Summary
여기서, 합성 또는 시험관내 전사 RNA에 대한 메틸트랜스퍼라제 활성의 직접 분석을 위한 항체-무체질 시험관내 분석이 기재되어 있다.
Abstract
RNA의 100개 이상의 화학적으로 명백한 수정이 있습니다, 그 중 2/3는 메틸화로 이루어져 있습니다. RNA 수정, 특히 메틸화에 대한 관심은 질병과 암과 관련된 생물학적 과정에서 효소를 쓰고 지우는 중요한 역할로 인해 다시 나타났습니다. 여기서, 합성 또는 시험관내 전사 RNA에 대한 RNA 메틸화 기활성의 정확한 분석을 위한 민감한 시험관내 분석이 제공된다. 이 분석은 삼각형태인 S-아데노실-메티오닌을 사용하며, 그 결과 메틸화된 RNA를 트리튬으로 직접 라벨링합니다. 삼중수소 방사선의 낮은 에너지는 이 방법을 안전하고 기존의 삼중수소 신호 증폭 방법을 가능하게 하며, 일반적으로 유물에 걸리기 쉬운 항체를 사용하지 않고 메틸화된 RNA를 정량화하고 시각화할 수 있게 합니다. 이 방법은 RNA 메틸화를 위해 쓰여진 동안, 몇몇 비틀기는 14C 아세틸 코엔자임 A를 가진 RNA 아세틸화와 같은 방사성으로 표지될 수 있는 그밖 RNA 수정의 연구 결과에 적용가능하게 합니다, 이 분석법은 RNA를 빨리 평가할 수 있습니다 메틸화 조건, 소분자 억제제로 억제, 또는 RNA 또는 효소 돌연변이체의 효과, 세포에서 얻은 결과를 검증하고 확장할 수 있는 강력한 도구를 제공한다.
Introduction
DNA, RNA 및 단백질은 유전자 발현을엄격하게 조절하는 변형의 대상이 된다 1. 이러한 수정 중, 메틸화는 세 가지 생체 고분자 모두에 발생합니다. DNA와 단백질 메틸화는 지난 3년간 아주 잘 연구되었습니다. 대조적으로, RNA 메틸화에 대한 관심은 최근에 RNA 메틸화를 쓰거나 지우거나 결합하는 단백질이 발달 및 질병2에서재생하는 중요한 역할에 비추어 재점화되었다. 풍부한 리보좀 및 전사 RNA에서 더 잘 알려진 기능 외에도 RNA 메틸화 경로는특정 메신저 RNA 안정성 3,4,접합5 및 번역6,7을조절합니다. miRNA처리 8,9 및 전사 일시 중지 및 릴리스10,11.
여기서, 분자 생물학 실험실의 설정에서 RNA 메틸트랜스퍼라제 활성의 시험관내 검증을 위한 간단하고 견고한 방법이 보고된다(도 1에요약). 많은 연구는 관심의 RNA 수정에 대하여 항체를 가진 점 얼룩을 통해 RNA 메틸 트랜스퍼라제의 활동을 평가합니다. 그러나, 도트-블롯은 RNA 메틸트랜스퍼라제와 배양시 RNA의 무결성을 검증하지 않는다. 이것은 중요 하기 때문에 뉴클레아제와 재조합 단백질의 사소한 오염 부분 RNA 저하 및 혼란 결과 이어질 수 있습니다. 더욱이, 고도로 특이적인 RNA 변형 항체조차도 특정 서열 또는 구조를 가진 수정되지 않은 RNA를 인식할 수 있다. 여기서 보고된 시험관내 RNA 메틸트랜스퍼라제 분석서는 S-아데노실 메티오닌이 메틸군 공여자에 삼각화될수 있다는 사실을 활용한다(그림 1), 항체를 사용하지 않고 메틸화된 RNA를 정확하게 검출할 수 있도록 함 . 지시서는 관심 있는 효소에 의해 말의 전사체의 메틸화및 시험의 생체외 전사 및 정제를 위해 제공된다. 이 방법은 유연하고 견고하며 주어진 프로젝트의 요구에 따라 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 시험관 내에서 전사 및 정제된 RNA, 화학적으로 합성된 RNA, 뿐만 아니라 세포 RNA도 사용될 수 있다. 이 분석법은 메틸화된 RNA가 겔에서 정확히 실행되는 위치를 보여줌으로써 질적 정보뿐만 아니라, 석질 카운트의 형태로 정량적 정보를 제공한다. 이것은 메틸화에 표적으로 하는 RNA RNA 또는 RNA의 크기를 직접 관찰하는 방법을 제공하기 때문에, 특히 세포 RNA를 기질로 사용하는 경우에, RNA 메틸 트랜스퍼라제의 기능에 독특한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
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Protocol
1. 대상 RNA의 생체 외 전사 및 젤 정제
- 확립된 분자 복제 기술12 또는 키트를 사용하여 T7 및/또는 SP6 프로모터를 함유하는 플라스미드로 관심 의 순서를 복제합니다.
