Summary
Из-за спектрального перекрытия возбуждения и длины волн выбросов аналогов NADH и fura-2, сигнальные помехи от обоих химических веществ в живых клетках неизбежны во время количественного измерения «Ca2». Таким образом, был разработан новый онлайн-метод коррекции помех сигнала NADH для измерения «Ca2».
Abstract
Для количественного измерения «Ca2»часто используются аналоги фура-2, которые являются социеметрическими флюорозондами. Тем не менее, использование красителя внутренне ограничено в живых клетках из-за аутофлуоресценции вмешательства, в основном от никотинамида аденин динуклеотид (NADH). Более конкретно, это является основным препятствием при измерении митохондриальных «Ca2»- количественно с помощью аналогов fura-2, потому что большинство NADH находится в митохондриях. Если концентрация флуоресцентного красителя одинакова, определенная интенсивность возбуждения должна производить такую же интенсивность выбросов. Таким образом, коэффициент интенсивности выбросов двух различных длин волн возбуждения должен быть постоянным. На основе этого принципа был разработан новый онлайн-метод коррекции помех сигнала NADH для измерения «Ca2»,и можно получить реальную интенсивность сигнала NADH и fura-2. Кроме того, было разработано новое уравнение для расчета «Ca2»с изосбестическим возбуждением или возбуждением на уровне 400 нм. С помощью этого метода можно было бы успешно измерить изменения в митохондриальной «Ca2». Кроме того, с различным набором возбуждения и длины волн выбросов, несколько параметров, в том числе NADH, "Ca2"и рН или митохондриальной мембраны потенциал(м)), может быть одновременно измерены. Митохондриальные «Ca2»им или рН были измерены с помощью фура-2-FF и тетраметилходамин этилэтил-эстер (TMRE) или carboxy-seminaphtorhodafluor-1 (карбокси-SNARF-1).
Introduction
Значительная роль внутриклеточного Ca2 "широко известен1. Количественная оценка «Ca2»необходима для понимания процессов клеточных физиологических функций. Аналоги Fura-2 весьма полезны, потому что они возбуждаются в УФ-диапазоне (Злт;400 нм), а коэффициентеметрический метод может быть применен для количественного измерения. Таким образом, другие физиологические параметры, такие как рН, мембранный потенциал и т.д., могут быть измерены с другими флуоресцентными красителями. Митохондриальная концентрация Ca2 "("Ca 2"м) диапазон, как сообщается, 0,08 х 20 мкм2,3,4,5. Среди аналогов fura-2, fura-2-FF подходит для измерения этого диапазона «Ca2». Тем не менее, живые клетки, к сожалению, содержат NADH/NADPH для их метаболических процессов, а NADH генерирует сигнальные помехи из-за перекрывающихся возбужденийных и эмиссионных спектров с аналогом fura-2. Это вмешательство значительно ограничивает использование аналогов fura-2. В частности, если аналог применяется для измерения митохондриальных «Ca2»,это вмешательство является самым большим препятствием, потому что наибольшее количество NADH находится в митохондриях. Это еще больше осложняется изменениями NADH, связанными с митохондриальным мембрановым потенциалом(м)и изменением м влияетна «Ca2»m6,7,8 , 9. Кроме того, для изучения динамики «Ca2»m, важно знать состояние других митохондриальных параметров, таких как NADH,м ,и рН.
Выбросы на уровне 450 нм и 500 нм с возбуждением на уровне 353 нм, 361 нм и 400 нм содержат сигналы от NADH и fura-2-FF, и уравнения следующие. При этом 353 нм и 361 нм являются изосбестовыми точками фурас-2-ФЗ для выбросов на уровне 450 нм и 500 нм соответственно.
