Summary
우리는 플레이트 리더를 사용 하 여 박막 조건 하에서 기도 표면 액체 pH의 동적 측정을 할 수 있는 프로토콜을 제시 한다.
Abstract
최근에는 기도 표면 액체 (ASL) 수 화, 점액 점성 및 항균 펩타이드의 활성을 조절 하는 능력에 의해 기도의 점 막 표면 pH의 중요성이 부각 되 고 있으며, 주요 매개 변수는 폐. 이것은 이러한 매개 변수가 장애 조절 되는 낭 포 성 섬유 증 (CF)과 같은 만성 호흡기 질환 분야의 주요 관련성입니다. 상이한 그룹은 생체 내 및 시험관 내에서 ASL pH를 연구 했지만, 그들의 방법은 상대적으로 광범위 한 ASL ph 값과 비 CF 및 CF 셀 사이의 pH 차이에 관한 모순 된 결과를 보고 합니다. 더욱이, 그들의 프로토콜은 재현성을 보장 하기 위해 항상 충분 한 세부 사항을 제공 하지 않습니다, 대부분은 낮은 처리량과 고가의 장비 또는 구현 하는 전문 지식을 필요로, 대부분의 실험실에서 확립 하기 어려운. 여기서 우리는 생체 내 상황을 더욱 유사 하 게 하는 박막 조건 하에서 ASL pH의 실시간 측정을 가능 하 게 하는 반자동 형광 플레이트 판독기 분석 법을 설명 합니다. 이 기술은 여러 기도 배양에서 동시에 많은 시간 동안 안정 된 측정을 가능 하 게 하며, 중요 하 게는, 작용 제 및 억제제에 반응 하 여 ASL pH의 동적 변화가 모니터링 될 수 있다. 이를 달성 하기 위해, 완전히 분화 된 일차 인간 기도 상피 세포 (hAECs)의 ASL은 과도 한 유체의 재흡수를 허용 하기 위해 pH 민감성 염료로 밤새 염색 되어 박막 상태를 보장 한다. 작용 제의 존재 또는 부재 하에 형광을 모니터링 한 후에, pH 교정은 부피 및 염료 농도를 보정 하기 위해 현장에서 수행 된다. 설명 된 방법은 안정적이 고 재현성 있는 ASL pH 측정을 수행 하는 데 필요한 제어를 제공 하며,이는 궁극적으로 개인화 된 의약품에 대 한 약물 발견 플랫폼으로 사용 될 뿐만 아니라 다른 상피 조직 및 실험에 적용 될 수 있습니다. 염증 및/또는 숙주-병원 체 모델과 같은 조건.
Introduction
기도 상피는 기도 표면 액체 (ASL) 라고 불리는 얇은 (~ 10 μ m) 유체 층으로 덮여 있다. 이 ASL의 조성 및 깊이 (수 화)는 엄격 하 게 규제 되 고 mucociliary 에스컬레이터1,2,4에 의해 기도 클리어런스의 효율을 제어 한다. 최근에는 asl H+/hco3 의 중요성은 asl 수 화를 조절 하는 능력으로 인해 다른 그룹에 의해 입증 되었습니다5, 기도 염증6 및 감염7, 8 뿐만 아니라 점액 점도8,9. 중요 하 게도, 일부 논쟁 들이 존재 하지만, 많은연구가 천식10,11,12, COPD 등의 만성 기도 질환에서의 기도 pH의 장애 조절을 보고 하였다 기관지 확장 제11, 만성 부 비 동 염13,14 및 낭 포 성 섬유 증 (CF) ASL pH를 복원 하는 치료법은 여러 유형의 만성 기도 질환을 치료 하는 데 유용할 수 있음을 시사 합니다. CF는 백인 인구에서 가장 흔한 상 염색체 열성 유전 질환 이며, CF 막 횡단 전도 력 조절기 (CFTR) 유전자의 돌연변이 때문입니다. 이 유전자 코드는 음이온 (hco3 및 Cl)채널을 통해에 피 탈리 아 (18)에 걸쳐 이온 및 유체 수송 및 항상성에서 중요 한 역할을 한다. Cf가 다중 기관 질환 이지만, 폐 병리학은 사망률 및 사망률의 주요 원인19,20 및 cf의 1 차 결점을 고려 하 여 Cl 및 hco3의 손상 된 수송- 하나는 cf를 가진 사람들에 있는 세포 외 액체 pH는 CF가 없는 사람들에 비교 하 여 통제 될 것 이라는 것을 가설 수 있습니다. 따라서, ASL pH의 측정은 cf 연구 및 상이한 그룹의 국 소 영역으로 되어 CF에서 ASL pH를 측정 하는 기법을 개발 하였다 항공.
생체 내에서, 기도 ph는 마이크로 프로브 (광섬유, 금 또는 모 비 듐 프로브) 로부터 다양 한 기술을 사용 하 여 측정 되었으며 ,이는 ph 측정 재료 또는 호기 호흡 응축 수 (ebc)10,25,26 CF의 연구 분야에서, pH는 그것의 잠재적인 임상 연루 때문에 넓게 공부 되 고 있습니다. 이론적으로, 기도를 더 알칼리 성으로 만드는 것은 세균 살해를 증가 하 고 전체적으로 mucociliary 클리어런스 및 기도 항상성 향상 시킬 수 있었습니다. 그러나, 생체 내/전 생체 내 연구는 ph 값의 넓은 범위를 보고 하 고, 그 결과는 비 CF 및 cf 에어웨이 사이의 ph 차이의 존재에 관한 결정적인 것이 아니다. 2000 년대 초반에, 상이한 그룹은 EBC의 pH를 보고 하였다. 병이 없는 집단에서, ph 값은 4.6에서 8.5로, 그러나 흥미롭게도, ebc ph는 CF12,27를 가진 사람들에 있는 격화 도중 더 산 성 발견 되었습니다. 보다 최근에는, CF의 인간과 동물 모델에서의 ASL의 생체 내 측정이 충돌 결과를 보고하였으며,17,21,22,23 24 cf 항공이 비 cf 에어웨이 보다 더 산 성이 라면 여전히 불분명 합니다.