- 시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿 선형화
- 앞서 설명한바와같이, 삽입을 통해 T7 프로모터 영역을 포함하도록 설계된 프라이머를 사용하여 플라스미드의 PCR에 의한 관심의 서열을 증폭, +20-30 bp 업스트림 및 다운스트림.
- 대안적으로, RE의 공급자가 제공한 지침에 따라 인서트를 하류로 사용할 수 있는 제한 효소(RE) 컷 사이트를 사용하여 플라스미드의 5 μg를 소화한다.
참고: 선택한 RE에 의해 인서트가 절단되지 않는지 다시 확인하십시오. 이 단계에서 사용되는 RE의 선택은 전사체의 수율에 극적으로 영향을 미칠 수 있다. 우선, 반대 DNA 가닥(14)에 T7 RNA 폴리머라제의 템플릿 스위칭을 피하기 위해무딘 또는 5'-돌출된 말단 생산 RE로 선형화한다. 초기 수율이 충분하지 않은 경우 다른 RE를 시도하십시오.
- DNA 아가로즈 겔 추출 및 정화용 키트를 사용하여 생성된 DNA를 정화한다. 30 μL의 물로 DNA를 용해시다.
- 소용돌이, 파이펫 1.5 μL로 잘 혼합하고 마이크로 볼륨 분광광도계로 DNA 농도를 측정합니다.
- 250 ng의 DNA를 사용하여 1% 아가로즈 겔 전기영동에 대해 정제된 DNA의 품질과 크기를 4V/cm에서 1시간 동안 이동한 1x TBE 완충액에서 확인합니다.
- 시험관 내 전사 키트의 냉동 시약을 해동합니다. T7 RNA 폴리머라제 믹스를 얼음 위에 놓고 다른 시약을 실온의 영양분위에 놓습니다. 해동이 완료된 직후, rNTP 튜브를 5s로 빠르게 회전하여 튜브 바닥에 용액을 수집하고 얼음 위에 놓습니다. 강수량을 피하기 위해 10x 반응 버퍼를 실온에서 유지하십시오.
- 1.5 mL 튜브에 피펫은 표시된 순서로 실온에서 20 μL 전사 반응의 다음 구성 요소: 물 6 μL, 선형 DNA 템플릿의 2 μL (0.1 - 1 μg), 75 mM ATP 솔루션의 2 μL, 75 mM GTP 용액의 2 μL , 75 mM CTP 용액의 2 μL, 75 mM UTP 용액의 2 μL, 10x 반응 완충제의 2 μL 및 T7 RNA 폴리머라제 믹스의 2 μL.
참고 : PCR에 의해 생성 된 DNA 템플릿의 경우 100 - 200 ng DNA를 사용하십시오. 플라스미드의 제한 효소 다이제스트에 의해 생성된 DNA 템플릿의 경우,~1 μg. 활성 재조합 그의 6-태그가 있는 T7 RNA 폴리머라제는 대장균15에서정제될 수 있다. - 튜브를 완전히 섞는다. 5s에 대한 빠른 스핀은 튜브의 바닥에 반응 용액을 수집한 다음 2-4 시간 동안 37 °C에서 배양합니다.
참고 : 모든 전사체는 DNA 템플릿, 길이, 서열 또는 구조에 따라 다르게 행동합니다. 최대 6 시간까지 다른 배양 시간을 테스트하여 시험관 내 전사 조건을 최적화; DNA 템플릿, T7 RNA 폴리머라제, 또는 NTP의 상이한 농도; 또는 T7 RNA 폴리머라제 혼합물에 존재하는 것에 보충 MgCl 2를 첨가한다. - 잠복기의 끝에서, 20 μL 반응 당 1 μL의 DNase I를 추가하고 15 분 동안 37 °C에서 배양한다.
참고 : 전사 반응은 폴리 아크릴아미드 젤이 준비 될 때까지 얼음에 일시적으로 보관 될 수 있습니다. - 폴리아크릴아미드 겔로 정제를 진행합니다.