F361,450 - F361,450,NADH - F361,450,Fura Equation 1
F353,500 - F353,500,NADH - F353,500,Fura Equation 2
F400,500 - F400,500,NADH - F400,500,Fura Equation 3
где Fx,y является измеренной интенсивностью выбросов на y-nm по x-nm возбуждение, Fх,y, NADH представляет собой чистую NADH-зависимую интенсивность выбросов, и Fx,y,Fura представляет собой чистую интенсивность выбросов фура-2-FF. При той же концентрации флуоресцентного красителя определенная интенсивность возбуждения должна производить такую же интенсивность выбросов. Таким образом, коэффициент интенсивности выбросов двух различных длин волн возбуждения должен быть постоянным. Ca2 и fura-2 не повлияли на характеристики флуоресценции NADH; таким образом, соотношение выбросов на 450 нм и на 500 нм NADH было постоянным на любой волне возбуждения. То же правило может быть использовано для fura-2-FF на основе предположения, что NADH или «Ca2»не влияет на спектры выбросов и возбуждения фурас-2-FF. Тем не менее, Ca2 "вызвало спектральный сдвиг фура-2-FF выбросов. Таким образом, чтобы удалить эффект Ca2 ",изосбестическое возбуждение, которое не зависит от Ca2 ", необходимо использовать. Каждая длина волны эмиссии (т.е. 450 нм и 500 нм) имеет различную изосбестную точку, и из нашей экспериментальной установки было выбрано 353 нм при 500 Нм и 361 нм при 450 Нм. Из них, следующие уравнения действительны10.
Rf - F361,450,Fura/F353,500,Fura Equation 4
RN1 - F400,500,NADH/F361,450,NADH Уравнение 5
RN2 - F353,500,NADH/F361,450,NADH Уравнение 6
С этими константами, следующие уравнения из (Equation 1) (Equation 2), и (Equation 3) действительны.
F361,450 - F361,450,NADH - Rf f353,500,Fura Equation 7
F353,450 - RN2 - F361,450,NADH -F 353,500,Fura Equation 8
F400,500 - RN1 - F361,450,NADH -F 400,500,Fura Equation 9
Из этих уравнений, если Rf,RN1и RN2 известны, чистые сигналы NADH и fura-2 могут быть получены следующим образом.
F361,450,NADH (F361,450 - Rf f353,500)/(1 - Rf и RN2) Уравнение 10
F353,500,Fura (RN2 и F361,450 ) F353,500)/(Rf и RN2 - 1) Уравнение 11
F400,500,Fura - F400,500 - RN1 - F361,450,NADH Equation 12
RФура - F353,500,Fura/F400,500,Fura Equation 13
Форма привязкиКП -2к фура-2-FF была практически нефлуоресцентной на длине волны возбуждения 400 нм. На основе этого свойства можно получить следующее новое уравнение калибровки.
"Ca2"-К-д ( F400,500,max/F353,500,max)
где Kd является постоянной диссоциации, F400,500,max и F353,500, макс являются максимальными значениями излучаемых сигналов на 500 нм с возбуждениями на 400 нм и 353 нм, соответственно, и Rмин является минимальным RFura в Ca2 -бесплатное состояние. В виду того что isosbestic excitations были использованы, уровнение можно упростить более далее следующим образом.
"Ca2"-К д . (1 / Rмин)
Таким образом, для расчета значения K d иRmin необходимы только значения Kd и R.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные протоколы были одобрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и использованию.
1. Подготовка решения
- Подготовка одного свежеизолированных сердечных миоцитов11.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая лаборатория может иметь другое решение для хранения клеток. Здесь миоциты хранятся в культурной среде (DMEM). - Подготовьте 100 мл решения Ca2-free(таблица 1).
- Приготовьте 50 мл культуры среды в 50 мл стакан. Aliquot 5 мл и положить его в водяную баню при 37 градусов по Цельсию. Храните оставшийся раствор при комнатной температуре.
- Приготовьте 50 мл раствора сапонина, добавив 5 мг сапонина до 50 мл раствора Ca2-free.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сапонин используется для пермяки сердечных миоцитов, для удаления цитозольных отсеков, и визуализировать митохондриальной флуоресценции только. - Приготовьте 16 мкм фура-2-FF-AM, растворенный в диметилсульфодокси (ДМСО).
ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте 1 мМ запасной раствор фурас-2-FF-AM растворенного в DMSO и aliquot 16 л в трубке 2 мл. Храните их при -20 градусах Цельсия до использования. - Приготовьте 50 мл безNADH Ca2 --бесплатноерешение(Таблица 1) и 50 мл безNADH Ca 2"насыщенныйраствор (Таблица 1) когда изосбестные точки должны быть измерены. Отрегулируйте рН до 7.0 с KOH.
