Summary
På grund av den spektrala överlappningen av excitation och emissions våglängder av NADH och fura-2 analoger, är signalinterferensen från båda kemikalierna i levande celler oundviklig vid kvantitativ mätning av [ca2 +]. Således, en roman online korrigering metod för NADH signal störningar för att mäta [ca2 +] utvecklades.
Abstract
För att mäta [ca2 +] kvantitativt används ofta fura-2-analoger, som är ratiometriska fluorosonder. Emellertid, Dye användning är i sin tur begränsad i levande celler på grund av autofluorescence inblandning, främst från nikotinamid adenin--dinukleotid (NADH). Mer specifikt, detta är ett stort hinder vid mätning av mitokondrien [ca2 +] kvantitativt med hjälp av fura-2 analoger eftersom majoriteten av NADH är i Mitochondria. Om den fluorescerande färg koncentrationen är densamma, bör en viss exciteringsintensitet ge samma utsläppsintensitet. Därför bör förhållandet mellan utsläppsintensiteten för två olika magnetisering våglängder vara konstant. Baserat på denna princip, en roman online korrigering metod för NADH signalinterferens att mäta [ca2 +] utvecklades, och den verkliga signalintensiteten hos NADH och fura-2 kan erhållas. Vidare utvecklades en ny ekvation för att beräkna [ca2 +] med isosbestic excitation eller excitation vid 400 nm. Med den här metoden kan förändringar i mitokondrien [ca2 +] mätas framgångsrikt. Dessutom, med en annan uppsättning av excitation och utsläpp våglängder, flera parametrar, inklusive NADH, [ca2 +], och pH eller mitokondriell membran potential (Ψm), kunde mätas samtidigt. Mitokondrie [ca2 +] och Ψm eller pH mättes med fura-2-FF och tetrametylrodamin etylester (tmre) eller karboxy-seminaphtorhodafluor-1 (karboxy-snarf-1).
Introduction
Den betydande roll intracellulära ca2 + är vida känd1. Kvantifieringen av [ca2 +] är nödvändig för att förstå de cellulära fysiologiska funktionernas processer. Fura-2 analoger är ganska användbara eftersom de är upphetsad i UV-området (< 400 nm), och den ratiometriska metoden kan tillämpas för den kvantitativa mätningen. Därför kan andra fysiologiska parametrar såsom pH, membran potential, etc., mätas med andra fluorescerande färgämnen. Den mitokondriella ca2 + koncentrationen ([ca2 +]m) var enligt uppgift 0,08 − 20 μm2,3,4,5. Bland fura-2 analoger är fura-2-FF lämplig för att mäta detta intervall på [ca2 +]. Men levande celler innehåller tyvärr NADH/NADPH för sina metaboliska processer, och NADH genererar signalinterferens på grund av överlappande excitation och emission spektra med fura-2 Analog. Denna störning begränsar kraftigt användningen av fura-2 analoger. Specifikt, om analog används för att mäta mitokondriell [ca2 +], denna störning är det största hindret eftersom det högsta beloppet av NADH är i Mitochondria. Detta kompliceras ytterligare av NADH förändringar är relaterade till mitokondriella membranet potential (Ψm) och förändringen av Ψm påverkar [ca2 +]m6,7,8 , 9. för att studera [ca2 +]m dynamik är det dessutom viktigt att känna till status för andra MITOKONDRIELLA parametrar, såsom NADH, Ψmoch pH.
Utsläppen vid 450 nm och 500 Nm med exciteringar vid 353 nm, 361 nm och 400 nm innehåller signalerna från NADH och fura-2-FF, och ekvationerna är som följer. Häri, 353 nm och 361 Nm är de isosbestic punkterna i fura-2-FF för utsläpp vid 450 nm och vid 500 Nm, respektive.