참고: RNA는 pH 및 RNase 오염에 민감하기 때문에 RNA 전용 장비와 RNase 가없는 시약을 사용하십시오. - 관심있는 전사체의 크기에 따라 겔에 대한 폴리 아크릴아미드의 비율을 결정 : 100-2000 nt에 대한 3.5 %(XC : 460 nt; BB: 100 nt), 80-500 nt에 대한 5 % (XC : 260 nt; BB: 65 nt), 60-400 nt에 대한 8 % (XC : 160 nt; BB: 45 nt), 40-200 nt에 대한 12 % (XC : 70 nt; BB: 20 nt), 25-150 nt에 대한 15 % (XC : 60 nt; BB: 15 nt, 및 6-100 nt에 대한 20% (XC: 45 nt; BB: 12 nt).
- 50 mL 원추형 튜브에 다음 시약을 결합하여 우레아 변성 폴리아크릴아미드 겔을 준비: 분자 등급 요소 9.6 g, 10x TBE의 2 mL, 40% 아크릴아미드의 x mL:비스-아크릴아미드 믹스(29:1) 및 튜브에 20 mL 마크까지 물 , 여기서 x = 20 mL / (40 % / 젤 비율 %).
주의: 폴리아크릴아미드 젤에는 종종 환경에 도입될 때 위험을 초래할 수 있는 독성 물질인 중합되지 않은 아크릴아미드를 함유하고 있습니다. 기관의 화학 폐기물 프로그램을 통해 폴리아크릴아미드 젤을 폐기하십시오. - 30% 전원으로 15s용 전자레인지. 실온에서 또는 우레아가 완전히 녹을 때까지 10분 동안 영양분에 놓습니다.
- 겔 혼합물이 회전하는 동안, 겔 카세트(18-well, 1 mm 두께, 13.3 x 8.7 cm(W x L))를 회수하고, 빗을 제거하고 겔 주조를 위해 카세트를 배치한다.
- 5s에 대한 50 mL 튜브를 빠르게 회전하여 튜브 의 바닥에 젤 용액을 수집합니다. 10% 황산암모늄 용액(APS)의 125 μL을 첨가하십시오. 영양을 1분 동안 영양에 놓습니다.
- 테트라메틸레틸렌디아민 25μl(TEMED)을 넣고 거품을 피하는 25mL 파이펫으로 5회 위아래로 파이펫팅하여 조심스럽게 섞습니다.
- 피펫을 젤 캐스트에 넣고 거품을 피하면서 젤 빗을 조심스럽게 삽입합니다.
- 카세트 상단에 큰 바인더 클립을 추가하여 씰을 조입니다.
- 겔이 1시간 동안 중합되도록 합니다.
- 젤이 굳어지면 바인더 클립을 제거합니다. 전기 동공 상자에 카세트를 삽입합니다. 상단 및 하단 저장소에 1x TBE 버퍼를 추가합니다.
- 전사 반응을 검색합니다. 물을 최대 100 μL까지 추가한 다음 2x 젤 로딩 버퍼의 100 μL을 추가합니다. 권장량을 물과 10 μL 및 10 μL의 2x 겔 로딩 버퍼를 별도의 1.5 mL 튜브에 혼합하여 사다리를 준비한다.
- 사다리와 시험관내 전사 반응을 70°C에서 15분 동안 열믹서에 인큐베이션한다.
- 시료가 70°C에서 변성하는 동안 빗을 조심스럽게 제거하고, P1000 파이펫으로 각 우물을 위아래로 파이펫팅하여 우물을 청소하고, 100V에서 10분 동안 즉시 사전 실행합니다.
- 시료가 70°C에서 15분 변기를 완료하면 써모믹서에서 튜브를 제거하고 즉시 얼음 위에 놓습니다.
- P1000 파이펫으로 젤의 각 웰을 다시 청소합니다. 사다리의 20 μL을 왼쪽에 첫 번째 우물에, 10 개의 별도 웰에 RNA 샘플의 20 μL, 미사용 우물에 1x 젤 로딩 버퍼의 20 μL을 로드합니다.
- 젤의 % 폴리아크릴아미드에 따라 60-240 분 동안 100V에서 젤을 실행합니다.