ПРИМЕЧАНИЕ: Без NADH Ca2 --бесплатноерешение (Таблица 1) содержит 10 ММ FCCP и 100 ММ ADP без каких-либо митохондриальных субстратов, чтобы свести к минимуму NADH в митохондриях. - Подготовьте 50 мл раствора Ca2- свободного, 50 мл раствора malate, 50 мл раствора пирувата, 50 мл раствора malate-pyruvate и 50 мл раствора ротенона, который будет использоваться для измерения фактора коррекции NADH(таблица 1).
2. Процедура загрузки фторзонда в митохондрии
- Подготовьте раствор для загрузки красителя, добавив 2 мл культуры среднего до 16 л от 1 мм фура-2-FF-AM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентный краситель хрупкий под светом. Подготовьте решение непосредственно перед использованием. Храните раствор, содержащий флуоресцентный краситель в темном месте. Окончательная концентрация фура-2-FF-AM составляет 8 мкм. Если использовался carboxy-SNARF-1, подготовьте раствор для погрузки красителя с 2 мкм карбокси-SNARF-1-AM. - Возьмите 2 мл изолированных клеток и поместите в пробирку 5 мл в вертикальном положении.
- Подождите 15 минут для миоцитов, чтобы опуститься на дно и удалить супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатант может содержать клеточный мусор. Не центрифуги трубки, чтобы избежать повреждения клеток. - Добавьте 2 мл раствора для загрузки красителя.
- Инкубировать раствор для загрузки красителя с клетками в течение 60 мин при 4 градусах Цельсия.
- Затем поместите пробирку в водяную ванну 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут в вертикальном положении.
- Удалите супернатант и добавьте 4 мл предощенной культуры среды 37 градусов по Цельсию. Инкубировать клетки в течение 60 минут в водяной бане 37 градусов по Цельсию.
- Наконец, удалите супернатант, добавьте 4 мл культуры среды при комнатной температуре и держите трубку при комнатной температуре.
3. Внедрение системы многопараметрических измерений
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показана диаграмма всей системы.
- Для источника возбуждения света используйте быстрый монохроматор (полихром II), который может изменять свет в пределах 3 мс.
- Используйте линзу погружения масла (40x, NA 1.3) с перевернутым микроскопом для увеличения интенсивности сигнала.
- Используйте ближнеинфракрасный фильтр и камеру с зарядным устройством (CCD) для мониторинга поля объекта без флуоресцентных помех сигнала.
- Захват изображения поля объекта, чтобы получить область.
- Отрегулируйте поле объекта на экране монитора с помощью полевой диафрагмы только для того, чтобы показать ячейку для уменьшения фона.
- Используйте четыре фотомультипликатора с каждым фильтром диапазона (450, 500, 590 и 640 нм) для обнаружения длин волн выбросов с помощью метода подсчета фотонов. Используйте соответствующие дихроические зеркала, чтобы разделить и перенаправить свет выбросов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возбуждение света очень сильна по сравнению с выбросом света. Таким образом, выберите фильтр диапазона прохода с самыми высокими блокирующими характеристиками, чтобы уменьшить фон. Система подсчета фотонов состоит из комбинации ПМТ, фотоновистого счетчика и высокоскоростного счетчика. Для управления системой и отбора проб данных использовалось программное обеспечение для вождения на заказ. Необходимо найти способ применения этого метода с другими системами.
4. Методы коррекции NADH с многопараметрической системой измерения
- Идентификация изосбестовых точек Fura-2-FF на месте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Многие доклады заявили, что флуоресцентные характеристики изменяются в клетках. Таким образом, выполнить все процедуры для получения параметров для коррекции вмешательства в situ.- Установите красителя загруженной клетки на микроскоп и ждать 3 мин, чтобы потопить клетки на дно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте номера клеток, чтобы увидеть около одной ячейки на одно объективное поле с 40-x объективом. - Perfuse NADH-бесплатно ca2 "-бесплатноерешение при 37 градусах Цельсия.
- После ориентации ячейки измерьте фон, свободный от ячейки, и область ячейки, как показано в разделе 4.1. Рассчитайте фон ячейки из области ячейки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оба фоновых сигнала должны быть исправлены в каждом эксперименте. - Пронизом сапонина раствор для 60 с и вернуться к NADH-бесплатно ca2 "-бесплатноерешение.
