Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

בזמן אמת, חצי אוטומטי מדידה פלורסנט של משטח נתיב האוויר הנוזלי של ה-pH העיקרי של תאים אפיתל דרכי האוויר האנושי

Published: June 13, 2019 doi: 10.3791/59815
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2,4, 1,2, 2,3, 1
1Epithelial Research Group, Institute for Cell and Molecular Biosciences, Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, 2Respiratory Group, Institute of Cellular Medicine, Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, 3Paediatric Respiratory Medicine, Great North Children's Hospital, Newcastle upon Tyne Hospitals NHS Foundation Trust, 4Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לבצע מדידות דינמיות של pH נוזלי משטח האוויר בתנאי סרט דק באמצעות קורא צלחת.

Abstract

בשנים האחרונות, את החשיבות של משטח המים של רירית בדרכי הנשימה כבר הודגש על ידי יכולתה להסדיר את משטח הנשימה נוזלי (asl) לחות, צמיגות ריר ופעילות של פפטידים מיקרוביאלית, פרמטרים מפתח מעורב הגנה מולדת של ריאות. זה של הרלוונטיות העיקרית בתחום של מחלות הנשימה כרונית כגון סיסטיק פיברוזיס (CF) שבו פרמטרים אלה אינם מוסדרים. בעוד קבוצות שונות למדו ASL pH הן בvivo והן בתחום החוץ, השיטות שלהם לדווח על מגוון רחב יחסית של ערכי ה-pH ASL ואפילו ממצאים סותרים לגבי כל הבדלים ב-pH בין תאים שאינם CF ו-CF. יתר על כן, הפרוטוקולים שלהם לא תמיד לספק מספיק פרטים כדי להבטיח את הנתונים, רוב התפוקה נמוכה דורשים ציוד יקר או ידע מיוחד כדי ליישם, מה שהופך אותם קשה להקים ברוב המעבדות. כאן אנו מתארים למחצה אוטומטי הקורא לוחית הניאון האפשרות המאפשרת מדידה בזמן אמת של ASL pH תחת תנאי הסרט דק כי דומה יותר במצב vivo. טכניקה זו מאפשרת מדידות יציבה במשך שעות רבות מתרבויות דרכי הנשימה מרובים בו זמנית, וחשוב, שינויים דינאמיים ב ASL pH בתגובה אגוניסטים ומעכבי ניתן לפקח. כדי להשיג זאת, ASL של הבדיל במלואו תאים האפיתל דרכי הנשימה האנושית (hAECs) הם מוכתם לילה עם צבע pH-רגיש כדי לאפשר את ספיגת הנוזלים העודפים כדי להבטיח את המצב הסרט הדק. לאחר הזריחה הוא מפוקח בנוכחות או העדר של אגוניסטים, כיול pH מבוצע באתרו כדי לתקן את הנפח ואת הריכוז לצבוע. השיטה המתוארת מספקת את הפקדים הנדרשים כדי להפוך יציבה מדידות ASL pH, אשר בסופו של דבר יכול לשמש כפלטפורמה גילוי התרופה עבור רפואה אישית, כמו גם מותאם רקמות אפיתל אחרות וניסיוני תנאים, כגון מודלים דלקתיים ו/או פתוגן-מארח.

Introduction

האפיתל של דרכי הנשימה מכוסה על ידי דק (~ 10 μm) שכבת הנוזלים כינה את משטח הנשימה נוזלי (ASL). הרכב ועומק (לחות) של asl זה מוסדר היטב ושולט ביעילות של פינוי דרכי הנשימה על ידי הדרגנוע mucociliary1,2,3,4. בשנים האחרונות, את החשיבות של asl H+/hco3- תוכן הוכח על ידי קבוצות שונות בשל יכולתה לווסת asl לחות5, דלקת דרכי הנשימה6 ו זיהום7, 8 וכן צמיגות של ריר8,9. חשוב, למרות שקיים מחלוקות מסוימות, מחקרים רבים דיווחו על דיסרגולציה של pH של דרכי הנשימה במחלות דרכי הנשימה כרונית כגון אסטמה10,11,12, copd11, ברונכיאקטזיס11, כרוניתrhinosinusitis 13,14 ו סיסטיק פיברוזיס (CF)5,9,15,16,17, אשר מציע כי טיפולים השחזור ASL pH יכול להיות שימושי כדי לטפל בסוגים מרובים של מחלות דרכי הנשימה כרונית. CF הוא המחלה השכיחה ביותר אוטוזומלית רצסיבי באוכלוסיות קווקזיות והוא בשל מוטציות ב-מוליכות החשמלית CF הרגולטור (CFTR) גן. זה קודים גן אניון (hco3- ו-Cl-) ערוץ המשחק תפקיד מכריע של הובלה יון ונוזלים הומאוסטזיס על פני epithelia18. למרות CF הוא מחלה רב איברים, פתולוגיה של ריאות היא הגורם העיקרי של תחלואה ותמותה19,20 בהתחשב הפגם העיקרי ב-CF הוא הובלה לקויה של קלרנית-ו- hco3-, אחד יכול לההשערה pH נוזלי מסחטות באנשים עם CF יהיה בלתי מוסדר לעומת אנשים שאין להם CF. Thus, המדידה של ASL pH כבר אזור אקטואלי של מחקר CF וקבוצות שונות פיתחו טכניקות למדוד ASL pH ב CF איירווייז.

בשנת vivo, pH בדרכי הנשימה נמדד באמצעות טכניקות שונות, מ מיקרו זונדים (סיבים אופטיים, זהב או מולודיום רגשים)5,21,22,23,24 מדידות pH של חומר מקוצר או מעובה נשימה נשפה (ebc)10,11,12,25,26,27. בתחום המחקר של CF, pH הוא למד נרחב בשל ההשלכות הקליניות הפוטנציאליות שלה. תיאורטית, הפיכת דרכי הנשימה לאלקליין יותר יכולות להגביר את ההרג החיידקי ולשפר את הסיווג המודלקת והומאוסטזיס בכללותה. עם זאת, במחקרים vivo/ex vivo לדווח על מגוון רחב של ערכי pH, ועד היום, התוצאות אינן מכרעת לגבי קיומו של הבדל ב-ph בין NON-cf ו-cf איירווייז. בשנות האלפיים המוקדמות, קבוצות שונות דיווחו על ה-pH של EBC. בקבוצות שאינן חולות, ערכי ה-ph נעו מ 4.6 אל 8.5 אך מעניין, ebc pH נמצא חומצי יותר במהלך השאיפה אצל אנשים עם CF12,27. לאחרונה, ב vivo מדידות של asl במודלים אנושיים ובעלי חיים של CF דיווחו על תוצאות סותרות16,17,21,22,23, 24 וזה עדיין לא ברור אם האיירווייז CF הם חומציים יותר מאשר non-CF איירווייז.