참고: 젤 로딩 버퍼의 염료는 젤을 통과할 때 두 개의 밴드, 느린 이동 브로모페놀 블루(BB) 블루 밴드, 그리고 빠르게 이동하는 자일렌 시안(XC) 시안 밴드로 분리됩니다. 상이한 % 폴리아크릴아미드 겔에서 이들 밴드의 대략적인 이동은 공지되어 있으며(단계 1.11 참조) 겔에서 RNA의 이동을 추정하는데 사용될 수 있다. - 젤이 멈추면 카세트에서 젤을 조심스럽게 제거하십시오.
- 50 μL의 핵산 겔 얼룩을 가진 1x TBE 완충액의 50 mL의 용액을 포함하는 깨끗한 상자에 젤을 놓고 RNA를 염색하기 위하여 로커에 5 분 동안 배양합니다.
- 겔 이미징 시스템에서 겔의 전후 밴드 절제 사진을 촬영, 바람직하게는 UV transillumation 대신 청색광을 사용하여.
- 뉴클레아제 프리 일회용 젤 절단 팁을 사용하여 관심 있는 각 밴드를 절제합니다. 각각잘 후, 겔 슬라이스를 함유하는 팁을 1.5 mL 튜브로 옮기고 젤 슬라이스를 모으기 위해 잠시 스핀한다. 모든 밴드가 동일한 1.5 mL 튜브에서 수집될 때까지 반복합니다.
- 모든 젤 슬라이스가 수집되면, 1.5 mL 튜브에 100 μL의 뉴클레아제 없는 물 또는 TE 버퍼를 추가합니다. ~48시간 동안 4°C에서 보관하십시오. 이것은 RNA가 용액으로 젤 조각을 종료하는 것을 허용합니다.
- 48시간 후, 물 또는 TE 버퍼를 신선한 1.5 mL 튜브로 피펫처리한다. 나머지 젤 슬라이스를 폐기합니다. 다음과 같이 클린업 키트를 통해 RNA를 정화한다.
- 실온에서 스핀 컬럼을 30분 이상 평형화합니다.
- 1.32단계에서 새로운 1.5 mL 튜브에서 RNA 용액의 100 μL에, 350 μL의 RLT 버퍼를 첨가하고 영양분에 2분 동안 잘 섞는다. 튜브 의 하단에 용액을 수집하기 위해 200 x g에서 1 s를 회전합니다.
- 100% EtOH의 675 μL을 넣고 영양분에 2분 동안 잘 섞으세요. 200 x g에서 1 s를 스핀하고 즉시 다음 단계로 진행하십시오.
- 혼합물의 565 μL을 스핀 컬럼에 옮기고 15,000 x g에서 1 분 동안 회전합니다. 포부로 수집 튜브를 비웁습니다.
- 샘플의 두 번째 절반으로 이전 단계를 반복합니다.
- RPE 버퍼 500 μL을 컬럼에 추가하고 15,000 x g에서 1분 동안 회전합니다. 포부로 수집 튜브를 비웁습니다.
- 열에 750 μL의 80 % 에탄올을 추가하고 15,000 x g에서 1 분 동안 돌루습니다. 포부로 수집 튜브를 비웁습니다.
- 뚜껑이 열린 새 2mL 컬렉션 튜브에 컬럼을 놓고 5분 동안 15,000 x g으로 회전합니다.
- 컬럼을 새 1.5mL 튜브로 옮김.
- 기둥 중앙에 17 μL의 물을 넣고 1분 동안 15,000 x g으로 돌리면 용해됩니다. 또 다른 17 μL의 물을 사용하여 다시 용신하십시오. 회수된 총 부피는 32 μL이어야 합니다.
- 소용돌이, 파이펫 1.5 μL에 의해 잘 혼합하고 마이크로 볼륨 분광광도계를 사용하여 RNA의 농도를 측정합니다.
- 단계 1.11-1.29에서와 같이 우레아 변성 폴리아크릴아미드 겔에 의한 RNA 정제의 품질을 확인한다.
2. 체외 RNA 메틸 트랜스퍼라제 분석
- 100 μL RNA 메틸 트랜스퍼래아제 분석제를 얼음 위에 1.5 mL 튜브에 설정: 물 23 μL, 10 μL 의 10 x TBS (500 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1.5 M NaCl), 0.05 M EDTA의 2 μL, 100 mMMMM의 5 μL , 40 μL 의 50 % 글리세롤, 4 μL 의 58 μM 3H-SAM, 5 20 x 프로테아제 억제제 칵테일의 5 μL, RNaseOUT 의 1 μL (선택 사항), RNA 5 μL 및 메틸 트랜스 페트리파아제 5 μL.