- Измерьте сигналы Fura-2-FF на уровне 450 нм и 500 нм одновременно при сканировании возбуждения от 350 нм до 365 нм с шагом 0,1 нм.
- Perfuse NADH-бесплатно Ca2 "насыщенныйраствор и повторить шаг 4.2.5.
- Вычтите сигналы в S2 -насыщенномрастворе из сигналов в условиях Ca2.s.-free.
- Повторите процедуры от 4.2.2 до 4.2.7 с другими одиночными сердечными миоцитами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если интенсивность сигнала ослабевает, повторите с 4.2.1. Повторите процедуру, по крайней мере, 5 различных клеток. - Из всех полученных сигналов вычислите стандартные отклонения эмиссии при каждом возбуждении и выберите длину волн возбуждения, показывающую минимальное стандартное значение отклонения (SD) в качестве изосбестовой точки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные цифры показаны на рисунке 2.
- Установите красителя загруженной клетки на микроскоп и ждать 3 мин, чтобы потопить клетки на дно.
- Обнаружение фонового сигнала и методы коррекции с областью ячейки
ПРИМЕЧАНИЕ: Есть два вида фонов. Один из них исходит от клеток, а другой исходит от отражения на крышке скольжения (клетки свободной фоне). Оба фона должны быть исправлены в каждом эксперименте.- Установите безкрасить клетки в ванну на микроскоп и ждать 3 мин, чтобы потопить клетки на дно. Perfuse NADH-бесплатно ca2 "-бесплатное решение в течение примерно 5 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы перфузии скорость 2-3 мл / мин при 37 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте номера клеток, чтобы увидеть около одной ячейки на одно объективное поле с 40-x объективом. - Установите поле объекта для покрытия целевой ячейки.
- После перемещения ячейки из поля, измерьте фоновые сигналы окна, свободной от ячейки, и установите их в качестве смещений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал означает, что световой сигнал должен быть обнаружен в системе подсчета фотонов. - Верните ячейку в исходное положение и измерьте фоновые сигналы ячейки и область ячейки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что возбуждая свет фильтруется с помощью фильтра bandpass, он по-прежнему содержит довольно большое количество фильтрованного света. Этот свет рассеивается при попадании в ячейки и вызывает значительный фоновый сигнал, потому что система подсчета фотонов очень чувствительна. Она должна быть исправлена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Область ячейки может быть рассчитана с помощью захваченного изображения ячейки и доступного программного обеспечения для визуализации. Единица области ячейки может быть любой единицей, включая количество пикселей. Нужна просто стандартизация. - Повторите от 4.1.1 до 4.1.4 в течение 10 раз, чтобы получить связь между областью клетки и сигналами фона клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Позже, фоновые сигналы ячейки могут быть рассчитаны из области ячейки от отношения. Так как возбуждение лампочки стареет, эта процедура должна быть повторена, по крайней мере, каждый месяц.
- Установите безкрасить клетки в ванну на микроскоп и ждать 3 мин, чтобы потопить клетки на дно. Perfuse NADH-бесплатно ca2 "-бесплатное решение в течение примерно 5 минут.
- Измерение факторов R
- Рассчитайте RF с уравнением 4 из сигналов, полученных в разделе 4.2.
- Смонтировать безкрасить клетки на микроскоп и пронизать Ca2 "-свободныйраствор.
- Измерьте сигналы, такие как F361, 450, NADH, F400, 500, NADH, F361, 450, NADH, и F353, 500, NADH.
- Профуйте раствор malate и повторите 4.3.3. и измерять сигналы.
- Профуйте пируватный раствор и повторите 4.3.3. и измерять сигналы.
- Профудизировать раствор малат-пирувате и повторить 4.3.3. и измерять сигналы.
- Пронизом решение rotenone и повторить 4.3.3. и измерять сигналы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пример сигнала NADH, записанного на 5 мМ пирувате, 5 мМ малиате плюс 5 мМ пирувате, и 10 мкм rotenone добавление показано на рисунке 3. - Рассчитайте каждый склон F361, 450, NADH против F400, 500, NADH и F361, 450, NADH против F353, 500, NADH. Как показано на рисунке 3. Каждый склон указывает RN1 и RN2.