כמו במדידה vivo של ASL התחתון pH הוכיחה קשה בשל כמות קטנה מאוד של נוזל הבטנה את הנשימה ואת הנוכחות הפוטנציאלית של מאטמי ריר במחלה, קבוצות רבות הפכו בניסויים מבחנה כדי למדוד ASL pH, בעיקר באמצעות שלושה שונים תודולוגיות. הגישה הראשונה משתמשת dextran ביחד תא-ציוויים משמעותו הצבעים פלורסנט pH-רגישים שנוספו כאבקה יבשה, או ישירות asl או באמצעות נוזל אינרטי הנקרא perfluorocarbon (טוראי ראשון)5,8,16 , מיכל בן 17 , מיכל בן 28 , בן 29 , בן 30 , מיכל בן 31 , 32. עם זאת, טכניקה זו מספקת שליטה מועטה על כמות הצבע המדויקת הנוספת לתרבויות ומציגה סיכון לאגרגטים לצבען והבדלים גדולים בריכוז בין דוגמאות ו/או ניסויים ואף בתוך אותה דוגמית . בדרך כלל בוצע במיקרוסקופ קונפוקלית וקד, אשר מגביל את תחולתו ובמקרים רבים, מונע ניטור מפורט של דגימות ושינויים מרובים בתנאי הקלטה. השיטה השנייה המועסקים למדוד asl ph הוא השימוש של מיקרואלקטרודות רגישות ל-ph5,15. לפיכך, מדידות ASL pH אינן תלויות בריכוז לצבוע פלורסנט וצריך לתת תוצאות חזקות יותר ומאודלות. עם זאת, שיטה זו אינה מאפשרת מדידות דינמית בזמן אמת של ASL pH, וגם לא קל לבצע קריאות מרובות בתנאים שונים. זהו גם עבודה אינטנסיבית, מורכבת, תהליך הדורש ציוד מומחה (מיקרואלקטרודה ייצור/אלקטרופיזיולוגיה הקלטה התקנים) והדרכה עבור אוסף של דגימות עבור מדידה pH וכיול עוקבות. יתר על כן, שתי טכניקות אלה הראו גם כמה חוסר עקביות ביכולת לייצר תוצאות לאחר מכן: באמצעות השיטה pH-תלויית צבע פלורסנט, טאנג et al. דיווח ערכים של 7.35 עבור non-CF ASL ו 7.0 עבור CF ASL8 ואילו בעוד הנייר האחרון מאותה קבוצה, ASL pH היה 6.9 ו 6.4 עבור לא CF ו CF, בהתאמה17. באופן דומה, מדידות מיקרואלקטרודה נתן ערכים של 6.4 ב-CF ASL ו 6.1 ב CF ASL במחקר מ 200315 בעוד הקבוצה אותה דיווחו ערכים של 6.7 עבור NON-CF asl ו 6.45 עבור CF asl במחקר מ 20135. בסופו של דבר, בגישה השלישית, החוקרים להוסיף נפח גדול יחסית של פתרון באגירה חלש על המשטח (mucosal) של התרבויות, ובכך להרוס את תנאי הסרט דק ושינוי הרכב ASL, פוטנציאל הרגולציה שלה. ph הוא נמדד אז באמצעות ph-תלויית צבעי פלורסנט33, על ידי שיטת ph-stat השיטה בחדר ussing13,14, או דורש asl מדולל להיות מוסר מן התרבויות ו-ph נמדד באמצעות pH אלקטרודה, מנתח או רצועות לקמוס34. קושי נוסף במדידה המדויקת של ASL pH הוא הקמת עיקול סטנדרטי שהוא מדויק ככל האפשר. ואכן, האם הקריאות מבוצעות באמצעות אלקטרודה שתמדוד את ההפרש בפוטנציאל החשמלי באמצעות שרף או שימוש בצבעי פלורסנט הרגישים ל-pH, הן הגישות הללו יושפעו על ידי המיקרו-סביבה המקומית של הדגימות נמדד. באופן ספציפי יותר, קבוע הדיסוציאציה (Kd) של הצבעים עשוי להשתנות באופן משמעותי בהתאם לטמפרטורה, כוח יוניים, צמיגות, כמו גם אינטראקציה פוטנציאלית של הצבע עם המרכיבים הסלולריים כגון חלבונים וכלי פוטנציאל.

כדי לנסות להתגבר על רבים מהנושאים הטכניים הללו, כמו גם לפתח שיטת תפוקה דינמית יותר, פשוטה וגבוהה יותר, הקמנו טכניקת חוץ-גופית הרושמת את ASL pH בתרבויות הראשיות hAEC באמצעות תא-הכוונה ל-pH רגיש צבע פלורסנט בקורא לוחית מסחרי רגיל. השיטה מייצרת מדידות של שדרוג, דינמי, חצי אוטומטי, בזמן אמת של ה-ASL pH של הבדיל באופן מלא תרבויות התא תלת-ממדי תחת תנאי סרט דק. באמצעות שימוש בקורא צלחת מרובת היטב, זו שיטת חצי אוטומטי יכול לעשות ליד מדידות סימולטני של pH עד 24 מצבים מעל 12 h והוא יכול לפקח על ההשפעה של הוספת אגוניסטים שונים או מעכבי. במאמר זה אנו מתארים את המתודולוגיה בפירוט התוצאות נציג דוחות תחת תנאי שליטה חיוביים ושליליים המאמת את הטכניקה.

Protocol

ראשית non-CF (n = 3 תורמים, גיל 34, 27 ו -23 שנים) ו-CF (n = 3 תורמים, כל F580del/F508del; גיל 40, 41, לא ידוע) hAECs היו מתנה טובה ד ר סקוט רנדל (Marsico מכון לריאות, אוניברסיטת צפון קרוליינה בצ היל, ארצות הברית) היו obtai נד תחת פרוטוקול03-1396 אושרה על ידי אוניברסיטת צפון קרוליינה בבית התפילה היל ביורפואי מוסדי הלוח סקירה. התאים גדלו על פי שיטות שפורסמו בעבר באמצעות הצמיחה ובידול מדיה תיאר פולצ'ר ו רנדל35,36.

1. הכנה לדוגמא

  1. לגדול haecs העיקרי על 6.5 מילימטר קוטר החלק החדיר (טבלת חומרים) באוויר-נוזלי ממשק לפחות 28 ימים, כפי שתוארה בעבר35,36.
  2. להכין 50 mL של פתרון סטרילי של hco3- המכילים מאגר krebs פתרון (hco3- krb, ריכוזים מקבלים mM נחקו3 (25) הנאגל (115), kcl (5), לארג2 (1), mgcl2 (1), D-גלוקוז (5)) ולסנן-לעקר באמצעות מסנן מזרק 0.2 יקרומטר.
  3. לשנות את המדיום basolateral לתוך בינוני בידול טרי כפי שמתואר ב 1.135,36.
    הערה: הוכח כי הריכוז בזלת שצלעות של גלוקוז משפיע על ASL pH33. בשלב זה, את תכולת הגלוקוז של התא basolateral יכול להיות נשלט על ידי החלפת המדיום על ידי פתרונות באגירה של ריכוזי גלוקוז ידוע.
  4. לשטוף את המשטח הרשמי של התאים על ידי הוספת 150 μl של hco3- krb ו-דגירה של 20 דקות ב 37 ° צ', 5% CO2.
  5. להסיר את הכביסה פסגה מבלי לשבש את האפיתל על ידי שאיבת אותו בזהירות באמצעות זכוכית סטרילית פסטר pipet ו P200 pipet עצה מקושר משאבת השאיפה היוצרת ואקום בבקבוק האוסף. בשלב זה, צריך להיות כמו נוזל קטן שנותר על פני השטח פסגה ככל האפשר כדי לשחזר את ממשק נוזלי אוויר.
  6. דגירה את התאים עבור 30 דקות נוספות ב 37 ° c, 5% CO2.