주의: 방사성 삼각물질은 위험하며 장갑, 실험실 코트 및 기타 필요한 PPE를 착용한 상태에서만 취급해야 합니다. 방사성 물질과 접촉하는 모든 파이펫 팁과 튜브는 고체 방사성 폐기물로 간주됩니다. 실험실의 승인된 방사성 폐기물 프로토콜에 따라 모든 고체 및 액체 방사성 폐기물을 폐기합니다.
참고: 메틸 트랜스퍼라제없이 RNA없이 대조군 샘플을 포함시다. 시약 농도는 MgCl2 또는 라벨이 지정되지 않은 SAM과 같은 이가 성 양이온 염의 최적화 및/또는 포함이 필요할 수 있습니다. 최종 RNA 농도의 최적 범위는 50 nM에서 1 μM이며 메틸 트랜스퍼 라제 농도는 25 nM에서 300 nM입니다. - 튜브를 부드럽게 소용돌이쳐 서 완전히 섞으세요. 튜브의 하단에 용액을 수집하기 위해 200 x g에서 5 s를 돌루십시오. 튜브를 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
- 1.32단계에서와 같이 컬럼 정제를 사용하여 반응을 정리한다.
주의: 특히 컬럼 세차(수거 튜브에서 폐기물을 흡입하는 대신 파이펫 아웃)하는 동안 방사성 물질을 적절히 폐기할 때 매우 주의하십시오. - 액체 침전 카운트 수행
- 샘플당 유리병 1개, 배경 측정용 바이알 1개, 스와이프 테스트를 위한 바이알 1개로 별미 계산 랙을 설정합니다. 5 mL의 진미 계수 용액으로 바이알을 채웁니다.
- 용출된 방사성 RNA 샘플 10 μL을 1바이알에 넣고 뚜껑을 조이고 부드럽게 섞습니다.
- 스 와이프 테스트 바이알을 준비합니다. 프로토콜 중에 사용되는 모든 표면과 장비에 면봉을 철저히 문지릅니다. 5 mL의 진미 용액이 채워진 바이알에 면봉을 넣고 뚜껑을 조입니다.
- 다음과 같이 반짝이 카운터에서 샘플을 실행합니다. 카운터 후드를 열고 랙을 기기에 삽입하고 후드를 닫습니다. 단일 랙 수를 선택합니다. 사용자 프로그램 선택 선택을 선택합니다. 선택 하거나 60 s. 히트 카운트 랙에 대 한 삼중수소 (3 H)를 측정 하는 프로그램을 만듭니다. 세 번 번 번 번의 반짝이 계산을 반복합니다.
참고: 장비는 각 샘플의 번화 수를 측정하고 화면과 인쇄물 모두에 출력합니다. 원하는 경우 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 2.3단계에서 남은 RNA 샘플은 나중에 사용하기 위해 -80°C에서 동결되어야 한다.
- 자동 라디오그램 진행
- 단계 1.11-1.20에서와 같이 우레아 분해 폴리아크릴아미드 겔을 준비하고 미리 실행한다.
- 방사성 RNA 물질의 피펫 20 μL을 2x 겔 로딩 버퍼의 20 μL을 함유하는 새로운 1.5 mL 튜브로. 잘 섞으세요. 1.21단계에서와 같이 사다리를 준비한다. 샘플을 70°C에서 15분 동안 배양합니다.
- 시료 로딩 직전에 젤의 우물을 한 번 더 씻으시고 드시면 됩니다. 준비된 사다리의 20 μL, 시료의 20 μL, 나머지 차선에 1x 젤 로딩 버퍼의 20 μL을 적재하십시오. 폴리아크릴아미드 백분율에 따라 60-180분 동안 100V에서 젤을 실행합니다.
- 겔이 실행이 끝나면 카세트에서 젤을 제거하고 50 mL의 1x TBE 버퍼를 함유 한 상자에 5 μL의 초감응성 핵산 젤 얼룩을 담았습니다.
- RNA를 얼룩지게 하기 위해 로커에 5분 동안 배양합니다.
- 조심스럽게 상자에서 젤을 꺼내 우물과 왼쪽에있는 사다리가있는 젤 이미징 시스템의 UV 트랜스 딜루미에이터에 놓습니다.
- 젤에 카메라를 초점을 맞추고 UV 광선을 켜고 신호 강도에 따라 50ms에서 1s까지 노출하여 젤의 이미지를 찍습니다.
