppbevar celle pellet ved-78 ° c til enzym rensing.
Merk: supernatanten kan enten være kjemisk sterilisert ved behandling med blekemiddel eller sterilisert ved hjelp av en autoklav og deretter helles ned i avløpet.
2. rensing av BM3.
-
Cellelyse
- Tin celle pellet på is og resuspend i 40 mL is kaldt (4 ° c) oppløseliggjøringen buffer (10 mM Tris, 0,01 mM phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8).
FORSIKTIG: PMSF er giftig ved kontakt. - Mens på isen, sonikere cellene i 1 min med en ultrasonisk homogenisator (utgangseffekt innstilling 10, Duty 100%), etterfulgt av en 1 min pause på isen for å lyse cellene. Gjenta denne prosedyren 6 ganger. Sentrifuger celle lysat ved 4 ° c i 30 min ved 11 000 x g til pellets celle rusk.
- Tin celle pellet på is og resuspend i 40 mL is kaldt (4 ° c) oppløseliggjøringen buffer (10 mM Tris, 0,01 mM phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8).
-
Affinitet kromatografi
- Forbered en sterk anion utveksling kromatografi kolonne (se tabell av materialer; diameter: 2,8 cm x 6 cm, Kol onne volum: 37 ml) ved å vaske med 5 Kol onne VOLUMER (CV) buffer a (10 mm Tris, pH 7,8) ved 4 ° c.
- Legg til celle lysater til equilibrated kolonne og vask kolonnen med 3 CV med kald buffer A. Eluere BM3 ved å vaske kolonnen med kald buffer B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).
- Samle den rødlig-brune eluent brøk. Hvis proteinet ikke brukes umiddelbart, bland det med et likt volum av glyserol og Flash fryse med flytende nitrogen. Oppbevar den frosne løsningen ved-78 ° c.
3. Epoxidation av DHA ved BM3
- Forbered reaksjonen ved å legge 0,308 g (0,940 mmol) av DHA i 18,8 mL dimetylsulfoksid (DMSO) til 2 L av omrøring reaksjonsbuffer (0,12 M kalium fosfat, 5 mM MgCl2, pH 7,4) sammen med 20 nM av tint BM3 enzymet. Enzymet konsentrasjonen kan bestemmes av karbonmonoksid/dithionite Spectral analysen metode19.
- Mens løsningen er omrøring, begynner reaksjonen ved å legge 1 tilsvarer NADPH (nikotinamid adenine dinucleotide fosfat redusert, tetrasodium salt, 0,808 g, 0,940 mmol) oppløst i reaksjonsbuffer. Rør reaksjonen i 30 min mens boblende luft gjennom reaksjonsblandingen med en luft-fylt ballong festet til en sprøyte og nål.
- Bruk en spektrofotometer (se tabell over materialer), og kontroller absorbansen til reaksjonsblandingen ved 340 NM for å avgjøre om NADPH er oppbrukt. Hvis det ikke finnes noen gjenværende absorbansen som indikerer forbruket av NADPH, er reaksjonen fullstendig.
Merk: vanligvis er reaksjonen fullført etter 30 min. - Slukke reaksjonen blanding av langsomt tilføyer 1 M oksalsyre syren, dråpevis, til det pH av oppløsningen når 4.
4. ekstraksjon av EDPs
- Pakk ut slukket buffer løsning med 2 L av dietyl Eter (vannfri, peroxide-Free) 3 ganger. Samle Eter laget (6 L) og tørk med vannfri magnesium sulfat (MgSO4).
- Filtrer MgSO4 fra løsningen og Konsentrer tørket Eter laget på en roterende fordamper for å gi den rå EDP-rester.
- Rens rester av Flash kolonne kromatografi (en 40 g silica patron er tilstrekkelig). Start på 10% etanol acetate (EtOAc) i hexaner og rampe opp til 60% EtOAc i hexaner over 22 min.