낮은 ASL pH의 생체 내 측정으로 서는 기도의 양이 매우 소량으로 인하여 질병 중의 점액이 연결 되어 있고, 많은 그룹이 수 화 pH를 측정 하는 시험관 내 실험으로 전환 되어 왔으며, 주로 3 가지 상이한 방법론. 첫 번째 접근법은 덱 스 트 란 결합 세포를 사용 하는 것으로, 건조 분말로 서 직접 ASL에 첨가 되거나 또는 불활성 유체를 사용 하 여 perfluorocarbon (PFC)5,8,16 으로 추가 되는 pH 민감성 형광 염료를 의미 합니다. , 17 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. 그러나,이 기술은 배양 물에 첨가 되는 염료의 정확한 양에 대 한 약간의 통제를 제공 하 고 염료 응집 체 및 샘플 및/또는 실험 사이의 농도에 큰 차이를 제시 하 고 심지어 동일한 샘플 내에서 . 그것은 또한 일반적으로 적용을 제한 하 고 많은 경우에, 여러 샘플 및 기록 조건의 변화에 대 한 상세한 모니터링을 방지 하는 공초점 현미경으로 수행 되었습니다. ASL ph를 측정 하기 위해 사용 되는 제 2 방법은 ph 민감성 마이크로 전극 (15)을 이용 하는 것 이다. ASL pH 측정은 형광 염료 농도에 의존 하지 않으므로 보다 견고 하 고 재현성 있는 결과를 제공 해야 합니다. 그러나이 방법은 수 화 pH의 동적 실시간 측정을 허용 하지 않으며, 다른 조건에서 여러 판독을 쉽게 만들 수 없습니다. 이는 또한 특수 장비 (미세 전극 제조/전기 생리학적 기록 장치) 및 후속 pH 측정 및 교정을 위한 시료 수집을 위한 교육을 필요로 하는 노동 집약적이 고 복잡 한 공정입니다. 또한,이 두 가지 기술은 재현성 있는 결과를 생성 하는 능력의 일부 불일치를 보여 주었다: pH 민감성 형광 염료 법을 사용 하 여, 당나라 외. CF ASL8 에 대 한 비 cf asl 및 7.0에 대 한 7.35의 보고 된 값 반면 동일한 그룹의 최근 논문, ASL pH는 6.9 및 6.4 비 CF 및 CF 각각17이다. 유사한 방식으로, 마이크로 전극 측정은 6.4의 값을 cf에서 비 CF asl 및 6.1에 대 한 연구의 결과를 200315 에서와 같은 그룹에서 cf asl에 대 한 비 cf asl 및 6.45에 대 한 6.7의 값을 보고 하는 반면에 연구에서5. 마지막으로, 세 번째 접근법에서 연구진은 상대적으로 많은 양의 약하게 완충 된 용액을 배양 물의 점 막 표면에 추가 하 여 박막 조건을 파괴 하 고 ASL 조성 물과 잠재적으로 규제를 변경 합니다. ph는 ph 민감성 형광 염료33을 사용 하 여 측정 한 후, ussing 챔버 (13)에서 ph-stat 적정 법에 의해, 또는 ph를 이용 하 여 측정 된 배양 물 및 ph에서 제거 되는 희석 된 ASL을 필요로 한다 전극, 분석기 또는 리 무스 스트립34. ASL pH의 정확한 측정의 또 다른 어려움은 가능한 한 정확 하 게 표준 곡선을 확립 하는 것입니다. 사실, 판독 값이 수 지를 통한 전기적 전위의 차이를 측정 하거나 pH 민감성 형광 염료를 사용 하는 전극을 통해 수행 되는지 여부에 관계 없이 이러한 접근법은 모두 시료의 국부 미세 환경에 영향을 받게 됩니다 측정. 보다 구체적으로, 염료의 해리 상수 (Kd)는 단백질 및 잠재적으로 점액과 같은 세포 성분과 염료의 잠재적인 상호작용 뿐만 아니라 온도, 이온 강도, 점도 등에 따라 상당히 변할 수 있다.
이러한 기술적 문제를 많이 극복 하 고 보다 역동적이 고 간단 하 고 더 높은 처리량 방법을 개발 하기 위해, 우리는 세포를 사용 하 여 일차 hAEC 배양 액에 ASL pH를 기록 하는 시험관 내 기술을 확립 했습니다. pH 민감성 표준 상업용 플레이트 판독기에서 형광 염료. 이 방법은 박막 조건 하에서 완전히 분화 된 3D 세포 배양 물의 ASL pH에 대 한 재현성 있는 동적, 반자동, 실시간 측정을 생성 합니다. 다중 웰 플레이트 리더기의 사용을 통해,이 반자동 분석은 12 시간 동안 최대 24 개 조건에 대 한 pH의 동시 측정을 할 수 있으며 다양 한 작용 제 또는 억제제를 추가 하는 효과를 모니터링 할 수 있습니다. 이 문서에서는 방법론을 자세히 설명 하 고 기술 유효성을 검사 하는 양수 및 음수 제어 조건에서 대표 결과를 보고 합니다.
Protocol
1 차 비 F580del 기증자, 나이 34, 27 세 및 F508del) 및 40, 41에 해당 하는 경우에는 미국 노스캐롤라이나 대학교의 스 캇 에이치 란 젤 박사에서 일종의 선물이 됐다. 오 타이, 채 플 힐에서 노스 캐롤라이나 대학에 도착 한 ' 하이 코 ' 프로토콜에 따라 ned #03-1396는 채 플 힐 의료 기관 검토 위원회에서 노스 캐롤라이나 대학에 의해 승인. 상기 세포는 fulcher 및 란 겔35,36에 의해 기술 된 성장 및 분화 배지를 이용 하 여 이전에 출판 된 방법에 따라 성장 하였다.
1. 샘플 준비
- 앞서 설명한35,36에 따라 최소 28 일 동안 공기 액체 인터페이스에서 6.5 mm 반투과성 지지대 (재료 표)를 기본 haecs로 성장 시킵니다.