2. מדידת רקע

  1. הפעל את קורא הלוחית ואת המחשב.
  2. . פתח את לוח המחוונים
  3. לחץ על ניצוץ 10M, פתח את בקרת הטמפרטורה והגדר עד 37 ° c. פתח את בקרת הגז והגדר את שיתוף2 עד 5%.
  4. המתן עד שטמפרטורה ו-CO2 הגיעו ליעדם.
  5. פתח את מגירת קורא הצלחות, הכנס את קלטת הלחות המלאה ב-6 מ ל של dH2O בכל צד. ודא את המכסה ואת החלק התחתון של הצלחת הם נקיים – אם לא, נקי עם 70% של אתנול על פיסת רקמה-ומניחים את הצלחת בקלטת לחות.
    הערה: לאורך הניסוי, מכסה הצלחת של תרבות הרקמה נשמר על הצלחת והוסר רק בעת הוספת תרופות או שינוי המדיום בזלת צלעות, אשר מבוצעים בתרבות רקמה למינטת מכסה כדי לשמור על התרבויות בסביבה סטרילית.
  6. פתח את עורך שיטות הניצוץ והגדר את הפרמטרים בתוכנה באופן הבא:
    1. בחר את תבנית הלוחית המתאימה (עבור תמיכה בקוטר 6.5 מ"מ למחצה הניתנת לחדירות, בחר את ה-24 צלחת) ואת הבארות שיעקבו אחריהם במהלך ניסוי זה.
    2. הוסף טמפרטורה ו-CO2 לוח הבקרה ולהגדיר אותם 37 ° צ' ו 5%, בהתאמה. סמן את ההמתנה לתאי טמפרטורה/גז .
    3. הוסף לוח לולאה קינטית ובחר את המשך כסוג לולאה והגדר אותו ל-5-10 דקות. בחר באפשרות לא להגדיר כסוג מרווח כדי לאפשר קריאה רציפה.
      הערה: תזמון הקריאה הרציפה תלוי במספר הבארות/התנאים. 5 דקות הוא מספיק זמן עבור 6-12 בארות, ואילו צלחת מלאה המכילה 24 תנאים ידרוש 10 דקות של מדידות רציפה.
    4. בתוך הלולאה הקינטית, להוסיף שתי "בעוצמה פלואורסצנטית" פאנלים, באמצעות גרור ושחרר פונקציה, כי יהיה להגדיר את ה-pH רגיש ואת צבעי הפלורסנט pH רגישות בהתאמה. הגדר העירור ואת אורכי גל הפליטה כדי 560 ו 590 nm, בהתאמה, עבור הצבע הרגיש pH ו 495 ו520 ננומטר, בהתאמה, עבור צבע בלתי תלוי-pH.
    5. הגדר את מספר הבזקים ל 30 ואת z-מיקום 33200 עבור כל fluorophore.
      הערה: מיקום z והגדרות הרווח תלויים במאפייני קורא הלוחית. הגדר את הרווח באופן ידני לערך שיעניק ספירות מספיקות כך שההבדלים בין הדגימות יאספו אך מספיק נמוכים כדי שתוספת אגוניסט לא תפיק ערכים מטווח הזיהוי.
    6. הגדר את המספר הכולל לקריאה לכל משתמש המוגדר כסוג מעגל של 3 × 3 גודל עם גבול של 4750 μm.
  7. לחץ על לחצן התחל כדי לבצע מדידה ברקע ואישור כדי לאשר את המכסה של הקלטת לחות ממוקם במקום.
  8. בסוף המדידה, לפתוח את המגירה קורא לוחית, לקחת את הצלחת החוצה Pplace את cellsit לאחור בחממה תוך הכנת הפתרון ערבוב צבע פלורסנט.
  9. להכין את הפתרון ערבוב צבע פלורסנט על ידי הוספת 2 μl של 1 מ"ג/mL dextran מצמידים בשילוב pH-רגישים (phsens) צבע פלורסנט ל 0.2 μl של 10 מ"ג/mL dextran-מצמידים בשילוב של pH-לצבוע (phsens) פלורסנט ו 0.8 μl של משולב החברה3- krb עבור הסופי נפח של 3 μL לכל תנאי.
    הערה: הנפח הכולל של פתרון ערבוב לצבוע צריך להיות מוכן עבור n בארות +1 אם יש בין 1 ל 10 דגימות, או n בארות + 2 אם יש בין 11 ל 24 דגימות. הצבעים dextran מצמידים מחדש ב-hco מסוננים, מסונן3- krb פתרון, מצוטט ומאוחסן ב-20 ° c. כל כימיקל ניתן להוסיף בשלב זה עבור 16-24 h הדגירה תקופה37 על פני השטח האפירשמי. כימיקלים צריך להיות מוכן 0.1 x, כמו הכרך הסופי, לאחר ספיגת הנוזל עודף על ידי התרבות, יהיה סביב 0.3 μL עבור תמיכה בקוטר 6.5 מ"מ למחצה.
  10. בזהירות להוסיף 3 μL של תערובת לצבוע (לראות 2.8) אל פני השטח הרשמי של התאים והדגירה לילה ב 37 ° c, 5% CO2.

3. קינטי מדידה

  1. חזור על שלבים 2.1 כדי 2.4 כדי להכין את קורא הלוחית.
  2. לחצו על הסמל ' פתח ' ובחרו בקובץ השיטה ששימש למדידות הרקע
  3. בלוח לולאה קינטית, לשמור את סוג הלולאה כמו משך ולהגדיר אותו ל-08 שעות. שנה את סוג מרווח הזמן לקבוע והגדר אותה ל-5 דקות. השאר את הפאנלים בעוצמה של קרינה בדומה למידות הרקע
    הערה: סוג מרווח עבור מדידות רקע מוגדר כ "לא מוגדר" כדי לאפשר קריאה רציפה. עבור קינטי כמו גם ניסויים כיול, סוג מרווח מוגדר "קבוע" עם מרווח של 5 דקות. ניתן לכוונן זאת בהתאם לעיצוב הניסוי ולמספר התנאים.
  4. פתח את מגירת קורא הצלחות; הכנס את קלטת הלחות מלאה ב -6 מ ל של dH2O בכל צד. ודא את המכסה ואת החלק התחתון של הצלחת הם נקיים – אם לא, נקי עם 70% אתנול על פיסת רקמה-ומניחים את הצלחת בקלטת לחות, עם הכיסוי שלה.
  5. הפעל קריאות זריחה על ידי לחיצה על התחל. לחץ על אישור לאחר הבטחת המכסה של קלטת הלחות במקומה.
  6. לאחר n מחזורים, בדרך כלל בין 12 ל-24, ששווה ל-1 עד 2 שעות, לחץ על השהה כדי לקטוע את הניסוי. קחו את הצלחת החוצה והחילו כל תרופה/אגוניסטים basolaterally לדגימות השונות.
    הערה: כאשר התאים נלקחים מתוך הקורא לוחית, CO2 בורח וזה יגרום לעלייה ב-Asl pH כפי שמוצג על ידי ירידה ב-ph-רגישות לצבע הקרינה. זה CO2המושרה pH שינוי היפוך בתוך 10-15 דקות לאחר הצבת התרבויות בחזרה קורא לוחית.
  7. לשים את הצלחת בחזרה בקלטת לחות על מגש, למקם מחדש את המכסה קלטת לחות ולחץ להמשיך כדי להקליט נוספת asl ph ולנטר את ההשפעה של תרופות/אגוניסטים על asl ph.