Merk: tre store topper er innhentet og samlet, tent i rekkefølge 1. ureagerte DHA; 2. blanding av EDP-isomerene; og 3. di-epoxide (normale over-oksidasjon produkter (se figur 1)). - Kombiner fraksjoner og konsentrere dem på den roterende fordamperen. Fra dette eksempelet, 0,074 g, (24%) av ureagerte DHA, 0,151 g (47%) av EDP-isomerene og 0,076 g, (22%) av di-epoxide ble innhentet.
5. esterification av EDPs, separasjon av 16 (r), 17 (r)-og 19 (s), 20 (r)-EDP, og forsåpning av estere
FORSIKTIG: Trimethylsilyldiazomethane (TMS-diazometan) er svært giftig ved både kontakt og innånding. Skal kun brukes i en avtrekksvifte med riktig personlig verneutstyr.
- Fortynne epoksider (0,151 g, 0,435 mmol) i en rund bunn kolbe eller liten hetteglass med 2 mL vannfri metanol (MeOH) og 3 mL vannfri toluen, legge til en røre-bar, og legge TMS-diazometan (1,2 molar ekvivalenter, eller 0,26 mL av en 2 M løsning i hexaner) under Argon.
- Vent 10 min og Legg til ytterligere TMS-diazometan (0,050 mL) til en blek gul farge gjenstår.
- Etter 30 min, nøye konsentrere blandingen ved hjelp av roterende fordamperen og rense rester av Flash kolonne kromatografi. Eluere med 4% EtOAc i hexaner (ved hjelp av en 40 g silica gel kolonne eller kassett) i 22 min. I dette eksempelet, 19, 20-EDP methyl ester (0,116 g, 74%) og 16, ble 17-EDP metyl Ester (0,029 g, 19%), innhentet som klare oljer (total avkastning, 93%).
- Samle fraksjoner som inneholder renset EDP metyl Ester regioisomers. 19 (S), 20 (R)-EDP metyl Ester elutes først, etterfulgt av 16 (s), 17 (R)-EDP methyl ester.
- Hvis noen blandede fraksjoner gjenstår (som inneholder begge isomerene; kan vurderes av tynne lag kromatografi (TLC) i 8:1 Heksan/EtOAc og beiset med kalium kaliumpermanganat (KMnO4)), re-kromatografisk dem med samme løsningsmiddel systemet som før.
- Konsentrer fraksjoner som inneholder de enkelte regioisomers.
Merk: på dette tidspunktet kan identitet og renhet vurderes av NMR (ved bruk av CDCl3 som løsningsmiddel; se forklaringen for figur 2). - Hvis du vil konvertere individuelle edb methyl ester regioisomers til sine syre former, fortynne EDP Ester i THF: vann (ca. 0,7 mL/0,1 mmol av Ester). Tilsett 2 M vandig LiOH (3 molar ekvivalenter) og rør over natten.
Merk: fullstendigheten av reaksjonen kan vurderes av TLC, med 3:1 hexaner/EtOAc, farging med KMnO4; produktet har en oppbevarings faktor på ~ 0,3. - Slukke reaksjonen langsomt med maursyre syre, inntil pH i blandingen når 3-4. Tilsett vann og etanol acetate (1-2 mL/0.100 mmol av Ester) og skille lagene. Pakk ut vann laget med EtOAc (3 x 5 mL), vask med mettet saltlake (NaCl) løsning, og tørk EtOAc laget over vannfri natriumsulfat (na2så4).
- Konsentrere den etanol acetate løsningen ved hjelp av en roterende fordamper, tilsett hexaner (10 mL) og konsentrere seg igjen. Gjenta to ganger for å azeotropically fjerne rester av maursyre syre. Rens rester av Flash kolonne kromatografi, tent med 10-30% EtOAc over 15 min.
- Konsentrer de ønskede fraksjoner og tørk i vacuo å ha råd til renset syre.