5. Выбор возбуждения и свет выбросов для TMRE или carboxy-SNARF-1
- Если TMRE для измерения митохондриального потенциала был использован в дополнение, используйте 530 нм возбуждания длины волны и 590 нм длины эмиссии волны.
- Если carboxy-SNARF-1 для измерения митохондриального потенциала был использован в дополнение, используйте волнообразное возбуждение длины волны 540 нм и длины волн выбросов 590 нм и 640 нм12.
6. Выбор Kd стоимости фура-2-FF
- Изменение рН может повлиять на значения Kd для привязки Ca2 на fura-2-FF10. Используйте значение Kd 5.28 при рН 7.5 для митохондрий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Митохондриальный Ca2 "изменения из-за коррекции10
На рисунке 4 показаны изменения в «Ca2»м до и после коррекции. Результаты ясно показали существенные изменения в «Ca2»м. Концентрация кальция в митохондрии без цитосолика Ca2 (Ca 2)составила 1,03 и 0,13 мкм (средний -S.E., n no 32), а максимальная концентрация кальция в 1-ММ (Ca 2)с был 29,6 и 1,61 мм ( среднее означает S.E., n no 33)(рисунок 5).
Одновременные измерения NADH, «Ca2»и«м10»
Положительно заряженный TMRE может быть распределен в мембранной потенциально зависимой основе. Мембранный потенциал можно рассчитать с помощью уравнения Нернста с концентрацией в каждом отсеке. Митохондриальная TMRA контролировалась с перфузией 2-нМ TMRE. Предполагалось, что начальная м в 150 мВ, и на основе этого было рассчитано изменением. Применение Ca2 "уменьшилась NADH, но повлиялона м только незначительно (Рисунок 6).
Митохондриальный рН изменяется изменением в «Ca2»m10
Митохондриальный рН с дополнительной загрузкой carboxy-SNARF-1 отслеживался после изменений Ca2 (рисунок 7). Митохондриальный рН не был затронут увеличением в «Ca2»м. Покоя митохондриальный рН был 7,504 и 0,047 (средний s.E., n No 13). Из этих результатов, 5,28 мкм был выбран Kd значение fura-2-FF на рН 7,5.
Рисунок 1: Система микрофторометрии для мультипараметрических измерений
Была показана схематическая схема системы микрофторометрии. Установленные ячейки были визуализированы с помощью камеры CCD. Четыре различных эмиссионных света были обнаружены с четырьмя ПМТ с помощью системы подсчета фотонов. Эта цифра была воспроизведена с разрешения Корейского журнала физиологии и фармакологии10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Определение изосбестовых точек
(A) Красная стрелка указывает на изосбестную точку на длине волны 450 нм. Fura-2 FF в несвязанном состоянии отображается с пунктирной линией и в состоянии Ca2 'с твердой линией. (B) Красная стрелка указывает на изосбестную точку на длине волны выбросов 500 нм. (C) Показаны вычитанные данные сигнала на уровне 450 нм в Ca2-свободных условиях от Ca2 -свободныхнасыщенных условий. (D) Показаны вычитанные данные сигнала на уровне 500 нм в Ca2-свободных условиях от Ca2 -свободныхнасыщенных условий. (E) Стандартные данные отклонения с графика C показаны. (F) Стандартные данные отклонения с графика D показаны. Эта цифра была воспроизведена с разрешения Корейского журнала физиологии и фармакологии10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Измерение факторов RN.