- Hco 3 함유 크 렙 스 완충 용액 에 50 mL의 멸 균 용액을 제조 하였다 (hco 3krb) 염화 나트륨 (115) , cacl 2(11), mgcl 2(1), 디 글 루 코 티 드 (5 ) 및 필터-0.2 μ m 주사기 필터를 사용 하 여 살 균 합니다.
- 1.135,36에 기재 된 바와 같이 basolateral 배지를 신선한 분화 배지로 변경 한다.
참고: basolateral 글루코스 농도가 ASL pH33에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 이 단계에서, basolateral 구획의 글루코스 함량은 알려진 글루코스 농도의 완충 용액에 의해 배지를 대체 함으로써 제어 될 수 있다. - Hco3- krb의 150 µ l을 추가 하 여 세포의 근 면 표면을 세척 하 고 37 ° c에서 20 분 동안 배양 합니다.
- 멸 균 유리 파스퇴르 pipet 및 수집 병에 진공을 만드는 흡 인 펌프에 연결 된 멸 균 P200 pipet 팁을 사용 하 여 조심 스럽게 흡입 하 여 상피를 방해 하지 않고 애 피 컬 세척을 제거 합니다. 이 단계에서 공기 액체 인터페이스를 복원 하기 위해 가능한 한 약간의 액체가 남아 있어야 합니다.
- 37 ° c, 5% CO2에서 추가로 30 분 동안 세포를 배양 한다.
2. 배경 측정
- 플레이트 리더 및 컴퓨터를 켭니다.
- 대시보드를 엽니다.
- 10M 스파크를 클릭 하 고 온도 제어를 열고 37 ° c로 설정 합니다. 가스 제어를 열고 CO2를 5% 로 설정 합니다.
- 온도와 CO2가 목표 에 도달 할 때까지 기다리십시오.
- 플레이트 리더 서랍을 열고 각 측면에 dH 2o의 6ml로 채워진습도 카세트를 삽입 하십시오. 플레이트의 뚜껑과 바닥이 깨끗 한지 확인 하십시오-그렇지 않다면, 70%의 에탄올을 티슈에 넣고 깨끗 하 게 하 고, 플레이트를 습도 카세트에 놓습니다.
참고: 실험 전반에 걸쳐, 조직 배양 판 뚜껑은 약 제를 첨가 하거나 basolateral 배지를 변경 하는 경우에만 제거 하 고, 조직 배양에서 수행 되는 층 류 후드를 멸 균 환경에서 배양 하 여 유지 한다. - Spark 메서드 편집기를 열고 다음과 같이 소프트웨어에 대 한 매개 변수를 설정 합니다.
- 적절 한 플레이트 템플릿을 선택 합니다 (6.5 mm 반 투과성 지지대의 경우 24 웰 플레이트를 선택 하 고이 실험 중 모니터링 되는 웰).
- 온도 및 CO2 제어 패널 을 추가 하 고 각각 37 ° c 및 5%로 설정 합니다. 온도/가스 상자에 대 한 대기 를 체크 합니다.
- 키네틱 루프 패널을 추가 하 고 루프 유형으로 지속 시간을 선택 하 고 5-10 분으로 설정 합니다. 연속 읽기를 사용 하려면 간격 유형으로 정의 되지 않음을 선택 합니다.
참고: 연속 판독의 타이밍은 웰/조건의 수에 따라 달라 집니다. 5 분은 6-12 우물을 위해 충분히 긴 반면, 24 조건을 포함 하는 전체 판은 연속 측정의 10 분이 필요 합니다. - 운동 루프 내에서 드래그 앤 드롭 기능을 사용 하 여 두 개의 "형광 강도" 패널을 추가 하 고, ph 민감성 및 pH 민감 하지 않은 형광 염료를 각각 설정 합니다. 상기 ph 민감성 염료 및 495 및 520 nm 각각에 대해 여기 및 방출 파장을 560 및 590 nm로 각각 설정 하 여 pH에 민감 하지 않은 염료를 들 수 있다.
- 플래시의 수를 30으로 설정 하 고 각 형광 단에 대해 z 위치를 33200 합니다.
주: z 위치 및 게인 설정은 플레이트 리더의 특성에 따라 달라 집니다. 게인을 수동으로 설정 하 여 샘플 간의 차이가 포착 될 수 있을 만큼 충분히 높은 값을 제공 하지만, 주 작동 근의 추가가 감지 범위를 벗어난 값을 생성 하지 않도록 충분히 낮습니다. - 4750 µm의 테두리와 함께 3 × 3 크기의 원 유형으로 정의 된 사용자에 게 한 우물 당 다중 판독을 설정 합니다.
- 시작 단추를 클릭 하 여 배경 측정을 수행 하 고 확인을 통해 습도 카세트의 뚜껑이 제자리에 있는지 확인 합니다.
- 측정의 끝에서, 플레이트 리더 서랍을 열고, 플레이트 밖으로 가져와 서, 형광 염료 혼합 용액을 제조 하는 동안 배양 기에 다시 세포 시트를 Pplace.
- 상기 형광 염료 혼합 용액을 1 mg/ml 덱 스 트 란 결합 된 ph 감 응 (phsens) 형광 염료 0.2 µ l의 10mg/ml 덱 스 트 란 결합 ph에 민감 하지 않은 (phsens) 형광 염료 및 0.8 µ l의 멸 균 hco3- krb를 첨가 하 여 제조 된 최종 조건 당 3 µ L의 부피.
참고: 염료 혼합 용액의 총량은 1 ~ 10 개의 샘플이 있는 경우 엔 웰 스 + 1에 대해 준비 되어야 하며, 11 개 및 24 개의 샘플이 있는 경우에는 n 우물 + 2가 있어야 합니다. 덱 스 트 란 결합 염료는 여과 된 멸 균 hco3- krb 용액으로 재구성 되 고,이는-20°c에서 저장 된다. 임의의 화학 물질이 애 피 컬 표면에 16-24 h 인큐베이션 기간37 에 대해이 단계에서 추가 될 수 있다. 화학 물질은 0.1 x로 제조 되어야 하며, 최종 부피는 배양에 의해 과량의 유체의 흡수 후, 6.5 mm 반 투과성 지 지체를 위한 0.3 µ L 부근에 있을 것 이다. - 3 µ의 염료 믹스 (2.8 참조)를 세포의 근 표면에 조심 스럽게 추가 하 고 37 ° c, 5% CO2에서 밤새 배양 한다.