- UV 노출을 끄고 이미지를 Tiff 파일로 저장합니다.
- 젤을 다시 상자에 넣습니다. TBE를 제거합니다. 로커에서 실온에서 30 분 동안 50 mL의 고정 용액 (50 % 메탄올, 10 % 아세트산, 40 % 초순수)으로 젤을 고정하십시오.
- 젤을 다시 25mL의 자가 방사선 증강 용액이 들어 있는 신선한 블랙 박스로 부드럽게 옮김. 블랙 박스가없는 경우, 빛으로부터 용액을 보호하기 위해 알루미늄 호일로 상자를 덮습니다.
- 로커의 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 젤을 살짝 들어 올려 우물과 오른쪽 사다리가 있는 플라스틱 랩 시트에 얼굴을 아래로 향하게 놓습니다. 젤 뒷면에 크로마토그래피 용지 2장을 놓습니다. 전체 스택을 부드럽게 뒤집습니다.
- 젤 건조기를 80°C로 예열합니다. 젤 건조기의 플라스틱 커버를 뒤로 이동합니다. 플라스틱 커버 아래에 랩, 젤 및 크로마토그래피 용지 스택을 삽입하고 플라스틱 커버를 아래로 이동하여 씰을 만듭니다.
- 젤 건조기에서 80°C에서 1시간 동안 건조시.
- 젤 드라이어를 끄고 스택을 부드럽게 제거합니다. 랩과 두 번째 크로마토그래피 용지를 제거합니다. 자가 라디오 그램 카세트에 말린 젤과 함께 남아있는 크로마토그래피 종이를 테이프로 채집니다.
- 어두운 방에 1 장의 자가 방사선 필름을 추가하십시오.
- -80 °C에서 카세트를 놓고 이전에 측정 된 scintillation 카운트에 따라 판단 할 수있는 신호 강도에 따라 1 시간에서 4 주 후에 필름을 개발하십시오 : 250-1,000 cpm의 경우 1-4 주, 1,000-10,000 cpm의 경우 24 h ~ 1 주, gt;10,000h의 경우 1 h ~ 24 h M.
- 필름이 개발되면, 카세트 위에 필름을 놓고 실험실 마커로 조심스럽게 젤의 4 가장자리, 각 우물, XC 및 BB 염료의 위치를 표시합니다.
- 인치 해상도당 300 픽셀 또는 600 픽셀로 필름을 스캔하고 이미지를 Tiff 파일로 저장합니다.
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Representative Results
생체 외 에서 전사 반응
그림 2 A는 7SK snRNA의 T7 RNA 폴리머라제와의 시험관내 전사 반응으로부터의 전형적인 실행을 나타내며, 이는 비교적 짧은(331 nt) 및 고도로 구조화된 RNA이다. 원시 이미지에 표시된 것처럼, 여러 원치 않는 밴드가 있다, 둘 다 짧고 긴 7SK, 아마 임의의 전사 개시 또는 종료 이벤트에서 발생. 이 때문에, 시험관 내 전사 반응에 따른 겔 정제는 도 2B에도시된 바와 같이 깨끗한 RNA 샘플을 얻는 것이 중요하다. 이 시점에서, 관심 있는 RNA는 사다리에 상대적인 위치에 의해 식별되고 겔 정제에 의해 정제될 수 있다.
앞서 언급한 바와 같이, 겔 정제 단계 이전에 전사 반응의 길이를 최적화할 필요가 있을 수 있다. 너무 오래 실행되는 전사 반응은 RNA 생산의 극단적으로 높은 양이 귀착될 수 있고, 정확한 전사체의 다운스트림 식별을 어렵게 만듭니다. 또한 특정 프라이머를 사용하여 역전사 및 정량적 PCR(RTqPCR)에 의한 정제된 전사체의 신원을 확인하는 것이 중요하다.
체외 RNA 메틸 트랜스퍼라제 분석
도 3은 당사의 권장 RNA 및 단백질 농도의 하한을 이용하여 프로토콜에 기재된 RNA 메틸트랜스퍼라제 분석법의 대표적인 결과를 나타낸다. 이 분석법은 scintillation 카운트의 정량적 결과뿐만 아니라 자동 라디오 그램의 질적 결과를 모두 허용합니다. 여기서, 메틸트랜스페라제인 메틸트랜스퍼라제인 MePCE 는 메틸레이트 7SK10에공지되어 있으며, U6메틸레이트도 할 수 있는 것으로 나타났다. 더욱이, 최근 7SK16에도시된 바와 같이, 헤스톤 H4를 MePCE에 결합하는 것도 U6 메틸화를 억제한다. 우리는 이 프로토콜의 견고성을 나타내는 광도 수(그림3C)와 자동 라디오그램(그림3B)에서 이를 관찰할 수 있었습니다.