(A) Изменения в сигнале NADH без флуоресцентного красителя путем прикладировать различные митохондриальные субстраты были измерены на 361 nm возбуждение и 450 nm длины волны излучения. (B) Вмешательство NADH в сигналы fura-2-FF, F400,500 (я) и F353,500 (-), были одновременно проверены. (C) Показаны отношения между F361,450,NADH и F400,500,NADH (я) и между F361,450,NADH и F353,500,NADH (я). Полученные склоны представлены как RN1 и RN2,соответственно. Эта цифра была воспроизведена с разрешения Корейского журнала физиологии и фармакологии10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Результаты коррекции помех NADH и fura-2-FF
Изменение сигналов от до коррекции (показано в левой панели) на после коррекции (показано в правых панелях). (A) Сигналы NADH на длине волны излучения 450 nm. (B) Fura-2-FF сигналы на 500 нм длины эмиссии волны. На рисунке показаны F400,500 (яп. ) иF 353 500 (----) и соотношение фура-2-FF (-). (C) Концентрация митохондриального кальция. Красная пунктирная линия указывает на ноль. Эта цифра была воспроизведена с разрешения Корейского журнала физиологии и фармакологии10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Отдых (Ca2)м без цитосолика Ca2 и максимальное устойчивое состояние (Ca2)м при 1 китосолике Ca2
Митохондрии были под напряжением с перфузией раствора мало-пирувате. Было показано устойчивое состояние «Ca2»m в условиях Ca2и в условиях 1 мкм Ca2. Добавление 5 мМ Na- восстановлено NADH и уменьшено "Ca2"м к базовому. Эта цифра была воспроизведена с разрешения Корейского журнала физиологии и фармакологии10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Одновременные измерения NADH, «Ca2»m, им
Митохондрии были под напряжением с перфузией раствора мало-пирувате. Были показаны изменения NAHD, «Ca2»m иm. Добавление 1 мкм Ca2 "уменьшило NAHD и увеличило "Ca2"м, ном не был существенно изменен. Эта цифра была воспроизведена с разрешения Корейского журнала физиологии и фармакологии10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Одновременное измерение NADH, «Ca2»mи pH
Повторное применение Ca2 "может вызвать снижение NADH и увеличение "Ca2"м, но митохондриальный рН не был затронут применением Ca2 ". Добавление Наз может вернуть NADH и «Ca2»м к исходной линии. Эта цифра была воспроизведена с разрешения Корейского журнала физиологии и фармакологии10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Название решений | Концентрация (мМ) | |||||||||
| Kcl | ГЕПЕС | EGTA | CaCl2 | М | P | R | FCCP | Adp | Сапонин | |
| Ca2 -бесплатно | 150 | 10 | 1 | |||||||
| Без NADH | 150 | 10 | 1 | 0.01 | 0.1 | |||||
| Ca2 -бесплатно | ||||||||||
| Без NADH | 135 | 10 | 1 | 0.01 | 0.1 | |||||
| Ca2 '-Насыщенный | ||||||||||
| Сапонин | 150 | 10 | 1 | 0,1 мг/мл | ||||||
| Malate | 145 | 10 | 1 | 5 | ||||||
| Пирувате | 145 | 10 | 1 | 5 | ||||||
| Матате-пирувате | 140 | 10 | 1 | 5 | 5 | |||||
| Ротеноне | 140 | 10 | 1 | 5 | 5 | 0.01 | ||||
| Культура Средний | Модифицированный орел-Медиум Дульбекко (DMEM) | |||||||||
| Загрузка красителя | Добавить 1мМ Fura-2-FF-AM (16 мл) в среде культуры (2 мл) | |||||||||
Таблица 1: Решения
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод коррекции помех был успешно разработан для измерения сигналов аналогов NADH и fura-2. Точное измерение сигналов имеет важное значение для точной коррекции. Тем не менее, присущий характер флуоресцентного устройства производит фоновый сигнал, не связанный с NADH фура-2. Фильтр с высоким качеством диапазона-прохода может проходить только до 108 нежелательных длин волн света. Тем не менее, флуоресцентный сигнал от одной клетки очень мал, и отражение возбуждающего света после фильтра диапазона прохода по-прежнему достаточно сильны, чтобы загрязнять фактические флуоресцентные сигналы. Поэтому необходима тщательная коррекция фонового сигнала.
Fura-2 имеет проблему загрузки для измерения митохондриального Ca2 " Во-первых, это не легко загрузить краситель специально в митохондрии, и неспецифическая загрузка в другую органель может быть ошибочным. Митохондриальная концентрация Ca2 ", как правило, выше, чем у цитозола, и использование фура-2-FF с высоким значением Kd может избежать загрязнения цитозолических Ca2 "изменения. Другой проблемной органеллой является саркоплазмический ретикулум (SR). Тем не менее, разница в объеме распределения (SR 3,5% против митохондрий 34%-36% в желудочковжелудох миоцитах крыс)13,14 и удаление АТС в экспериментах может компенсировать загрязнение от SR.