3. 운동 측정
- 2.1 ~ 2.4 단계를 반복 하 여 플레이트 리더를 준비 합니다.
- 열기 아이콘을 클릭 하 고 배경 측정에 사용 되는 방법 파일을 선택 합니다.
- 키네틱 루프 패널에서 루프 유형을 지속 시간으로 유지 하 고 08 시간으로 설정 합니다. 간격 유형을 고정으로 변경 하 고 5 분으로 설정 합니다. 형광 강도 패널을 배경 측정과 동일 하 게 유지
참고: 백그라운드 측정을 위한 간격 유형은 연속 읽기를 허용 하기 위해 "정의 되지 않음"으로 설정 됩니다. 운동 뿐만 아니라 교정 실험의 경우, 간격 유형은 5 분 간격으로 "고정"으로 설정 됩니다. 이는 실험의 설계와 조건의 수에 따라 조정 될 수 있다. - 플레이트 리더 서랍을 엽 니 다; 각 면에는 dH 2o의 6ml로 채워진 습도 카세트를 넣습니다. 플레이트의 뚜껑과 바닥이 깨끗 한지 확인 하십시오-그렇지 않은 경우 티슈에 70% 에탄올로 청소 하 고 뚜껑을 덮고 습기 카세트에 플레이트를 놓습니다.
- 시작을 클릭 하 여 형광 판독값을 시작 합니다. 습도 카세트의 뚜껑이 제자리에 있는지 확인 한 후 OK 를 클릭 합니다.
- 일반적으로 1 ~ 2 시간에 해당 하는 n 싸이 클이 12 ~ 24 일 후 일시 중지 를 클릭 하 여 실험을 중단 합니다. 플레이트를 꺼내 다른 샘플에 대 한 모든 약물/촉진제를 적용 합니다.
참고: 세포가 플레이트 리더에서 꺼내어 지 면, CO2는 pH 민감성 염료 형광에 의해 나타난 바와 같이 ASL ph의 증가를 유도 합니다. 이 CO2유도 pH 변화는 배양 물을 플레이트 리더에 다시 배치한 후 10-15 분 이내에 역전 됩니다. - 접시를 트레이에 있는 습기 카세트에 다시 놓고, 습도 카세트 뚜껑을 재배치 하 고, ASL pH를 더 기록 하 고, ASL ph에 대 한 약물/작용 제의 효과를 모니터링 하기 위해 계속 을 클릭 합니다.
4. 현장 pH 교정
- 플레이트 리더에서 플레이트를 꺼내 세요.
- Basolateral 매체/용액을 흡입 합니다.
- Basolateral 구획과 애 피 컬 표면에 각각 고도로 버퍼링 된 표준 곡선 솔루션의 750 µ l 및 1 µ l을 추가 합니다.
주: 고도로 버퍼링 된 표준 원 곡선 솔루션은 86), CaCl2(1.2 1.2), 내 헵 또는 MES 또는 스 트리 스 100 (5mm)를 포함 합니다. MES를 사용 하 여 ph가 7 미만인 용액을 완충 하 고 ph 7-7.5 및 트리 스를 pH 8로 솔루션에 대 한 Na헵. HCl을 사용 하 여 pH를 원하는 값으로 고정 합니다. - 평판 판독기에서 co2를 끄거나 0.1%로 설정 하 고 플레이트를 습도 카세트에 다시 놓습니다.
- 앞에서 설명한 것과 동일한 매개 변수를 사용 하 여 플레이트 판독기를 설정 하 고 3.2 단계에서와 같이 CO2 를 사용 하지 않습니다.
- 1-1.5 시간 동안 5 분 마다 형광 판독값을 시작 합니다.
5. 보정 데이터에 대 한 염료 농도 및 서 스 펜 션 부피의 효과 평가
- 3 가지 용적에서 최소 4 가지 pH 값으로 형광을 기록 하기에 충분 한 pH 민감성 및 민감 하지 않은 염료 혼합물을 준비 하십시오.
참고: 여기에서, 혼합 1은 µ의 pH 민감성 (1mg/ml) 및 2.6 µ L의 ph 민감성 (10mg/ml)을 혼합 하 고, ph 감 응 형 (1mg/ml)의 13µ L 및 1.3 µ L을 섞어 2 개를 제조 하였다. - 2.2 µ L 또는 1.1 µ L을 혼합 1 또는 혼합 2, 각각 96 웰 플레이트의 12 웰에 넣고 충분 한 교정 솔루션을 추가 하 여 50, 100 또는 200 µ L의 최종 볼륨을 얻고 잘 섞어 줍니다.
참고:이 설정에서 형광 계수는 5µ의 염료 농도 (200 µ L), 10µ에서 100 또는 200 µ L) 또는 50 또는 100 µ L) 또는 40 µ g/ml(50 µ L)에 대해 기록 될 것입니다. - 평판 판독기를 켠 후 온도를 37 ° c로 설정 하 고 플레이트 리더에 플레이트를 삽입 합니다. CO2 컨트롤러를 켜지 마십시오.
참고: 이것은 짧은 실험 이며 온도를 평형 화 하기에 충분 한 시간을 필요로 하기 때문에, 습도 카세트는 필요 하지 않습니다. - 96 well 플레이트의 z 위치와 게인을 조정 하 고 반 투과성 지지대에서 수행 된 실험과 동일한 매개 변수를 사용 합니다.
6. 데이터 분석
- 모든 데이터를 스프레드시트에 저장 하 고 새 파일을 만듭니다.
- 배경 파일에서 두 파장의 각 샘플/조건에 대 한 모든 평균 데이터를 선택 하 고 복사 하 여 새 파일에 붙여넣습니다. 각 우물과 각 파장에 대 한 평균 배경을 계산 합니다.
- 보정 및 키네틱 데이터를 사용 하 여이를 반복 하 고 각 파장에 대 한 각 데이터 포인트에서 배경을 뺍니다.