그림 1 . 전형적인 RNA 메틸트랜스페타제 분석 워크플로우 및 예상 결과의 개략적 표현. 시네풍인은 경쟁력 있는 메틸트랜스퍼라제 억제제이다. L: 사다리; WT: 와일드 타입; M: 촉매 돌연변이; cpm: 분당 카운트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 . 대표적인 실험은 (A) 전(A) 및 (B) 핵산 얼룩으로 염색된 8% 겔에 대한 변성 우레아-폴리아크릴아미드에 대한 정제 전의 생성물을 나타낸다. 화살표는 겔 정제 전후의 7SK 전사체를 가리킨다. L: 사다리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 . 생체외 RNA 메틸-트랜스페라제 분석술은 MePCE와 함께 U6에 대하여 수행되었습니다. 생체외 메틸트랜스퍼라제 는 재조합 GST-MePCE(25 nM), 3H-방사성 SAM을 메틸기 공여자로서 사용하고 시험관내 U6 RNA(50 nM)를 기질로 전사하였다. 자가 라디오그램은 +Histone H4 샘플에서 잔류 활성(250 cpm)을 검출하기 위해 2주 동안 노출되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서, 특정 전사체를 향한 RNA 메틸트랜스퍼라제 활성의 시험관내 검증을 위한 간단하고 견고한 방법이 보고된다. 이 분석은 S-아데노실 메티오닌이 메틸 기공체에서 삼각화될 수있다는 사실을 활용합니다(그림 1), 메틸화된 RNA가 항체를 사용하지 않고 정확하게 검출될 수 있도록 한다. 그러나,이 분석효소는 어떤 잔기 또는 화학 기가 효소에 의해 메틸화되어 있는지 나타낼 수 없다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 특정 잔기가 메틸화되어 있는지 확인하거나 확인하기 위해 RNA 기판의 돌연변이 분석, 역전사 블록 또는 질량 분광 분석과 같은 다른 방법이 RNA 메틸 트랜스퍼라제 분석과 함께 사용될 수 있다.
RNA의 선택과 합성의 그들의 모드는 RNA의 크기에 달려 있습니다. 18 과 120 nt 사이의 크기의 특정 RNA는 많은 평판이 좋은 핵산 공급자로부터 편리하게 맞춤형 합성될 수 있다. 그러나, 가장 일반적으로, 다양한 크기의 특정 RNA는 시험관 내에서 전사된다. 시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿은 다양한 방법으로 생성될 수 있고, 관심의 순서가 T7 또는 SP6 프로모터의 하류에 위치하도록 요구한다. RNA의 정확한 끝이 중요한 경우에, pRZ 플라스미드는17을추천합니다 . 분석의 높은 감도(그림3) 또한 세포 RNA의 혼합물로 정제 된 RNA를 대체 할 수 있습니다, 예를 들어 총 또는 메신저 RNA. 실제로, 겔 및 오토라디오그램은 메틸화를 표적으로 하는 RNA(들)의 크기를 직접 관찰하는 방법을 제공한다.
프로토콜의 2.1 단계에서 여기에서 보고된 조건은 인간에 있는 2개의 상동통이 있는 메틸 트랜스퍼라제의 BIN3 가족에 최적입니다, MePCE10 및 BCDIN3D9. 분석 조건은 관심있는 특정 단백질 및 RNA로 조정될 필요가 있다는 것을 강조하는 것이 중요합니다. 예를 들어, MgCl2의 존재는 BCDIN3D 활성18을감소시키는 것으로 나타났지만, MgCl2는 RNA 구조의 중요한 코디네이터가 될 수 있으며, 따라서 다른 RNA에 대한 분석의 중요한 구성 요소를 구성할 수 있음 메틸 트랜스퍼라제.