Наше уравнение калибровки (Equation 14 и 15) имеет много выгодных характеристик по сравнению с уравнением Гринкевича15 следующим образом:
1) Он требует только три параметра: Kd, F400,500,max/F353,500,max, и Rмин.
2) Существует линейность значения соотношения к концентрации Ca2 'при постоянном рН.
3) Существует относительный безошибочный параметр в F400,500,max/F353,500,max по сравнению с Sf2/Sb215.
4) В уравнении 15, только Kd и Rмин необходимы, если изобестическое возбуждение используется.
5) Процедура калибровки для получения параметра гораздо проще с уравнением 15.
Тем не менее, есть ограничение, потому что Ca2 "насыщенныхфура-2-FF генерирует очень небольшое излучение. Это вызывает ошибку. Новое уравнение может быть применено к концентрациям «Ca2»до 50 раз в 50 раз, что kd.
В заключение был разработан протокол для успешного решения существующей проблемы помех NADH и fura-2-FF. Этот метод может более точно измерять динамику Ca2. Мультипараметрическая система измерения, особенно в митохондриях, поможет понять митохондриальную физиологию в количественном смысле.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана Программой фундаментальных научных исследований через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемый Министерством образования (2018R1A6A3A011832), Министерством науки, ИКТ и будущего планирования (NRF-2016M3C1A6936606) и Министерством торговли, промышленности и энергетики (10068076).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL eppendorf tube | Axygen | MCT-200-C | 2 mL Tube |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | Equipment |
| ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma-aldrich | A5285 | Chemicals |
| Band pass filter | Ealing Electro-Optics, Inc | 35-3920 | Equipment, 640±11nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 690-9823 | Equipment, 590±15nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 500DF20-9916 | Equipment, 500±20nm |
| Band pass filter | Chroma Technology Corp. | 60685 | Equipment, 450±30nm |
| Calcium chloride solution | Sigma-aldrich | 21114 | Chemicals |
| carboxy-SNARF-1(AM) | Invitrogen | C1272 | Chemicals |
| Charge-coupled device (CCD) camera | Philips | FTM1800NH/HGI | Equipment |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 86009 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <400nm, 490±10, 560±10, Transmission : 460±15, 510±20, >580nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 567DCXRU | Equipment, Reflection : <560nm, Transmission : > 580 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 480dclp | Equipment, Reflection : <470nm, Transmission : > 490 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 20728 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <405nm, 470±30, Transmission : 430nm~520nm, > 640 nm |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-aldrich | 154938 | Chemicals |
| DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Sigma-aldrich | D5030 | Chemicals |
| EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid | Sigma-aldrich | E4378 | Chemicals |
| FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone | Sigma-aldrich | 21857 | Chemicals |
| field diaphragm | Nikon | 86506 | Equipment |
| Fura-2-FF(AM) | TEFLABS | 137 | chemicals |
| Green tube | DWM | test tube | |
| HEPES, 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-aldrich | H3375 | Chemicals |
| High-speed counter | National Instruments | NI-6022 | Equipment |
| Hot mirror | Chroma Technology Corp. | 21002 | Equipment, 50:50 |
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | Equipment |
| Malate | Sigma-aldrich | 27606 | Chemicals |
| Near infrared filter | Chroma Technology Corp. | D750/100X | Equipment, 750±100nm |
| Oil immersion lens | Nikon | MRF01400 | 40x, NA 1.3; Equipment |
| Photon counter unit | Hamamatsu | C3866 | Equipment |
| Photon multiplier tube | Hamamatsu | R2949 | Equipment |
| Polychrome II | Till Photonics | SA3/MG04 | Equipment |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936 | Chemicals |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-aldrich | P4494 | Chemicals |
| Pyruvate | Sigma-aldrich | 107360 | Chemicals |
| Rotenone | Sigma-aldrich | R8875 | Chemicals |
| Saponin | Sigma-aldrich | S4521 | Chemicals |
| TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Molecular probes | T669 | Chemicals |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Miyata, H., et al. Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes. American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).
- Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).
- Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium. Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).
- Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues. European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).
- Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
- Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes. Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).
- Brandes, R., Bers, D. M. Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae. Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).
- Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).
- Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat. Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).
- Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium. Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).
- Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism. Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).
- Page, E. Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology. American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).
- Page, E., McCallister, L. P., Power, B. Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