4. כיול pH באתרו

  1. . תוציא את הצלחת מקורא הלוחית
  2. מנושף את התמיסה הבינונית/פתרון.
  3. הוסף 750 μL ו-1 μL של פתרונות באגירה רגילה מאוד לאורך התאים העיליים והמשטח האפילי, בהתאמה.
    הערה: הפתרונות הסטנדרטיים באגירה מאוד מכילים (ב ממ) (86), KCl (5), CaCl2 (1.2), MgCl2 (1.2), NAHEPES או MES או טריס (100 mM). השתמש ב-MES כדי לאגור פתרונות עם pH נמוך מ 7, NaHEPES עבור פתרונות של pH 7-7.5 ו טריס עבור פתרון עם pH 8. הצמד את ה-pH לערך הרצוי באמצעות HCl.
  4. החלף את קו2 על קורא לוחית או להגדיר אותו 0.1% ולמקם את הצלחת בחזרה בקלטת לחות.
  5. הגדר את הקורא לוחית עם אותם פרמטרים כפי שמתואר קודם לכן, אך ללא CO2 כמו בשלב 3.2.
  6. , התחילו בקריאות הקרינה. כל 5 דקות בשביל 1-1.5 שעות

5. הערכת ההשפעה של ריכוז הצבע וההשעיה בנתוני כיול

  1. הכינו מספיק תערובת חומציות רגיש וחסר רגישות כדי להקליט את הזריחה במינימום של 4 ערכי pH שונים ב 3 כרכים שונים.
    הערה: כאן, לערבב 1 היה מוכן עם 26 μL של pH-רגישים (1 מ"ג/mL) ו-2.6 μL של pH-למעלה (10 מ"ג/mL) ו לערבב 2 עם 13 μL של pH-רגישים (1 מ"ג/mL) ו 1.3 μL של רמת החומציות (10 מ"ג/mL).
  2. הפץ 2.2 μL או 1.1 μL של תערובת 1 או לערבב 2, בהתאמה, לתוך 12 בארות של 96 הצלחת היטב ולהוסיף מספיק פתרונות כיול כדי להשיג כרכים הסופי של 50, 100 או 200 μL ומערבבים היטב.
    הערה: בהגדרה זו, ספירות פלואורסצנטית יירשמו עבור ריכוזי של צבעים של 5 μg/mL (ב-200 μL), 10 μg/mL (ב 100 או 200 μL), 20 μg/mL (ב50 או ב100 μL) או ב40 μg/mL (ב-50 μL).
  3. הפעל את הקורא, הגדר את הטמפרטורה ל-37 ° c והכנס את הצלחת בקורא הלוחית. אל תפעיל את בקר ה-CO2 .
    הערה: מאחר שזהו ניסוי קצר ודורש מספיק זמן כדי למדוד את הטמפרטורה, אין צורך בקלטת הלחות.
  4. להתאים את z-מיקום ולהשיג את צלחת הטוב 96 ולהשתמש באותם פרמטרים כמו עבור הניסוי נעשה על תמיכה למחצה חדירות.

6. ניתוח נתונים

  1. שמור את כל הנתונים לגיליונות אלקטרוניים וצור קובץ חדש.
  2. בקובץ הרקע, בחר את כל הנתונים הרעים עבור כל מדגם/תנאי עבור שני אורכי הגל, העתק והדבק לקובץ החדש. לחשב את הרקע הממוצע עבור כל באר כל אורך גל.
  3. חזור על הפעולה עם הכיול והנתונים הקינטית והפחת את הרקע מכל נקודת נתונים עבור כל אורך גל.
  4. עבור כל נקודת זמן וכל דוגמה, חשב את היחס בין הזריחה הרגישה ל-pH לבין קרינה בעלת רגישות גבוהה ל-pH
  5. אם כל הדגימות התקבלו מתורם פרטני, חשב את המשמעות של היחס בכל נקודת זמן של עקומת הכיול
    הערה: חשוב ליצור מספר רב של עקומות כיול כתורמים או כפתרונות בעלי צלעות. ואכן, פרמטרים אלה יכולים להשפיע על הרקע קריאות או שיעור ספיגת הנוזל, אשר בתורו ישפיע על ריכוז הצבע ולכן ה-pH מחושב.
  6. עבור כל נקודת זמן, צור עקומה סטנדרטית מהיחס, התוויית ערכי ה-pH המוכרים על ציר ה-x ועל היחס בציר ה-y.
  7. קבע את נקודת הזמן שבה היחס יציב, התאם לקו רגרסיה ליניארי וקבל את המשוואה עבור קו זה.
  8. מן הנתונים הקינטית, לחשב את ה-pH עבור כל נקודת זמן ולהתוות את ה-pH על ציר y ואת הזמן על ציר ה-x
    הערה: הנחה/pH בסיס יכול להיות מחושב על ידי ממוצע נקודות נתונים על מדידה יציבה של pH לפני הוספת כל אגוניסט או כל התערבות אחרת. ההשפעה של אגוניסט יכול להיות מאופיין על ידי חישוב ההבדל ב-pH לפני ואחרי (זמן מסוים) את הטיפול או על ידי התאמת עקומת לא ליניארי לנקודות הנתונים ישירות לאחר ההתערבות. הדבר יעניק מידע נוסף אודות ה-t1/2 והערך המקסימלי. לבסוף, ניתן להשיג גם את שיעורי החמצה או האלמלחת משיפוע של קו ישר שהותאם לנקודות הראשונות לאחר ההתערבות.

Representative Results

הטכניקה המתוארת לעיל מאפשרת את המדידה הדינמית של ASL pH בתוך עד 24 שונים של תרבויות hAECs העיקרי. איור 1 מציג סכמטי של השלבים העיקריים והציוד שהוגדר. התאים הטעונים לילה ממוקמים בתוך CO2 והטמפרטורה מבוקרת הקורא לוחית שבה הקרינה מצמידים dextran בשילוב הצבעים הרגישים ל-ph ו-ph מוקלטים כל 5 דקות.