- 각 시간 점과 모든 시료에 대해 pH 민감성과 pH에 민감 하지 않은 형광 사이의 비율을 계산 합니다.
- 개별 기증자 로부터 모든 샘플을 얻은 경우, 보정 곡선의 각 시점에서 비율의 평균을 계산
참고: 기부자 또는 basolateral 솔루션으로 많은 교정 곡선을 생성 하는 것이 중요 합니다. 실제로, 이러한 매개 변수는 차례로 염료 농도 및 계산 된 pH에 영향을 미칠 것 이다 유체의 흡수 속도 또는 배경 판독에 영향을 미칠 수 있다. - 각 시간 점에 대해 비율에서 표준 곡선을 생성 하 여 x 축에 알려진 pH 값과 y 축의 비율을 플로팅 합니다.
- 비율이 안정 되는 시점을 결정 하 고 선형 회귀 선을 피팅 하 고이 선에 대 한 방정식을 구합니다.
- 운동 데이터 로부터, 각 시점에 대 한 pH를 계산 하 고 y 축에 pH를 x 축의 시간에 플로팅합니다.
주: 휴식/기저 pH는 작용 제 또는 기타 개입의 추가 전에 pH의 안정적인 측정을 통해 데이터 포인트를 평균화 하 여 계산할 수 있습니다. 작용 제의 효과는 처리 전 및 후의 pH 차이를 계산 하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 개입 직후에 데이터 포인트에 비선형 곡선을 피팅 하 여도 된다. 이렇게 하면 t1/2 및 최대값에 대 한 추가 정보가 제공 됩니다. 최종적으로, 산성화 또는 알칼리 화의 비율은 또한 개입 후 첫 번째 지점에 장착 직선의 기울기 로부터 얻을 수 있다.
Representative Results
위에서 설명한 기술은 최대 24 개의 별도의 기본 hAECs 문화권에서 ASL pH의 동적 측정을 가능 하 게 합니다. 그림 1 은 설정 된 주요 단계와 장비를 개략적으로 나타낸 것입니다. 밤새 로드 된 세포는 덱 스 트 란 결합 된 ph 감 응 및 ph 민감 하지 않은 염료 로부터 형광이 5 분 마다 기록 되는 co2 및 온도 제어 플레이트 판독기에 배치 됩니다.
그림 1: ASL pH 측정 방법의 개략도. 배양 물을 세척 하 고 배경 독서를 수행한 후, 1 차 인간 기도 상피 세포 (hAECs) ASL은 덱 스 트 란과 ph 민감성 및 pH 민감 색소 혼합물을 37 ° c, 5%co2에서 밤새 혼합 하 여 로딩 한다. 다음날, 플레이트는 온도 및 CO2 제어 플레이트 리더로 이송 되 고, 두 염료 로부터의 형광은 시간이 지남에 따라 기록 된다. 실험 후에는 현장 교정을 수행 하 고 시간이 지남에 따라 데이터를 수 화 pH로 분석 하 여 제시 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
첫째, 우리는 형광 카운트에 따라서 560/495 비율에 다른 부피 및 염료 농도의 효력을 조사 했습니다. 실제로, ph 민감성 염료에 pH를 둔감 하 게 첨가 하는 목적은 ASL 화 하 중에서 변동성을 교정 하는 것 이다. 그러나,이 가정을 테스트 하 고 우리가 모든 실험 및 세포 유형에 대 한 96 well 플레이트에 세포의 부재에서 수행 된 표준 보정 곡선을 사용할 수 있는지 평가 하는 것이 중요 했다. 50, 100 또는 200 µ의 교정 솔루션 (pH 5.5, 6.5, 7 또는 8)에서 1h 이상의 형광 계수를 5, 10, 20 또는 40 µ의 염료를 포함 하 여 모니터링 했습니다. 그 결과는 도 2aa-c에 제시 되어, 동일한 pH 및 동일한 농도의 염료에 대해, 보고 된 phsens/phsens 방출 비율 (y 축에 560/495)이 부피에 따라 차이가 나는 것을 보여준다 (도 2a). 추가적으로, 동일한 pH와 동일한 부피에서, 상이한 염료 농도는 상이한 비율 값을 제공 한다 (도 2b). 따라서, 부피 또는 염료 농도의 변화는 방출 비율 로부터 산출 된 pH의 절대값에 영향을 미치게 된다. 도 2c 는 온도 평형을 위해 필요한 시간이 약 15-20 분 임을 보여준다. 염료 농도 및 방출 비율에 대 한 부피의 효과를 확인 하기 위해, 우리는 1 차 비 CF 및 CF hAECs의 ASL에 적재 된 염료의 형광을 현장에서 기록 했습니다. 그런 다음 교정을 수행 하 고 (1) 모든 샘플에서 하나의 글로벌 표준 곡선을 생성 하거나 (2) 각 셀 타입에 대해 2 개의 독립적인 표준 곡선 (CF 및 CF가 아닌)을 생성 하 여 결과를 분석 하였다. 두 세포 유형에 서의 ASL pH는 시간 (도 3a, B) 및 평균에 대해 플로팅 하였다 (도 3c). 단일 글로벌 표준 곡선에서 얻어진 asl ph 값은 비 cf 및 cf 배양 간의 유의 한 차이를 보여 주었다 (도 3a, C) 반면에 asl ph는 ph가 계산 되었을 때 cf와 비 cf haecs 간에 크게 다르지 않았다. 독립 표준 곡선 (그림 3b, C). 이러한 결과는 각 기증자 샘플에 대해 각 실험에 대해 독립적인 보정 곡선을 생성 하는 것의 중요성을 보여 주며, 보정 곡선이 함께 평균화 될 때, 높은 pHsens/Phsens 비율 값이 CF 문화권에서 발견 되었기 때문에 , 보다 산 성 pH를 나타내는 (도 3c).