장시간 노출될 수 있는 오토라디오그램을 사용하면 번광 분석법에서 검출되지 않는 매우 약한 활성을 감지할 수 있다는 장점이 있습니다. 보통 이것은 단백질이 메틸 트랜스퍼라제이지만 하나 이상의 반응 조건 또는 시약이 최적화되어야 한다는 것을 나타낸다: 효소; 기판, 보조 인자, 버퍼조건 등 9. 예를 들어, 효소 정제는 태그의 위치를 제거하거나 변경하기 위해 개선될 필요가 있다. 또한 기질로서 사용되는 RNA가 제대로 접히거나 효소에 의해 메틸화되는 다른 단백질 또는 RNA 인자와 상호 작용할 필요가 있을 수 있다. 따라서, 세포에서 기존의 문헌 및/또는 자체 결과는 관심 있는 효소 및 RNA에 대한 분석 조건을 설정하기 위해 신중하게 검토될 필요가 있다.
분석또한 매우 유연합니다. 예를 들어, 방사성 메틸화된 RNA가 정량적 및 정성적 데메틸라아제 분석(11)에 사용되는 것과 같은또 다른 유형의 분석소가 전구체 단계일 수 있으며, 또는 RNA 결합 분석제에서 구체적으로 상기의 거동을 시각화할 수 있도록 한다. 메틸화된 RNA는 수정되지 않은 RNA와 비교됩니다. 또한, 아세틸 코엔자임 A와 같이 방사성 표지될 수 있는 코엔자임인을 사용하는 RNA의 변형을 분석하기 위해 분석하는 분석은19,20.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 ChemDraw에 대한 그의 도움에 대한 박사 투르자 칸티 데브나스 에게 감사드립니다. Xhemalçe 실험실에서 연구는 국방부에 의해 지원됩니다 - 의회 지시 의료 연구 프로그램 - 유방암 획기적인 상 (W81XWH-16-1-0352), NIH 그랜트 R01 GM127802 및 셀룰러 연구소의 시작 자금 분자 생물학 및 오스틴, 미국 텍사스 대학에서 자연 과학 대학.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 bp DNA Ladder | Invitrogen | 10821-015 | 10 bp DNA Ladder kit. |
| 10% Ammonium Persulfate (APS) | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter). |
| 10X TBE Buffer | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter). |
| 10X TBS | N/A | N/A | For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter. |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher | BP1408-1 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H]) | Perkin Elmer | NET155V250UC | For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM. Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot. |
| Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes | GE Healthcare | RPN11649 | For autoradiogram gel exposure. |
| Amersham Hyperfilm MP | GE Healthcare | 28906846 | For autoradiogram gel exposure. |
| Beckman Scintillation Counter | Beckman | LS6500 | For liquid scintillation count. |
| Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704466 | Mini Horizontal Electrophoresis System. |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Applied Science | 4693159001 | For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water. |
| Criterion Cell | Biorad | 345-9902 | RNase free empty cassette for polyacrylamide gel. |
| Criterion empty Cassettes | Biorad | 1656001 | Vertical midi-format electrophoresis cell. |
| DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer | DeNovix | DS-11-S | Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration. |
| Ecoscint Original | National Diagnostics | LS-271 | For liquid scintillation count. |
| Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials | Fisher | 03-337-1 | For liquid scintillation count. |
| Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer | RPI CORP | 112600 | For autoradiogram gel pretreatment. |
| Gel dryer | Biorad | 1651745 | For drying gel. |
| Gel Loading Buffer II | Ambion | AM8547 | For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue). |
| GeneCatcher disposable gel excision tips | Gel Company | NC9431993 | For removing bands from agarose and polyacrylamide gels. |
| Megascript Kit | Ambion | AM1333 | For in vitro transcription with T7 RNA polymerase. |
| Perfectwestern Extralarge Container | Genhunter Corporation | NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black) | Gel staining box. |
| pRZ | Addgene | #27663 | Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends |
| Qiagen RNeasy MinElute Cleanup | Qiagen | 74204 | For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol. |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription. |
| Saran Premium Plastic Wrap | Saran Wrap | Amazon | For drying gel. |
| SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | Ultra sensitive nucleic acid gel stain. |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Nucleic acid gel stain. |
| TE | Sigma | 93283-100ML | 10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0 |
| TEMED | Fisher | 110-18-9 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES | eppendorf | 5382000023/5361000038 | For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes. |
| TOPO TA Cloning Kit | life technologies | Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription. | |
| TURBO DNase (2 U⁄µL) | Ambion | AM2238 | For DNA removal from in vitro transcription reactions. |
| Urea | Sigma | 51456-500G | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Whatman 3MM paper | GE Healthcare | 3030-154 | Chromatography paper for drying gel. |
References
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