Merk: på dette stadiet, kan enantiomeriske renhet vurderes (ved chiral HPLC, se legender for Figur 3 - Figur 4 for kolonne og betingelser). Kjemisk renhet kan vurderes av C18 (achiral) HPLC (se tabell over materialer og referanse 14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Glimtet søylen kromatogram (utført benytter en automatisert glimtet rensing system idet beskrevet neden) oppnådd på rensing av det grov blanding fra enzymatisk epoxidation er vist inne skikkelsen 1. Etter esterification og separasjon av regioisomers, ren 16 (s), 17 (r)-EDP og 19 (s), 20 (r)-EDP methyl estere ble innhentet. Vanligvis er de til stede i en omtrentlig 1:4 til 1:5 ratio, med hovedproduktet er 19 (S), 20 (R)-EDP. Ingen andre EDP-regioisomers (for eksempel 13, 14-eller 10, 11-EDP) er innhentet. 1H-NMR Spectra av 16 (s), 17 (r)-EDP (figur 2a) og 19 (S), 20 (r)-EDP (figur 2b) methyl estere sammen med sine strukturer er vist nedenfor, noe som indikerer høy renhet av disse forbindelser C18 (achiral) HPLC av syre former også indikert renheter > 98%. Deres identitet ble ytterligere bekreftet av høyoppløselig masse spektroskopi (begge av syre og Ester former), som ga masse/charge prosenter og fragmentering mønstre i samsvar med de identifiserte EDPs. Enantiomeriske renhet ble bestemt ved hjelp av chiral HPLC, sammenlignet med autentiske enantiopure og blandede standarder for EDPs (i deres syre form, figur 3a og figur 4a). Som kan observeres i figur 3b og figur 4b, både EDPs fremstilt ved enzymatisk epoxidation er svært enantiopure følgende forsåpning (> 99% en enantiomeren). Identiteten til disse enantiomerer ble tidligere rapportert å være 16 (s), 17 (r)-og 19 (s), 20 (r)-EDP18.
Figur 1 . Kromatogram fra rensing av råolje blanding innhentet fra enzymatisk epoxidation av DHA (sammen med relevante strukturer). Midt toppen (monoepoxide) inneholder ønsket EDPs. Rensing ble utført ved hjelp av en automatisert Flash rensing system (se tabell over materialer). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Eksempel 1H-NMR Spectra fra Pure 16 (S), 17 (r)-EDP methyl ester (2a) og 19 (S), 20 (r)-EDP methyl ester (2b). Spectra ble spilt inn på 500 MHz i CDCl3 (løsemiddel er synlig på 7,26 ppm og rest vann på 1,6 ppm). De kjemiske skiftene er som følger: 16 (S), 17 (R)-EDP methyl ester: 1H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.57-5.35 (m, 10 h), 3,68 (s, 3 h), 2.99-2.95 (m, 2 h), 2.87-2.83 (m, 6 h), 2.47-2.37 (m, 6 h), 2.29-2.21 (m, 2 h), 2.11-2.05 (m, 2 h), 0,99 (t, J = 7,5 Hz, 3 h); 19 (S), 20 (R)-EDP methyl ester: 1H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.54-5.35 (m, 10 h), 3,68 (s, 3 h), 2,97 (td, j = 6,4, 4,2 Hz, 1 h), 2,91 (td, J = 6,3, 4,2 Hz, 1 H), 2.85-2.82 (m, 8 h), 2.44-2.36 (m, 5 h), 2.27-2.21 (m, 1 H), 1.65-1.51 (m, 3 h), 1,06 (t, J = 7,5 Hz , 3 H). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. CHIRAL HPLC som indikerer enantiopurity av 16, 17-EDP (syre form) produsert av BM3. Figur 3a viser en chiral HPLC-kromatogram av "racemiske" 16, 17-EDP (en kunstig blanding av autentiske standarder for både enantiomerer14), mens figur 3b viser en chiral HPLC-kromatogram på enantiopure 16 (S), 17 (R )-EDP produsert av epoxidation av DHA med BM3, vurdert som > 99% S, R isomer. Kolonnen er cellulose BAS ert (se tabell over materialer, 250 x 4,6 mm, 5 μm, 1 000 å) tent med isocratic 45% 50 mM ammonium bikarbonat (NH4HCO3) i metanol (30 min), med en prøve konsentrasjon på 0,5 mm og strømningshastighet på 1 ml/min. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. CHIRAL HPLC som indikerer enantiopurity av 19, 20-EDP (syre form) produsert av BM3. Figur 4a viser en chiral HPLC kromatogram av "racemiske" 19, 20-EDP (en kunstig blanding av autentiske standarder for både enantiomerer14), mens figur 4b viser en chiral HPLC kromatogram av enantiopure 19 (S), 20 (R)-EDP produsert ved epoxidation av DHA med BM3, vurdert som > 99% S,R isomer (metode som beskrevet for Figur 3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Samlet enzymatisk epoxidation reaksjons ordning og relevante strukturer av AA, EPA, EETs og EEQs produsert av denne metoden kan du klikke her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 . Chiral HPLC som indikerer enantiopurity av 17, 18-EEQ (syre form) produsert av BM3. Figur 6a viser en chiral HPLC-kromatogram av "racemiske" 17, 18-EEQ (en kunstig blanding av autentiske standarder for både enantiomerer14), mens figur 6b viser en chiral HPLC-kromatogram på enantiopure 17 (S), 18 (R )-EEQ produsert av epoxidation av EPA med BM3, vurdert som > 99% S,R isomer (metode som beskrevet for Figur 3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterer her en operativt enkel og kostnadseffektiv metode for å forberede de to mest tallrike epoxy metabolitter av DHA-19, 20 og 16, 17-EDP. Disse epoxy fettsyrer kan tilberedes i svært enantiopure (som sin S, R-isomerene) form med vill-type BM3 enzym. Flere kritiske punkter som kan brukes til feilsøking, og forlengelsen av vår metode for å forberede enantiopure epoxy metabolitter av AA og EPA, er beskrevet nedenfor.
BM3 lagring retningslinjer
Lagring av renset BM3 enzymet er mulig ved å blande protein løsning med samme volum av glyserol og blits frysing med flytende nitrogen før lagring i en-78 ° c fryser. Når enzymet er frosset, kan det lagres i opptil et år. Enzymet kan bare tint en gang, må tint på isen, og kan bare stå på isen for 4 h. frysing igjen, og slik at enzymet å tine uten et is bad vil deaktivere enzymet.
Retningslinjer for kjemisk lagring
Mange av forbindelsene som kreves for prosedyren er luft-sensitive. Disse inkluderer DHA og andre Fuf, EDPs og andre epoxy metabolitter, og NADPH. For å hindre peroxidation (og andre oksidativt prosesser) av disse forbindelsene, skyll alltid beholderne der de er lagret med Argon eller nitrogen, og oppbevar ved-78 ° c.
En annen viktig merknad er løsningen som DHA er lagret. Selv om DHA er ikke veldig stabil i DMSO, BM3 er uforenlig med etanol og metanol, så DMSO må brukes. For å motvirke dens lave stabilitet må DHA-blandingen tilberedes på samme dag som epoxidation. Den totale DMSO-prosenten i reaksjonsblandingen må holdes under 1% for å unngå å deaktivere enzymet. I tillegg, fordi NADPH har en kort hylle livet, bør konsentrasjonen sjekkes med spektrofotometer før tillegg til reaksjon. Dette sikrer at 1 tilsvarende NADPH alltid legges til reaksjonsblandingen.
Retningslinjer for Epoxidation reaksjon
Luftstrømmen fra ballongen inn i reaksjonsblandingen må opprettholdes for å holde reaksjonen oksygenrikt som oksygen er nødvendig for epoxidation. Blandingen må også røres raskt, siden Fuf ikke er veldig oppløselig i vann (løselighet av DHA er ≤ 125 μM i reaksjons bufferen). Reaksjonen er slukket med oksalsyre syre til denaturere protein (som det Chelates metall og fjerner kofaktorer) og syre holder DHA sin nøytrale form, noe som er nødvendig for dietyl Eter utvinning. Den brå slukking av reaksjonsblandingen må gjøres langsomt for å unngå syre-katalysert hydrolyse av EDPs.