도 2: 시험관 내 pH 교정의 최적화. 알려진 pH 및 다양 한 염료 농도를 함유 하는 용액의 상이한 부피는 96 웰 플레이트 상에 로딩 되 고 형광은 1 h 이상으로 기록 되었다. 부피 (a) 및 염료 농도 (B)의 형광 비율에 대 한 효과. 비율은 24 분 동안 pH에 대해 플롯 되었습니다. (C) 각 용액에 대해 형광의 변화의 기울기를 계산 하 고 시간 (분)의 함수로 서 플로팅 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 일차 hAECs에 대 한 pH 교정 분석의 최적화 . (A) 비 CF 및 cf 배양 으로부터의 평균 데이터를 단일 표준 곡선 으로부터 구한 대표적인 ASL pH의 트레이스. (B) 비 CF 또는 cf 배양에서 수행 된 독립적인 표준 곡선 으로부터 얻어진 미식 화 pH의 대표적인 흔적. 각 데이터 세트는 자체 보정 곡선에서 계산 되었습니다. (C) 비 CF 및 cf 배양 간의 ASL pH 차이를 캘리브레이션 수행 방법의 함수로 평가. 데이터는 n=3 실험 으로부터, 2 방향 ANOVA, Sidak의 다중 비교 시험 으로부터의 평균 ± SEM을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
우리의 기술을 더욱 검증 하기 위해, 우리는이 기술이 ASL pH에서 ' 예상 되는 ' 변화를 감지할 수 있다는 것을 입증 하기 위해 긍정적인 통제를 요구 했습니다. 더 산 성 ASL의 존재로 서 CF 세포는 여전히 논쟁의 여지가, 우리는 캠프 길 항 제 산림을 사용, 긍정적 인 제어 조건으로, cftr을 통해 hco3분 비를 자극 하. 예상 되는 결과는 돌연변이의 중증도에 따라 CF 세포에서 크게 감소 되거나 폐지 될 비 CF 세포에서 ASL의 수 화 알칼리 화를 표시 하는 것 이다. 도 4a 는 시간 경과에 따른 비 CF 및 cf 전지의 대표적인 asl ph의 흔적을 나타낸 것이 고, 도 4b 는 두 세포 유형에 서 산림 치료 전후에 asl ph의 평균 데이터를 보여준다. 우리는 이러한 결과에서 다른 정보를 얻을 수 있습니다. 먼저 도 3b에 도시 된 바와 같이, C에서는, ASL pH를 휴식 하는 것은 비 CF 및 cf 상피 사이에서 다르지 않았다. 둘째, 처음 3-4 시간 포인트는 세포를 산림으로 치료 하기 위해 실험을 일시 중지 한 후, 15 분 내에 회복 된 pH의 큰 증가를 보였다. 이는 플레이트 리더 들 사이의 CO2 농도 강하에 기인 하였다 (5%) 그리고 조직 배양 안전 내각 (~ 0%). 헨 더 슨 핫 셀 발트 방정식에 따르면, 5% co2 환경에서 7의 pH 는 hco3 ~ 9.3 mM의 농도에 상당 합니다. 세포가 플레이트 리더 로부터 제거 되 면, CO2 농도의 0% 로의 강하는 이론적으로 > 8의 pH의 증가로 이어질 것 이다. 도 4a 는 (즉, 5% co2 환경에서) 플레이트 리더에서 플레이트를 재배치 하는 시간의 경과에 의해 설명 될 수 있는 ~ 7.8의 ASL pH 증가를 보여준다. 최종적으로, basolateral 10 µ M 포스 콜린 (Fsk)의 첨가는 비-CF 배양만에서의 ASL의 pH를 현저히 증가 시켰다. CF와 비 CF 외에도 정상 상태 ASL pH에 차이가 존재 하는 다른 그룹에 의해 표시 된 바와 같이, 우리는 우리의 실험에서 pH 차이의 명백한 부재와 CFTR의 역할을 자세히 조사 하 고 싶었습니다. 이를 위해 우리는 비 CF 배양을 특정 CFTR 억제제, CFTRinh172 (172)로 사전 인큐베이션 했습니다. 상기 프로토콜 섹션 2.8에 명시 된 바와 같이, 상기 언급 된 바와 같이 염료 혼합물을 제조 하 고 0.1 X = 2 µ M의 농도로 첨가 하였다. 문헌에 따르면, 비 CF 세포의 ASL 높이는 약 10 µm 이다. 6.5 mm 지름의 반 투과성 지 지체에서, ASL의 이론적 부피는 π × 3.252 = 0.3 µ l입니다. 2 µ M에서 3 µ의 염료 + 172을 첨가 함으로써, 과량의 유체의 흡수 후 억제제의 농도는 이론적으로 20 µ M(1x, 원하는 농도)가 될 것입니다. 도 4c 에서의 대표적인 흔적은 44d 에서의 평균 요약으로, 172이 쉬는 asl ph를 감소 시 지 않았지만, 수 화 ph에서 산림 유도 증가를 방지 하는 것을 보여주고, 따라서 cf 대비 cf와 비교 하 여 얻은 결과를 확인 더 나아가 우리의 기술을 검증 합니다.
그림 4: 산림에의 한 CFTR 활성화에 대 한 반응으로 동적 ASL pH 측정. (A) 비 CF 및 Cf haecs에서 시간이 지남에 따라 ASL pH의 역학에 대 한 산림의 영향의 대표적인 흔적 (Fsk, 10µ m). 데이터는 n=3 실험 으로부터의 평균 ± SEM을 나타낸다. (B) 비 CF 및 cf 배양에서의 ASL 화 pH에 대 한 Fsk의 효과 요약. 데이터는 n=69 비 CF 배양에서의 평균 ± SD 및 35 CF 배양 (2 방향 ANOVA, Sidak의 다중 비교 시험)을 나타낸다. (C) ctrinh172 (172, 20 µ m)이 비-CF haecs에서 ASL으로 유도 되는 미식 화 pH 증가에 미치는 영향의 대표적인 흔적. 데이터는 n=5 실험 으로부터의 평균 ± SEM을 나타낸다. (D) 비 CF 문화권에서의 Fsk 유도 알칼리 화에 대 한 172의 효과 요약. 데이터는 n=5 실험 으로부터 평균 ± SEM을 나타낸다 (2 방향 ANOVA, Sidak의 다중 비교 시험). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
마지막으로, 프로토콜 섹션 6.8에 명시 된 바와 같이, 산성화/알칼리 화의 비율은 개입 후 초기 시간 지점에 선형 회귀를 피팅 함으로써 계산 될 수 있다. 도 5a 는 co2가 없는 경우 basolateral hco3 함유 용액 (hco3- krb)을 제거 하 고 헵 스 완충 용액으로 대체 하는 것을 보여주고, ASL의 현저한 산성화를 유도 하였다. 이것은 hco3 억제 transepithelial hco3 분 비의 부족과 일치 하며,이는 이러한 기도 세포에의 한 구성성 양성자 분 비를 허용 하 여 꾸준히 ASL pH15, 17을 감소 시킵니다. 흥미롭게도, 비 CF 세포의 산성화의 초기 속도는 CF 배양 보다 현저히 느립니다 (그림 5b).