Figure 1
איור 1: סכמטית של שיטת המדידה ASL pH. לאחר שטיפת התרבויות וביצוע קריאה ברקע, הראשי תאים האפיתל דרכי הנשימה האנושית (hAECs) ASL טעונים עם דקטרן מצמידים רמת pH רגיש ו-pH רגישות לילה ב 37 ° c, 5% CO2. למחרת, הצלחת מועברת לטמפרטורה וקורא לוחית של2מבוקרים וקרינה פלואורסצנטית משני הצבעים נרשם לאורך זמן. לאחר הניסוי, כיול באתרו מבוצע הנתונים נותחו והציג כ ASL pH לאורך זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ראשית, חקרנו את ההשפעה של כרכים שונים וריכוזי הצבע על מונה הזריחה ולכן על 560/495 יחס. אכן, המטרה של הוספת ה-pH-רגישות לצבע הרגיש ל-pH הוא לתקן את השונות בטעינת ASL. עם זאת, היה חשוב לבחון את ההנחה הזאת ולהעריך אם נוכל להשתמש בעקומת כיול סטנדרטית שבוצעה בהיעדר תאים בצלחת 96 היטב עבור כל הניסויים וסוגי תאים. אנו פיקוח על הזריחה ספירות מעל 1 h ב 50, 100 או 200 μl של פתרונות כיול (ב-pH 5.5, 6.5, 7 או 8) המכיל 5, 10, 20 או 40 μg/mL של צבעים. התוצאות מוצגות באיור 2a-C, ומראים שעבור אותו pH וריכוז זהה של הצבעים, יחס הפליטה המדווח של phsens/phsens (560/495 על ציר y) שונה בהתאם לעוצמת הקול (איור 2a). בנוסף, ב-pH זהה ובאותו אמצעי אחסון, ריכוזי צבע שונים מספקים ערכי יחס שונים (איור 2B). לכן, שינויים באמצעי האחסון או בריכוז הצבע ישפיעו על הערך המוחלט של ה-pH שחושב מיחס הפליטה. איור 2C מראה כי הזמן הנדרש עבור טמפרטורה לימוד היא כ 15-20 דקות. כדי לאשר את ההשפעה של ריכוז לצבוע ונפח על יחסי פליטה, הקלטנו זריחה מצבעים טעון ASL של העיקרי הלא-CF ו-CF hAECs באתרו. לאחר מכן ביצעת את הכיול וניתח את התוצאות על ידי (1) יצירת עקומת התקן הגלובלי אחד מכל הדגימות או (2) יצירת שני עקומות סטנדרטיות עצמאיות עבור כל סוג תא (non-CF ו-CF). ASL pH משני סוגי התא היו לאחר מכן התווה נגד הזמן (איור 3 א, ב) ו ממוצעים (איור 3a). ערכי asl pH שהתקבלו מתוך עקומת הכללית יחיד הראה הבדל משמעותי בין שאינם cf ו cf תרבויות (איור 3a, C) בעוד asl pH לא היה שונה באופן משמעותי בין cf ו-cf haecs כאשר ph חישב מ עקומות סטנדרטיות עצמאיות (איור 3B, C). תוצאות אלה מציגות את החשיבות של יצירת עקומות כיול עצמאיות עבור כל ניסוי ובתוך הניסוי, עבור כל דגימת התורם, מאחר שכאשר עקומות הכיול המוצעים יחד, נמצאו ערכי יחס גבוהים יותר בתרבויות CF , המציין pH חומצי יותר (איור 3C).

Figure 2
איור 2: אופטימיזציה של כיול ה-pH ב מבחנה. כמויות שונות של פתרונות של ה-pH ידוע והמכיל ריכוזי צבע שונים נטענו על 96 צלחת באר ו-פלואורסצנטית נרשמה מעל 1 h. השפעת נפח (a) והריכוז צבען (ב) על יחסי קרינה. היחס הותווה נגד pH לזמן-נקודה 24 דקות. (ג) השיפוע של שינוי בזריחה היה מחושב עבור כל פתרון והתווה כפונקציה של זמן (בדקות). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אופטימיזציה של הניתוח של כיול ה-pH על hAECs הראשי באתרו. (א) עקבות נציג של Asl pH שהתקבלו מעקומת תקן יחיד בממוצע נתונים מתרבויות שאינן cf ו-cf. (ב) עקבות נציג של Asl pH השיג מתוך עקומת תקן עצמאי שבוצעה על תרבויות שאינן CF או cf. כל ערכת נתונים חושבה מעקומת כיול משלו. (ג) הערכת ההבדלים ב-Asl pH בין תרבויות שאינן cf ו-cf כפונקציה של איך הכיול בוצע. נתונים מייצגים את הממוצע ± SEM מ n = 3 ניסויים, ANOVA 2-way, Sidak מבחן השוואות מרובות). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

כדי להמשיך ולאמת את הטכניקה שלנו, אז אנחנו נדרשים שליטה חיובית כדי להדגים כי הטכניקה היתה מסוגלת לזהות שינוי ' צפוי ' ב-ASL pH. כנוכחות של asl חומצי יותר בתאי CF הוא עדיין שנוי במחלוקת, השתמשנו אגוניסט מחנה forskolin, כמצב בקרת חיובי, כדי לעורר hco3 הפרשה דרך cftr. התוצאות הצפויות יראו בסיסיות forskolin המושרה של ASL בתאים שאינם CF כי יהיה במידה ניכרת ירידה או בוטלה בתאי CF בהתאם לחומרת המוטציות. איור 4A מראה עקבות הנציג של Asl pH של NON-CF תאים cf לאורך זמן ואיור 4a מראה את הנתונים הממוצע של asl pH לפני ואחרי הטיפול עם forskolin בשני סוגי התא. אנחנו יכולים להשיג מידע שונה מהתוצאות האלה. ראשון, כפי שמוצג כבר באיור 3B, C, הנחה Asl pH לא היה שונה בין לא cf ו-cf epithelia. שנית, הראשון 3-4 זמן-נקודות לאחר השהיית הניסוי לטיפול בתאים עם forskolin, הראה עלייה גדולה ב-pH ששוחזרו בתוך ~ 15 דקות. זה היה בגלל הירידה ב CO2 ריכוז בין קורא לוחית (5%) וארון הבטיחות של תרבות הרקמה (~ 0%). לדברי משוואת האסלבאך של הנדרסון, pH של 7 ב 5% CO2 הסביבה משווה ריכוז של hco3- של ~ 9.3 mM. כאשר התאים מוסרים מקורא הצלחת, ירידה בריכוז CO2 ל -0% תיאורטית תוביל לעלייה ב-pH של > 8. איור 4A מראה כי Asl pH עלה ל ~ 7.8 אשר ניתן להסביר על ידי צניחה של זמן מיקום הצלחת בקורא לוחית (כלומר, בסביבה 5% CO2 ). לבסוף, כפי שניתן לחזות, תוספת של בזלת הצלעות 10 μM forskolin (Fsk) גדל באופן משמעותי ASL pH בתרבויות שאינן CF בלבד. כפי שהוא הוכח על ידי קבוצות שונות כי קיים הבדל במצב קבוע ASL pH בין CF ו-CF epithelia, רצינו עוד לחקור את העדר לכאורה של הבדל pH בניסויים שלנו ואת התפקיד של CFTR. כדי לעשות זאת אנו מראש התרבויות הבלתי-CF שאינם סיסטיק עם מעכב CFTR ספציפי, CFTRinh172 (172). כאמור בסעיף הפרוטוקול 2.8, תמהיל הצבע הוכן כאמור לעיל, המעכב התווסף בריכוז של 0.1 X = 2 μM. על פי הספרות, גובה ASL של תאים שאינם CF הוא כ 10 μm. בתמיכה למחצה חדיר של קוטר 6.5 מ"מ, הנפח התיאורטי של ASL הוא אפוא π × 3.252 = 0.3 μl. על-ידי הוספת 3 μL של צבע + 172 ב 2 μM, הריכוז של המעכב, לאחר ספיגת הנוזל עודף, תיאורטית יהיה 20 μM (1x, הריכוז הרצוי). הנציג עקבות באיור 4C ומתכוון סיכום באיור 4c להראות כי 172 לא להפחית את asl ph מנוחה אבל הייתה למנוע את העלייה forskolin המושרה ב-asl ph, ובכך מאשרת את התוצאות שלנו שהתקבלו מ-CF לעומת cf תרבויות ומאמתים עוד יותר את הטכניקה שלנו.