Retningslinjer for utpakking og rensing av EDP
Ether ble valgt spesifikt som avsugs løsningsmiddel av flere grunner. Diklormetan kan utløse protein ut av løsningen, noe som kompliserer utvinningen. EtOAc ekstrakter glyserol (lagt med enzymet lagerløsning), som er vanskelig å fjerne og forstyrrer blitsen kromatografi.
EDP-regioisomers i deres frie syre tilstand er ikke lett separable, noe som er grunnen til at regioisomers blandes inn i en enkelt topp i den første Flash-kolonnen kromatografi. Når de er konvertert til metyl estere, regioisomers er lett separable. I tillegg, estere er generelt mer stabile enn de tilsvarende syrer for langtidslagring hvis syreformen ikke er nødvendig umiddelbart.
Betydningen av metoden med hensyn til eksisterende/alternative metoder
Vår metode gir en enkel og effektiv metode for å skaffe enantiopure EDPs, som har mange fordeler fremfor eksisterende og alternative metoder. Først kjemisk epoxidation av DHA og andre Fuf og deres derivater er verken regioselektive eller enantioselective, og kompliserte blandinger er ofte innhentet. Flere Flash kromatografi søyler og preparativ HPLC, inkludert chiral preparativ HPLC, er derfor nødvendig å rense enantiopure epoxy fettsyrer fra disse blandinger, som er arbeidsintensiv og kan produsere bare svært små mengder av ønsket Metabolitter. Total syntese kan også anvendes for å produsere epoxy fettsyrer, men det er streng, tidkrevende, krever flere trinn, og gir en lav total avkastning, mens BM3 enzymet er lett å uttrykke og rense, og epoxidation er fullført innen en kort periode på Tid. Vår metode er også kostnadseffektiv: en kommersiell kilde20 i dag tilbyr 16, 17-og 19, 20-EDP (som deres racemates) for 528 USD/0,5 mg. 1 g av NADPH kan også kjøpes for ~ 500-800 USD, og kan brukes til å produsere over 200 ganger mengden av 19, 20- EDP (og omtrent 50 ganger så mye som 16, 17-EDP) tilbød kommersielt for en tilsvarende pris-og i enantiopure former, som for øyeblikket ikke er kommersielt tilgjengelig.
Begrensninger for metoden
Ettersom dette enzymet fortrinnsvis epoxidizes det siste dobbelte båndet av DHA, er hovedproduktet 19, 20-EDP (selv om 16, 17-EDP også produseres). Derfor kan andre DHA-regioisomers som kan være ønsket (for eksempel 13, 14-EDP, 10, 11-EDP) ikke bli produsert av enzymatisk epoxidation med vill-type BM3. Likeledes, idet bare det SR-enantiomerer er produsert av BM3, det RS-enantiomerer er utilgjengelig, til tross for våre tidligere offentliggjort kjemikalie inversjon metoden14 kanskje bli brukt til å syntetisere seg. I tillegg, på grunn av den lave løselighet av lipofile Fuf i reaksjons bufferen, ville svært store mengder buffer være nødvendig for Storskalaproduksjon (ca. 500-1000 mg) av EDPs, som potensielt kan gjøre utvinning tidkrevende eller uoverkommelige.