그림 5: hco3 제거에 대 한 반응으로 ASL pH의 동적 변화. (A) 비 CF 및 cf haecs에서 시간이 지남에 따라 ASL pH의 동역학을 제거 하는 hco3 의 효과를 보여주는 대표적인 트레이스. 초기 산성화 율은 hco3 제거 후 7 시간 지점에 장착 된 직선의 기울기를 통해 얻어진 다. 데이터는 각각 비 CF 및 CF 배양에 대 한 n=6 및 7 실험 으로부터의 평균 ± SEM을 나타낸다. (B) hco3 제거 후 초기 산성화 율 요약 데이터는 각각 비 CF 및 CF 배양에 대 한 n=6 및 7 실험에서의 평균 ± SEM을 나타낸다 (만 휘트니 시험). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
여기에서 우리는 1 차적인 인간적 인 기도 상피 세포에 있는 ASL pH의 동적인 측정을 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 중요 한 단계는 세포의 애 피 컬 표면에서 점액을 씻는 것을 포함 하 고, 실험에서와 같은 매개 변수를 사용 하 여 배경을 측정 하 고 뺀 후, z 위치를 최적화 하 고 현장 pH 교정을 수행 합니다.
세포를 세척 하는 첫 번째 단계는 점액의 두꺼운 층 (i)이 periciliary 층에 도달 하는 것을 방지 할 수 있다 (i) 및 (ii) 지연 또는 작용 제/억제제에 반응 하 여 형광의 변화를 검출 하는 것을 방지 하는 것이 중요 하다. 우리의 방법은 기본 haecs가 촉진제에 대 한 응답으로 hco3- 및 H+ 전송기의 활동을 변조 하는 방법을 연구 하기 위해 개발 되었습니다. PCL pH의 변화가 점액의 pH 변화에 어떻게 관련 되는지를 조사 하는 것이 흥미로울 것 이지만,이 프로토콜의 개발은 다른 분자량의 사용을 포함 하 여 필요 하며, 2 층 및 z-스캔을 통해 차별적으로 표적으로 하는 다른 분자-디 스 트- 전체 ASL.
백그라운드 측정은이 프로토콜의 또 다른 중요 한 단계입니다. 완전 하 게 분화 된 일차 기도 상피의 근 면은 거의 평평 하지 않아 빛의 경로와 배경에 영향을 미칩니다. 실험 중에 웰의 동일한 국부 지점에서 배경 판독을 수행 하는 것을 보장 하는 것은 기록의 재현성 및 안정성에 중요 하다.
Z 위치와 이득을 최적화 하는 것은 사용 되는 형광 염료의 각각의 상이한 농도에 대해 설정 될 필요가 있는 필요한 단계 이다. 이는 높은 실험 간 변동성을 방지 합니다. 일단 설정 되 면, 우리의 분석은 안정적이 고 재현성 있는 결과를 제공 합니다. 이것에 대 한 이유 중 하나는 염료가 상피에 의해 쉽게 재흡수 되는 소량의 유체에서 세포에 대 한 애 피 컬 표면에 첨가 되기 때문에 균질 하 게 표시 된 미식 화를 남깁니다. 또 다른 방법은, 동등 하 게 성공 할 수 ASL을 얼룩, PFC에서 "서 스 펜 션" 또는 건조 분말을 사용. 이것은 시간이 절약 될 수 있지만 (실험이 일반적으로 2 시간 이내에 수행 됨에 따라) 건조 한 염료가 ASL에서 완전히 가용 화 될 가능성은 희박 합니다. 양식 덩어리. 따라서 상이한 농도의 pH 민감성 염료는 상피 세포의 표면 상에 서 발견 될 것 이다.
현장 pH 교정은 정확 하 고 재현성 있는 결과를 얻기 위해 중요 한 단계입니다. 결과 섹션에 표시 되 고 설명 된 대로 ASL 볼륨의 차이는 형광 계수와 보간된 pH 값에 영향을 미칩니다 (그림 2 와 그림 3). 상이한 그룹 들이 이전에 ASL pH 측정을 출판 한 반면, 동일한 그룹8,17에 의해 출판 된 다른 연구 들 사이 에서도 광범위 한 값 들이 얻어진 다. 우리는 현장 교정을 수행 함으로써 결과를 보다 재현성 있게 될 것 이라고 믿습니다. 높은 K+/nigericin (또는 다중 이온화) 법을 사용 하 여 표준 곡선 (28)을 생성 하는 다른 pH 교정 기법과 비교 하 여, 여기에 제시 된 분석 법은 , 모든 단계가 안전 캐비닛에서 수행 되는 한, ASL pH에 사용 되는 세포는 세척, 유지 및 다른 실험에 재사용할 수 있어 상피 세포에 비가 역 적으로 영향을 미치지 않는 치료 수행이 가능 하다.