Figure 4
איור 4: מדד ASL מדידה דינאמי בתגובה להפעלת CFTR על ידי forskolin. (א) מייצג עקבות של השפעת forskolin (fsk, 10 μm) על קינטיקה של Asl pH לאורך זמן ב-cf ו-Cf hAECs. נתונים מייצגים את ממוצע ± SEM מ n = 3 ניסויים. (ב) סיכום ההשפעה של fsk על Asl pH בתרבויות שאינן cf ו-cf. נתונים מייצגים את ממוצע ± SD מ n = 69 תרבויות שאינן CF ו 35 CF תרבויות (2-way-ANOVA, Sidak של מבחן מרובה השוואות). (ג) עקבות הנציג של ההשפעה של CFTRinh172 (172, 20 μm) על עליית fsk-המושרה ב-ASL PH ב-CF haecs. נתונים מייצגים את ממוצע ± SEM מ n = 5 ניסויים. (ד) סיכום ההשפעה של 172 על fsk בלתי מושרה של asl בתרבויות שאינן CF. הנתונים מייצגים את הממוצע ± SEM מ n = 5 ניסויים (2-way-ANOVA, Sidak מבחן השוואות מרובה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

לבסוף, כאמור בסעיף הפרוטוקול 6.8, ניתן לחשב שיעורי חמצה/באלמורית על-ידי התאמת רגרסיה ליניארית לנקודות הזמן הראשוניות לאחר ההתערבות. איור 5a מראה כי הסרת the basolateral המכיל את hco3 המכילים פתרון (hco3- krb) והחלפת אותו עם פתרון באגירה hepes, בהעדר של CO2, המושרה חמצה מסומן של asl. זה עקבי עם חוסר של hco3- מעכב transepi, הפרשה3 הפרשת, אשר מאפשר הפרשת פרוטון הפרשות על ידי אלה תאי דרכי הנשימה כדי להפחית בהתמדה asl pH15, 17. מעניין, השיעור ההתחלתי של חמצה של תאים שאינם CF היה איטי באופן משמעותי מאשר תרבויות CF (איור 5B).

Figure 5
איור 5: שינויים דינאמיים ב-asl pH בתגובה ל-hco3- הסרה. (א) עקבות הנציג מראה את ההשפעה של hco3- הסרת על קינטיקה של asl pH לאורך זמן לא cf ו-cf haecs. התעריפים הראשוניים של חמצה הושגו באמצעות השיפוע של קו ישר מצויד 7 זמן נקודות לאחר hco3- הסרה. נתונים מייצגים את האמצעים ± SEM מ n = 6 ו 7 ניסויים על בתרבויות שאינן CF ו-CF בהתאמה. (ב) סיכום התעריפים הראשוניים של חמצה הבאים hco3- הסרה. נתונים מייצגים את האמצעים ± SEM מ n = 6 ו 7 ניסויים על בתרבויות שאינן CF ו-CF בהתאמה (מבחן מאן-ויטני). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור המדידה הדינמית של ASL pH בתאי האפיתל דרכי הנשימה האנושית הראשית. צעדים קריטיים כוללים לשטוף את הריר את פני השטח הרשמי של התאים, מדידת וחיסור הרקע באמצעות אותם פרמטרים כמו בניסוי, אופטימיזציה של z-מיקום ולהרוויח וביצוע של כיול pH באתרו.

הצעד הראשון של כביסה התאים הוא קריטי כמו שכבה עבה של ריר יכול (i) למנוע את הצבעים מלהגיע שכבת לקרום הלב (PCL) ו (ii) עיכוב או למנוע את האיתור של שינויים באור הזריחה בתגובה אגוניסטים/מעכבי. השיטה שלנו פותחה כדי ללמוד כיצד haecs העיקרי מאופנן את הפעילות של hco3- ו-H+ מובילים בתגובה לאגוניסטים. למרות שיהיה מעניין לחקור כיצד שינויים ב-PCL ph מתייחסים לשינויים ב-ph ריר, פיתוח נוסף של פרוטוקול זה נדרש, כולל שימוש במשקל מולקולרי שונים למקד את המטרה 2 שכבות ו-z סריקות דרך ה כל מארג

מדידת רקע היא שלב חשוב נוסף של פרוטוקול זה. משטח פסגה של באופן מלא הבדיל בצורה העיקרית epithelia הוא לעתים נדירות שטוח לחלוטין אשר ישפיע על הנתיב האור ולכן את הרקע. הבטחת שקריאות הרקע יבוצעו באותן נקודות מקומיות של הבארות, כמו במהלך הניסוי, באופן קריטי לצורך שמירה ויציבות של ההקלטות.

אופטימיזציה של z-מיקום ולהרוויח הם הצעדים הנחוצים שצריך להיות מוגדר עבור כל ריכוז שונה של צבע פלורסנט אשר ישמש. פעולה זו תמנע השתנות גבוהה בין ניסויים. לאחר ההגדרה, הגישה שלנו מספקת תוצאות יציבות ומשוב. אחת הסיבות לכך היא כי הצבעים מתווספים על פני השטח פסגה על התאים בנפח קטן של נוזל כי הוא נספג בקלות על ידי האפיתל, השארת asl באופן מאוד מתויג הומוקול. שיטה נוספת להכתים את ASL, זה יכול להיות מוצלח באותה מידה, השתמשו באבקה יבשה או "השעיה" בטוראי ראשון. למרות שזה עשוי להיות החיסכון בזמן (כמו הניסויים מבוצעים בדרך כלל בתוך 2 h), לא סביר כי הצבעים היבשים מסיסות באופן מלא ב ASL ולכן יכול גושים אחידים. כך ריכוזים שונים של צבע ה-pH רגיש יימצא על פני השטח של תאים אפיתל.

כיול ה-pH באתרו הוא צעד חשוב כדי להשיג תוצאות מדויקות ומושמעות. כפי שמוצג והוסבר בסעיף התוצאות, הבדלים באמצעי אחסון ASL ישפיעו על ספירות הזריחה ולכן ערכי ה-pH שעברו אינטרפולציה (איור 2 ואיור 3). בעוד קבוצות שונות שפורסמו בעבר asl pH מדידות, מגוון רחב של ערכים הושגו גם בין מחקרים שונים שפורסמו על ידי אותה קבוצה8,17. אנו מאמינים כי על ידי ביצוע באתרו כיול, התוצאות יהפכו יותר להיות מיותר. לעומת טכניקות כיול אחרות של pH, אשר להשתמש בשיטה גבוהה K+/nigericin (או מספר ionophores) כדי ליצור את עקומת רגיל28,29,30, את הבקשה המוצגת כאן יש את היתרון כי , כל עוד כל צעד מבוצע בארון בטיחות, התאים המשמשים ASL pH ניתן לשטוף, נשמר ולעשות שימוש חוזר עבור ניסויים אחרים בתנאי כי הטיפולים ביצעו לא בלתי הפיך להשפיע על התאים האפיתל.