Andre anvendelser av metoden
Behagelig, denne enzymatisk epoxidation protokollen gjelder også for EPA og AA (relevante strukturer er vist i figur 5). Konsentrasjonen, buffer og reaksjonstiden som kreves for epoxidation av alle tre fettsyrer er den samme. For EPA, det vill-type BM3 enzym er likeledes anvendt, og det EEQ brøk oppnådd fra EPA (56% utbytte av monoepoxide), etter esterification er ~ 14:1 17, 18-EEQ: 14, 15-EEQ. I likhet med observasjonene som er gjort for EDPs, er 17, 18-EEQ oppnådd svært enantiopure (> 99% 17 (S), 18 (R)-EEQ, se figur 6) som vurdert av chiral HPLC (se Figur 3 Legend og tabell av materialer). Identiteten til enantiomerer ble tidligere rapportert17. For AA, men den F87V BM3 mutant må brukes i stedet som vill-type BM3 er en hydroksylase for AA21. Uttrykk og rensing av dette mutant bruker også protokollen ovenfor, og epoxidation utføres på en analog måte. Ved denne metoden, 14, 15-EET oppnås som eneste regioisomer. Som 14, 15-EET fri syre er uatskillelig fra ureagerte AA etter epoxidation, esterification er nødvendig; 14, 15-EET metyl Ester er innhentet i 52% avkastning fra AA. Chiral HPLC (se Figur 3 Legend og materialfortegnelsen) av syren indikerer svært enantiopure (> 99%) 14 (r), 15 (r)-eet (som tidligere rapportert)15. De kjemiske Skift for disse EPA og AA metabolitter er som følger: 17 (S), 18 (R)-EEQ metyl Ester:1H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.53-5.34 (m, 8 H), 3,67 (s, 3 h), 2,96 (TD, J = 6,4, 4,2 Hz, 1 H), 2,90 (td, J = 6,3, 4,2 Hz, 1 h), 2.85-2.79 (m, 6 h), 2.44-2.38 (m, 1 H), 2,32 (t, J = 7,5 Hz, 2 h), 2.26-2.20 (m, 1 h) , 2,11 (q, j = 6,7 Hz, 2 h), 1,71 (kvintett, j = 7,4 Hz, 2 h), 1.66-1,50 (m, 2 H), 1,05 (t, j = 7,5 Hz, 3 h); 14 (S), 15 (r)-eet methyl ester: 1 den andre H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.53-5.33 (m, 6 H), 3,67 (s, 3 h), 2.95-2.92 (m, 2 h), 2,81 (DT, J = 17,8, 5,8 Hz, 4 h), 2,40 (dt, J = 14,1, 6,8 hz, 1 h), 2,32 (t, j = 7,5 Hz, 2 h), 2,23 (DT, j = 14,1, 6,8 Hz, 1 H) , 2,11 (q, J = 6,8 Hz, 2 h), 1,71 (kvintett, j = 7,4 Hz, 2 h), 1.56-1.41 (m, 4 h), 1.38-1.30 (m, 4 h), 0,90 (t, J = 7,1 Hz, 3 h).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er finansiert av r00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) og oppstart midler fra Michigan State University. Forfatterne ønsker å takke Dr. jun Yang (University of California på Davis) og Lalitha Karchalla (Michigan State University) for å få hjelp med optimalisering av enzymatisk reaksjon, og Dr. Tony Schilmiller (MSU Mass massespektrometri og Plantemetabolomikk Facility) for hjelp med HRMS datainnsamling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
References
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
- Ulu, A., et al. An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).
- Ye, D., et al. Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).
- Imig, J. D. Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury. Hypertension. 65, 476-682 (2015).
- Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation. Scientific Reports. 6, 39211 (2016).
- Zou, A. P., et al. Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity. American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).
- Lauterbach, B., et al. Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators. Hypertension. 39, 609-613 (2002).
- Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , National Center for Health Statistics. Hyattsville, MD. (2015).
- Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease. Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).
- Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters. Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).
- Ostermann, A. I., Schebb, N. H. Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids. Food & Function. 8, 2355-2367 (2017).
- Khan, M. A., Wood, P. L. Method for the synthesis of DHA. , WO2012126088A1 (2012).
- Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).
- Cinelli, M. A., et al. Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids. Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).
- Falck, J. R., et al. Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid). Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).
- Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium. Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).
- Capdevila, J. H., et al. The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3. Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).
- Lucas, D., et al. Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450. Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).
- Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase. Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).
- Cayman Chemical, 19,20-EpDPA. , https://www.caymanchem.com/product/10175 (2019).
- Graham-Lorence, S., et al. An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase. Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).