이 분석의 개발과 최적화는 재현성 있는 결과를 제공 하 고 우리는이 방법이 자신의 ASL pH 측정을 가진 다른 그룹을 도울 것으로 믿습니다. 그러나이 기법은 설정 및 사용 중인 셀의 유형으로 인 한 몇 가지 제한 사항도 있습니다. > 여기에 제시 된 것 보다 더 긴 기간 동안 ASL pH를 모니터링 하는 것은 장기적으로 습도가 높은 환경에서 장비가 손상 될 수 있으며 대부분의 판 판독기가 운동 판독값을 기록 하는 옵션을 제공 하는 것 보다는 어려울 수 있습니다. 일정 시간 (일반적으로 24h)입니다. 완전히 차별화 된 기본 haecs의 사용은 분화의 다른 단계가 hco3 및 H+ 전송기의 표현에 영향을 미칠 것 이라는 점에서 매우 중요 합니다. 그러나, 얇은 막 조건 하에서 성장 하는 세포에서 ASL의 부피를 정확 하 게 제어할 가능성이 거의 없다. 프로토콜 및 결과 섹션에 명시 된 바와 같이, 볼륨의 변화는 형광 비율에 영향을 미칠 것이 고 불행히도 단일 개인에서 자란 세포에서 다른 반 투과성 지 지체에서 같은 날에 시드 되었다고 가정 하는 것이 필요 합니다. ASL 볼륨 동일 하 게 됩니다. 이러한 제한으로 인해, 유체 분 비 또는 흡수에 영향을 미치는 모든 작용 제 또는 억제제는 ASL 볼륨 및 아마도 형광 비율에 영향을 미칠 것 이다. 그러나, 우리의 분석에서, 교정 곡선은 실험의 끝에서 수행 됩니다, 그래서 우리는 볼륨에서 이러한 변화는 운동 실험과 같은 방식으로 교정 비율에 영향을 미칠 것 이라고 추정 할 수 있다. 이러한 이유로 우리는 각 조건에 대 한 표준 곡선의 설립을 허용 하기 때문에 테스트 조건 당 적어도 2-3 복제를 사용 하기 위해,이 분석을 개발에 관심이 있을 것 그룹을 조언 한다.
여기에서 우리는 박막 조건 하에서 점 막 표면 pH를 실시간으로 측정할 수 있는 단순, 반자동, 분석을 제시 합니다. 그것은 내부와 기증자 간 비교를 허용 하는 거의 동시에 많은 문화권에서 동적 pH 응답을 조사 하는 능력을가지고. 편광 시스템 (HTS 96 웰 플레이트38 )을 사용 하 여 96 well 플레이트 형식으로이 방법을 업 스케일링 하는 것은 약물 발견 분석으로 더 높은 처리량을 제공 할 것입니다. 더욱이, 우리는이 기술이 ASL pH에 대 한 작용 제의 급성 효과를 연구 하는 데 어떻게 사용 될 수 있는지를 보여 왔으며 이미이 방법은 CF haecs ASL39에 대 한 애 피 컬 양성자 펌프 억제제의 장기적인 효과를 연구 하는 데 사용할 수 있다고 발표 했습니다. PH가 감염, 염증, 점액 점성 및 이온 수송을 조절 하는 것으로 나타났다, pH를 증가 시킬 수 있는 분자 표적을 식별 하는 것은 만성 폐 질환의 연구 분야에서 가치가 있을 것이 고,이 기술은 잠재적으로 용이 하 게 맞춤형 의학 접근법의 약물 스크리닝 개발. 마지막으로, 산-염기 항상성에서의 역 조절은 다른 질병에서 중요 한 역할을 하기 때문에,이 프로토콜은 다른 상피 세포와 같은 다른 장비 (플레이트 판독기) 및 세포 유형으로 최적화 단계와 함께 적응 될 수 있다. 세포 외 산도는 암40,41,42 및이 분석 법이 고 형 종양이 낮은 pHe 를 생산 하는 방법을 결정 하는 것을 도울 수 있거나 저 처리량 약물 스크리닝 분석 법으로 사용 될 수 있었다 pH 항상성 회복. 유사 하 게, 만성 기도 질병에 관해서는, 또한 개인화 한 의학 접근의 발달을 위한 플랫폼을 제공할 수 있었습니다.
Disclosures
MB:이 작업과 관련 되지 않음: 화 이자와 로슈 진단을 통해 조사 관이 주도하는 연구 보조금; 노바 티 스, 로슈 진단 및 TEVA에서 뉴캐슬 대학에 지불 한 스피커 수수료. 베링 거 겔 하 임 및 버텍스 제약에서 교육 회의에 여행 경비.
Acknowledgments
이 작업은 두 개의 CF 트러스트 전략적 연구 센터 교부 금 (SRC003 및 SRC013)과 개념 부여 (MC_PC_15030)에 대 한 의료 연구 위원회 (MRC) 신뢰에 의해 지원 되었습니다. JG는 의학 연구 재단 (MRF-091-0001-RG-GARNE)의 보조금에 의해 지원 되었다. MB는 의학 연구 위원회 임상 과학자 펠로 우 십 (MR/M008797)에 의해 지원 되었습니다. IH는 웰컴 트러스트 임상 훈련 펠로 우 십 (203520/Z/16z)에 의해 지지 되었다. 이 연구는 뉴캐슬 병원 NHS 재단 신탁 및 뉴캐슬 대학교를 기반으로 한 국립 건강 연구 협회 뉴캐슬 생물 의학 연구 센터의 지원을 받았습니다. 표현 된 견해는 저자 (들)의 것 들 이며 반드시 NHS, NIHR 또는 보건부의 것이 아닙니다. 란 젤 박사의 일차 세포는 낭 포 성 섬유 증 기초 교부 금 (BOUCHE15R0)과 NIH 그랜트 (P30DK065988)에 의해 지지 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm syringe filter | Starlab | E4780-1226 | |
| 6.5 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3470 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | 21115 | |
| CFTRInh172 | RnD Systems (Tocris) | 3430 | Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 20 µM |
| Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3524 | |
| dextran-coupled pH-insensitive fluorescent dye: AlexaFluor488-dextran | ThermoFisher | D22910 | Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL |
| dextran-coupled pH-sensitive fluorescent dye: pHrodo-dextran | ThermoFisher | P10361 | Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Forskolin | RnD Systems (Tocris) | 1099 | Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 10 µM |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Cellstar | 655180 | |
| Humidity cassette | TECAN | 30090495 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | |
| MES | Sigma Aldrich | M3885 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaHepes | Sigma Aldrich | H3784 | |
| Plate reader: TECAN SPARK 10M | TECAN | 30086375 | |
| Tris | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Universal pH electrodes DJ 113 | VWR | 662-1385 |
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