הפיתוח והאופטימיזציה של השיטה סיפקה תוצאות הניתנות לכימות ואנו מאמינים כי שיטה זו תסייע לקבוצות אחרות עם מדידת pH-ASL שלהם. עם זאת, טכניקה זו יש גם כמה מגבלות בשל הגדרת סוג התאים הנמצאים בשימוש. ניטור ASL pH על פרק זמן ארוך יותר מאשר הציג כאן (> 8-10 h) עשוי להתברר קשה כמו סביבה ארוכת טווח לחות גבוהה עלול לגרום נזק לציוד והעובדה כי רוב קוראי הצלחת רק להציע את האפשרות להקליט קריאות קינטי על פרק זמן מסוים (בדרך כלל 24 שעות). השימוש במלואו haecs העיקרי הוא קריטי באופן שלבים שונים של בידול ישפיע על הביטוי של hco3- ו-H+ מובילים. עם זאת, אין כמעט כל אפשרות לשלוט במדויק את עוצמת הקול של ASL בתאים גדל תחת תנאי הסרט דק. כפי שצוין בפרוטוקול ואת סעיפים התוצאות, שינויים באמצעי האחסון ישפיע על יחס הזריחה, ולמרבה הצער יש צורך להניח כי בתאים גדלו מאדם אחד, שנזרע באותו יום על תמיכה שונים למחצה חדירות, כרכים ASL יהיה אותו הדבר הנובע ממגבלה זו, כל אגוניסט או מעכבי שישפיעו על הפרשת הנוזלים או על הספיגה ישפיעו על אמצעי האחסון ASL וכנראה את יחסי הזריחה. עם זאת, במסגרת שלנו, עקומת הכיול מבוצעת בסוף הניסוי, כך שאנו יכולים להניח ששינויים אלה באמצעי האחסון ישפיעו על יחסי הכיול באותו אופן כמו במהלך הניסוי הקינטי. מסיבה זו אנו מייעצים לקבוצות שיהיו מעוניינות לפתח בדיקה זו, להשתמש ב-2-3 לפחות משכפל לכל תנאי שנבדק, כך שיאפשר הקמת עקומה סטנדרטית לכל תנאי.

כאן אנו מציגים פשוטה, חצי אוטומטי, שיטת המאפשר מדידה בזמן אמת של pH משטח מתחת לתנאים הסרט דק. יש לו את היכולת לחקור תגובות ה-pH דינאמי בתרבויות רבות באופן כמעט סימולטני המאפשר השוואות בין הפנים והתורמים. הפיכה של שיטה זו לתבנית צלחת 96 היטב באמצעות מערכת מקוטב (HTS 96 לוחות הבאר)38 יספק תפוקה גבוהה אף יותר כמו שיטת גילוי התרופה. יתר על כן, הצגנו כיצד טכניקה זו יכולה לשמש כדי ללמוד את ההשפעה החריפה של אגוניסטים ב-asl pH ואנחנו כבר פרסמו כי שיטה זו יכולה לשמש כדי ללמוד את ההשפעה ארוכת טווח של מעכבי משאבת פרוטון פסגה ב-CF haecs asl39. כמו ph הוכח לווסת זיהום, דלקת, צמיגות של ריר והובלת יונים, זיהוי מטרות מולקולריות שיכולות להגדיל את ה-ph יהיה בעל ערך בתחומי המחקר של מחלות ריאה כרוניות וטכניקה זו עשויה להקל על ה פיתוח הקרנת סמים בגישות לרפואה אישית. בסופו של דבר, מאז דיסתקנה ב-חומצה בסיס הומאוסטזיס משחק תפקיד מרכזי במחלות אחרות, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם, עם שלבי אופטימיזציה, ציוד שונים (הקוראים לוחית) וסוגי תאים, כגון תאים אפיתל אחרים. חומציות מסחטות הוא מאפיין של סרטן40,41,42 ושיטת זה יכול לעזור לקבוע כיצד גידולים מוצקים לייצר pH נמוך או יכול לשמש בתור התפוקה נמוכה ההקרנה התרופה שיטת הסינון עבור שחזור של הומאוסטזיס pH. באופן דומה, באשר למחלות דרכי הנשימה כרוניות, היא יכולה גם לספק פלטפורמה לפיתוח גישה רפואית אישית.

Disclosures

מגה בייט: לא קשור לעבודה זו: מענקי מחקר שהביאו חוקרים מתוכנית האבחון ע ש פייזר ורושה; דמי הרמקול ששולמו לאוניברסיטת ניוקאסל מנובארטיס, מדיאגנוסטיקה רושה וטבע. לנסוע הוצאות לפגישות חינוכיות מ Boehringer Ingelheim ותרופות קודקוד.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי שני מענקים CF Trust מרכז מחקר אסטרטגי (SRC003 ו SRC013) ו מועצת מחקר רפואי (MRC) ביטחון במענק המושג (MC_PC_15030). JG היה נתמך על ידי מענק מתוך הקרן למחקר רפואי (MRF-091-0001-RG-גרנט). מגה-בתים נתמך על ידי מועצת המחקר הרפואי האגודה הקלינית מדען (MR/M008797/1). IH נתמכת על ידי מלגת אימון קליני ברוך הבא (203520/Z/16/Z). המחקר נתמך על ידי המכון הלאומי לחקר בריאות ניוקאסל מרכז המחקר ביורפואי מבוסס בבית החולים ניוקאסל אמון ואוניברסיטת ניוקאסל. ההשקפות המובעות הן אלה של המחברים ולא בהכרח של משרד הבריאות, ה-NIHR או מחלקת בריאות. התאים הראשוניים של ד ר רנדל היו נתמכים על ידי מענק סיסטיק פיברוזיס קרן (BOUCHE15R0) ו-NIH מענק (P30DK065988).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filter Starlab E4780-1226
6.5 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert Corning 3470
CaCl2 Sigma Aldrich 21115
CFTRInh172 RnD Systems (Tocris) 3430 Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 20 µM
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
dextran-coupled pH-insensitive fluorescent dye: AlexaFluor488-dextran ThermoFisher D22910 Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL
dextran-coupled pH-sensitive fluorescent dye: pHrodo-dextran ThermoFisher P10361 Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL
D-glucose Sigma Aldrich G5767
Forskolin RnD Systems (Tocris) 1099 Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 10 µM
Greiner CELLSTAR 96 well plates Cellstar 655180
Humidity cassette TECAN 30090495
KCl Sigma Aldrich P9541
MES Sigma Aldrich M3885
MgCl2 Sigma Aldrich M1028
NaCl Sigma Aldrich S9888
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
NaHepes Sigma Aldrich H3784
Plate reader: TECAN SPARK 10M TECAN 30086375
Tris Sigma Aldrich T1503
Universal pH electrodes DJ 113 VWR 662-1385