F361 450 = f361450, NADH + f361450, fura ekvation 1
F353 500 = f353500, NADH + f353500, fura ekvation 2
F400 500 = f400500, NADH + f400500, fura ekvation 3
där Fx, y är den uppmätta utsläppsintensiteten vid y-nm genom x-nm excitation, fx, y, utgör NADH den rena NADH-beroende emissions intensiteten, och fx, y, fura representerar den rena fura-2-FF-beroende utsläppsintensiteten. Under samma koncentration av det fluorescerande färgämnet bör en viss exciteringsintensitet ge samma utsläppsintensitet. Därför bör förhållandet mellan utsläppsintensiteten för två olika magnetisering våglängder vara konstant. Ca2 + och fura-2 påverkade inte NADH-fluorescensegenskaper; Därför var förhållandet av utsläppet på 450 nm och på 500 Nm av NADH konstant på någon magnetisering våglängd. Samma regel kan användas för fura-2-FF baserat på antagandet att NADH eller [ca2 +] inte påverkar emissions-och exciteringspektrat av fura-2-FF. Ca2 + orsakade dock en spektralförskjutning av fura-2-FF-utsläppet. Därför, för att ta bort effekten av ca2 +, isosbestic excitation, som är oberoende av ca2 +, måste användas. Varje emissionsvåglängd (dvs. 450 nm och 500 Nm) har en annan isosbestic punkt, och från vår experimentella inställning, 353 Nm vid 500 Nm och 361 Nm vid 450 nm valdes. Av dessa är följande ekvationer giltiga10.
Rf = f361450, fura/F353500, fura ekvation 4
RN1 = F400500, NADH/F361450, NADH ekvation 5
RN2 = F353500, NADH/F361450, NADH ekvation 6
Med dessa konstanter är följande ekvationer från (ekvation 1) (ekvation 2) och (ekvation 3) giltiga.
F361 450 = f361450, NADH + Rf × f353500, fura ekvation 7
F353 450 = RN2 × F361450, NADH + F353500, fura ekvation 8
F400 500 = RN1 × f361450, NADH + f400500, fura ekvation 9
Från dessa ekvationer, om Rf, rN1och rN2 är kända, kan rena signaler från NADH och fura-2 erhållas enligt följande.
F361450, NADH = (f361 450 -rf × f353 500)/(1 − rf × rN2) ekvation 10
F353500, fura = (rN2 × f361 450 − f353 500)/(rF × rN2 − 1) ekvation 11
F400500, fura = f400 500 − RN1 × f361450, NADH ekvation 12
Rfura = f353500, fura/F400500, fura ekvation 13
Ca2 +-bunden form av fura-2-FF var praktiskt taget icke-fluorescerande vid 400 nm excitation våglängd. Baserat på denna egenskap kan följande nya kalibrerings ekvation härledas.
[Ca2 +] = Kd ∙ (F400500, Max/f353500, Max) × (rfura − rmin) ekvation 14
där Kd är en dissociationskonstant, F400500, Max och F353500, Max är maximivärdena för de avgivna signalerna vid 500 Nm med Magnetiseringar värden vid 400 nm respektive 353 nm, och rmin är minsta rfura i ca2 +-gratis skick. Sedan isosbestic magnetiserna användes, kan ekvationen förenklas vidare som följer.
[Ca2 +] = Kd ∙ (1/Rmin) ∙ (rfura − rmin) ekvation 15
Därför krävs endast Kd och Rminvärden för att beräkna [ca2 +].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella protokoll godkändes av den lokala institutionella djurvårds-och användnings kommittén.
1. beredning av lösningen
- Förbered enstaka nyligen isolerade hjärt myocyter11.
Varje laboratorium kan ha en annan cell lagringslösning. Här, den myocyter lagras i kultur medium (DMEM). - Bered 100 mL ca2 +-fri lösning (tabell 1).
- Förbered 50 mL odlingssubstrat i en 50 mL-bägare. Alikvot 5 mL och Lägg den i ett vattenbad vid 37 ° c. Förvara resterande lösning i rumstemperatur.
- Förbered 50 mL av saponin lösningen genom att tillsätta 5 mg saponin till 50 mL ca2 +-fri lösning.
Obs: saponin används för att permeabilize hjärt myocyter, att ta bort cytosoliska fack, och att visualisera mitokondriell fluorescens endast. - Bered 16 μL av 1 mM fura-2-FF-AM upplöst i dimetylsulfoxid (DMSO).
Anmärkning: gör 1 mm stamlösning av fura-2-FF-am upplöst i DMSO och alikvot 16 μl i en 2 ml tub. Förvara dem vid-20 ° c tills de används. - Bered 50 mL NADH-fri ca2 +-fri lösning (tabell 1) och 50 ml NADH-fri ca2 +-mättad lösning (tabell 1) när isosbestic punkter ska mätas. Justera pH till 7,0 med KOH.
Obs: NADH-fri ca2 +-fri lösning (tabell 1) innehåller 10 μM Fccp och 100 μm ADP utan några mitokondriella substrat för att minimera NADH i Mitochondria. - Förbered 50 mL av ca2 +-fri lösning, 50 ml malatlösning, 50 ml pyruvatlösning, 50 ml malat-pyruvatlösning, och 50 ml rotenonlösning som skall användas för NADH korrektionsfaktor mätningar (tabell 1).
2. belastnings procedur för fluorsond i mitokon
- Förbered färg-lastning lösning genom att tillsätta 2 mL av odlingsmediet till 16 μL av 1 mM fura-2-FF-AM.
Anmärkning: fluorescerande färgämne är bräckligt under ljuset. Bered lösningen precis före användning. Förvara lösningen som innehåller fluorescerande färgämne på en mörk plats. Den slutliga koncentrationen av fura-2-FF-AM är 8 μM. Om karboxy-SNARF-1 användes, förbereda Dye lastning lösning med 2 μM karboxy-SNARF-1-AM. - Ta 2 mL av de isolerade cellerna och placera i ett 5 mL provrör i upprätt läge.
- Vänta 15 min för myocyter att sjunka till botten och ta bort supernatanten.
Obs: supernatanten kan innehålla cellfragment. Centrifugera inte röret för att undvika cellskador. - Tillsätt 2 mL av Dye-lastningslösningen.
- Inkubera den Dye-loading lösning med celler för 60 min vid 4 ° c.
- Sedan, sätta provrör i en 37 ° c vattenbad för 30 min i upprätt läge.
- Ta bort supernatanten och tillsätt 4 mL av det förvärmda odlingsmediet på 37 ° c. Inkubera cellerna för 60 min i ett 37 ° c vattenbad.
- Slutligen, ta bort supernatanten, tillsätt 4 mL odlingssubstrat vid rumstemperatur och håll röret i rumstemperatur.
3. införande av det multiparametriska mätsystemet
Anm.: figur 1 visar ett diagram över hela systemet.
- För en excitation ljuskälla, använda en snabb monokromator (polykrom II) som kan ändra ljuset inom 3 MS.
- Använd en oljedoppning lins (40x, NA 1,3) med ett inverterat Mikroskop för att öka signalintensiteten.
- Använd ett nära-infrarött filter och en CCD-kamera (Charge-kopplad enhet) för att övervaka objektfältet utan störningar i fluorescerande signaler.
- Avbilda objekt fälts bilden för att hämta området.
- Justera objektfältet på skärmen med ett fält membran bara för att Visa cellen för att minska bakgrunden.
- Använd fyra Fotomultiplikator-rör med varje bandpassfilter (450, 500, 590 och 640 Nm) för att detektera emissions våglängder med fotons räkningsmetod. Använd lämpliga DICHROIC speglar att dela och att omdirigera utsläpps ljuset.
Anmärkning: excitationsljuset är mycket starkt jämfört med utsläpps ljuset. Välj alltså bandpassfiltret med de högsta blockerande egenskaperna för att minska bakgrunden. Ett fotons räknings system består av en kombination av PMTs, Photon Counter units och en höghastighetsräknare. För att kontrollerasystemet och ta prov på data användes en skräddarsydd kör programvara. Att hitta ett sätt att tillämpa denna metod med andra system är nödvändigt.
4. NADH korrektions metoder med ett multiparametriskt mätsystem
- Identifiering av de isosbestic punkterna i fura-2-FF in situ.
Obs: många rapporter har uppgett att fluorescerande egenskaper ändras i celler. Utför därför alla procedurer för att erhålla parametrarna för att korrigera interferensen på plats .- Montera den Dye-laddade cellen på mikroskopet och vänta 3 min att sjunka cellerna till botten.
ANMÄRKNINGAR: justera cell nummer för att se runt en cell per ett mål fält med 40x objektiv. - Parfymera NADH-fri ca2 +-fri lösning vid 37 ° c.
- Efter inriktnings cell, Mät den cell fria bakgrunden och cellområdet som visas i avsnitt 4,1. Beräkna cellbakgrunden från cellområdet.
Obs: båda bakgrunds signalerna måste korrigeras i varje experiment. - Parfymera saponin-lösningen för 60 s och återgå till NADH-fri ca2 +-fri lösning.
- Mät fura-2-FF-avgivna signaler vid 450 nm och 500 Nm samtidigt genom magnetiseringen Skanna från 350 nm till 365 nm med 0,1 Nm steg.
- Parfymera den NADH-fria ca2 +-mättade lösningen och upprepa steg 4.2.5.
- Subtrahera signalerna i ca2 +-mättade lösningen från signalerna i ca2 +-fria förhållanden.
- Upprepa procedurerna från 4.2.2 till 4.2.7 med andra singelhjärtmyocyter.
Anmärkning: om signalintensiteten blir svagare, upprepa från 4.2.1. Upprepa proceduren för, åtminstone, 5 olika celler. - Från alla erhållna signaler, beräkna standardavvikelser av utsläppet vid varje excitation och välj excitation våglängd som visar lägsta standardavvikelse (SD) värde som en isosbestic punkt.
Anm.: de representativa siffrorna visas i figur 2.
- Montera den Dye-laddade cellen på mikroskopet och vänta 3 min att sjunka cellerna till botten.
- Bakgrunds signaldetekteringen och korrektions metoderna med cellområdet
Obs: det finns två typer av bakgrunder. Den ena kommer från cellerna och den andra kommer från reflektionen på följesedeln (den cell fria bakgrunden). Båda bakgrunder måste korrigeras i varje experiment.- Montera Dye-fria celler i badet på mikroskopet och vänta 3 min att sjunka cellerna till botten. Perfuse NADH-gratis ca2 +-gratis lösning för cirka 5 minuter.
Anmärkning: alla lösnings per fusions hastighet är 2-3 mL/min vid 37 ° c.
ANMÄRKNINGAR: justera cell nummer för att se runt en cell per ett mål fält med 40x objektiv. - Ange att objektfältet ska täcka målcellen.
- När du har flyttat cellen från fältet, Mät bakgrunds signalerna i det cell fria fönstret och Ställ in dem som förskjutningar.
Obs: signalen betyder att ljussignalen upptäcks i fotons räknesystem. - Returnera cellen till den ursprungliga positionen och mät cell bakgrunds signalerna och cellområdet.
Observera: även om excitationsljuset filtreras med bandpass-filtret, innehåller det fortfarande ganska stor mängd av det filtrerade ljuset. Detta ljus sprids när man träffar cellerna och orsakar en avsevärd bakgrunds signal, eftersom fotons räknesystem är mycket känsligt. Den måste korrigeras.
Cellområdet kan beräknas med en avbildat cell bild och en tillgänglig avbildningsprogramvara. Enheten för cellområdet kan vara vilken enhet som helst inklusive pixelantal. Bara standardisering är nödvändigt. - Upprepa från 4.1.1 till 4.1.4 i 10 gånger för att få relationen mellan cellområdet och cell bakgrunds signalerna.
ANMÄRKNINGAR: senare kan cell bakgrunds signalerna beräknas från cellområdet från relationen. Eftersom excitation glödlampa blir åldrande, måste detta förfarande upprepas, åtminstone varje månad.
- Montera Dye-fria celler i badet på mikroskopet och vänta 3 min att sjunka cellerna till botten. Perfuse NADH-gratis ca2 +-gratis lösning för cirka 5 minuter.
- Mätning av R-faktorer
- Beräkna RF med ekvationen 4 från signalerna som erhålls i avsnitt 4,2.
- Montera Dye-fria celler på mikroskopet och parfymera ca2 +-fri lösning.
- Mätsignalerna som F361, 450, nadh, f400, 500, NADH, f361, 450, NADH, och f353, 500, NADH.
- Parfymera malatlösningen och upprepa 4.3.3. och mätsignalerna.
- Parfymera pyruvatlösningen och upprepa 4.3.3. och mätsignalerna.
- Parfymera malat-pyruvatlösningen och upprepa 4.3.3. och mätsignalerna.
- Parfymera rotenonlösningen och upprepa 4.3.3. och mätsignalerna.
Anmärkning: exemplet med NADH signal inspelad på 5 mM pyruvat, 5 mM malat plus 5 mM pyruvat, och 10 μM Rotenon tillägg visas i figur 3. - Beräkna varje lutning av F361, 450, nadh vs. f400, 500, NADH och f361, 450, NADH vs. f353, 500, NADH. Som visas i figur 3. Varje lutning indikerar RN1 och rN2.
5. Val av magnetisering och utsläpp ljus för TMRE eller karboxy-SNARF-1
- Om TMRE för mätning av mitokondriell potential användes i tillägg, Använd 530 nm excitation våglängd och 590 Nm emission våglängd.
- Om karboxy-SNARF-1 för mätning av mitokondriell potential användes i tillägg, använda excitation våglängd av 540 nm och utsläpp våglängder av 590 nm och 640 Nm12.
6. Val av Kd -värde för fura-2-FF
- Förändringen av pH kan påverka Kd värden för ca2 + bindning på fura-2-FF10. Använd Kd -värdet av 5,28 vid pH 7,5 för mitokonan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mitokondriell ca2 + förändringar på grund av korrigering10
Figur 4 visar förändringarna i [ca2 +]m före och efter korrigeringen. Resultaten visade tydligt de väsentliga förändringarna i [ca2 +]m. Den mitokondriella vilande kalciumkoncentrationen utan cytosoliska ca2 + ([ca2 +]c) var 1,03 ± 0,13 μm (medelvärde ± e, n = 32), och den maximala [ca 2 +]m vid 1-μm [ca2 +]c var 29,6 ± 1,61 μm ( medelvärde ± e, n = 33) (figur 5).
Samtidig mätning av NADH, [ca2 +] och Ψm10
En positivt laddad TMRE kan fördelas i ett membran potentiellt beroende sätt. Membran potential kan beräknas med hjälp av Nernst ' s ekvation med koncentrationen i varje fack. Mitokondriell TMRA övervakades med perfusion av 2-nM TMRE. Den initiala Ψm antogs vara − 150 MV, och förändringen av Ψm beräknades utifrån detta. Tillämpningen av ca2 + minskade NADH men påverkade Ψm endast negligibly (figur 6).
Mitokondriella pH-förändringar genom förändringen i [ca2 +] m10
Mitokondriellt pH med ytterligare lastning av karboxy-SNARF-1 övervakades efter ca2 + förändringar (figur 7). Mitokondriellt pH påverkades inte av ökningen av [ca2 +]m. Det vilande mitokondriella pH-värdet var 7,504 ± 0,047 (medelvärde ± e, n = 13). Av dessa resultat var 5,28 μM det valda Kd -värdet av fura-2-FF vid pH 7,5.
Figur 1: ett mikrofluorometrisystem för multiparametrisk mätning
Det schematiska diagrammet av microfluorometry systemet visades. De monterade cellerna visualiserades via en CCD-kamera. Fyra olika utsläpps lampor upptäcktes med fyra PMTs via ett fotons räknings system. Denna siffra har reproducerats med tillstånd från den koreanska tidskriften fysiologi & farmakologi10. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: identifiering av isosbestic Points
(A) den röda pilen pekar på isosbestic punkt vid 450 nm emission våglängd. Fura-2 FF i det icke-bundna tillståndet visas med en prickad linje och i ca2 + bundet läge med en heldragen linje. (B) den röda pilen pekar mot den isosbestic punkten vid utsläpps våglängden på 500 Nm. C) de subtragerade data från signalen vid 450 nm i ca2 +-fria förhållanden från ca2 +-fria mättade tillstånd visas. D) de subdragna data för signalen vid 500 Nm i ca2 +-fria förhållanden från ca2 +-fria mättade tillstånd visas. (E) standard avvikelse data från graf C visas. (F) standard avvikelse data från diagram D visas. Denna siffra har reproducerats med tillstånd från den koreanska tidskriften fysiologi & farmakologi10. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: mätning av RN -faktorer.
Aförändringar i NADH-signalen utan fluorescerande färg genom tillämpning av olika mitokondriella substrat mättes vid 361 nm excitation och 450 nm emissions våglängder. B) NADH-interferensen i fura-2-FF-signalerna, f400 500 (∙ ∙ ∙) och f353 500 (—), övervakades samtidigt. C) förhållandet mellan f361450, NADH och f400500, NADH (○) och mellan F361450, NADH och f353500, NADH (●) visas. De erhållna backarna representeras av RN1 respektive rN2. Denna siffra har reproducerats med tillstånd från den koreanska tidskriften fysiologi & farmakologi10. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: resultat från NADH och fura-2-FF störnings korrigering
Förändringen av signalerna från före korrigeringen (visas i de vänstra panelerna) till efter korrigeringen (visas i de högra panelerna). (A) NADH signaler vid 450 nm emission våglängd. B) fura-2-FF signaler vid 500 Nm emission våglängd. Figuren visar F400, 500 (− −), F353 500 (----) och förhållandet mellan fura-2-FF (—). Cden mitokondriella kalciumkoncentrationen. Den röda prickade linjen indikerar nollan. Denna siffra har reproducerats med tillstånd från den koreanska tidskriften fysiologi & farmakologi10. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: vila [ca2 +]m utan cytosoliska ca2 + och maximal steady state [ca2 +]m vid 1 μm cytosoliska ca2 +
Mitokonen var strömförande med perfusion av malat-pyruvatlösning. Steady state [ca2 +]m i ett ca2 +-fritt tillstånd och i 1 μm ca2 + villkor visades. Tillsatsen av 5 mM na+ återhämtade NADH och reducerade [ca2 +]m till baslinjen. Denna siffra har reproducerats med tillstånd från den koreanska tidskriften fysiologi & farmakologi10. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: samtidig mätning av NADH, [ca2 +]moch Ψm
Mitokonen var strömförande med perfusion av malat-pyruvatlösning. Förändringarna i NAHD, [ca2 +]m och Ψm visades. Tillsatsen av 1 μM ca2 + minskade nahd och ökade [ca2 +]m men Ψm ändrades inte signifikant. Denna siffra har reproducerats med tillstånd från den koreanska tidskriften fysiologi & farmakologi10. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: samtidig mätning av NADH, [ca2 +]moch pH
Upprepad applicering av ca2 + kan inducera minskningen av NADH och ökningen av [ca2 +]m men mitokondriellt pH påverkades inte av applicering av ca2 +. Tillsatsen av na + kan returnera NADH och [ca2 +]m till baslinjen. Denna siffra har reproducerats med tillstånd från den koreanska tidskriften fysiologi & farmakologi10. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn på lösningar | Koncentration (mM) | |||||||||
| KCl | HEPES | EGTA | CaCl2 | M | P | R | FCCP | Adp | Saponin | |
| Ca2 +-gratis | 150 | 10 | 1 | |||||||
| NADH-gratis | 150 | 10 | 1 | 0,01 | 0,1 | |||||
| Ca2 +-gratis | ||||||||||
| NADH-gratis | 135 | 10 | 1 | 0,01 | 0,1 | |||||
| Ca2 +-mättade | ||||||||||
| Saponin | 150 | 10 | 1 | 0,1 mg/ml | ||||||
| Malate | 145 | 10 | 1 | 5 | ||||||
| Pyruvat | 145 | 10 | 1 | 5 | ||||||
| Malat-pyruvat | 140 | 10 | 1 | 5 | 5 | |||||
| Rotenon | 140 | 10 | 1 | 5 | 5 | 0,01 | ||||
| Odlingssubstrat | Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM) | |||||||||
| Dye-loading | Tillsätt en 1mM fura-2-FF-AM Stock (16 mL) i odlingsmediet (2 mL) | |||||||||
Tabell 1: lösningar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Störnings korrigerings metoden utvecklades framgångsrikt för att mäta signalerna från NADH och fura-2 analoger. Exakt mätning av signalerna är avgörande för exakt korrektion. Den inneboende karaktären hos den fluorescerande anordningen ger emellertid en bakgrunds signal som inte har något samband med NADH för fura-2. Det högsta kvalitets bandet-pass filtret kan bara passera upp till 10− 8 av ljusets oönskade våglängder. Men den fluorescerande signalen från en enda cell är mycket liten, och reflektion av excitation ljuset efter bandet-pass filtret är fortfarande stark nog att förora de faktiska fluorescerande signaler. Därför är noggrann korrigering av bakgrunds signalen nödvändig.
Fura-2 har ett belastningsproblem för att mäta mitokondriell ca2 +. För det första är det inte lätt att ladda färgämnet specifikt i mitokonfören, och icke-specifik lastning i en annan organell kan vara felaktig. Mitokondriell ca2 + koncentration är i allmänhet högre än för Cytosol, och användning av fura-2-FF med högt Kd värde kan undvika kontaminering av cytosoliska ca2 + förändringar. Den andra problematiska organell är sarkoplasmatiska nätmagen (SR). Emellertid, fördelningen volymskillnader (SR 3,5% vs. mitokonen 34% − 36% i råtta ventrikulär myocyter)13,14 och avlägsnande av ATP i experiment kan kompensera för kontaminering från SR.
Vår kalibrerings ekvation (ekvation 14 och 15) har många fördelaktiga egenskaper över Grynkiewicz ekvation15 enligt följande:
1) det kräver endast tre parametrar: KD, F400500, Max/f353500, Maxoch Rmin.
2) det finns linearitet av förhållandet värdet till CA2 + koncentrationen vid ett konstant pH.
3) det finns en relativ felfri parameter i F400500, Max/f353500, Max jämfört med SF2/sB215.
4) i ekvation 15 krävs endast Kd och Rmin om isosbestic excitation används.
5) Kalibreringsproceduren för att erhålla parametern är mycket enklare med ekvation 15.
Det finns dock en begränsning eftersom ca2 +-mättade fura-2-FF genererar en mycket liten emission. Det orsakar ett fel. Den nya ekvationen kan appliceras på [ca2 +] koncentrationer upp till 50x som Kd.
Sammanfattningsvis har ett protokoll utvecklats för att framgångsrikt lösa det befintliga problemet med NADH och fura-2-FF inblandning. Den här metoden kan mäta ca2 + Dynamics mer exakt. Multiparametriska mätsystem, särskilt i mitokondrien, kommer att bidra till att förstå den mitokondriell fysiologi på ett kvantitativt sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av grundforskning forsknings program genom National Research Foundation i Korea (NRF) som finansieras av undervisningsministeriet (2018R1A6A3A01011832), av ministeriet för vetenskap, IKT & framtida planering (NRF-2016M3C1A6936606) och handelsministeriet, industri & energi (10068076).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL eppendorf tube | Axygen | MCT-200-C | 2 mL Tube |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | Equipment |
| ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma-aldrich | A5285 | Chemicals |
| Band pass filter | Ealing Electro-Optics, Inc | 35-3920 | Equipment, 640±11nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 690-9823 | Equipment, 590±15nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 500DF20-9916 | Equipment, 500±20nm |
| Band pass filter | Chroma Technology Corp. | 60685 | Equipment, 450±30nm |
| Calcium chloride solution | Sigma-aldrich | 21114 | Chemicals |
| carboxy-SNARF-1(AM) | Invitrogen | C1272 | Chemicals |
| Charge-coupled device (CCD) camera | Philips | FTM1800NH/HGI | Equipment |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 86009 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <400nm, 490±10, 560±10, Transmission : 460±15, 510±20, >580nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 567DCXRU | Equipment, Reflection : <560nm, Transmission : > 580 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 480dclp | Equipment, Reflection : <470nm, Transmission : > 490 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 20728 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <405nm, 470±30, Transmission : 430nm~520nm, > 640 nm |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-aldrich | 154938 | Chemicals |
| DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Sigma-aldrich | D5030 | Chemicals |
| EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid | Sigma-aldrich | E4378 | Chemicals |
| FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone | Sigma-aldrich | 21857 | Chemicals |
| field diaphragm | Nikon | 86506 | Equipment |
| Fura-2-FF(AM) | TEFLABS | 137 | chemicals |
| Green tube | DWM | test tube | |
| HEPES, 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-aldrich | H3375 | Chemicals |
| High-speed counter | National Instruments | NI-6022 | Equipment |
| Hot mirror | Chroma Technology Corp. | 21002 | Equipment, 50:50 |
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | Equipment |
| Malate | Sigma-aldrich | 27606 | Chemicals |
| Near infrared filter | Chroma Technology Corp. | D750/100X | Equipment, 750±100nm |
| Oil immersion lens | Nikon | MRF01400 | 40x, NA 1.3; Equipment |
| Photon counter unit | Hamamatsu | C3866 | Equipment |
| Photon multiplier tube | Hamamatsu | R2949 | Equipment |
| Polychrome II | Till Photonics | SA3/MG04 | Equipment |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936 | Chemicals |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-aldrich | P4494 | Chemicals |
| Pyruvate | Sigma-aldrich | 107360 | Chemicals |
| Rotenone | Sigma-aldrich | R8875 | Chemicals |
| Saponin | Sigma-aldrich | S4521 | Chemicals |
| TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Molecular probes | T669 | Chemicals |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Miyata, H., et al. Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes. American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).
- Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).
- Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium. Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).
- Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues. European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).
- Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
- Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes. Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).
- Brandes, R., Bers, D. M. Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae. Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).
- Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).
- Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat. Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).
- Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium. Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).
- Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism. Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).
- Page, E. Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology. American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).
- Page, E., McCallister, L. P., Power, B. Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
