Summary
由于NADH和fura-2类似物的激发和发射波长的光谱重叠，在[Ca2]的定量测量中，活细胞中两种化学物质的信号干扰是不可避免的。因此，开发了一种新型的NADH信号干扰在线校正方法，以测量[Ca2]。
Abstract
为了定量测量[Ca2]，经常使用fura-2类比，即比例荧光探针。然而，由于自荧光干扰，染料在活细胞中的使用受到内在限制，主要来自烟酰胺腺苷二核苷酸（NADH）。更具体地说，这是使用 fura-2 模拟体定量测量线粒体 [Ca2]时的一个主要障碍，因为 NADH 的大部分位于线粒体中。如果荧光染料浓度相同，则一定的激发强度应产生相同的发射强度。因此，两个不同激发波长的发射强度比应该是恒定的。基于此原理，开发了一种新型的NADH信号干扰测量在线校正方法，并得到了NADH和fura-2的实际信号强度。此外，在400nm处，在无共态激发或激发下，开发了一种计算[Ca2]的新方程。使用这种方法，可以成功地测量线粒体 [Ca2]的变化。此外，使用一组不同的激发和发射波长，可以同时测量多个参数，包括NADH、[Ca2]和pH或线粒体膜电位（μm）。线粒体 [Ca2]和μm或 pH 值使用 fura-2-FF 和四甲基二甲胺乙酯 （TMRE） 或半磷酸二酯-1（卡博比-SNARF-1）进行测量。
Introduction
细胞内Ca2+的重要作用是众所周知的1。[Ca2]的量化对于了解细胞生理功能的过程至关重要。Fura-2 类比非常有用，因为它们在 UV 范围（<400 nm）中激发，比例测量方法可用于定量测量。因此，其他生理参数，如pH、膜电位等，可以使用其他荧光染料进行测量。据报道，线粒体Ca2+浓度（[Ca2+]m）范围为0.08±20 μM2，3，4，5。在 fura-2 模拟中，fura-2-FF 适用于测量此范围 [Ca2]。然而，不幸的是，活细胞含有NADH/NADPH的代谢过程，NADH产生信号干扰，因为与fura-2模拟的激发和发射光谱重叠。这种干扰极大地限制了 fura-2 模拟物的使用。具体来说，如果应用模拟测量线粒体[Ca2]，这种干扰是最大的障碍，因为NADH的最大量是线粒体。这与线粒体膜电位 （μm）相关的 NADH 变化进一步复杂化，而 αm的变化影响 [Ca2]m6，7，8,9.此外，为了研究[Ca2]m动力学，必须了解其他线粒体参数（如NADH、μm和pH值）的状态。
450 nm 和 500 nm 的排放，在 353 nm、361 nm 和 400 nm 的激发下包含来自 NADH 和 fura-2-FF 的信号，方程如下。在这里，353 nm 和 361 nm 是 fura-2-FF 的等位，分别用于 450 nm 和 500 nm 的排放。
F361，450 = F361，450，NADH = F361，450，富拉方程 1
F353，500 = F353，500，NADH = F353，500，富拉方程 2
F400，500 = F400，500，NADH = F400，500，Fura方程 3
其中 Fx，y是通过 x-nm 激发在 y-nm 处测量的发射强度，F x，y，NADH表示纯 NADH 相关发射强度，而 Fx，y，Fura表示纯 fura-2-FF 依赖性发射强度。在荧光染料的相同浓度下，一定的激发强度应产生相同的发射强度。因此，两个不同激发波长的发射强度比应该是恒定的。Ca2+和 fura-2 不影响 NADH 荧光特性;因此，在450nm和500nm的NADH下，在任何激发波长下，发射率是恒定的。基于NADH或[Ca2]不影响fura-2-FF的发射和激发光谱的假设，同样的规则可用于fura-2-FF。但是，Ca2+导致 fura-2-FF 发射的光谱偏移。因此，要消除Ca2+的影响，需要使用独立于Ca2+的等位激励。每个发射波长（即 450 nm 和 500 nm）具有不同的异位，从我们的实验设置中，选择 353 nm 在 500 nm，361 nm 在 450 nm。从这些，以下方程是有效的10。
Rf = F361，450，富拉/F353，500，富拉方程 4
RN1 = F400，500，NADH/F361，450，NADH方程 5
RN2 = F353，500，NADH/F361，450，NADH方程 6
对于这些常数，以下（公式 1）（方程 2）和（方程 3）的方程有效。
F361，450 = F361，450，NADH = Rf = F353，500，富拉方程 7
F353，450 = RN2 = F361，450，NADH = F353，500，富拉方程 8
F400，500 = RN1 = F361，450，NADH = F400，500，富拉方程 9
从这些方程中，如果已知Rf、RN1和RN2，则可以获得NADH和fura-2的纯信号，如下所示。
F361，450，NADH = （F361，450 - Rf = F353，500）/（1 = Rf = RN2）方程 10
F353，500，Fura = （RN2 = F361，450 = F353，500）/（Rf = RN2 = 1） 方程 11
F400，500，Fura = F400，500 = RN1 = F361，450，NADH方程 12
RFura = F353，500，富拉/F400，500，富拉方程 13
在400nm激发波长下，Fura-2-FF的Ca2+结合形式几乎是非荧光的。基于此属性，可以派生出以下新的校准方程。
[Ca2]= = Kd = （F400，500，最大/F353，500， 最大值） = （RFura = R分钟）方程 14
其中 Kd是解散常数，F400，500、max和 F353，500，最大值是 500 nm 时发射信号的最大值，激发分别为 400 nm 和 353 nm，Rmin是 Ca 2 中的最低 RFura *-免费条件。由于使用了等位激励，可以进一步简化方程，如下所示。
[Ca2+= Kd = （1 / R分钟）] （RFura = R分钟）方程 15
因此，只需 Kd和 R最小值即可计算 [Ca2]。
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Protocol
所有实验协议都通过了当地机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 解决方案准备
- 准备单新鲜分离的心脏肌细胞11。
注：每个实验室可能有不同的细胞存储解决方案。在这里，肌细胞存储在培养基（DMEM）中。 - 准备 100 mL 的 Ca2+无解决方案 （表 1.
- 在 50 mL 烧杯中准备 50 mL 的培养基。5 mL，在 37°C 下放入水浴中。将剩余的溶液保持在室温下。
- 通过在 50 mL 的 Ca2+无溶液中加入 5 毫克皂苷，制备 50 mL 的皂苷溶液。
注：皂苷用于渗透心肌细胞，去除细胞体隔间，并仅可视化线粒体荧光。 - 制备16 μL的1 mM fura-2-FF-AM溶解在二甲基硫酸盐（DMSO）中。
注：在2mL管中制造1mM库存溶液，将Fura-2-FF-AM溶解在DMSO中，在2mL管中等分16μL。将它们储存在-20°C，直到使用。 - 在测量无状态点时，准备 50 mL 的无 NADH Ca2+无抗性溶液（表 1）和 50 mL 的 NADH 无 Ca2+饱和溶液（表 1）。使用 KOH 将 pH 调整到 7.0。
注： 无NADH Ca2+无溶液 （表 1） 包含 10 μM FCCP 和 100 μM ADP，不含任何线粒体基板，以尽量减少线粒体中的 NADH。 - 制备 50 mL 的 Ca2+无溶液、50 mL 的麻原溶液、50 mL 的丙酸酯溶液、50 mL 的麻黄素-硫柳酸溶液和 50 mL 的罗酮溶液，用于 NADH 校正系数测量（表 1）。
2. 线粒体中的荧光探针加载程序
- 通过将培养基的 2 mL 添加到 1 mM fura-2-FF-AM 的 16 μL，准备染料加载溶液。
注：荧光染料在光线下易碎。在使用前准备解决方案。将含有荧光染料的溶液保存在黑暗的地方。fura-2-FF-AM 的最终浓度为8μM。如果使用卡博基-SNARF-1，则使用 2 μM 卡博基-SNARF-1-AM 制备染料加载溶液。 - 取2 mL的分离细胞，并放置在5 mL试管的直立位置。
- 等待 15 分钟，让肌细胞沉入底部并取出上清液。
注：上清液可能包含细胞碎片。请勿使管离心以避免细胞损坏。 - 添加 2 mL 的染料加载溶液。
- 在4°C下用细胞孵育60分钟的染料加载溶液。
- 然后，将试管置于 37°C 水浴中，以直立姿势放置 30 分钟。
- 去除上清液，并添加4 mL的预加热培养基37°C。在37°C的水浴中孵育细胞60分钟。
- 最后，去除上清液，在室温下加入4mL培养基，并将管保持在室温下。
3. 多参数测量系统的介绍
注：图1显示了整个系统的图表。
- 对于激励光源，请使用可在 3 毫秒内改变光线的快速单色器（多色 II）。
- 使用油浸透镜（40x，NA 1.3）与倒置显微镜来增加信号强度。
- 使用近红外滤波器和电荷耦合器件 （CCD） 摄像机监控对象场，无荧光信号干扰。
- 捕获对象字段图像以获取区域。
- 使用字段隔膜调整监视器屏幕中的对象字段，以显示用于减少背景的单元格。
- 使用每个带通滤波器（450、500、590 和 640 nm）使用四个光电倍增管，使用光子计数方法检测发射波长。使用适当的二色反射镜分割和重定向发射灯。
注：与发射灯相比，激发光非常强。因此，选择具有最高阻塞特性的带通滤波器以减少背景。光子计数系统由PMT、光子计数器单元和高速计数器组合组成。为了控制系统和对数据进行采样，使用了定制的驱动软件。找到一种方法将此方法应用于其他系统是必要的。
4. 具有多参数测量系统的 NADH 校正方法
- 原位对 Fura-2-FF 等位点的识别。
注：许多报告指出，荧光特性在细胞中发生变化。因此，执行所有步骤以获取参数以纠正原位干扰。- 将染料加载的细胞安装在显微镜上，等待 3 分钟将细胞沉入底部。
注：调整细胞数，使用40倍物镜，每一个物位看一个细胞。 - 在 37°C 下注入无 NADH Ca2+无溶液。
- 靶向细胞后，测量无细胞背景和细胞区域，如第 4.1 节所示。从单元格区域计算单元格背景。
注：两个背景信号都需要在每个实验中进行校正。 - 将皂苷溶液注入 60 s，并返回到无 NADH Ca2+无解决方案。
- 通过从 350 nm 到 365 nm 的激励扫描，使用 0.1 nm 步长同时测量 450 nm 和 500 nm 的 Fura-2-FF 发射信号。
- 注入无 NADH Ca2+饱和溶液并重复步骤 4.2.5。
- 从 Ca2+自由条件下的信号中减去 Ca2+饱和溶液中的信号。
- 用其他单心肌细胞重复从4.2.2到4.2.7的过程。
注：如果信号强度变弱，请从 4.2.1 重复。对至少5个不同的单元格重复此过程。 - 从所有获得的信号中，计算每个激发处发射的标准偏差，并选择显示最小标准偏差 （SD） 值的激发波长作为等位。
注：具有代表性的数字如图2所示。
- 将染料加载的细胞安装在显微镜上，等待 3 分钟将细胞沉入底部。
- 背景信号检测及细胞面积校正方法
注：有两种背景。一个来自细胞，另一个来自封面滑轨上的反射（无细胞背景）。每个实验中都需要纠正这两个背景。- 将无染料细胞安装在浴缸的显微镜上，等待 3 分钟将细胞沉入底部。注入无 NADH Ca2+无解决方案约 5 分钟。
注：在37°C下，所有溶液灌注速率为2-3 mL/min。
注：调整细胞数，使用40倍物镜，每一个物位看一个细胞。 - 将对象字段设置为覆盖目标单元格。
- 将单元格移出字段后，测量无像元窗口的背景信号并将其设置为偏移。
注： 信号表示光子计数系统中要检测到的光信号。 - 将单元格返回到初始位置，并测量细胞背景信号和细胞区域。
注： 即使激励光使用带通滤波器进行滤波，它仍然包含大量滤光。由于光子计数系统高度敏感，因此在击中细胞时，此光会分散，并产生相当大的背景信号。需要纠正此问题。
注： 可以使用捕获的细胞图像和可用的成像软件计算细胞面积。像元区域的单位可以是包括像素计数在内的任何单位。只有标准化是必要的。 - 从 4.1.1 到 4.1.4 重复 10 次，以获取细胞区域和细胞背景信号之间的关系。
注：稍后，可以从关系中的细胞区域计算细胞背景信号。由于激励灯泡老化，这个程序需要重复，至少，每月。
- 将无染料细胞安装在浴缸的显微镜上，等待 3 分钟将细胞沉入底部。注入无 NADH Ca2+无解决方案约 5 分钟。
- R 因子的测量
- 使用公式 4 从第 4.2 节中获得的信号计算 Rf。
- 将无染料细胞安装在显微镜上，并注入 Ca2+无溶液。
- 测量信号，如F361，450，NADH，F400，500，NADH，F361，450，NADH和F353，500，N ADH。
- 注入麻麦溶液并重复4.3.3。并测量信号。
- 注入丙酮酸盐溶液并重复4.3.3。并测量信号。
- 注入麻胶-硫磷溶液，重复4.3.3。并测量信号。
- 注入罗酮溶液并重复4.3.3。并测量信号。
注：在5 mM丙酸、5 mM马酸盐加5 mM丙酮和10 μM罗酮添加上记录的NADH信号示例如图3所示。 - 计算每个斜率 F361， 450， NADH vs. F400， 500， NADH和 F361， 450， NADH vs. F353， 500， NADH。如图3所示。每个斜率指示 RN1和 RN2。
5. TMRE 或 Carboxy-SNARF-1 的激励和发射灯的选择
- 如果另外使用用于测量线粒体电位的 TMRE，请使用 530 nm 激发波长和 590 nm 发射波长。
- 如果此外还使用了Carboxy-SNARF-1测量线粒体电位，则使用540nm的激发波长和590nm和640nm12的发射波长。
6. 选择 Fura-2-FF 的 Kd值
- pH 的变化会影响 Ca2+绑定在 fura-2-FF10上的 Kd值。线粒体在 pH 7.5 时使用 Kd值 5.28。
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Representative Results
线粒体 Ca2+因校正10而改变
图 4显示了更正前后[Ca2]m 中的更改。结果清楚地表明了[Ca2]m的重大变化。无细胞Ca2+（[Ca 2+]c ） 的线粒体静钙浓度为 1.03 ± 0.13 μM （均值 = S.E.， n = 32），最大 [Ca2]m在1-μM [Ca2]c为 29.6 ± 1.61 μM （均值 = S.E.，n = 33） （图 5）。
同时测量 NADH、[Ca2]和+m10
带正电荷的TMRE可以以膜电位相关的方式分布。膜电位可以使用Nernst的方程计算，每个隔间中的浓度。线粒体TMRA通过2-nM TMRE的灌注进行监测。假定初始 μm为 ±150 mV，并在此基础上计算了 μm的变化。Ca2+的应用降低了 NADH，但只影响 _m（图 6）。
线粒体 pH 随 [Ca2][m10]的变化而变化
线粒体pH值与卡博基-SNARF-1的额外载荷在Ca2+变化后被监测（图7）。线粒体pH仪不受[Ca2]m增加的影响。静止线粒体 pH 值为 7.504 ± 0.047 （均值 = S.E.， n = 13）。从这些结果中，5.28 μM 是 pH 7.5 时 Fura-2-FF 的选定 Kd值。
图1：用于多参数测量的微荧光测量系统
显示了微荧光测量系统的原理图。安装的细胞通过CCD相机进行可视化。通过光子计数系统检测出四个不同的发射灯，其中四个PMT。这个数字已经复制了从韩国生理学和药理学杂志10的许可。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：等位点的识别
（A） 红色箭头指向 450 nm 发射波长的等位。非绑定状态的 Fura-2 FF 以虚线显示，在具有实线的 Ca2+绑定状态中显示。（B） 红色箭头指向 500 nm 发射波长的等位。（C） 显示了 Ca2+无饱和条件下 450 nm 处信号的减去数据，从 Ca2+无饱和条件中显示。（D） 显示了 Ca2+无饱和条件下 500 nm 处信号的减去数据，从 Ca2+无饱和条件中。（E） 显示了图 C 的标准偏差数据。（F） 图 D 的标准偏差数据显示.这个数字已经复制了从韩国生理学和药理学杂志10的许可。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：RN因子的测量。
（A） 在361nm激发和450nm发射波长下，通过应用各种线粒体基板，在无荧光染料的情况下，NADH信号的变化被测量。（B） 同时监测了 FRa-2-FF 信号的 NADH 干扰，F400，500 （+） 和 F353，500 （+）。（C） 显示 F361，450、NADH和 F400，500、NADH （+） 与 F361，450、NADH和 F353，500、NADH （+） 之间的关系。获得的斜率分别表示为RN1和RN2。这个数字已经复制了从韩国生理学和药理学杂志10的许可。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：NADH和fura-2-FF干扰校正的结果
修正前的信号（如左侧面板所示）到修正后（如右侧面板所示）的变化。（A） 以 450 nm 发射波长处的 NADH 信号.（B） 500 nm 发射波长的 Fura-2-FF 信号。图中显示了F400，500 （+ +）、F353，500（----）和 fura-2-FF （+） 的比率。（C） 线粒体钙浓度.红色虚线表示零。这个数字已经复制了从韩国生理学和药理学杂志10的许可。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5：在 1 [M 细胞Ca2]下休息[Ca2]=m，最大稳定状态 [Ca2]m
线粒体通过灌注麻精-硫磷溶液获得能量。在 Ca2+无条件和 1 [M Ca2]条件下显示了稳定状态 [Ca2]m。增加 5 mM Na=恢复 NADH，并将 [Ca2]m降低到基线。这个数字已经复制了从韩国生理学和药理学杂志10的许可。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：同时测量NADH、[Ca2]=m和[m]
线粒体通过灌注麻精-硫磷溶液获得能量。显示了NAHD、[Ca2]=m和+m的变化。1 [M Ca2]的添加降低了 NAHD 并增加 [Ca2]m，但[m]没有显著变化。这个数字已经复制了从韩国生理学和药理学杂志10的许可。请点击此处查看此图的较大版本。
图7：同时测量NADH、[Ca2]m和pH
Ca2+的反复应用可诱导NADH的降低和[Ca2][m]的增加，但线粒体pH不受Ca2+应用的影响。添加 Na+ 可使 NADH 和 [Ca2]m返回基线。这个数字已经复制了从韩国生理学和药理学杂志10的许可。请点击此处查看此图的较大版本。
| 解决方案名称 | 浓度（mM） | |||||||||
| 氯化钾 | 赫佩斯 | EGTA | CaCl2 | M | P | R | FCCP | Adp | 皂 苷 | |
| Ca2+-免费 | 150 | 10 | 1 | |||||||
| 无 NADH | 150 | 10 | 1 | 0.01 | 0.1 | |||||
| Ca2+-免费 | ||||||||||
| 无 NADH | 135 | 10 | 1 | 0.01 | 0.1 | |||||
| Ca2+-饱和 | ||||||||||
| 皂 苷 | 150 | 10 | 1 | 0.1毫克/毫升 | ||||||
| 马拉提 | 145 | 10 | 1 | 5 | ||||||
| 丙酮 酸 | 145 | 10 | 1 | 5 | ||||||
| 麻胶-皮鲁瓦酸盐 | 140 | 10 | 1 | 5 | 5 | |||||
| 罗泰内内 | 140 | 10 | 1 | 5 | 5 | 0.01 | ||||
| 文化媒介 | 杜尔贝科的改良鹰介质 （DMEM） | |||||||||
| 染料加载 | 在培养基（2 mL）中添加1mM Fura-2-FF-AM 库存（16 mL） | |||||||||
表 1：解决方案
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Discussion
成功地开发了用于测量NADH和fura-2模拟信号的干扰校正方法。准确测量信号对于精确校正至关重要。然而，荧光装置的固有特性会产生与Fura-2的NADH无关的背景信号。最高质量的带通滤波器只能传递多达10~8个不需要的光波长。然而，来自单个细胞的荧光信号非常小，带通滤波器后激发光的反射仍然足够强，足以污染实际的荧光信号。因此，有必要仔细校正背景信号。
Fura-2 存在测量线粒体 Ca2+的加载问题。首先，将染料具体加载到线粒体中并不容易，而非特异性加载到另一个细胞器中可能是错误的。线粒体 Ca2+浓度通常高于细胞醇，使用具有高 Kd值的 fura-2-FF 可以避免细胞体 Ca2+变化的污染。另一个有问题的细胞器是肉质视网膜（SR）。然而，分布体积差异（SR 3.5% 与线粒体 34%-36% 大鼠心室肌细胞）13，14和在实验中去除ATP可以补偿SR的污染.
我们的校准方程（方程 14 和 15）比格林凯维奇的方程15具有许多优势特征，如下所示：
1） 它只需要三个参数：Kd、F400，500、最大/F353，500、最大值和 R最小值 。
2） 在恒定的pH值下，与Ca2+浓度的比值是线性的。
3） 与 Sf2/Sb215相比，F 400，500、最大/F353，500，最大值中存在相对无误差参数。
4） 在公式15中，如果使用等位激励，则只需要Kd和Rmin。
5） 使用公式 15 获得参数的校准过程要简单得多。
但是，存在限制，因为 Ca2+-饱和 fura-2-FF 产生的发射量非常小。它会导致错误。新方程可应用于[Ca2]浓度，浓度可达Kd的50倍。
最后，开发了一种协议，成功地解决了现有的NADH和fura-2-FF干扰问题。此方法可以更准确地测量 Ca2+动力学。多参数测量系统，特别是在线粒体中，将有助于定量地了解线粒体生理学。
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Disclosures
提交人没有利益冲突可披露。
Acknowledgments
这项工作部分得到韩国国家科学研究基金会（NRF）基础科学研究计划的支持，该基金会由韩国教育部资助（2018R1A6A3A0101011832），由科学、ICT和未来规划部（NRF-2016M3C1A693666）资助。贸易、工业和能源部 （10068076）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL eppendorf tube | Axygen | MCT-200-C | 2 mL Tube |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | Equipment |
| ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma-aldrich | A5285 | Chemicals |
| Band pass filter | Ealing Electro-Optics, Inc | 35-3920 | Equipment, 640±11nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 690-9823 | Equipment, 590±15nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 500DF20-9916 | Equipment, 500±20nm |
| Band pass filter | Chroma Technology Corp. | 60685 | Equipment, 450±30nm |
| Calcium chloride solution | Sigma-aldrich | 21114 | Chemicals |
| carboxy-SNARF-1(AM) | Invitrogen | C1272 | Chemicals |
| Charge-coupled device (CCD) camera | Philips | FTM1800NH/HGI | Equipment |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 86009 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <400nm, 490±10, 560±10, Transmission : 460±15, 510±20, >580nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 567DCXRU | Equipment, Reflection : <560nm, Transmission : > 580 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 480dclp | Equipment, Reflection : <470nm, Transmission : > 490 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 20728 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <405nm, 470±30, Transmission : 430nm~520nm, > 640 nm |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-aldrich | 154938 | Chemicals |
| DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Sigma-aldrich | D5030 | Chemicals |
| EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid | Sigma-aldrich | E4378 | Chemicals |
| FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone | Sigma-aldrich | 21857 | Chemicals |
| field diaphragm | Nikon | 86506 | Equipment |
| Fura-2-FF(AM) | TEFLABS | 137 | chemicals |
| Green tube | DWM | test tube | |
| HEPES, 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-aldrich | H3375 | Chemicals |
| High-speed counter | National Instruments | NI-6022 | Equipment |
| Hot mirror | Chroma Technology Corp. | 21002 | Equipment, 50:50 |
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | Equipment |
| Malate | Sigma-aldrich | 27606 | Chemicals |
| Near infrared filter | Chroma Technology Corp. | D750/100X | Equipment, 750±100nm |
| Oil immersion lens | Nikon | MRF01400 | 40x, NA 1.3; Equipment |
| Photon counter unit | Hamamatsu | C3866 | Equipment |
| Photon multiplier tube | Hamamatsu | R2949 | Equipment |
| Polychrome II | Till Photonics | SA3/MG04 | Equipment |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936 | Chemicals |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-aldrich | P4494 | Chemicals |
| Pyruvate | Sigma-aldrich | 107360 | Chemicals |
| Rotenone | Sigma-aldrich | R8875 | Chemicals |
| Saponin | Sigma-aldrich | S4521 | Chemicals |
| TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Molecular probes | T669 | Chemicals |
References
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