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boucher, R. C. Human airway ion transport. Part one. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 150 (1), 271-281 (1994).
  2. Roomans, G. M., et al. Measurements of airway surface liquid height and mucus transport by fluorescence microscopy, and of ion composition by X-ray microanalysis. Journal of Cystic Fibrosis. 3, Suppl 2. 135-139 (2004).
  3. Haq, I. J., Gray, M. A., Garnett, J. P., Ward, C., Brodlie, M. Airway surface liquid homeostasis in cystic fibrosis: pathophysiology and therapeutic targets. Thorax. 71 (3), 284-287 (2016).
  4. Martin, S. L., Saint-Criq, V., Hwang, T. C., Csanady, L. Ion channels as targets to treat cystic fibrosis lung disease. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2S), S22-S27 (2018).
  5. Garland, A. L., et al. Molecular basis for pH-dependent mucosal dehydration in cystic fibrosis airways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15973-15978 (2013).
  6. Torres, I. M., Patankar, Y. R., Berwin, B. Acidosis exacerbates in vivo IL-1-dependent inflammatory responses and neutrophil recruitment during pulmonary Pseudomonas aeruginosa infection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (2), L225-L235 (2018).
  7. Berkebile, A. R., McCray, P. B. Effects of airway surface liquid pH on host defense in cystic fibrosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 52, 124-129 (2014).
  8. Tang, X. X., et al. Acidic pH increases airway surface liquid viscosity in cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 879-891 (2016).
  9. Quinton, P. M. Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis. Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).
  10. Hunt, J. F., et al. Endogenous airway acidification. Implications for asthma pathophysiology. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161, 694-699 (2000).
  11. Kostikas, K., et al. pH in expired breath condensate of patients with inflammatory airway diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 165 (10), 1364-1370 (2002).
  12. Ojoo, J. C., Mulrennan, S. A., Kastelik, J. A., Morice, A. H., Redington, A. E. Exhaled breath condensate pH and exhaled nitric oxide in allergic asthma and in cystic fibrosis. Thorax. 60 (1), 22-26 (2005).
  13. Cho, D. Y., Hajighasemi, M., Hwang, P. H., Illek, B., Fischer, H. Proton secretion in freshly excised sinonasal mucosa from asthma and sinusitis patients. American Journal of Rhinology & Allergy. 23 (6), e10-e13 (2009).
  14. Cho, D. Y., Hwang, P. H., Illek, B., Fischer, H. Acid and base secretion in freshly excised nasal tissue from cystic fibrosis patients with DeltaF508 mutation. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (2), 123-127 (2011).
  15. Coakley, R. D., et al. Abnormal surface liquid pH regulation by cultured cystic fibrosis bronchial epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 16083-16088 (2003).
  16. Pezzulo, A. A., et al. Reduced airway surface pH impairs bacterial killing in the porcine cystic fibrosis lung. Nature. 487 (7405), 109-113 (2012).
  17. Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).
  18. Saint-Criq, V., Gray, M. A. Role of CFTR in epithelial physiology. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (1), 93-115 (2017).
  19. ECFS Patient Registry Annual Data Report. , Available from: https://www.ecfs.eu/sites/default/files/general-content-images/working-groups/ecfs-patient-registry/ECFSPR_Report2016_06062018.pdf (2016).
  20. Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry Annual Data Report 2017. , Available from: https://www.cff.org/Research/Researcher-Resources/Patient-Registry/2017-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf (2017).
  21. Abou Alaiwa, M. H., et al. Neonates with cystic fibrosis have a reduced nasal liquid pH; a small pilot study. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (4), 373-377 (2014).
  22. Abou Alaiwa, M. H., et al. Ivacaftor-induced sweat chloride reductions correlate with increases in airway surface liquid pH in cystic fibrosis. JCI Insight. 3 (15), (2018).
  23. McShane, D., et al. Airway surface pH in subjects with cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 21 (1), 37-42 (2003).
  24. Schultz, A., et al. Airway surface liquid pH is not acidic in children with cystic fibrosis. Nature Communications. 8 (1), 1409 (2017).
  25. Abou Alaiwa, M. H., et al. Repurposing tromethamine as inhaled therapy to treat CF airway disease. JCI Insight. 1 (8), (2016).
  26. Ngamtrakulpanit, L., et al. Identification of Intrinsic Airway Acidification in Pulmonary Tuberculosis. Global Journal of Health Science. 2 (1), 106-110 (2010).
  27. Tate, S., MacGregor, G., Davis, M., Innes, J. A., Greening, A. P. Airways in cystic fibrosis are acidified: detection by exhaled breath condensate. Thorax. 57 (11), 926-929 (2002).
  28. Jayaraman, S., Song, Y. Airway surface liquid pH in well-differentiated airway epithelial cell cultures and mouse trachea. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 281 (5), C1504-C1511 (2001).
  29. Jayaraman, S., Song, Y., Vetrivel, L., Shankar, L., Verkman, A. S. Noninvasive in vivo fluorescence measurement of airway-surface liquid depth, salt concentration, and pH. Journal of Clinical Investigation. 107 (3), 317-324 (2001).
  30. Lennox, A. T., et al. ATP12A promotes mucus dysfunction during Type 2 airway inflammation. Scientific Reports. 8 (1), 2109 (2018).
  31. Song, Y., Thiagarajah, J., Verkman, A. S. Sodium and chloride concentrations, pH, and depth of airway surface liquid in distal airways. The Journal of General Physiology. 122 (5), 511-519 (2003).
  32. Thiagarajah, J. R., Song, Y., Haggie, P. M., Verkman, A. S. A small molecule CFTR inhibitor produces cystic fibrosis-like submucosal gland fluid secretions in normal airways. FASEB Journal. 18 (7), 875-877 (2004).
  33. Garnett, J. P., et al. Hyperglycaemia and Pseudomonas aeruginosa acidify cystic fibrosis airway surface liquid by elevating epithelial monocarboxylate transporter 2 dependent lactate-H(+) secretion. Scientific Reports. 6, 37955 (2016).
  34. Gorrieri, G., et al. Goblet Cell Hyperplasia Requires High Bicarbonate Transport To Support Mucin Release. Scientific Reports. 6, 36016 (2016).
  35. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods in Molecular Biology. 742, 285-310 (2011).
  36. Fulcher, M. L., Randell, S. H. Human nasal and tracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture. Methods in Molecular Biology. , 109-121 (2013).
  37. Matsui, H., et al. Evidence for periciliary liquid layer depletion, not abnormal ion composition, in the pathogenesis of cystic fibrosis airways disease. Cell. 95 (7), 1005-1015 (1998).
  38. Ahmadi, S., et al. Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia. npj Genomic Medicine. 2, 12 (2017).
  39. Delpiano, L., et al. Esomeprazole Increases Airway Surface Liquid pH in Primary Cystic Fibrosis Epithelial Cells. Frontiers in Pharmacology. 9, 1462 (2018).
  40. Gillies, R. J., Liu, Z., Bhujwalla, Z. 31P-MRS measurements of extracellular pH of tumors using 3-aminopropylphosphonate. American Journal of Physiology. 267 (1 Pt 1), C195-C203 (1994).
  41. Tannock, I. F., Rotin, D. Acid pH in tumors and its potential for therapeutic exploitation. Cancer Research. 49 (16), 4373-4384 (1989).
  42. Wike-Hooley, J. L., Haveman, J., Reinhold, H. S. The relevance of tumour pH to the treatment of malignant disease. Radiotherapy and Oncology. 2 (4), 343-366 (1984).

Tags

ביוכימיה סוגיה 148 משטח האוויר נוזלי מאזן חומצה בסיס pH קורא צלחת ממשק נוזלי אוויר אפיתל דרכי הנשימה סיסטיק פיברוזיס
בזמן אמת, חצי אוטומטי מדידה פלורסנט של משטח נתיב האוויר הנוזלי של ה-pH העיקרי של תאים אפיתל דרכי האוויר האנושי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saint-Criq, V., Haq, I. J., Gardner, … More

Saint-Criq, V., Haq, I. J., Gardner, A. I., Garnett, J. P., Ward, C., Brodlie, M., Gray, M. A. Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (148), e59815, doi:10.3791/59815 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter